Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolasjon og tidsforløpavbildning av primære mus embryonale palatale mesenchymeceller for å analysere kollektive bevegelsesattributter

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for isolasjon og kultur av primære mus embryonale palatal mesenchymale celler for tidsforløp avbildning av todimensjonal (2D) vekst og sårreparasjonsanalyser. Vi tilbyr også metodikk for analyse av tidsforløpavbildningsdata for å bestemme cellestrømsdannelse og retningsmotilitet.

Abstract

Utviklingen av ganen er en dynamisk prosess, som innebærer vertikal vekst av bilaterale palatale hyller ved siden av tungen etterfulgt av høyde og fusjon over tungen. Defekter i denne prosessen fører til kløft gane, en vanlig fødselsdefekt. Nyere studier har vist at palasshyllehøyde innebærer en ombyggingsprosess som forvandler retningen på hyllen fra vertikal til horisontal. Rollen til palatalhyllen mesenchymale celler i denne dynamiske ombyggingen har vært vanskelig å studere. Tidsforløp-avbildningsbasert kvantitativ analyse har nylig blitt brukt til å vise at primære mus embryonale palatal mesenchymale (MEPM) celler kan selv organisere seg i en kollektiv bevegelse. Kvantitative analyser kan identifisere forskjeller i mutante MEPM-celler fra en musemodell med ganehøydefeil. Dette dokumentet beskriver metoder for å isolere og dyrke MEPM-celler fra E13.5 embryoer - spesielt for tidsforløpavbildning - og for å bestemme ulike cellulære attributter for kollektiv bevegelse, inkludert tiltak for strømdannelse, formjustering og utholdenhet i retning. Det hevder at MEPM-celler kan tjene som en proxy-modell for å studere rollen som palatalhylle mesenchyme under den dynamiske høydeprosessen. Disse kvantitative metodene vil gjøre det mulig for etterforskere i kraniofacialfeltet å vurdere og sammenligne kollektive bevegelsesattributter i kontroll- og mutantceller, noe som vil øke forståelsen av mesenchymal ombygging under palatal hyllehøyde. Videre gir MEPM-celler en sjelden mesenchymal cellemodell for undersøkelse av kollektiv cellebevegelse generelt.

Introduction

Gane utvikling har blitt studert mye som defekter i palatogenesis fører til cleft gane-en vanlig fødselsdefekt som oppstår i isolerte tilfeller eller som en del av hundrevis av syndromer1,2. Utviklingen av den embryonale ganen er en dynamisk prosess som innebærer bevegelse og sammensmelting av embryonalt vev. Denne prosessen kan deles inn i fire hovedtrinn: 1) induksjon av palatale hyller, 2) vertikal vekst av palatalhyllene ved siden av tungen, 3) høyde av palatale hyller over tungen, og 4) fusjon av palatalhyllene på midtlinjen1,3,4. I løpet av de siste tiårene har mange musemutanter blitt identifisert som manifest cleft gane5,6,7,8. Karakterisering av disse modellene har indikert feil i palatalhylleinduksjon, spredning og fusjonstrinn; Høydefeil på palatalhyllen har imidlertid vært sjeldne. Dermed er det å forstå dynamikken i palatal hyllehøyde et spennende forskningsområde.

Nøye analyse av noen musemutanter med palasshøydefeil har ført til at den nåværende modellen viser at den svært fremre regionen av palatalhyllen ser ut til å vippe opp, mens en vertikal til horisontal bevegelse eller "ombygging" av palatale hyller forekommer i midten til bakre regioner i ganen1,3,4, 9,10,11. Medial kant epitelet på palatalhyllen initierer sannsynligvis signalene som kreves for denne ombyggingen, som deretter drives av palatalhyllen mesenchyme. Nylig har mange forskere identifisert palatal hyllehøydeforsinkelse i musemodeller som viste forbigående orale vedheft som involverer palatalhyller12,13. Den mesenchymale ombyggingen innebærer omorganisering av cellene for å skape en bule i horisontal retning, samtidig som palatalhyllen trekkes tilbake i vertikal retning9,10,14. Blant de flere mekanismene som foreslås å påvirke palatal hyllehøyde og underliggende mesenchymal ombygging er celleproliferasjon15,16,17, kjemoaktiske gradienter18og ekstracellulære matrisekomponenter19,20. Et viktig spørsmål oppstod: er den palatale hyllehøydeforsinkelsen observert i Specc1l-mangelfullemus også delvis på grunn av en defekt i palatalhyllens ombygging, og kan denne ombyggingsfeilen manifestere seg i en iboende defekt i oppførselen til primære MEPM-celler21?

Primære MEPM-celler har blitt brukt i kraniofacialfeltet for mange studier som involverer genuttrykk22,23,24,25,26,27,28,29og noen få som involverer spredning30,31 og migrasjon25,31,32 , men ingen for analyse av kollektiv cellevirkemåte. Tidsforløpavbildning av MEPM-celler ble utført i 2D-kultur- og sårreparasjonsanalyser for å vise at MEPM-celler viste retningsbevegelse og dannet tetthetsavhengige cellestrømmer-attributter for kollektiv bevegelse21. Videre dannet Specc1l mutantceller smalere cellestrømmer og viste svært variable cellemigrasjonsbaner. Denne mangelen på koordinert bevegelighet anses å bidra til ganens høydeforsinkelse i Specc1l mutant embryoer13,21. Dermed kan disse relativt enkle analysene ved hjelp av primære MEPM-celler fungere som en proxy for å studere mesenchymal ombygging under palatal hyllehøyde. Dette dokumentet beskriver isolasjonen og kulturen til primære MEPM-celler, samt tidsforløpavbildning og analyse, for 2D- og sårreparasjonsanalysene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter som involverte dyr ble utført med en protokoll godkjent av KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, i samsvar med deres retningslinjer og forskrifter (Protokollnummer: 2018-2447).

1. Innhøsting av E13.5 embryoer

  1. Avlive gravide kvinnelige mus ved hjelp av et CO 2-innåndingskammer eller ved en prosedyre godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee. Fortsett umiddelbart med disseksjonen.
  2. Utsett den dårligere halvdelen av bukhulen ved å fjerne huden og bukhinnen. Sluk begge livmorhornene, som inneholder E13,5 embryoer.
  3. Plasser livmoren kort i forvarsel 37 °C steril fosfatbufret saltvann (PBS) for å skylle av overflødig blod, hår eller annet rusk. Legg livmoren i en steril 10 cm tallerken fylt med steril PBS.
  4. Bruk liten saks, kutt gjennom livmorveggen langs livmorens lengde for å eksponere hvert embryo, fortsatt i eggeplommesekken. Fjern eggeplommesekken rundt embryoet, men spar det til genotyping, om nødvendig. Når embryoene fjernes, plasser hvert embryo i sin egen brønn av en 12-brønns plate fylt med PBS.

2. Disseksjon av palasshyller fra embryoer (Figur 1)

MERK: Steriliser disseksjonsinstrumentene i rustfritt stål (se materialtabellen) etter behandling av hvert embryo ved å plassere instrumentene først i et beger med 100% etylalkohol (EtOH), deretter i en instrumentsterilisator ved 350 °C i 10 s, og deretter kjøle dem ned i et annet beger på 100 % EtOH.

  1. Bruk en sterilisert perforert skje, plasser embryoet i en ny 10 cm tallerken fylt med MEPM kulturmedium som består av Dulbeccos minimum essensielle medium (DMEM) som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), L-glutamin (4 mM L-Glu), og antibiotika-penicillin og streptomycin (50 enheter / ml).
  2. Decapitate embryoet rett under kjevelinjen ved hjelp av steril saks (Figur 1A, rød prikket linje). Fjern underkjeven ved å sette inn ett punkt av de steriliserte fine #5 tangene i munnen, og hold den rett inne i kinnet. Skyv punktet på de innsatte tangene gjennom til det går ut av baksiden av skallen.
  3. Orienter tangene, langs den gule linjen i figur 1B, slik at den andre siden av tangene (som fortsatt er utenfor embryoet) svever like over ørekanalen, og klem deretter tangene lukket for å kutte vevet. Kjør om nødvendig ytterligere fine tang langs sømmen til de nå lukkede tangene for å kutte gjennom vev som ikke var helt kuttet av klemmen.
  4. Gjenta det forrige trinnet for den andre siden av embryohodet. Fortsett klemme-cut prosedyren for å fjerne underkjeven, tungen og dårligere del av skallen og eksponere palatalhyllene.
  5. Fjern kraniet på skallen ved å skjære like over øynene, som vist i figur 1C (grønn linje). Gjør dette ved å plassere hodet på venstre eller høyre side og plassere punktene til den lille saksen i rustfritt stål foran og bak skallen like over embryoets øyenivå. Klipp av toppen av skallen med ett raskt klipp av saksen, og lag en flat overflate som vil være viktig for stabilitet i senere trinn, og som skal se ut som figur 1D når den ses fra siden.
  6. Plasser den resterende delen av hodet opp ned, med det overlegne aspektet av hodet (kraniet fjernet) hviler flatt på bunnen av parabolen, noe som vil gi en stabil overflate for fjerning av palatalhylle. Ta deg tid til å identifisere palasshyllene, som nå er eksponert og vendt opp og vil vises som to hevede rygger på hver side av et sentralt spor i den fremre halvdelen av hodet (Figur 1E).
  7. Fest den gjenværende delen av hodet til parabolen for å immobilisere den mens hyllene fjernes. Gjør dette ved å sette inn ett punkt av en fin tang gjennom vevet nær neseområdet av hodet, fremre til palatalhyllene, og sett inn det andre punktet av tang gjennom bunnen av skallen, bakre til palatalhyllene. Hold disse på plass mens du utfører eksisjonen av palatalhyllene.
    1. Immobilisere hodet med en hånd, velg hvilken som helst av de to hyllene for å fjerne først, og sett inn begge punktene i et annet par fine tang i vevet ved foten av den laterale overflaten av hyllen, og klem for å kutte vevet (Figur 1F). Gjenta dette langs bunnen av medialoverflaten på hyllen og deretter i både de fremre og bakre endene av hyllen for å løsne fra hodet.
  8. Løft forsiktig hyllen, og gjør ekstra klemmer, etter behov, for å frigjøre hyllen helt fra det omkringliggende vevet.
  9. Gjenta de to foregående trinnene for å fjerne den andre palatalhyllen.
  10. Med palatalhyllene nå frigjort fra det omkringliggende vevet og plassert i PBS (Figur G), bruk en steril plastpæreoverføringspipette for å tegne hyllene i pipetten, og overfør dem til et 1,5 ml mikrocentrifugerør sammen med ca. 500 μL PBS. Hold rørene som inneholder palasshyller på is mens resten av søppelet behandles på samme måte.
    MERK: Alternativt kan hyller plasseres i et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder forhåndsvarslet trypsin (0,25 %) umiddelbart etter disseksjon (i stedet for å plassere dem på is). Prøver vil bli ferskere, men det må tas hensyn til alle de pågangstrinnene for hver enkelt prøve i motsetning til å behandle prøvene samlet.

3. Kultur av MEPM-celler

MERK: Under forholdene som er beskrevet her, overlever ikke ganens epitelceller den første passasjen, noe som resulterer i en ren gane mesenchymal cellekultur. Bruk steril teknikk for å utføre alle trinnene i en vevskultur hette.

  1. Aspirer og kast PBS fra 1,5 ml-røret, pass på at du ikke kaster hyllene i prosessen. Tilsett umiddelbart 200 μL forvarsel (37 °C) trypsin (0,25 %) til hvert rør som inneholder palasshyller. Rør kort hyllene opp og ned i trypsin ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss for å akselerere trypsiniseringen.
  2. Inkuber rørene i 5 min ved 37 °C, og rør deretter hver prøve opp og ned igjen for å hjelpe til med å bryte opp vevet. Inkuber rørene i ytterligere 5 min ved 37 °C, og rør opp og ned igjen for å fullføre oppløsningen av vevet.
    MERK: Hyllene må være helt eller nesten helt dissosierte og suspendert i trypsin uten synlige biter av vev igjen.
  3. Tilsett 800 μL MEPM kulturmedium (trinn 2.1) i hvert 1,5 ml rør. Sentrifuger 1,5 ml-røret ved 200 × g i 5 minutter for å pellet cellene. Fjern supernatanten, og bruk cellepelleten på nytt i 1 ml MEPM-kulturmedium.
  4. Lag MEPM-cellene i en 6-brønns vevskulturbehandlet plate som inneholder MEPM-kulturmedium. La cellene feste seg til plastoverflaten i 12 timer ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
    MERK: Etter inkubering over natten vil de aller fleste (~ 90%) av cellene festes. På dette tidspunktet vil de festede cellene se ganske homogene ut, med en trekantet eller litt langstrakt form.
  5. Bytt medium hver dag ved å forsiktig aspirere det gamle mediet og umiddelbart erstatte det med 1 ml varm steril PBS uten kalsium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirer PBS, og erstatt med 3 ml forhåndsvarslet MEPM-kulturmedium.
  6. Passasje cellene når de blir 100% sammenfallende.
    MERK: MEPM-celler bør spre seg ved å doble antallet nesten daglig.
    1. For å passere cellene, aspirer forsiktig det gamle mediet, og erstatt det umiddelbart med varm PBS uten kalsium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirer PBS, og erstatt den med 0,5 ml forhåndsvarslet 0,25% trypsin.
    2. Inkuber ved 37 °C i ~5 min, eller til cellene løsner fra overflaten av retten når de forsiktig gynges frem og tilbake for hånd. Når cellene er løsnet, tilsett umiddelbart 5 ml forhåndsvarslet MEPM-kulturmedium til de trypsiniserte cellene.
    3. Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipet samler du forsiktig cellene i et 15 ml konisk rør, og sentrifugerer røret ved 200 × g i 5 minutter for å pellet cellene. Aspirer trypsin og medium, og resuspend cellene i 3 ml forhåndsvarslet MEPM kultur medium. Rør forsiktig 1 ml celler inn i en enkelt brønn av en 6-brønns tallerken, og tilsett 2 ml MEPM-kulturmedium for å bringe det totale volumet til 3 ml.
      MERK: Dette utgjør en 1:3-deling av celler. MEPMer kan passeres opptil tre ganger. Såddtettheten til MEPMer er noe fleksibel, og antall celler som er tilstede varierer avhengig av kulturbeholderen. MEPMer sprer seg imidlertid ikke riktig når de er delt for sparsomt og bør være minst 20-25% sammenfallende i sin nye tallerken når de holder seg.

4. Kryopreservering av MEPM-celler

  1. Når trypsiniserte MEPM-celler er pelletert, resuspenderer du cellene i MEPM-kulturmediet for å oppnå en konsentrasjon på ~ 1 × 106 celler / ml. Rør cellene i kryolegemer, og legg til en endelig konsentrasjon på 5% dimetylsulfoksid i cellebestanden. Hette kryonalen, bland kort ved å invertere, og legg straks hetteglassene i en frysebeholder som avkjøles med en hastighet på 1 °C/min.
  2. Plasser kjøleboksen i en -80 °C fryser over natten. På neste dag, flytt kryopiene til en flytende nitrogentank for langsiktig lagring.
  3. Tining cryopreserved MEPM celler
    1. Fjern kryovariene fra den flytende nitrogentanken, og tine ved romtemperatur til innholdet begynner å bli flytende. Tøm innholdet i et 15 ml konisk rør som inneholder 9 ml forhåndsvarslet MEPM-kulturmedium.
    2. Sentrifuger røret ved 200 × g for å pellet cellene. Resuspend cellene i 1 ml MEPM kulturmedium, og rør cellene inn i en enkelt brønn av en 6-brønns plate. Tilsett 2 ml varmt MEPM-kulturmedium for å bringe det totale volumet til 3 ml.
    3. Kultur cellene ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2. Endre mediet daglig.

5. Live-avbildning av MEPM-celler - 2D kollektiv migrasjonsanalyse (Figur 2)

  1. Forbered en plate som skal brukes til levende bildebehandling.
    1. Bruk liten kirurgisk saks eller en skarp skalpell for å forkorte en steril 2-brønns silikoninnsats til en høyde på ~ 1 mm. Klargjør en innsats for hver prøve som brukes.
    2. Bruk tang, plasser den forkortede 2-brønns silikoninnsatsen i midten av en brønn på en 6-brønns plate. Trykk ned langs alle kanter for å sikre at den sitter helt fast.
  2. Tine kryopreserverte celler ved å følge trinnene i avsnitt 4.3 i denne protokollen. Tell MEPM-celler, og frø 300 celler/mm2 av de forkortede silikoninnsatsene i et totalt volum på 40-50 μL MEPM kulturmedium per brønn. Kultur cellene over natten ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
  3. På neste dag, forbered deg på live time-lapse bildebehandling.
    1. Bruk et fasekontrastmikroskop med en inkubator på scenen og automatisk bildebehandlingsevne. Tilsett vann til onstage inkubatorreservoaret for å redusere fordampning av kulturmediet; temperatur til 37 °C og CO2 til 5 %. La det bygges opp ~30 min for at luftfuktigheten skal bygge seg opp før du plasserer 6-brønnsfatet i inkubatoren på scenen.
  4. Bruk innstillinger som tilsvarer følgende for tidsforløpavbildning.
    1. Velg 4x-målsettingen som skal ha store synsfelt og fasekontrastfilter.
      MERK: Autofokus, Automatisk søk etter prøve, z-stack og automatisk belysning er vanligvis ikke nødvendig.
    2. Velg to mikroskopiske felt per brønn for å fange lumen til de forkortede silikoninnleggene. Kontroller at alle bildeposisjoner har riktig fokus.
      MERK: Bildeplan kan justeres under bildebehandling, men slik justering er vanligvis ikke nødvendig.
    3. Velg ønsket bildeutdatafiltype, og velg eller fjern deretter alternativene etter bildebehandling, for eksempel automatisk videooppretting og vannmerker, etter ønske. Hvis det er aktuelt, velger du fasekontrast som bildemodus.
      MERK: Bruk av vannmerker kan hindre påfølgende bildebehandlingstrinn.
    4. Sett varigheten av opptaket til 72 timer. Sett programmet til å ta bilder hvert 10.
      MERK: Vanligvis er det bare nødvendig med 48 timers bildebehandling, men bildebehandling kan stoppes når som helst før 72-h-merket uten å miste bilder som allerede er tatt.
    5. Sørg for at miljøkammeret er i drift etter behov i 5.3.1. Lagre disse innstillingene (rutinen) og start avbildningen.
  5. Fortsett avbildningen til 72 timer (eller den angitte tiden).

6. Live-avbildning av MEPM-celler i en sårreparasjonsanalyse (figur 3)

  1. Klargjør en plate som skal brukes til levende bildebehandling. Bruk tang, plasser en steril 2-brønns silikoninnsats i midten av en brønn på en 6-brønns plate, og trykk ned langs alle kanter for å sikre at den sitter helt fast. Forbered en 2-brønns innsats for hver prøve som brukes.
  2. Tine kryopreserverte celler ved å følge trinnene i avsnitt 4.3 i denne protokollen. Tell MEPM-celler, og konsentrer om nødvendig cellene til minst 350 celler/μL.
  3. Frø 1400 celler/mm2 inn i silikoninnsatsene i et volum på 100 μL MEPM kulturmedium per brønn. Kultur cellene i 48 h ved 37 °C i en inkubator med 5% CO2, og bytt medium hver dag.
  4. Etter 48 timer klargjør et mikroskop for levende tidsforløpavbildning som beskrevet i pkt. 5.3 og 5.4. Umiddelbart før du plasserer cellene i onstage-inkubatoren, tilsett 3 ml forhåndsvarslet MEPM-kulturmedium til brønnen (men utenfor innsatsene), og fjern deretter silikoninnsatsene forsiktig.
    MERK: Veggen som skiller de to kamrene etterlater et gap som er "såret".
  5. Start tidsforløpavbildning som beskrevet i 5.4, med følgende forskjeller:
    1. Bruk en høyere forstørrelse (f.eks. 10x) målsetting. For å fange såret lukking, velg 5 synsfelt langs hvert sår, slik at såret er parallelt med den vertikale aksen i bildet.
  6. Stopp avbildningen etter 72 timer eller når sårene er helt lukket.

7. Beregningsanalyse av tidsforløp bildesekvenser

MERK: Utfør følgende prosedyrer på en datamaskin som er utstyrt med standard beregningsverktøy, for eksempel pythontolk, C-kompilator og et skall (se materialtabellen).

  1. Samløpsanalyse
    MERK: Denne prosedyren kan brukes til å estimere celleproliferasjon i en sparsom kultur eller til å kvantifisere sårlukkingsforsøk. For å oppdage områder som er okkupert av celler, brukes en segmenteringsterskel på det lokale standardavviket for bildelysstyrken. Koden har tidligere blitt beskrevet av Wu et al.33 og Neufeld et al.34 og er tilgjengelig på http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Bestem segmenteringsterskelen for bildene. Hvis du for eksempel vil se segmenteringen med en terskel 4, utsteder du kommandoen
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -testutgang.jpg
      og kontroller deretter utgangen (utgang.jpg).
      MERK: Hvis terskelen er for lav, klassifiseres bakgrunnsområder i mikrografen som celledekket. Derimot, hvis terskelen er for høy, er celledekkede områder ikke klassifisert som sådan. Den optimale terskelverdien holder begge feilene på et minimum.
    2. Bruk det angitte area.sh skriptet til å beregne samtidighetsverdier for en sekvens med bilder som
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > samløp.dat
      MERK: Diskrimineringsterskelverdien 4 bekreftes i trinn 1, og resultatene lagres i filsamtid.dat. Ved å sortere bildene i riktige mapper, kan listen over bildefilnavn erstattes av jokertegnnotasjon:
      area.sh -S4 * .jpg > samløp.dat
    3. For sårlukkingseksperimenter kan du transformere sammenløpsdataene A(t)- størrelsen på det celledekkede området uttrykt som en prosentandel som en funksjon av tid til sårkantutbredelseshastighet V som
      Equation 1
      der w angir bredden på feltet og dA/dt er tidsderivatet for A(t), det vil si utvidelseshastigheten for det celledekkede området.
  2. Kart over cellemotilitet
    1. Utfør en PIV-algoritme (particle image velocimetry) for å karakterisere cellemotilitet, og trekk ut omfanget av lokal bevegelse "optisk strømning" mellom bildepar, men ikke for å identifisere individuelle celler.
      MERK: Her brukes en innledende vindusstørrelse på 50 μm, som beskrevet i detalj av Zamir et al.35 og Czirok et al.36, med en innledende vindusstørrelse på 50 μm. PIV-analysen gir et hastighetsfelt v(x,t) for hver bilderamme t og plassering (i bildet) x.
    2. Trekk ut gjennomsnittlig hastighet på cellemotilitet fra v(x,t) som et romlig gjennomsnitt beregnet over det okkuperte celleområdet, som bestemt i avsnitt 7.1.
  3. Manuell cellesporing
    MERK: Selv om PIV-analysen gir en automatisk vurdering av cellemotiliteten, krever det ofte manuell sporing for å fokusere på oppførselen til enkeltceller. Selv om flere verktøy gir denne funksjonaliteten, er det svært nyttig hvis de manuelt plasserte markørene kan endres etter den første plasseringen, og hvis sporing kan utføres både fremover og bakover i tid.
    1. Utfør cellesporing med et spesialutviklet pythonverktøy (http://github.com/donnagreta/cm_track), som også gir grunnleggende redigeringsfunksjoner som sletting av banesegmenter.
      MERK: Dette manuelle sporingsverktøyet gir posisjonene P(i,t) til celle i på tidspunktet t i en tekstfil, og påberopes som
      cm_track.py -i bilder/ -o spor.dat
      der tidsforløpbildene er i mappebildene/ og posisjonsdataene samles inn i filsporet.dat (Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Analyse av individuelle cellebaner. (A) Tidsforløpmikrografer for fasekontrast blir utsatt for (B, C) en manuell sporingsprosedyre som markerer celler (grønne prikker). (D) Celleposisjoner (x,y) lagres for hver celle som er preget av IDen, og for hver ramme f. (E) Kan baner legges over mikrografene og fargekodet for å angi tidsmessig informasjon. Som et eksempel, i hver bane, indikerer en blå til rød fargepalett gradvis senere banesegmenter, med henholdsvis rød og blå som markerer de opprinnelige og endelige celleplasseringene. (F) Ulike statistiske egenskaper til baner, for eksempel gjennomsnittlig firkantet forskyvning, kan trekkes ut og brukes til å karakterisere motiliteten til ulike cellepopulasjoner, som i dette eksemplet inkluderer wildtype-celler (wt, blue) og knockdown-celler (kd, rød). Skalastolpene representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Overleggsbaner på bilder ved hjelp av et annet verktøy, påkalt som
    visdat.py -d spor.dat -i bilder/ -o overlegg/ -l999 -r3 -C2
  2. Samle bildene med banene lagt i mappeoverlegget.
    MERK: I dette eksemplet lagres celleposisjonsdata i filsporet.dat, mens bildesekvensen for tidsforløp er innenfor mappebildene. Resten av parameterne styrer den maksimale lengden på de tegnede banene (-l), størrelsen på symbolene (-r) og fargevalget (-C) som brukes.
  1. Analyse av individuelle cellebaner
    1. Karakterisere baner etter total banelengde
      Equation 2,
      og nettforskyvning mot såret
      Equation 3,
      der X betegner projeksjonen av P i retning vinkelrett på såret: x-koordinaten til posisjonene når såret er parallelt med y-aksen.
    2. Beregn veiledningseffektiviteten som Equation 4 for hver celle i og tidspunkt t37. Karakteriser kulturer etter populasjonsgjennomsnittet av disse enkeltcelletiltakene, evaluert på et passende tidspunkt t.
  2. Kollektiv streaming bevegelse av celler
    1. Karakterisere de lokale romlige korrelasjonene til cellebevegelser ved gjennomsnittlig hastighet for andre celler som er i nærheten av en bevegelig celle, som beskrevet tidligere38,39.
      MERK: Beregningskoden er tilgjengelig på https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Juster et referansesystem etter anvisninger foran, bak, til venstre og til høyre for hver vektor v(x,t) (Figur 5A). Tilordne hver av de omkringliggende celle- eller PIV-hastighetsvektorene til den aktuelle romlige cellen i referansesystemet (Figur 5B). Gjenta prosedyren slik hver vektor fungerer som opprinnelsen til referansesystemene (Figur 5C,D) slik at en gitt hastighetsvektor tilordnes flere hyller.
        MERK: Et datapunkt kan være foran en vektor, og til venstre for en annen.
      2. Roter referansesystemene til en felles retning (Figur 5C, F) og grupper dem ( Figur5G).
        MERK: Gjennomsnittet av hver skuff av de samlede hastighetsdataene er en hastighetsvektor (U) som indikerer romlig korrelasjon: gjennomsnittet er et mål på en delt hastighetskomponent (Figur 5H).
      3. Tilpass U(x)-flytfeltene med en eksponentiell funksjon Equation 5 , der a, x0 og U0 tilpasser parametere. Av de tre tilpasningsparametrene fokuserer du på x0, korrelasjonslengden (Figur 5I,J), som er den karakteristiske avstanden der lokale hastighetshastighetskorrelasjoner forsvinner.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering av strømdannelse av dyrkede celler. (A,D) Tidsforløpbilder for fasekontrast fra figur 4A brukes til å identifisere cellebevegelser. For hver flyttende celle ble en referanseramme (blå) og romlige beholdere (hvite) samjustert for å kategorisere tilstøtende celler som å være foran, bak, venstre eller høyre. (B,E) Hastigheten til tilstøtende celler (svarte vektorer) var relatert til samme referanseramme (C,F). Denne prosedyren ble gjentatt for hver celle og hvert tidspunkt. (G) Etter å ha gruppert denne lokale informasjonen, vil hver skuff inneholde flere hastighetsvektorer (grå), som kan beregnes i gjennomsnitt for å bestemme gjennomsnittlig koflytende hastighet (magenta piler) på forskjellige steder i forhold til en gjennomsnittlig motile celle. (H) Det gjennomsnittlige hastighetskartet karakteriserer dermed de typiske cellehastighetene på forskjellige steder i forhold til en bevegelig celle. (I,J) Til slutt ble dette feltet samplet langs den fremerside (parallelle) aksen og også langs venstre-høyre (vinkelrett) akse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disseksjonen av palasshyller er illustrert i figur 1. Sekvensen av snitt er designet for å minimere glidning av vevet. Etter at hodet er fjernet (Figur 1A,B), fjernes underkjeven (Figur 1B,C). Snittet i den øvre delen av hodet (Figur 1C,D) gjøres for å stabilisere vevet når det plasseres opp-ned (Figur 1E) for å visualisere (Figur 1E, stiplede linjer), klemme ( Figur1F) og særavgifter (Figur 1G) palatale hyller.

Det utskilte palatalhylleparet fra et enkelt embryo er trypsinisert og dyrket i en 35 mm tallerken eller i en brønn av en 6-brønns tallerken. Større retter foretrekkes ikke, da celletettheten er for lav for optimal vekst. Ved samløp blir cellene fra hver brønn trypsinisert og passert inn i tre 35 mm tilsvarende brønner (passasje #1). Konfluenteceller fra passasje #1 kan deretter fryses ned i aliquots på 1 × 106 celler/ml. Frosne aliquots blir senere tatt opp i en 35 mm tilsvarende tallerken og vokst til samløp. Cellene blir deretter prøvet (passasje #2) og frø i henhold til eksperimentet. Å skape og bruke frosne aliquots bidro til å normalisere forholdene, spesielt med hensyn til celletetthet. Bruken av ferske MEPM-celler resulterte i mer variasjon i endelig celletetthet i eksperimenter, noe som antas å skyldes en variabel andel levedyktige eller under levedyktige celler i friske kulturer. I tillegg var antallet MEPM-cellepassasjer strengt begrenset til to (oppført ovenfor) for disse eksperimentene.

Tatt i betraktning at a) celletetthet var kritisk, b) MEPM-celler fra et enkelt embryo var begrenset, og c) bildeoptikk var bedre i en stor tallerken, ble 2-brønns silikoninnlegg brukt (Figur 2 og figur 3). For sårreparasjonsanalyser ble MEPM-celler dyrket i de 2-brønns silikoninnsatsene til høy sammenløp, deretter ble innsatsene fjernet, og såret avbildet til lukking (Figur 3). Men for 2D-kultur trengte MEPM-cellene avbildning etter hvert som de vokste, slik at de 2-brønns silikoninnsatsene ganske enkelt ble trimmet til 1/3rd av høyden for å tillate klar bildebehandling (Figur 2C). Små 3D-trykte ringer40 i 35 mm retter ble også brukt til 2D-motilitetsanalyse (Figur 2D).

MEPM-baner (figur 4E) er vedvarende: retningen av cellemotilitet opprettholdes i flere timer. Gjennomsnittlig forskyvning vs. tidsanalyse (figur 4F) indikerer at utholdenheten i form av forskyvning er proporsjonal med forløpt tid. Den typiske hastigheten til MEPM-celler på vevskultur plastoverflate, 10 μm / t, kan også brukes til kvalitetskontroll av cellekulturen. Flytanalyse av motilitetsdataene viser at ko-bevegelige klynger av MEPM-celler er ~300 μm i størrelse (Figur 5I,J). De representative resultatene indikerer også en dyp motilitetsforskjell mellom wild-type og mutant MEPM-celler. I tillegg til wildtype og mutant sammenligning, kan både 2D- og sårreparasjonsanalyser kombineres med ulike biokjemiske behandlinger. Pi3K-AKT-baneaktivatorer har for eksempel blitt brukt med MEPM-celler, som beskrevet tidligere 21.

Figure 1
Figur 1: Disseksjon av embryonale palatale hyller for å isolere mesenchymale celler. (A) Et E13.5 museembryohode fjernes ved å kutte langs nakken (rød linje). (B) Deretter fjernes underkjeven og tungen med snitt langs munnhulen, mellom over- og underkjeven (gul linje). (C) For å stabilisere vevet for fjerning av palatalhylle, utskilles toppen av hodet (grønn linje). (D) Det resulterende dissekerte overkjeveområdet er plassert (E) opp ned for å visualisere palatalhyllene (svarte stiplede linjer). (F) Eksisjonen av individuelle palasshyller er avbildet skjematisk, hvor individuelle fremspringende hyller (gul) klemmes av fra maxilla (blå). (G) Utskilt par palatalhyller fra et enkelt embryo, som deretter kan prøves og dyrkes i en 35 mm tallerken eller i en 6-brønns tallerken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentelt oppsett av 2D MEPM cellekultur. (A) Tine en frossen aliquot av MEPM celler, og (B) kultur cellene i en 35 mm tallerken eller en 6-brønns plate. Når de er sammenfavnende, må du prøve cellene og frø dem som beskrevet i protokollen i en 35 mm tallerken enten med (C) 2-brønns silikoninnlegg som er trimmet eller (D) med 3D-trykte ringer. Et lite kulturområde minimerer behovet for et stort antall MEPM-celler. Den lave profilen til de trimmede silikoninnleggene eller de 3D-trykte ringene gir mulighet for direkte bildebehandling uten glorieeffekt. Tidsforløpavbildning kan fortsette til ønsket celletetthet oppnås, noe som kan være opptil 72 timer. Representative bilder vises ved (E) 0 t, (F) 24 h og (G) 45 h tidspunkt. Bildene ble tatt med en 4x målsetting. Skalastolpene for E, F, G = 300 μm. Forkortelser: 2D = todimensjonal; MEPM = mus embryonal palatal mesenchyme; 3D = tredimensjonal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentelt oppsett av sårlukkingsanalyse ved hjelp av MEPM-celler. (A) Tine en frossen aliquot av MEPM celler, og (B) kulturceller i en 35 mm tallerken eller en 6-brønns plate. Når de er sammenfavnende, må du prøve cellene og (C) frø dem i de 2-brønns silikoninnleggene i en 35 mm tallerken. Kultur cellene i innsatsen til ønsket samløp oppnås (~ 48 h), fjern deretter silikoninnsatsen og bildet. Representative bilder vises (D) umiddelbart etter at innsatsen er fjernet, (E) etter 24 timer og (F) etter 40 timer. Sårlukking tar rundt 36 timer. Bildene ble tatt med et 10x mål. Skalafeltet representerer 300 μm. Forkortelser: MEPM = mus embryonal palatal mesenchyme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Palatal hyllehøyde utgjør en vertikal til horisontal ombyggingshendelse1,3,4,9,11. Det er postulert at denne ombyggingsprosessen krever at palatalhyllemesenchymale celler oppfører seg koordinert. Analysene med WILDTYPE MEPM-celler viser at denne cellevirkemåten er innebygd og kan kvantiseres21. Dermed kan disse analysene brukes til å avdekke primære palasshøydefeil i nye og eksisterende musemodeller av kløftpalte. Metodene som er skissert i avsnitt 1 og 2, bør tillate etterforskere å isolere, kultur og fryse aliquots av primære MEPM-celler. Disse cellene kan deretter brukes til et bredt spekter av applikasjoner, inkludert 2D-kulturen og sårreparasjonsanalyser beskrevet her. 2D-kulturen, når den kombineres med tidsforløpavbildning, presenterer en enkel metode for å bestemme grunnleggende celleattributter over et område med celletettheter. Presentert her er en metode for å vurdere cellejustering og cellestrømdannelse, som er attributter for kollektiv cellebevegelse (figur 4). Sårlukkingsanalyser brukes vanligvis til å vurdere cellemigrering41,42,43. Det cellefrie området av "såret" gir et signal for retningsbevegelse av celler i periferien. Tidsforløpavbildning av denne prosessen tillot bestemmelse og vurdering av cellebaner under migrasjon. Disse cellebanene bestemmer i sin tur cellemigreringshastighet og direksjonalitet (figur 5).

Det er viktig å først optimalisere forholdene for kultur og analyser ved hjelp av bare WILDTYPE MEPM-celler. Etter at palatalhyllene har blitt vellykket prøvet og den resulterende encellede suspensjonen belagt over natten, vil de aller fleste (~ 90%) av cellene lett feste seg til vekstflaten på parabolen. Hvis cellene ikke lett holder seg, kan det være noe galt med kulturforholdene. I utgangspunktet vil de festede cellene se ganske homogene ut, med en trekantet eller litt langstrakt form, men etter hvert som de vokser til en høy tetthet, blir de mer spindelformede og langstrakte (Figur 2). Hvis cellene blir dramatisk store i størrelse eller multinucleated, bør de ikke brukes til eksperimenter. Denne optimaliseringen vil også etablere grunnleggende wildtype parametere for vellykket vekst (tid til sammenløp) og sårreparasjon (tid til lukking). Cellene skal spre seg ved å doble i antall nesten daglig og i tidsforløp bilder, vise motilitet på ~ 5-10 μm / t. På samme måte, hvis i et etterfølgende eksperiment som involverer en wildtype-mutant sammenligning, blir disse grunnleggende parametrene ikke oppfylt av wildtype-celler, kan eksperimentet måtte utelukkes fra analyse. For eksempel tar wildtype MEPM-celler 36-40 timer å lukke såret helt ved hjelp av de 2-brønns silikoninnsatsene. Hvis det i et eksperiment tar betydelig lengre tid enn 40 timer å lukke såret, vil hele eksperimentet være mistenkt. Dårlig ytelse fra MEPM-celler kan skyldes 1) dårlig frossen aliquot-kvalitet, 2) dårlig vekkelse eller 3) overdreven differensiering. Differensierte eller senescent celler kan oppdages visuelt som de blir svært store og ikke dele. En kultur med et stort antall slike celler bør unngås. Generelt bør det ikke være unormale celler i synsfeltet til et 10x mål (Figur 3); En celle eller to utenfor synsfeltet bør ikke ha vesentlig innvirkning på analysen. Hvis du begrenser analysen til bare to cellepassasjer (ovenfor), bidrar det til å opprettholde kvaliteten på MEPM-celler.

For både 2D-kulturen og sårreparasjonsanalysene som brukte primære MEPM-celler, var nøkkelkravet for suksess en høy startcelletetthet. Dette kravet ble først bestemt under optimalisering av sårreparasjonsanalyse der celler ble sådd ved > 1400 celler / mm2. Tettheten av celler som migrerer inn i såret ble deretter brukt som såddtetthet i 2D-kulturanalyser. En såddtetthet på ~ 300 celler / mm2 dannede cellestrømmer, samtidig som det muliggjør automatisert analyse av cellebaner. Tettheter høyere enn 300 celler/ mm2 har en tendens til å danne mer levende strømmer som kan visualiseres av øyet, men gjør individuell cellesporing vanskelig. Når du sammenligner primære MEPM-celler fra wildtype og mutantembryoer, selv om sårlukkingsforsinkelse kan vurderes uten beregningsanalyse, kan det hende at strømdannelse og retningsforskjeller ikke kan skilles for øyet. Hvis celletettheten er for høy eller bildekvaliteten er dårlig/uskarp, for eksempel på grunn av tap av fokus, kan automatisert cellesporing være vanskelig. I et slikt tilfelle er det mulig å bruke manuell cellesporing for å bestemme cellebaner i sårreparasjonsanalyser ved hjelp av ImageJ. En svært lav konsentrasjon av Hoechst kjernefysisk flekk (3 μL / ml 20 mM løsning i MEPM kulturmedium) kan også brukes til å lette cellesporing; Fluorescerende lasertoksisitet kan imidlertid være et problem med utvidet bruk.

For manuell sporing var det lettere å spore celler i revers fra slutten av sårlukking bakover så langt som mulig til høy celletetthet skjulte videre sporing. Selv delvise cellebaner, når de kombineres for en cellepopulasjon, var informative. I motsetning til sårreparasjonsanalyser kreves automatisert cellesporing for 2D-cellekulturanalyse, noe som er en av grunnene til at mellomliggende celletetthet ble valgt. Til slutt kan sensitive primære MEPM-baserte analyser brukes til å identifisere forbindelser og veier som kan påvirke ganehøyden. Tidligere studier indikerte at aktivering av PI3K-AKT-banen forbedret både cellehastighet og direksjonalitet for Specc1l mutant MEPM-celler21. Andre MEPM-studier har også brukt ulike vekstfaktorer eller narkotikabehandlinger for å stimulere nedstrøms signalkaskader eller for å vurdere spredning22,29,30,44,45. Dermed tilbyr MEPM-baserte analyser en rask metode for å identifisere mange flere positive eller negative regulatoriske faktorer, som deretter kan valideres in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble delvis støttet av National Institutes of Health grants DE026172 (I.S.), og GM102801 (A.C.). I.S. ble også delvis støttet av Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) og Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) grant (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Developmenty HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 168 Palatogenesis Cleft gane Ganehøyde Primære mesenchymale celler Cellemigrasjon Sårreparasjon Tidsforløpavbildning Cellestrømdannelse Kollektiv cellebevegelse Koordinert cellemotilitet
Isolasjon og tidsforløpavbildning av primære mus embryonale palatale mesenchymeceller for å analysere kollektive bevegelsesattributter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter