Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering och tidsfördröjning av primära mus embryonala palatala mesenchymeceller för att analysera kollektiva rörelseattribut

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar ett protokoll för isolering och kultur av primära mus embryonala palatal mesenchymal celler för tid-förfall av avbildning av tvådimensionella (2D) tillväxt och sår-reparation analyser. Vi tillhandahåller också metodiken för analys av tidsfördröjningsavbildningsdata för att bestämma cellströmsbildning och riktningsmotilitet.

Abstract

Utvecklingen av gommen är en dynamisk process, som innebär vertikal tillväxt av bilaterala palatala hyllor bredvid tungan följt av höjd och fusion ovanför tungan. Defekter i denna process leder till gomspalt, en vanlig missbildning. Nyligen genomförda studier har visat att palatal hyllhöjd innebär en ombyggnadsprocess som omvandlar orienteringen av hyllan från en vertikal till en horisontell. Rollen av palatal hyll mesenchymal celler i denna dynamiska ombyggnad har varit svårt att studera. Time-lapse-imaging-baserade kvantitativ analys har nyligen använts för att visa att primära mus embryonala palatal mesenchymal (MEPM) celler kan självorganisera sig i en kollektiv rörelse. Kvantitativa analyser kan identifiera skillnader i mutanta MEPM celler från en mus modell med gommen höjd defekter. Detta dokument beskriver metoder för att isolera och odla MEPM celler från E13.5 embryon-specifikt för time-lapse imaging-och att bestämma olika cellulära attribut för kollektiv rörelse, inklusive åtgärder för ström bildas, form justering och uthållighet av riktning. Det hävdar att MEPM-celler kan fungera som en proxymodell för att studera rollen som palatalhylla mesenchyme under den dynamiska höjdprocessen. Dessa kvantitativa metoder kommer att göra det möjligt för utredare i kraniofacial fältet att bedöma och jämföra kollektiva rörelse attribut i kontroll och mutanta celler, vilket kommer att öka förståelsen för mesenchymal ombyggnad under palatal hyll höjd. Dessutom ger MEPM-celler en sällsynt mesenchymal cellmodell för undersökning av kollektiva cellrörelser i allmänhet.

Introduction

Gomutveckling har studerats i stor utsträckning eftersom defekter i palatogenesis leder till gomspalt- en vanlig fosterskada som uppstår i isolerade fall eller som en del av hundratals syndrom1,2. Utvecklingen av den embryonala gommen är en dynamisk process som innebär rörelse och fusion av embryonal vävnad. Denna process kan delas in i fyra stora steg: 1) induktion av palatala hyllor, 2) vertikal tillväxt av palatala hyllorna bredvid tungan, 3) höjden av palatalhyllorna ovanför tungan och 4) fusion av palatalhyllorna vid mitten av1,3,4. Under de senaste decennierna har många musmutanter identifierats som manifesterar gomspalt5,6,7,8. Karakterisering av dessa modeller har indikerat defekter i palatal hyll induktion, spridning, och fusion steg; Palatal hyll höjd defekter har dock varit sällsynta. Således är förståelsen av dynamiken i palatal hyllhöjd ett spännande forskningsområde.

Noggrann analys av vissa musmutanter med palatala hyllhöjdsdefekter har lett till den nuvarande modellen som visar att den mycket främre regionen i palatalhyllan verkar vända upp, medan en vertikal till horisontell rörelse eller "ombyggnad" av palatalhyllorna sker i mitten till bakre regioner i gommen1,3,4, 9,10,11. Den mediala kanten epitel av palatalhyllan initierar sannolikt den signalering som krävs för denna ombyggnad, som sedan drivs av palatalhylla mesenchyme. Nyligen har många forskare identifierat palatal hyllhöjdsfördröjning i musmodeller som visade övergående orala vidhäftningar med palatalahyllor 12,13. Den mesenkymala ombyggnaden innebär omorganisering av cellerna för att skapa en utbuktning i horisontell riktning, samtidigt som den drar tillbaka palatalhyllan i vertikal riktning9,10,14. Bland de flera mekanismer som föreslås påverka palatalhylla höjd och den underliggande mesenkymala ombyggnad är cellproliferation15,16,17, chemotactic gradienter18och extracellulära matriskomponenter19,20. En viktig fråga uppstod: är palatalhylla höjd försening observeras i Specc1l-bristfälligamöss också delvis på grund av en defekt i palatalhyllan ombyggnad, och kan denna ombyggnad defekt manifestera i en inneboende defekt i beteendet hos primära MEPM celler21?

Primära MEPM-celler har använts inom kraniofacialområdet för många studier med genuttryck22,23,24,25,26,27,28,29och några som involverar spridning30,31 och migration25,31,32 , men ingen för analys av kollektivt cellbeteende. Time-lapse imaging av MEPM-celler utfördes i 2D-odling och sårreparationsanalyser för att visa att MEPM-celler visade riktningsrörelse och bildade densitetsberoende cellströmmar-attribut för kollektiv rörelse21. Dessutom bildade Specc1l mutanta celler smalare cellströmmar och visade mycket varierande cellmigreringsbanor. Denna brist på samordnad motilitet anses bidra till gommens höjdfördröjning i Specc1l mutanta embryon13,21. Således kan dessa relativt enkla analyser med primära MEPM-celler fungera som en proxy för att studera mesenchymal ombyggnad under palatal hyllhöjd. Detta dokument beskriver isolering och kultur av primära MEPM celler, liksom tidsfördröjning imaging och analys, för 2D och sår-reparation analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes med ett protokoll som godkänts av KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, i enlighet med deras riktlinjer och förordningar (protokollnummer: 2018-2447).

1. Skörda E13.5 embryon

  1. Avliva dräktiga honmöss med hjälp av en co2-inhalationskammare eller genom ett förfarande som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee. Fortsätt omedelbart till dissekering.
  2. Exponera den sämre halvan av bukhålan genom att ta bort huden och bukhinnan. Punkt punkt båda livmoderns horn, som innehåller E13.5 embryon.
  3. Placera kort livmodern i förvarnad 37 °C steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att skölja bort överflödigt blod, hår eller annat skräp. Placera livmodern i en steril 10 cm skål fylld med steril PBS.
  4. Använd en liten sax, skär genom livmoderväggen längs livmoderns längd för att exponera varje embryo, fortfarande i äggula säcken. Ta bort äggulasäcken som omger embryot, men spara det för genotypning, om det behövs. När embryona avlägsnas, placera varje embryo i sin egen brunn av en 12-brunnsplatta fylld med PBS.

2. Dissekering av palatala hyllor från embryon(figur 1)

OBS: Sterilisera dissektionsinstrumenten av rostfritt stål (se materialtabellen)efter bearbetning av varje embryo genom att först placera instrumenten i en bägare med 100% etylalkohol (EtOH), sedan i en instrumentsterilisering vid 350 °C i 10 s och sedan kyla dem i en andra bägare på 100% EtOH.

  1. Använd en steriliserad perforerad sked och placera embryot i en ny 10 cm skål fylld med MEPM-odlingsmedium bestående av Dulbeccos minsta väsentliga medium (DMEM) som innehåller 10% fetalt bovinserum (FBS), L-glutamin (4 mM L-Glu) och antibiotika-penicillin och streptomycin (50 enheter/ml).
  2. Halshugga embryot precis under käklinjen med steril sax (figur 1A, röd prickad linje). Ta bort underkäken genom att sätta in en punkt av de steriliserade fina # 5 tångarna i munnen och hålla den precis innanför kinden. Tryck igenom punkten på de insatta tångarna tills den lämnar ut baksidan av skallen.
  3. Orientera tången, längs den gula linjen i figur 1B, så att den andra sidan av tången (som fortfarande är utanför embryot) svävar strax över öronkanalen och nyp sedan tången för att skära vävnaden. Om det behövs, kör ytterligare en fin tång längs sömmen på de nu stängda tångarna för att skära igenom någon vävnad som inte var helt avskuren av nypan.
  4. Upprepa föregående steg för den andra sidan av embryohuvudet. Fortsätt nyp-skär proceduren för att helt ta bort underkäken, tungan och underlägsna delen av skallen och exponera palatala hyllorna.
  5. Ta bort skallens kranium genom att skära precis ovanför ögonen, som visas i figur 1C (grön linje). Gör detta genom att placera huvudet på vänster eller höger sida och placera punkterna på den lilla saxen i rostfritt stål framför och bakom skallen strax ovanför embryots ögonnivå. Skär av toppen av skallen med ett snabbt klipp på saxen, vilket skapar en plan yta som kommer att vara viktig för stabiliteten i senare steg och som ska se ut som figur 1D när den ses från sidan.
  6. Placera den återstående delen av huvudet upp och ner, med den överlägsna aspekten av huvudet (kraniet borttaget) som vilar platt på botten av skålen, vilket ger en stabil yta för palatal hyllborttagning. Ta en stund att identifiera palatala hyllor, som nu är exponerade och vända uppåt och kommer att visas som två upphöjda åsar på vardera sidan av ett centralt spår i den främre halvan av huvudet (figur 1E).
  7. Fäst den återstående delen av huvudet på skålen för att immobilisera den medan hyllorna tas bort. Gör detta genom att sätta in en punkt av en fin tång genom vävnaden nära huvudets nasala region, främre till palatalhyllorna, och sätt in den andra punkten på tången genom skallens botten, bakre till palatalhyllorna. Håll dessa på plats medan du utför excisionen av palatala hyllorna.
    1. Immobilisera huvudet med en hand, välj någon av de två hyllorna för att ta bort först och sätt in båda punkterna i ett andra par fina tångar i vävnaden vid basen av hyllans sidoyta och nypa för att skära vävnaden (figur 1F). Upprepa detta längs basen av hyllans mediala yta och sedan vid både hyllans främre och bakre ändar för att lossna från huvudet.
  8. Lyft försiktigt hyllan och gör ytterligare nypor, efter behov, för att helt frigöra hyllan från den omgivande vävnaden.
  9. Upprepa de två föregående stegen för att ta bort den andra palatala hyllan.
  10. Med palatalhyllorna nu befriade från den omgivande vävnaden och placerade i PBS (figur G), använd en steril plastlampa överföringspipett för att dra upp hyllorna i pipetten och överföra dem till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör tillsammans med cirka 500 μL PBS. Håll rören som innehåller palatalhyllor på is eftersom resten av kullen bearbetas på samma sätt.
    OBS: Alternativt kan hyllor placeras i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör som innehåller förvarnad trypsin (0,25%) omedelbart efter dissekering (i stället för att placera dem på is). Proverna kommer att vara färskare, men alla åtgärder för varje enskilt prov måste iakttas i tid i stället för att behandla proverna kollektivt.

3. Kultur av MEPM-celler

OBS: Under de förhållanden som beskrivs här överlever gommen epitelceller inte den första passagen, vilket resulterar i en ren gommen mesenkymal cell kultur. Använd steril teknik för att utföra alla steg i en mjukpapperskulturhuv.

  1. Aspirera och kassera PBS från 1,5 ml-röret, var försiktig så att du inte kasserar hyllorna i processen. Tillsätt omedelbart 200 μL förvarnad (37 °C) trypsin (0,25%) till varje rör som innehåller palatala hyllor. Rör hyllorna en kort stund upp och ner i trypsin med hjälp av en pipettspets på 1000 μL för att påskynda trypsiniseringen.
  2. Inkubera rören i 5 min vid 37 °C och rör sedan varje prov upp och ner igen för att hjälpa till att bryta upp vävnaden. Inkubera rören i ytterligare 5 min vid 37 °C och rör upp och ner igen för att slutföra dissociationen av vävnaden.
    OBS: Hyllorna måste vara helt eller nästan helt dissocierade och upphängda i trypsin utan synliga bitar av vävnad kvar.
  3. Tillsätt 800 μL MEPM-odlingsmedium (steg 2.1) till varje 1,5 ml rör. Centrifugera 1,5 ml-röret vid 200 × g i 5 min för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml MEPM-odlingsmedium.
  4. Plätera MEPM-cellerna till en 6-väl vävnadskulturbehandlad platta som innehåller MEPM-odlingsmedium. Låt cellerna fästa vid plastytan i 12 timmar vid 37 °C i en inkubator med 5% CO2.
    OBS: Efter inkubation över natten kommer de allra flesta (~ 90%) av cellerna att fästa. Vid denna tidpunkt kommer de vidhäftade cellerna att se ganska homogena ut, med en triangulär eller något långsträckt form.
  5. Byt medium varje dag genom att försiktigt aspirera det gamla mediet och omedelbart ersätta det med 1 ml varm steril PBS utan kalcium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirera PBS och ersätt med 3 ml förvarnat MEPM-odlingsmedium.
  6. Passage cellerna när de blir 100% sammanflöde.
    OBS: MEPM-celler bör spridas genom att fördubblas i antal nästan dagligen.
    1. För att passage cellerna, aspirera försiktigt det gamla mediet och omedelbart ersätta det med varm PBS utan kalcium eller magnesium i ~ 1 min. Aspirera PBS och ersätt den med 0,5 ml förvarnad 0,25% trypsin.
    2. Inkubera vid 37 °C i ~5 min, eller tills cellerna lossnar från skålens yta när de försiktigt vaggas fram och tillbaka för hand. När cellerna har lossnat, tillsätt omedelbart 5 ml förvarnat MEPM-odlingsmedium till de trypsiniserade cellerna.
    3. Använd en 10 mL serologisk pipet, samla försiktigt cellerna i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera röret vid 200 × g i 5 min för att pelletera cellerna. Aspirera trypsin och medium, och återanvänd cellerna i 3 ml förvarnad MEPM kulturmedium. Rör försiktigt 1 ml celler i en enda brunn av en 6-väl skål och tillsätt 2 ml MEPM-odlingsmedium för att få den totala volymen till 3 ml.
      OBS: Detta utgör en 1:3 uppdelning av celler. Parlamentsledamöterna får passeras upp till tre gånger. Såddtätheten hos parlamentsledamöter är något flexibel, och antalet celler som finns varierar beroende på odlingskärlet. Parlamentsledamöternas ledamöter förökar sig dock inte ordentligt när de delas för glest och bör vara minst 20-25 procent sammanflöde i sin nya maträtt när de väl har anslutit sig.

4. Cryopreservation av MEPM-celler

  1. När trypsiniserade MEPM-celler har pelleterats, återanvänd cellerna i MEPM-odlingsmedium för att få en koncentration av ~ 1 × 106 celler/ ml. Pipettera cellerna i kryovialer och tillsätt en slutlig koncentration på 5% dimetylsulfoxid i cellbeståndet. Kapa kryovialen, blanda kort genom invertering och placera omedelbart injektionsflaskan i en frysbehållare som svalnar med en hastighet av 1 °C/min.
  2. Placera kylaren i en frys på -80 °C över natten. På nästa dag flyttar du kryovialerna till en flytande kvävetank för långsiktig lagring.
  3. Tinande kryopreserverade MEPM-celler
    1. Ta bort kryovialerna från den flytande kvävetanken och tina vid rumstemperatur tills innehållet börjar bli flytande. Töm innehållet i ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 9 ml förvarnat MEPM-odlingsmedium.
    2. Centrifugera röret vid 200 × g för att pelletera cellerna. Resuspend cellerna i 1 mL MEPM kulturmedium, och pipet cellerna i en enda brunn av en 6-väl platta. Tillsätt 2 ml varmt MEPM-odlingsmedium för att få den totala volymen till 3 ml.
    3. Odla cellerna vid 37 °C i en inkubator med 5% CO2. Byt medium dagligen.

5. Live-imaging av MEPM-celler - 2D-kollektiv migrationsanalys (figur 2)

  1. Förbered en platta som ska användas för live-avbildning.
    1. Använd en liten kirurgisk sax eller en vass skalpell för att förkorta ett sterilt 2-väl silikoninsats till en höjd av ~1 mm. Förbered en insats för varje prov som används.
    2. Använd tång, placera den förkortade 2-brunn silikoninsatsen i mitten av en brunn på en 6-välplatta. Tryck ner längs alla kanter för att säkerställa att den är helt fastsatt.
  2. Tina kryopreserverade celler genom att följa stegen i avsnitt 4.3 i detta protokoll. Räkna MEPM-celler och frö 300 celler/mm2 av de förkortade silikoninsatserna i en total volym på 40-50 μL MEPM-odlingsmedium per brunn. Odla cellerna över natten vid 37 °C i en inkubator med 5% CO2.
  3. Nästa dag förbereder du dig för live time-lapse imaging.
    1. Använd ett faskontrastmikroskop med en inkubator på scenen och automatisk avbildningskapacitet. Tillsätt vatten till inkubatorreservoaren på scenen för att minska avdunstningen av odlingsmediet; ställ in temperaturen till 37 °C och CO2 till 5 %. Låt ~30 min för luftfuktigheten att byggas upp innan du placerar 6-brunnsfatet i inkubatorn på scenen.
  4. Använd inställningar som motsvarar följande för avbildning av tidsfördröjning.
    1. Välj 4x-målet om du vill ha stora synfält och faskontrastfilter.
      Autofokus, Auto find sample, z-stack och auto-lighting är vanligtvis inte nödvändiga.
    2. Välj två mikroskopiska fält per brunn för att fånga lumen i de förkortade silikoninsatserna. Se till att alla bildpositioner har rätt fokus.
      OBS: Bildplan kan justeras under avbildning, men en sådan justering är vanligtvis inte nödvändig.
    3. Välj önskad filtyp för bildutmatning och välj eller avmarkera alternativ efter avbildning, till exempel automatisk videoskapande och vattenstämplar, efter önskemål. Om tillämpligt väljer du faskontrast som bildläge.
      OBS: Användning av vattenstämplar kan hindra efterföljande bildbehandlingssteg.
    4. Ställ in inspelningens varaktighet till 72 timmar. Ställ in programmet för att ta bilder var 10: e minut.
      OBS: Vanligtvis krävs endast 48 timmar avbildning, men avbildning kan stoppas när som helst före 72-timmarsmarkeringen utan att förlora bilder som redan har tagits.
    5. Se till att miljökammaren är i drift enligt 5.3.1. Spara dessa inställningar (rutinen) och börja avbildning.
  5. Fortsätt avbildningen till 72 timmar (eller angiven tid).

6. Live-imaging av MEPM-celler i en sårreparationsanalys(figur 3)

  1. Förbered en platta som ska användas för live-imaging. Använd tång, placera en steril 2-väl silikoninsats i mitten av en brunn på en 6-brunnsplatta och tryck ner längs alla kanter för att säkerställa att den är helt fastsatt. Förbered en 2-brunnsinsats för varje prov som används.
  2. Tina kryopreserverade celler genom att följa stegen i avsnitt 4.3 i detta protokoll. Räkna MEPM-celler och koncentrera vid behov cellerna till minst 350 celler/μL.
  3. Frö 1400 celler/mm2 i silikoninsatserna i en volym av 100 μL MEPM-odlingsmedium per brunn. Odla cellerna i 48 timmar vid 37 °C i en inkubator med 5% CO2, och byt medium varje dag.
  4. Efter 48 timmar förbereda ett mikroskop för levande tidsfördröjning som beskrivs i avsnitten 5.3 och 5.4. Omedelbart innan du placerar cellerna i inkubatorn på scenen, tillsätt 3 ml förvarnat MEPM-odlingsmedium till brunnen (men utanför skären) och ta sedan försiktigt bort silikoninsatserna.
    OBS: Väggen som skiljer de 2 kamrarna lämnar ett mellanrum som är "såret".
  5. Starta avbildning av tidsfördröjning enligt beskrivningen i 5.4, med följande skillnader:
    1. Använd ett högre förstoringsmål (t.ex. 10x). För att fånga sårstängningen väljer du 5 synfält längs varje sår, så att såret är parallellt med bildens vertikala axel.
  6. Sluta avbilda efter 72 timmar eller när såren är helt stängda.

7. Beräkningsanalys av bildsekvenser för tidsfördröjning

OBS: Utför följande procedurer på en dator som är utrustad med standardberäkningsverktyg, till exempel pythontolken, C-kompilatorn och ett skal (se tabellen över material).

  1. Analys av sammanflöde
    OBS: Denna procedur kan användas för att uppskatta cellproliferation inom en gles kultur eller för att kvantifiera sår stängning experiment. För att identifiera områden som upptas av celler tillämpas ett segmenteringströskel på den lokala standardavvikelsen för bildens ljusstyrka. Koden har tidigare beskrivits av Wu et al.33 och Neufeld et al.34 och finns på http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Bestäm segmenteringströskeln för bilderna. Om du till exempel vill se segmenteringen med ett tröskelvärde 4 utfärdar du kommandot
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -testutgång.jpg
      och kontrollera sedan utdata(utdata.jpg).
      OBS: Om tröskelvärdet är för lågt klassificeras bakgrundsområden i mikrografen som celltäckta. Om tröskelvärdet däremot är för högt klassificeras inte celltäckta områden som sådana. Det optimala tröskelvärdet håller båda felen på ett minimum.
    2. Använd det angivna area.sh-skriptet för att beräkna sammanflödesvärden för en sekvens av bilder som
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > sammanflöde.dat
      OBS: Tröskelvärdet för diskriminering 4 verifieras i steg 1 och resultaten lagras i filkonfluensen.dat. Genom att sortera bilderna i lämpliga mappar kan listan med bildfilnamn ersättas med jokertecken:
      area.sh -S4 *.jpg > sammanflöde.dat
    3. För sårförslutningsexperiment omvandlar du sammanflödesdata A(t)– storleken på det celltäckta området uttryckt i procent som en funktion av tid till sårkantsutbredningshastighet V som
      Equation 1
      där w anger fältets bredd och dA/dt är tidsderivatet för A(t), dvs. expansionshastigheten för det celltäckta området.
  2. Karta över cellmotilitet
    1. Kör en PIV-algoritm (particle image velocimetry) för att karakterisera cellmotilitet och extrahera omfattningen av lokal rörelse "optiskt flöde" mellan bildpar, men inte för att identifiera enskilda celler.
      OBS: Här används en ursprunglig fönsterstorlek på 50 μm, som beskrivs i detalj av Zamir et al.35 och Czirok et al.36, med en initial fönsterstorlek på 50 μm. PIV-analysen ger ett hastighetsfält v(x,t) för varje bildram t och plats (inom bilden) x.
    2. Extrahera den genomsnittliga hastigheten för cellmotilitet från v(x,t) som ett rumsligt medelvärde beräknat över det cellbebodda området, enligt punkt 7.1.
  3. Manuell cellspårning
    OBS: Medan PIV-analysen ger en automatisk bedömning av cellmotilitet, kräver det ofta manuell spårning för att fokusera på enskilda cellers beteende. Flera verktyg ger den här funktionen, men det är till stor hjälp om de manuellt placerade markörerna kan ändras efter den första placeringen och om spårning kan utföras både framåt och bakåt i tiden.
    1. Utför cellspårning med ett specialutvecklat python-verktyg (http://github.com/donnagreta/cm_track), som också tillhandahåller grundläggande redigeringsfunktioner som att ta bort bansegment.
      OBS: Det här manuella spårningsverktyget ger positionerna P(i,t) för cell i vid tidpunkten t i en textfil och anropas som
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      där tidsfördröjningsbilderna finns i mappbilderna/ och positionsdata samlas in i filspåret.dat (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Analys av enskilda cellbanor. (A) Faskontrasttidsfördröjningsmikrografer utsätts för (B, C) en manuell spårningsprocedur som markerar celler (gröna prickar). ( D) Cellpositioner (x,y) lagras för varje cell som utmärks av dess ID och för varje bildruta f. (E) Banor kan läggas över på mikrograferna och färgkodas för att ange tidsinformation. I varje bana anger till exempel en blå till röd färgpalett gradvis senare bansegment, med rött och blått som markerar de ursprungliga respektive sista cellplatserna. (F) Olika statistiska egenskaper hos banor, såsom den genomsnittliga kvadratförskjutningen, kan extraheras och användas för att karakterisera motiliteten hos olika cellpopulationer, som i detta exempel inkluderar wildtype (wt, blue) och knockdown (kd, röd) MEPM-celler. Scalebars representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Överläggsbanor på bilder med ett andra verktyg, som
    visdat.py -d spåra.dat -i images/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2
  2. Samla in bilderna med banorna överdragna i mappöverlägget.
    I det här exemplet lagras cellpositionsdata i filspåret.dat, medan bildsekvensen för tidsfördröjning finns i mappbilderna. Resten av parametrarna styr den maximala längden på de ritade banorna (-l), storleken på symbolerna (-r) och det färgschema (-C) som används.
  1. Analys av enskilda cellbanor
    1. Karakterisera banor med den totala banlängden
      Equation 2,
      och nätförskjutning mot såret
      Equation 3,
      Där X betecknar projektionen av P i den riktning som är vinkelrät mot såret: x-koordinaten för positionerna när såret är parallellt med y-axeln.
    2. Beräkna vägledningseffektiviteten som Equation 4 för varje cell i och punkt t37. Karakterisera kulturer av befolkningsgenomsnittet av dessa encellsmått, utvärderade vid en lämplig tidpunkt t.
  2. Kollektiv strömningsrörelse av celler
    1. Karakterisera de lokala rumsliga korrelationerna av cellrörelser med medelhastigheten för andra celler som är i närheten av en rörlig cell, som beskrivits tidigare38,39.
      BERÄKNINGSkoden är tillgänglig på https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Justera ett referenssystem med riktningarna fram, bak, vänster och höger mot varje vektor v(x,t) (bild 5A). Tilldela var och en av den omgivande cellen eller PIV-hastighetsvektorn till referenssystemets lämpliga rumsliga cell (figur 5B). Upprepa proceduren eftersom varje vektor fungerar som referenssystemens ursprung (figur 5C,D) så att en given hastighetsvektor tilldelas flera lagerplatser.
        EN datapunkt kan finnas framför en vektor och till vänster om en annan.
      2. Rotera referenssystemen i en gemensam orientering (figur 5C, F) och slå samman dem ( figur5G).
        OBS: Medelvärdet för varje lagerplats i de poolade hastighetsdata är en hastighetsvektor (U) som indikerar rumslig korrelation: medelvärdet är ett mått på en delad hastighetskomponent (figur 5H).
      3. Montera flödesfälten U(x) med en exponentiell funktion Equation 5 , där a, x0 och U0 passar parametrar. Av de tre passande parametrarna, fokusera på x0, korrelationslängden (figur 5I, J), som är det karakteristiska avståndet där lokala hastighetshastighetskorresteringar försvinner.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering av strömbildning av odlade celler. För varje rörlig cell justerades en referensram (blå) och rumsliga lagerplatser (vita) för att kategorisera intilliggande celler som i främre, bakre, vänstra eller högra. (B,E) Hastigheten på angränsande celler (svarta vektorer) var relaterad till samma referensram (C,F). Denna procedur upprepades för varje cell och tidspunkt. (G) Efter att ha samlat denna lokala information kommer varje behållare att innehålla flera hastighetsvektorer (grå), som kan beräknas för att bestämma den genomsnittliga co-moving-hastigheten (magentapilar) på olika platser i förhållande till en genomsnittlig motil cell. (H) Den genomsnittliga hastighetskartan kännetecknar således de typiska cellhastigheterna på olika platser i förhållande till en rörlig cell. (I,J) Slutligen samplades detta fält längs den främre bakre (parallella) axeln och även längs den vänster-högra (vinkelräta) axeln. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dissekeringen av palatala hyllor illustreras i figur 1. Sekvensen av snitt är utformad för att minimera glidning av vävnaden. Efter avlägsnandet av huvudet (figur 1A,B)avlägsnas underkäken (figur 1B,C). Snittet i huvudets övre del (figur 1C,D) görs för att stabilisera vävnaden när den placeras upp och ner ( figur1E) för att visualisera (figur 1E,prickade linjer), nypa ( figur1F)och punktskatt (figur 1G) palatalhyllorna.

Det strukna palatala hyllparet från ett enda embryo är trypsiniserat och odlat i en 35 mm maträtt eller i en brunn av en 6-väl maträtt. Större rätter är inte att föredra eftersom celltätheten är för låg för optimal tillväxt. Vid sammanflöde trypsiniseras cellerna från varje brunn och passages i tre 35 mm-likvärdiga brunnar (passage #1). Konfluenta celler från passage #1 kan sedan frysas ner till alikvoter på 1 × 106 celler/ml. Frysta alikvoter tas därefter upp i en 35 mm motsvarande maträtt och odlas för att sammanfäta. Cellerna trypsiniseras sedan (passage #2) och sås enligt experimentet. Att skapa och använda frysta alikvoter hjälpte till att normalisera förhållandena, särskilt med avseende på celltäthet. Användningen av färska MEPM-celler resulterade i mer variabilitet i den slutliga celltätheten i experiment, vilket tros bero på en varierande andel livskraftiga eller sub-viable celler i färska kulturer. Dessutom var antalet MEPM-cellpassager strikt begränsat till två (listade ovan) för dessa experiment.

Med tanke på att a) celltätheten var kritisk, b) MEPM-celler från ett enda embryo var begränsade, och c) bildoptik var bättre i en stor maträtt, användes 2-brunns silikoninsatser(figur 2 och figur 3). För sårreparationsanalyser odlades MEPM-celler i 2-brunns silikoninsatserna tills hög sammanflöde, sedan togs skären bort och såret avbildades fram till stängning(figur 3). Men för 2D-kulturen behövde MEPM-cellerna avbildning när de växte, så 2-brunns silikoninsatserna trimmades helt enkelt till 1/3rd av deras höjd för att möjliggöra tydlig avbildning(figur 2C). Små 3D-printade ringar40 i 35 mm rätter användes också för 2D-motilitetsanalys(figur 2D).

MEPM-banor(figur 4E) är ihållande: cellmotilitetens riktning bibehålls i flera timmar. Den genomsnittliga förskjutningen kontra tidsanalysen (figur 4F) anger att persistensen i form av förskjutning är proportionell med förfluten tid. Den typiska hastigheten hos MEPM-celler på vävnadskulturens plastyta, 10 μm/h, kan också användas för kvalitetskontroll av cellkulturen. Flödesanalys av motilitetsdata visar att de co-moving klustren av MEPM-celler är ~ 300 μm i storlek (figur 5I, J). De representativa resultaten indikerar också en djupgående motility skillnad mellan vilda och mutanta MEPM celler. Förutom vildtyp och mutant jämförelse, både 2D och sårreparation analyser kan kombineras med olika biokemiska behandlingar. Till exempel har PI3K-AKT-vägar aktiverats med MEPM-celler, som beskrivits tidigare 21.

Figure 1
Figur 1: Dissekering av embryonala palatala hyllor för att isolera mesenkymala celler. (A) Ett E13,5 musembryonhuvud avlägsnas genom att skära längs nacken (röd linje). (B) Därefter avlägsnas underkäken och tungan med snitt längs munhålan, mellan övre och nedre käftarna (gul linje). (C) För att stabilisera vävnaden för palatal hyllborttagning är toppen av huvudet struken (grön linje). (D) Den resulterande dissekerade övre käftregionen placeras (E) upp och ner för att visualisera palatala hyllorna (svarta prickade linjer). (F) Excisionen av enskilda palatala hyllor avbildas schematiskt, där enskilda utskjutande hyllor (gula) kläms av från överkäken (blå). ( G) Strukna par palatalhyllor från ett enda embryo, som sedan kan trypsiniseras och odlas i en 35 mm skål eller i en 6-väl tallrik. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Experimentell installation av 2D MEPM-cellkultur. (A) Tina en frusen alikvot MEPM-celler och (B) odla cellerna i en 35 mm skål eller en 6-välplatta. När du konfluent, trypsinize cellerna och så dem enligt beskrivningen i protokollet i en 35 mm skål antingen med (C) 2-brunn silikoninsatser som har trimmats eller (D) med 3D-utskrivna ringar. Ett litet odlingsutrymme minimerar behovet av ett stort antal MEPM-celler. Den låga profilen på de trimmade silikoninsatserna eller de 3D-utskrivna ringarna möjliggör direkt avbildning utan haloeffekt. Tidsfördröjning kan fortsätta tills önskad celltäthet uppnås, vilket kan vara upp till 72 h. Representativa bilder visas vid (E) 0 h, (F) 24 h och (G) 45 h timepoints. Bilderna togs med ett 4x-mål. Skalfälten för E, F, G = 300 μm. Förkortningar: 2D = tvådimensionell; MEPM = mus embryonal palatal mesenchyme; 3D = tredimensionell. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Experimentell inställning av sårförslutningsanalys med MEPM-celler. a)Tina upp en frusen alikvot MEPM-celler och (B)odlingsceller i en 35 mm skål eller en 6-välplatta. När du konfluent, trypsinize cellerna och (C) så dem i 2-brunn silikoninsatser i en 35 mm skål. Odla cellerna i insatsen tills önskad sammanflöde uppnås (~ 48 h), ta sedan bort silikoninsatsen och bilden. Representativa bilder visas (D) omedelbart efter avlägsnande av insatsen, (E) efter 24 timmar och (F) efter 40 timmar. Sårstängning tar cirka 36 timmar. Bilderna togs med ett 10x-mål. Scalebaren representerar 300 μm. Förkortningar: MEPM = mus embryonal palatal mesenchyme. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Palatal hylla höjd utgör en vertikal till horisontell ombyggnad händelse1,3,4,9,11. Det är postulerat att denna ombyggnadsprocess kräver palatal hyll mesenchymal celler att bete sig samordnat. Analyserna med MEPM-celler av vildtyp visar att cellbeteendet är inneboende och kan mängderas21. Således kan dessa analyser användas för att avslöja primära palatala hyllhöjning defekter i nya och befintliga mus modeller av klyka gommen. De metoder som beskrivs i avsnitten 1 och 2 bör göra det möjligt för utredare att isolera, odla och frysa alikvoter av primära MEPM-celler. Dessa celler kan sedan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive 2D-kulturen och sårreparationsanalyser som beskrivs här. 2D-kulturen, i kombination med timelapse-avbildning, presenterar en enkel metod för att bestämma grundläggande cellattribut över ett intervall av celltätheter. Presenteras här är en metod för att bedöma celljustering och cellströmsbildning, som är attribut för kollektiv cellrörelse (figur 4). Sårförslutningsanalyser används ofta för att bedöma cellmigration41,42,43. Den cellfria regionen i "såret" ger en signal för riktningsrörelser av celler i periferin. Time-lapse imaging av denna process tillät bestämning och bedömning av cellbanor under migrering. Dessa cellbanor bestämmer i sin tur cellens migrationshastighet och riktning(figur 5).

Det är viktigt att först optimera villkoren för kultur och analyser med endast mepm-celler av vildtyp. Efter att palatalhyllorna framgångsrikt har provats och den resulterande encelliga suspensionen pläterats över natten, kommer de allra flesta (~ 90%) av cellerna lätt att fästa på skålens tillväxtyta. Om cellerna inte lätt klibbar, kan det vara något fel med kulturförhållandena. Ursprungligen kommer de vidhäftade cellerna att se ganska homogena ut, med en triangulär eller något långsträckt form, men när de växer till en hög densitet blir de mer spindelformade och långsträckta (figur 2). Om cellerna blir dramatiskt stora i storlek eller multinukleära, bör de inte användas för experiment. Denna optimering kommer också att fastställa grundläggande wildtype parametrar för framgångsrik tillväxt (tid att sammanflöde) och sårreparation (tid till stängning). Cellerna ska föröka sig genom att fördubbla antalet nästan dagligen och i tidsfördröjningsbilder, visa motilitet på ~5-10 μm/h. På samma sätt, om i något efterföljande experiment som involverar en wildtype-mutant jämförelse, dessa grundläggande parametrar inte uppfylls av vilda typ celler, kan experimentet behöva uteslutas från analys. Till exempel tar wildtype MEPM-celler 36-40 h för att helt stänga såret med 2-brunns silikoninsatserna. Om det i ett experiment tar betydligt längre tid än 40 timmar att stänga såret, skulle hela experimentet vara misstänkt. Dålig prestanda från MEPM-celler kan bero på 1) dålig fryst alikvotkvalitet, 2) dålig väckelse eller 3) överdriven differentiering. Differentierade eller senescenta celler kan detekteras visuellt eftersom de växer mycket stora och inte delar sig. En kultur med ett stort antal sådana celler bör undvikas. I allmänhet bör det inte finnas några onormala celler i synfältet för ett 10x-mål(figur 3); en cell eller två utanför synfältet bör inte väsentligt påverka analysen. Att begränsa analysen till endast två cellpassager (ovan) bidrar i hög grad till att upprätthålla kvaliteten på MEPM-celler.

För både 2D-kulturen och sårreparationsanalyser med primära MEPM-celler var det viktigaste kravet för framgång en hög initial celltäthet. Detta krav fastställdes först under optimering av sårreparationsanalys där celler såddes vid >1400 celler/mm2. Densiteten hos celler som migrerar in i såret användes sedan som sådddensitet i 2D-odlingsanalyser. En såddtäthet på ~300 celler/mm2 bildade cellströmmar, samtidigt som den möjliggör automatiserad analys av cellbanor. Densiteter högre än 300 celler/mm2 tenderar att bilda mer levande strömmar som kan visualiseras med ögat, men gör individuell cellspårning svår. Vid jämförelse av primära MEPM-celler från vilda och mutanta embryon, även om sår-stängning dröjsmål kan bedömas utan beräkningsanalys, kan strömbildning och riktningsskillnader inte urskiljas med ögat. Om celltätheten är för hög eller bildkvaliteten är dålig/suddig, till exempel på grund av fokusförlust, kan automatiserad cellspårning vara svår. I ett sådant fall är det möjligt att använda manuell cellspårning för att bestämma cellbanor i sårreparationsanalyser med ImageJ. En mycket låg koncentration av Hoechst kärnfläck (3 μL/ml 20 mM lösning i MEPM-odlingsmedium) kan också användas för att underlätta cellspårning. Fluorescerande lasertoxicitet kan dock vara ett problem med utökad användning.

För manuell spårning var det lättare att spåra celler i omvänd ordning från slutet av sårstängningen bakåt så långt som möjligt tills hög celltäthet dolde ytterligare spårning. Även partiella cellbanor, när de kombinerades för en cellpopulation, var informativa. I motsats till sårreparationsanalyser krävs automatiserad cellspårning för 2D-cellodlingsanalys, vilket är en anledning till att mellanliggande celltätheter valdes. Slutligen kan känsliga primära MEPM-baserade analyser användas för att identifiera föreningar och vägar som kan påverka gommens höjd. Tidigare studier visade att aktiveringen av PI3K-AKT-vägen förbättrade både cellhastighet och riktning av Specc1l mutanta MEPM-celler21. Andra MEPM-studier har också använt olika tillväxtfaktorer eller läkemedelsbehandlingar för att stimulera nedströms signalkaskader eller för att bedöma spridning22,29,30,44,45. Mepm-baserade analyser erbjuder således en snabb metod för att identifiera många fler positiva eller negativa regulatoriska faktorer, som sedan kan valideras in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt stöddes delvis av National Institutes of Health grants DE026172 (I.S.) och GM102801 (A.C.). I.S. stöddes också delvis av Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) och Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 168 Palatogenesis Cleft gom Gomhöjd Primära mesenkymala celler Cellmigrering Sårreparation Tidsfördröjning Cellströmsbildning Kollektiv cellrörelse Coordinated cellmotilitet
Isolering och tidsfördröjning av primära mus embryonala palatala mesenchymeceller för att analysera kollektiva rörelseattribut
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, … More

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter