Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die Isolierung und Kultur von primären embryonalen palatalen mesenchymalen Zellen der Maus für die Zeitraffer-Bildgebung von zweidimensionalen (2D) Wachstums- und Wundreparaturassays. Wir stellen auch die Methodik für die Analyse der Zeitraffer-Bildgebungsdaten zur Verfügung, um die Zellstrombildung und die Richtungsmotilität zu bestimmen.
Abstract
Die Entwicklung des Gaumens ist ein dynamischer Prozess, der ein vertikales Wachstum der bilateralen Gaumenregale neben der Zunge beinhaltet, gefolgt von einer Erhöhung und Fusion über der Zunge. Defekte in diesem Prozess führen zu Gaumenspalten, einem häufigen Geburtsfehler. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Palatal-Regalerhöhung einen Umbauprozess beinhaltet, der die Ausrichtung des Regals von einer vertikalen in eine horizontale transformiert. Die Rolle der mesenchymalen Zellen des palatalen Regals bei diesem dynamischen Umbau war schwer zu untersuchen. Die auf Zeitraffer-Bildgebung basierende quantitative Analyse wurde kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass sich primäre embryonale palatale mesenchymale (MEPM) Zellen der Maus selbst zu einer kollektiven Bewegung organisieren können. Quantitative Analysen konnten Unterschiede in mutierten MEPM-Zellen aus einem Mausmodell mit Gaumenerhöhungsdefekten identifizieren. Dieses Papier beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultivierung von MEPM-Zellen aus E13,5-Embryonen - speziell für die Zeitraffer-Bildgebung - und zur Bestimmung verschiedener zellulärer Attribute kollektiver Bewegung, einschließlich Messungen für die Strömungsbildung, Formausrichtung und Persistenz der Richtung. Es postuliert, dass MEPM-Zellen als Proxy-Modell für die Untersuchung der Rolle des palatalen Schelfmesenchyms während des dynamischen Elevationsprozesses dienen können. Diese quantitativen Methoden werden es Forschern im kraniofazialen Bereich ermöglichen, kollektive Bewegungsattribute in Kontroll- und Mutantenzellen zu bewerten und zu vergleichen, was das Verständnis des mesenchymalen Umbaus während der Palatalschellferhöhung verbessern wird. Darüber hinaus liefern MEPM-Zellen ein seltenes mesenchymales Zellmodell zur Untersuchung der kollektiven Zellbewegung im Allgemeinen.
Introduction
Die Entwicklung des Gaumens wurde ausführlich untersucht, da Defekte in der Gaumenogenese zu Gaumenspalten führen - einem häufigen Geburtsfehler, der in Einzelfällen oder als Teil von Hunderten von Syndromen auftritt1,2. Die Entwicklung des embryonalen Gaumens ist ein dynamischer Prozess, der die Bewegung und Fusion von embryonalem Gewebe beinhaltet. Dieser Prozess kann in vier Hauptschritte unterteilt werden: 1) Induktion von Palatalregalen, 2) vertikales Wachstum der Palatalregale neben der Zunge, 3) Erhöhung der Palatalregale über der Zunge und 4) Fusion der Palatalregale in der Mittellinie1,3,4. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Mausmutanten identifiziert, die Gaumenspalte5,6,7,8manifestieren. Die Charakterisierung dieser Modelle hat auf Defekte in der Induktion, Proliferation und Fusion des palatalen Regals hingewiesen; Gaumensche Regalerhöhungsfehler waren jedoch selten. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Palatal-Schelfhöhe ein faszinierendes Forschungsgebiet.
Die sorgfältige Analyse einiger Mausmutanten mit Gaumenregalhöhendefekten hat dazu geführt, dass das aktuelle Modell zeigt, dass der sehr vordere Bereich des Palatalregals nach oben zu kippen scheint, während eine vertikale bis horizontale Bewegung oder "Umgestaltung" der Gaumenregale in den mittleren bis hinteren Bereichen des Gaumens auftritt1,3,4, 9,10,11. Das mediale Randepithel des Palatalregals leitet wahrscheinlich die für diesen Umbau erforderliche Signalisierung ein, die dann vom mesenchym des palatalen Regals angetrieben wird. In jüngster Zeit haben viele Forscher eine Verzögerung der Palatal-Regalerhöhung in Mausmodellen identifiziert, die vorübergehende orale Adhäsionen mit Palatalregalen zeigten12,13. Der mesenchymale Umbau beinhaltet die Reorganisation der Zellen, um eine Ausbuchtung in horizontaler Richtung zu erzeugen, während gleichzeitig das Palatalregal in vertikaler Richtung zurückgezogen wird9,10,14. Zu den verschiedenen Mechanismen, die vorgeschlagen wurden, um die Palatal-Schelferhöhung und die zugrunde liegende mesenchymale Remodellierung zubeeinflussen,gehören die Zellproliferation15,16,17, chemotaktische Gradienten18und extrazelluläre Matrixkomponenten19,20. Es stellte sich eine wichtige Frage: Ist die bei Specc1l-defizientenMäusen beobachtete Verzögerung der palatalen Regalerhöhung auch teilweise auf einen Defekt im Palatal shelf remodeling zurückzuführen, und könnte sich dieser Remodeling-Defekt in einem intrinsischen Defekt im Verhalten primärer MEPM-Zellen manifestieren21?
Primäre MEPM-Zellen wurden im kraniofazialen Bereich für viele Studien mit Genexpression22,23,24,25,26,27,28,29und einigen wenigen mit Proliferation30,31 und Migration25,31,32 verwendet , aber keine für die kollektive Zellverhaltensanalyse. Die Zeitraffer-Bildgebung von MEPM-Zellen wurde in 2D-Kultur- und Wundreparaturassays durchgeführt, um zu zeigen, dass MEPM-Zellen gerichtete Bewegungen zeigten und dichteabhängige Zellströme-Attribute der kollektiven Bewegung bildeten21. Darüber hinaus bildeten Specc1l-mutante Zellen engere Zellströme und zeigten hochvariable Zellmigrationstrajektorien. Es wird angenommen, dass dieser Mangel an koordinierter Motilität zur Verzögerung der Gaumenerhöhung bei specc1l-mutierten Embryonenbeiträgt 13,21. Daher können diese relativ einfachen Assays unter Verwendung primärer MEPM-Zellen als Proxy für die Untersuchung des mesenchymalen Remodelings während der Erhöhung des palatalen Regals dienen. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung und Kultur von primären MEPM-Zellen sowie die Zeitraffer-Bildgebung und -Analyse für die 2D- und Wundreparaturassays.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden mit einem Protokoll durchgeführt, das vom KUMC Institutional Animal Care and Use Committee gemäß deren Richtlinien und Vorschriften (Protokollnummer: 2018-2447) genehmigt wurde.
1. Ernte E13.5 Embryonen
- Einschläfern Sie trächtige weibliche Mäuse mit einer CO 2 -Inhalationskammer oder nacheinem vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Verfahren. Fahren Sie sofort mit der Sezierung fort.
- Legen Sie die untere Hälfte der Bauchhöhle frei, indem Sie die Haut und das Peritoneum entfernen. Schneiden Sie beide Hörner der Gebärmutter aus, die die E13.5-Embryonen enthalten.
- Legen Sie die Gebärmutter kurz in vorgewärmte 37 ° C sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges Blut, Haare oder andere Ablagerungen abzuspülen. Legen Sie die Gebärmutter in eine sterile 10 cm große Schale, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
- Schneiden Sie mit einer kleinen Schere durch die Gebärmutterwand entlang der Länge der Gebärmutter, um jeden Embryo freizulegen, der sich noch in seinem Dottersack befindet. Entfernen Sie den Dottersack, der den Embryo umgibt, aber bewahren Sie ihn bei Bedarf für die Genotypisierung auf. Wenn die Embryonen entfernt werden, legen Sie jeden Embryo in einen eigenen Brunnen einer mit PBS gefüllten 12-Well-Platte.
2. Dissektion von Gaumenregalen aus Embryonen (Abbildung 1)
HINWEIS: Sterilisieren Sie die Dissektionsinstrumente aus Edelstahl (siehe Materialtabelle),nachdem Sie jeden Embryo verarbeitet haben, indem Sie die Instrumente zuerst in ein Becherglas aus 100% Ethylalkohol (EtOH), dann in einen Instrumentensterilisator bei 350 ° C für 10 s legen und dann in einem zweiten Becherglas von 100% EtOH abkühlen.
- Geben Sie den Embryo mit einem sterilisierten perforierten Löffel in eine neue 10-cm-Schale, die mit MEPM-Kulturmedium gefüllt ist, das aus Dulbeccos Minimum Essential Medium (DMEM) besteht, das 10% fötales Rinderserum (FBS), L-Glutamin (4 mM L-Glu) und die Antibiotika Penicillin und Streptomycin (50 Einheiten / ml) enthält.
- Enthaupten Sie den Embryo direkt unterhalb der Kieferlinie mit einer sterilen Schere (Abbildung 1A, rote gepunktete Linie). Entfernen Sie den Unterkiefer, indem Sie eine Stelle der sterilisierten feinen # 5 Pinzette in den Mund einführen und sie nur in der Wange halten. Drücken Sie die Spitze der eingeführten Pinzette durch, bis sie aus der Rückseite des Schädels austritt.
- Richten Sie die Pinzette entlang der gelben Linie in Abbildung 1Bso aus, dass die andere Seite der Pinzette (die sich noch außerhalb des Embryos befindet) knapp über dem Gehörgang schwebt, und drücken Sie dann die Pinzette zu, um das Gewebe zu schneiden. Führen Sie bei Bedarf eine weitere feine Pinzette entlang der Naht der nun geschlossenen Pinzette, um durch jedes Gewebe zu schneiden, das durch die Prise nicht vollständig durchtrennt wurde.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für die andere Seite des Embryokopfes. Setzen Sie das Pinch-Cut-Verfahren fort, um den Unterkiefer, die Zunge und den unteren Teil des Schädels vollständig zu entfernen und die Gaumenregale freizulegen.
- Entfernen Sie den Schädel des Schädels, indem Sie direkt über den Augen schneiden, wie in Abbildung 1C (grüne Linie) gezeigt. Tun Sie dies, indem Sie den Kopf auf die linke oder rechte Seite legen und die Punkte der kleinen Edelstahlschere vor und hinter dem Schädel knapp über der Augenhöhe des Embryos positionieren. Schneiden Sie die Oberseite des Schädels mit einem schnellen Splitter der Schere ab, wodurch eine flache Oberfläche entsteht, die für die Stabilität in späteren Schritten wichtig ist und die von der Seite betrachtet wie Abbildung 1D aussehen sollte.
- Stellen Sie den verbleibenden Teil des Kopfes auf den Kopf, wobei der überlegene Aspekt des Kopfes (Schädel entfernt) flach auf dem Boden der Schüssel ruht, was eine stabile Oberfläche für die Entfernung des Gaumenregals bietet. Nehmen Sie sich einen Moment Zeit, um die Palatalregale zu identifizieren, die jetzt freigelegt und nach oben gerichtet sind und als zwei erhöhte Grate auf beiden Seiten einer zentralen Rille in der vorderen Hälfte des Kopfes erscheinen (Abbildung 1E).
- Befestigen Sie den verbleibenden Teil des Kopfes an der Schüssel, um sie zu immobilisieren, während die Regale entfernt werden. Tun Sie dies, indem Sie einen Punkt einer feinen Pinzette durch das Gewebe in der Nähe der Nasenregion des Kopfes, anterior zu den Palatalregalen, einführen und die andere Spitze der Pinzette durch die Schädelbasis einführen, posterior zu den Palatalregalen. Halten Sie diese an Ort und Stelle, während Sie die Exzision der Gaumenregale durchführen.
- Den Kopf mit einer Hand immobilisieren, eines der beiden Regale auswählen, um es zuerst zu entfernen, und beide Punkte einer zweiten feinen Pinzette in das Gewebe an der Basis der seitlichen Oberfläche des Regals einführen und zusammendrücken, um das Gewebe zu schneiden (Abbildung 1F). Wiederholen Sie dies entlang der Basis der medialen Oberfläche des Regals und dann sowohl am vorderen als auch am hinteren Ende des Regals, um sich vom Kopf zu lösen.
- Heben Sie das Regal vorsichtig an und machen Sie bei Bedarf zusätzliche Pinchs, um das Regal vollständig vom umgebenden Gewebe zu befreien.
- Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte, um das zweite Palatalregal zu entfernen.
- Da die Palatalregale nun vom umgebenden Gewebe befreit und in PBS(Abbildung G)platziert sind, verwenden Sie eine sterile Kunststoff-Bulb-Transferpipette, um die Regale in der Pipette zu ziehen und sie zusammen mit etwa 500 μL PBS in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Bewahren Sie die Röhrchen, die Gaumenregale enthalten, auf Eis auf, da der Rest der Einstreu auf die gleiche Weise verarbeitet wird.
HINWEIS: Alternativ können Regale unmittelbar nach der Dissektion in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewärmtem Trypsin (0,25%) platziert werden (anstatt sie auf Eis zu legen). Die Proben werden frischer sein, aber es muss darauf geachtet werden, dass alle Schritte für jede einzelne Probe geplant werden, anstatt die Proben gemeinsam zu behandeln.
3. Kultur von MEPM-Zellen
HINWEIS: Unter den hier beschriebenen Bedingungen überleben die Gaumenepithelzellen die erste Passage nicht, was zu einer mesenchymalen Zellkultur des reinen Gaumens führt. Verwenden Sie sterile Technik, um alle Schritte in einer Gewebekulturhaube durchzuführen.
- Aspirieren und entsorgen Sie das PBS aus dem 1,5-ml-Röhrchen und achten Sie darauf, die Regale dabei nicht zu entsorgen. Geben Sie sofort 200 μL vorgewärmtes (37 °C) Trypsin (0,25%) in jede Tube, die Gaumenregale enthält. Pipettieren Sie die Regale kurz im Trypsin mit einer 1000 μL Pipettenspitze nach oben und unten, um die Trypsinisierung zu beschleunigen.
- Inkubieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 37 °C und pipettieren Sie dann jede Probe nach oben und unten, um das Gewebe aufzubrechen. Inkubieren Sie die Röhrchen für weitere 5 minuten bei 37 °C und pipetieren Sie sie erneut, um die Dissoziation des Gewebes abzuschließen.
HINWEIS: Die Regale müssen vollständig oder fast vollständig dissoziiert und im Trypsin suspendiert sein, ohne dass sichtbare Gewebestücke übrig bleiben. - Zu jedem 1,5-ml-Röhrchen werden 800 μL MEPM-Kulturmedium (Schritt 2.1) gegeben. Zentrifugieren Sie das 1,5 mL Röhrchen bei 200 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml MEPM-Kulturmedium.
- Platten Sie die MEPM-Zellen in eine mit 6-Well-Gewebekultur behandelte Platte, die MEPM-Kulturmedium enthält. Lassen Sie die Zellen in einem Inkubator mit 5% CO2 12 h bei 37 °C an der Kunststoffoberflächehaften.
HINWEIS: Nach der Inkubation über Nacht wird die überwiegende Mehrheit (~ 90%) der Zellen anhaften. An diesem Punkt sehen die anhaftenden Zellen ziemlich homogen aus, mit einer dreieckigen oder leicht länglichen Form. - Wechseln Sie das Medium jeden Tag, indem Sie das alte Medium vorsichtig ansaugen und sofort durch 1 ml warmes steriles PBS ohne Kalzium oder Magnesium für ~ 1 min ersetzen. Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 3 ml vorgewärmtes MEPM-Kulturmedium.
- Passieren Sie die Zellen, sobald sie zu 100% konfluent werden.
HINWEIS: MEPM-Zellen sollten sich fast täglich vermehren, indem sie sich verdoppeln.- Um die Zellen zu passieren, saugen Sie das alte Medium vorsichtig ab und ersetzen Sie es sofort durch warmes PBS ohne Kalzium oder Magnesium für ~ 1 min. Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 0,5 ml vorgewärmtes 0,25% Trypsin.
- Bei 37 °C für ~5 min inkubieren oder bis sich die Zellen von der Oberfläche der Schale lösen, wenn sie vorsichtig von Hand hin und her geschaukelt werden. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie sofort 5 ml vorgewärmtes MEPM-Kulturmedium zu den trypsinisierten Zellen hinzu.
- Sammeln Sie die Zellen mit einem 10 ml serologischen Pipett vorsichtig in einem konischen 15-ml-Rohr und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Aspirieren Sie das Trypsin und das Medium und resuspenieren Sie die Zellen in 3 ml vorgewarmtem MEPM-Kulturmedium. Pipettieren Sie vorsichtig 1 ml Zellen in eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Schale und fügen Sie 2 ml MEPM-Kulturmedium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 3 ml zu bringen.
HINWEIS: Dies stellt eine 1:3-Teilung von Zellen dar. MEPMs können bis zu dreimal durchlaufen werden. Die Aussaatdichte von MEPMs ist etwas flexibel, und die Anzahl der vorhandenen Zellen variiert je nach Kulturgefäß. MEPMs vermehren sich jedoch nicht richtig, wenn sie zu spärlich gespalten werden, und sollten in ihrer neuen Schüssel mindestens 20-25% konfluent sein, sobald sie haften.
4. Kryokonservierung von MEPM-Zellen
- Sobald trypsinisierte MEPM-Zellen pelletiert sind, resuspendieren Sie die Zellen im MEPM-Kulturmedium, um eine Konzentration von ~ 1 × 106 Zellen / ml zu erhalten. Pipettieren Sie die Zellen in Kryoviale und fügen Sie eine endgültige Konzentration von 5% Dimethylsulfoxid in den Zellbestand hinzu. Verschließen Sie das Kryovial, mischen Sie es kurz durch Umkehren und legen Sie die Fläschchen sofort in einen Gefrierbehälter, der mit einer Geschwindigkeit von 1 °C/min abkühlt.
- Stellen Sie den Kühler über Nacht in einen -80 °C Gefrierschrank. Am nächsten Tag bewegen Sie die Kryooviale zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank.
- Auftauen von kryokonservierten MEPM-Zellen
- Entfernen Sie die Kryoviale aus dem Flüssigstickstofftank und tauen Sie bei Raumtemperatur auf, bis der Inhalt flüssig wird. Den Inhalt in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 9 ml vorgewärmtem MEPM-Kulturmedium entleeren.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g, um die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml MEPM-Kulturmedium und pipettieren Sie die Zellen in eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte. Fügen Sie 2 ml warmes MEPM-Kulturmedium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 3 ml zu erhöhen.
- Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%CO2. Wechseln Sie das Medium täglich.
5. Live-Bildgebung von MEPM-Zellen - 2D-Kollektivmigrationsassay (Abbildung 2)
- Bereiten Sie eine Platte vor, die für die Live-Bildgebung verwendet werden soll.
- Verwenden Sie eine kleine chirurgische Schere oder ein scharfes Skalpell, um einen sterilen 2-Well-Silikoneinsatz auf eine Höhe von ~ 1 mm zu kürzen. Bereiten Sie für jede verwendete Probe einen Einschub vor.
- Platzieren Sie den verkürzten 2-Well-Silikoneinsatz mit einer Pinzette mit einer Pinzette in der Mitte eines Brunnens einer 6-Well-Platte. Drücken Sie entlang aller Kanten nach unten, um sicherzustellen, dass es vollständig haftet.
- Tauen Sie kryokonservierte Zellen auf, indem Sie die Schritte in Abschnitt 4.3 dieses Protokolls befolgen. Zählen Sie MEPM-Zellen und säen Sie 300 Zellen/mm2 der verkürzten Silikoneinsätze in einem Gesamtvolumen von 40-50 μL MEPM-Kulturmedium pro Vertiefung. Kulturieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%CO2.
- Bereiten Sie sich am nächsten Tag auf die Live-Zeitrafferaufnahme vor.
- Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit einem Inkubator auf der Bühne und automatischer Bildgebung. Fügen Sie Wasser in das Inkubatorreservoir auf der Bühne hinzu, um die Verdunstung des Kulturmediums zu reduzieren. die Temperatur auf 37 °C und CO2 auf 5% einstellen. Lassen Sie ~ 30 min warten, bis sich die Feuchtigkeit aufgebaut hat, bevor Sie die 6-Well-Schüssel in den Inkubator auf der Bühne stellen.
- Verwenden Sie für die Zeitrafferabbilderstellung Einstellungen, die den folgenden entsprechen.
- Wählen Sie das 4-fache Ziel aus, um große Sichtfelder und einen Phasenkontrastfilter zu erhalten.
HINWEIS: Autofokus, Auto-Find-Sample, Z-Stack und Auto-Lighting sind normalerweise nicht erforderlich. - Wählen Sie zwei mikroskopisch kleine Felder pro Vertiefung, um das Lumen der verkürzten Silikoneinsätze zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungspositionen den richtigen Fokus haben.
HINWEIS: Bildebenen können während der Bildgebung angepasst werden, aber eine solche Anpassung ist normalerweise nicht erforderlich. - Wählen Sie den gewünschten Dateityp für die Bildausgabe aus und aktivieren oder deaktivieren Sie dann nach Belieben Post-Imaging-Optionen wie automatische Videoerstellung und Wasserzeichen. Wählen Sie ggf. Phasenkontrast als Abbildungsmodus aus.
HINWEIS: Die Verwendung von Wasserzeichen kann nachfolgende Bildverarbeitungsschritte behindern. - Stellen Sie die Dauer der Aufnahme auf 72 h ein. Stellen Sie das Programm so ein, dass alle 10 Minuten Bilder aufgenommen werden.
HINWEIS: Normalerweise sind nur 48 h Bildgebung erforderlich, aber die Bildgebung kann an jedem Punkt vor der 72-Stunden-Marke gestoppt werden, ohne dass bereits aufgenommene Bilder verloren gehen. - Stellen Sie sicher, dass die Umweltkammer gemäß 5.3.1 betriebsbereit ist. Speichern Sie diese Einstellungen(die Routine)und beginnen Sie mit der Bildgebung.
- Wählen Sie das 4-fache Ziel aus, um große Sichtfelder und einen Phasenkontrastfilter zu erhalten.
- Setzen Sie die Bildgebung bis 72 h (oder die angegebene Zeit) fort.
6. Live-Bildgebung von MEPM-Zellen in einem Wundreparatur-Assay (Abbildung 3)
- Bereiten Sie eine Platte vor, die für die Live-Bildgebung verwendet werden soll. Legen Sie mit einer Pinzette einen sterilen 2-Well-Silikoneinsatz in die Mitte eines Brunnens einer 6-Well-Platte und drücken Sie entlang aller Kanten nach unten, um sicherzustellen, dass er vollständig haftet. Bereiten Sie für jede verwendete Probe einen 2-Well-Einsatz vor.
- Tauen Sie kryokonservierte Zellen auf, indem Sie die Schritte in Abschnitt 4.3 dieses Protokolls befolgen. Zählen Sie MEPM-Zellen und konzentrieren Sie die Zellen bei Bedarf auf mindestens 350 Zellen/μL.
- Geben Sie 1400 Zellen/mm2 in die Silikoneinsätze in einem Volumen von 100 μL MEPM-Kulturmedium pro Vertiefung ein. Kultivieren Sie die Zellen für 48 h bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%CO2und wechseln Sie das Medium jeden Tag.
- Bereiten Sie nach 48 h ein Mikroskop für die Live-Zeitrafferbildgebung vor, wie in den Abschnitten 5.3 und 5.4 beschrieben. Unmittelbar bevor Sie die Zellen in den Inkubator auf der Bühne legen, geben Sie 3 ml vorgewärmtes MEPM-Kulturmedium in die Vertiefung (jedoch außerhalb der Einsätze) und entfernen Sie dann vorsichtig die Silikoneinsätze.
HINWEIS: Die Wand, die die 2 Kammern trennt, hinterlässt eine Lücke, die die "Wunde" ist. - Starten Sie die Zeitraffer-Bildgebung wie in 5.4 beschrieben, mit den folgenden Unterschieden:
- Verwenden Sie ein Objektiv mit höherer Vergrößerung (z. B. 10-fach). Um den Wundverschluss zu erfassen, wählen Sie 5 Sichtfelder entlang jeder Wunde aus, so dass die Wunde parallel zur vertikalen Achse des Bildes verläuft.
- Beenden Sie die Bildgebung nach 72 h oder wenn sich die Wunden vollständig geschlossen haben.
7. Computergestützte Analyse von Zeitraffer-Bildsequenzen
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Verfahren auf einem Computer aus, der mit Standard-Rechenwerkzeugen wie dem Python-Interpreter, dem C-Compiler und einer Shell ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Konfluenzanalyse
HINWEIS: Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Zellproliferation innerhalb einer spärlichen Kultur abzuschätzen oder Wundverschlussexperimente zu quantifizieren. Um Bereiche zu erkennen, die von Zellen belegt sind, wird ein Segmentierungsschwellenwert auf die lokale Standardabweichung der Bildhelligkeit angewendet. Der Code wurde zuvor von Wu et al.33 und Neufeld et al.34 beschrieben und ist unter http://github.com/aczirok/cellconfluency verfügbar.- Bestimmen Sie den Segmentierungsschwellenwert für die Bilder. Um beispielsweise die Segmentierung mit einem Schwellenwert von 4 anzuzeigen, geben Sie den Befehl
segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
und überprüfen Sie dann die Ausgabe (Output.jpg).
HINWEIS: Wenn der Schwellenwert zu niedrig ist, werden Hintergrundbereiche in der Mikroaufnahme als zellbedeckt klassifiziert. Ist der Schwellenwert dagegen zu hoch, werden zellbedeckte Bereiche nicht als solche klassifiziert. Der optimale Schwellenwert hält beide Fehler auf einem Minimum. - Verwenden Sie das bereitgestellte area.sh Skript, um Konfluenzwerte für eine Sequenz von Bildern als
area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > Zusammenfluss.dat
HINWEIS: Der Diskriminierungsschwellenwert 4 wird in Schritt 1 überprüft, und die Ergebnisse werden in der Datei confluency.datgespeichert. Durch Sortieren der Bilder in entsprechende Ordner kann die Liste der Bilddateinamen durch Platzhalterschreibweise ersetzt werden:
area.sh -S4 *.jpg > Zusammenfluss.dat - Für Wundverschlussexperimente werden die Konfluenzdaten A(t)- die Größe der mit Zellen bedeckten Fläche, ausgedrückt als Prozentsatz als Funktion der Zeit in die Wundkantenausbreitungsgeschwindigkeit V als
wobei w die Breite des Feldes und dA/dt die Zeitableitung von A(t) ist, d. h. die Expansionsrate des zellenbedeckten Bereichs.
- Bestimmen Sie den Segmentierungsschwellenwert für die Bilder. Um beispielsweise die Segmentierung mit einem Schwellenwert von 4 anzuzeigen, geben Sie den Befehl
- Karte der Zellmotilität
- Führen Sie einen Partikelbild-Velocimetrie-Algorithmus (PIV) aus, um die Zellmotilität zu charakterisieren und das Ausmaß der lokalen Bewegung "optischer Fluss" zwischen Bildpaaren zu extrahieren, aber nicht, um einzelne Zellen zu identifizieren.
HINWEIS: Hier wird eine anfängliche Fenstergröße von 50 μm verwendet, wie von Zamir et al.35 und Czirok et al.36ausführlich beschrieben, mit einer anfänglichen Fenstergröße von 50 μm. Die PIV-Analyse liefert ein Geschwindigkeitsfeld v(x,t) für jeden Bildrahmen t und jede Position (innerhalb des Bildes) x. - Extrahieren Sie die durchschnittliche Geschwindigkeit der Zellmotilität aus v(x,t) als räumliches Mittel, das über die besetzte Zellfläche berechnet wird, wie in Abschnitt 7.1 bestimmt.
- Führen Sie einen Partikelbild-Velocimetrie-Algorithmus (PIV) aus, um die Zellmotilität zu charakterisieren und das Ausmaß der lokalen Bewegung "optischer Fluss" zwischen Bildpaaren zu extrahieren, aber nicht, um einzelne Zellen zu identifizieren.
- Manuelle Zellenverfolgung
HINWEIS: Während die PIV-Analyse eine automatische Beurteilung der Zellmotilität ermöglicht, erfordert die Konzentration auf das Verhalten einzelner Zellen häufig eine manuelle Verfolgung. Während mehrere Tools diese Funktionalität bieten, ist es sehr hilfreich, wenn die manuell positionierten Marker nach ihrer ersten Platzierung geändert werden können und wenn die Verfolgung sowohl vorwärts als auch rückwärts in der Zeit durchgeführt werden kann.- Führen Sie die Zellverfolgung mit einem speziell entwickelten Python-Werkzeug (http://github.com/donnagreta/cm_track) durch, das auch grundlegende Editorfunktionen wie das Löschen von Leitkurvensegmenten bereitstellt.
HINWEIS: Dieses manuelle Tracking-Tool liefert die Positionen P(i,t) der Zelle i zum Zeitpunkt t in einer Textdatei und wird aufgerufen als
cm_track.py -i images/ -o track.dat
wobei sich die Zeitrafferbilder im Ordner images/ befinden und die Positionsdaten in der Dateispur gesammelt werden.dat (Abbildung 4).
- Führen Sie die Zellverfolgung mit einem speziell entwickelten Python-Werkzeug (http://github.com/donnagreta/cm_track) durch, das auch grundlegende Editorfunktionen wie das Löschen von Leitkurvensegmenten bereitstellt.
Abbildung 4: Analyse einzelner Zelltrajektorien. (A) Phasenkontrast-Zeitraffer-Mikroskopaufnahmen werden (B, C) einem manuellen Tracking-Verfahren unterzogen, das Zellen markiert (grüne Punkte). (D) Zellpositionen (x,y) werden für jede Zelle gespeichert, die durch ihre ID und für jeden Rahmen f. (E) Trajektorien können auf den Mikrographen überlagert und farbcodiert werden, um zeitliche Informationen anzuzeigen. Beispielsweise zeigt in jeder Trajektorie eine blaue bis rote Farbpalette progressiv spätere Trajektoriensegmente an, wobei Rot und Blau die anfängliche bzw. endgültige Zellenposition markieren. (F) Verschiedene statistische Eigenschaften von Trajektorien, wie die mittlere quadratische Verschiebung, können extrahiert und verwendet werden, um die Motilität verschiedener Zellpopulationen zu charakterisieren, die in diesem Beispiel Wildtyp- (wt, blau) und Knockdown- (kd, rot) MEPM-Zellen umfassen. Die Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Überlagern Sie Trajektorien auf Bildern mit einem zweiten Werkzeug, das als
visdat.py -d track.dat -i images/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2 - Sammeln Sie die Bilder mit den Trajektorien, die im Ordner-Overlay überlagert sind.
HINWEIS: In diesem Beispiel werden Zellenpositionsdaten in der Dateispur.dat gespeichert,während sich die Zeitraffer-Bildsequenz innerhalb des Ordners images befindet. Der Rest der Parameter steuert die maximale Länge der gezeichneten Leitkurven (-l), die Größe der Symbole (-r) und das verwendete Farbschema (-C).
- Analyse einzelner Zelltrajektorien
- Charakterisieren von Trajektorien durch die Gesamtpfadlänge
,
und Nettoverschiebung in Richtung Wunde
,
wobei X die Projektion von P in die Richtung senkrecht zur Wunde bezeichnet: die x-Koordinate der Positionen, wenn die Wunde parallel zur y-Achse verläuft. - Berechnen Sie die Richtwirkung
wie für jede Zelle i und den Zeitpunkt t37. Charakterisieren Sie Kulturen durch den Populationsdurchschnitt dieser Einzelzellmaße, bewertet zu einem geeigneten Zeitpunkt t.
- Charakterisieren von Trajektorien durch die Gesamtpfadlänge
- Kollektive Streaming-Bewegung von Zellen
- Charakterisieren Sie die lokalen räumlichen Korrelationen von Zellbewegungen durch die Durchschnittsgeschwindigkeit anderer Zellen, die sich in der Nähe einer sich bewegenden Zelle befinden, wie zuvor beschrieben38,39.
HINWEIS: Der Berechnungscode ist unter https://github.com/aczirok/flowfield verfügbar.- Richten Sie ein Referenzsystem mit den Richtungen vorne, hinten, links und rechts an jedem Vektor v(x,t) aus (Abbildung 5A). Weisen Sie jede der umgebenden Zellen oder PIV-Geschwindigkeitsvektoren der entsprechenden räumlichen Zelle des Referenzsystems zu (Abbildung 5B). Wiederholen Sie den Vorgang, da jeder Vektor als Ursprung der Bezugssysteme dient (Abbildung 5C,D), so dass ein gegebener Geschwindigkeitsvektor mehreren Behältern zugeordnet wird.
HINWEIS: Ein Datenpunkt kann sich vor einem Vektor und links von einem anderen befinden. - Drehen Sie die Referenzsysteme in eine gemeinsame Ausrichtung (Abbildung 5C,F) und bündeln Sie sie (Abbildung 5G).
HINWEIS: Der Durchschnitt jedes Bins der gepoolten Geschwindigkeitsdaten ist ein Geschwindigkeitsvektor (U), der auf eine räumliche Korrelation hinweist: Der Durchschnitt ist ein Maß für eine gemeinsame Geschwindigkeitskomponente (Abbildung 5H). - Passen Sie die U(x)-Strömungsfelder mit einer Exponentialfunktion
an, wobei a, x0 und U0 Anpassungsparameter sind. Von den drei passenden Parametern konzentrieren Sie sich auf x0, die Korrelationslänge (Abbildung 5I, J), die die charakteristische Entfernung ist, in der lokale Geschwindigkeits-Geschwindigkeits-Korrelationen verschwinden.
- Richten Sie ein Referenzsystem mit den Richtungen vorne, hinten, links und rechts an jedem Vektor v(x,t) aus (Abbildung 5A). Weisen Sie jede der umgebenden Zellen oder PIV-Geschwindigkeitsvektoren der entsprechenden räumlichen Zelle des Referenzsystems zu (Abbildung 5B). Wiederholen Sie den Vorgang, da jeder Vektor als Ursprung der Bezugssysteme dient (Abbildung 5C,D), so dass ein gegebener Geschwindigkeitsvektor mehreren Behältern zugeordnet wird.
- Charakterisieren Sie die lokalen räumlichen Korrelationen von Zellbewegungen durch die Durchschnittsgeschwindigkeit anderer Zellen, die sich in der Nähe einer sich bewegenden Zelle befinden, wie zuvor beschrieben38,39.
,
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wie für jede Zelle i und den Zeitpunkt t37. Charakterisieren Sie Kulturen durch den Populationsdurchschnitt dieser Einzelzellmaße, bewertet zu einem geeigneten Zeitpunkt t.
an, wobei a, x0 und U0 Anpassungsparameter sind. Von den drei passenden Parametern konzentrieren Sie sich auf x0, die Korrelationslänge (Abbildung 5I, J), die die charakteristische Entfernung ist, in der lokale Geschwindigkeits-Geschwindigkeits-Korrelationen verschwinden.
Abbildung 5: Charakterisierung der Strömungsbildung von kultivierten Zellen. (A,D) Phasenkontrast-Zeitrafferbilder aus Abbildung 4A werden verwendet, um Zellbewegungen zu identifizieren. Für jede sich bewegende Zelle wurden ein Bezugsrahmen (blau) und räumliche Behälter (weiß) gemeinsam ausgerichtet, um benachbarte Zellen als vorne, hinten, links oder rechts zu kategorisieren. (B,E) Die Geschwindigkeit benachbarter Zellen (schwarze Vektoren) wurde auf das gleiche Bezugssystem (C,F )bezogen. Dieser Vorgang wurde für jede Zelle und jeden Zeitpunkt wiederholt. (G) Nach der Bündelung dieser lokalen Informationen enthält jeder Behälter mehrere Geschwindigkeitsvektoren (grau), die gemittelt werden können, um die durchschnittliche Sichbewegungsgeschwindigkeit (magentafarbene Pfeile) an verschiedenen Stellen relativ zu einer durchschnittlichen beweglichen Zelle zu bestimmen. (H) Die mittlere Geschwindigkeitskarte charakterisiert somit die typischen Zellgeschwindigkeiten an verschiedenen Stellen relativ zu einer sich bewegenden Zelle. (I,J) Schließlich wurde dieses Feld entlang der vorder-hinteren (parallelen) Achse und auch entlang der Links-Rechts-Achse (senkrecht) abgetastet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Die Dissektion von Gaumenregalen ist in Abbildung 1dargestellt. Die Abfolge der Schnitte ist so konzipiert, dass das Verrutschen des Gewebes minimiert wird. Nach der Entfernung des Kopfes (Abbildung 1A, B) wird der Unterkiefer entfernt ( Abbildung1B, C). Der Schnitt des oberen Teils des Kopfes (Abbildung 1C,D) wird durchgeführt, um das Gewebe zu stabilisieren, wenn es auf den Kopf gestellt wird (Abbildung 1E), um die Palatalregale zu visualisieren (Abbildung 1E, gepunktete Linien), zu kneifen ( Abbildung1F) und zu beschneiden (Abbildung 1G).
Das ausgeschnittene palatale Regalpaar aus einem einzelnen Embryo wird trypsinisiert und in einer 35-mm-Schale oder in einer Vertiefung einer 6-Well-Schale kultiviert. Größere Gerichte werden nicht bevorzugt, da die Zelldichte für ein optimales Wachstum zu gering ist. Beim Zusammenfluss werden die Zellen aus jedem Bohrloch trypsinisiert und in drei 35-mm-äquivalente Vertiefungen überführt (Passage Nr. 1). Konfluente Zellen aus Passage #1 können dann zu Aliquots von 1 × 106 Zellen/ml eingefroren werden. Gefrorene Aliquots werden anschließend in einem 35-mm-äquivalenten Gericht aufgezogen und bis zum Zusammenfluss gezüchtet. Die Zellen werden dann trypsinisiert (Passage #2) und entsprechend dem Experiment ausgesät. Die Herstellung und Verwendung von gefrorenen Aliquots trug dazu bei, die Bedingungen zu normalisieren, insbesondere in Bezug auf die Zelldichte. Die Verwendung von frischen MEPM-Zellen führte in Experimenten zu einer größeren Variabilität der endgültigen Zelldichte, von der angenommen wird, dass sie auf einen variablen Anteil lebensfähiger oder sublebender Zellen in frischen Kulturen zurückzuführen ist. Darüber hinaus war die Anzahl der MEPM-Zellpassagen für diese Experimente streng auf zwei (oben aufgeführt) begrenzt.
In Anbetracht der Tatsache, dass a) die Zelldichte kritisch war, b) MEPM-Zellen aus einem einzelnen Embryo begrenzt waren und c) die bildgebende Optik in einer großen Schale besser war, wurden 2-Well-Silikoneinsätze verwendet(Abbildung 2 und Abbildung 3). Für Wundreparaturassays wurden MEPM-Zellen in den 2-Well-Silikoneinsätzen bis zu einem hohen Zusammenfluss gezüchtet, dann wurden die Einsätze entfernt und die Wunde bis zum Verschluss abgebildet (Abbildung 3). Für die 2D-Kultur benötigten die MEPM-Zellen jedoch eine Bildgebung, als sie wuchsen, so dass die 2-Well-Silikoneinsätze einfach auf 1/3 ihrer Höhe getrimmtwurden, um eine klare Bildgebung zu ermöglichen (Abbildung 2C). Kleine 3D-gedruckte Ringe40 in 35 mm Schalen wurden auch für die 2D-Motilitätsanalyse verwendet (Abbildung 2D).
MEPM-Trajektorien (Abbildung 4E) sind persistent: Die Richtung der Zellmotilität wird für mehrere Stunden aufrechterhalten. Die mittlere Verschiebungs-Zeit-Analyse (Abbildung 4F) zeigt an, dass die Persistenz in Form der Verschiebung proportional zur verstrichenen Zeit ist. Die typische Geschwindigkeit von MEPM-Zellen auf Gewebekultur-Kunststoffoberfläche, 10 μm/h, kann auch zur Qualitätskontrolle der Zellkultur verwendet werden. Die Strömungsanalyse der Motilitätsdaten zeigt, dass die sich gemeinsam bewegenden Cluster von MEPM-Zellen ~ 300 μm groß sind (Abbildung 5I, J). Die repräsentativen Ergebnisse deuten auch auf einen tiefgreifenden Motilitätsunterschied zwischen Wildtyp- und mutierten MEPM-Zellen hin. Zusätzlich zum Wildtyp- und Mutantenvergleich können sowohl 2D- als auch Wundreparaturassays mit verschiedenen biochemischen Behandlungen kombiniert werden. Zum Beispiel wurden PI3K-AKT-Signalwegaktivatoren mit MEPM-Zellen verwendet, wie zuvor beschrieben 21.
Abbildung 1: Dissektion embryonaler Gaumenregale zur Isolierung mesenchymaler Zellen. (A) Ein E13,5-Mausembryokopf wird durch Schneiden entlang des Halses (rote Linie) entfernt. (B) Als nächstes werden der Unterkiefer und die Zunge mit Schnitten entlang der Mundhöhle, zwischen Ober- und Unterkiefer (gelbe Linie) entfernt. (C) Um das Gewebe für die Entfernung des Gaumenregals zu stabilisieren, wird die Oberseite des Kopfes ausgeschnitten (grüne Linie). (D) Die resultierende sezierte Oberkieferregion wird (E) auf den Kopf gestellt, um die Palatalregale (schwarze gepunktete Linien) zu visualisieren. (F) Die Exzision einzelner Gaumenregale wird schematisch dargestellt, wo einzelne hervorstehende Regale (gelb) vom Oberkiefer abgeklemmt werden (blau). (G) Ausgeschnittenes Paar Palatalregale aus einem einzigen Embryo, die dann in einer 35-mm-Schale oder in einem 6-Well-Teller trypsinisiert und kultiviert werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Versuchsaufbau einer 2D-MEPM-Zellkultur. (A) Tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von MEPM-Zellen auf und (B) kultiviert die Zellen in einer 35-mm-Schale oder einer 6-Well-Platte. Wenn konfluent, trypsinisieren Sie die Zellen und säen Sie sie wie im Protokoll beschrieben in einer 35-mm-Schale entweder mit(C)2-Well-Silikoneinsätzen, die getrimmt wurden, oder(D)mit 3D-gedruckten Ringen. Ein kleiner Kulturraum minimiert den Bedarf an einer großen Anzahl von MEPM-Zellen. Das flache Profil der getrimmten Silikoneinsätze oder der 3D-gedruckten Ringe ermöglicht eine direkte Bildgebung ohne Halo-Effekt. Die Zeitraffer-Bildgebung kann fortgesetzt werden, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist, die bis zu 72 h betragen kann. Repräsentative Bilder werden bei (E) 0 h, (F) 24 h und (G) 45 h Zeitpunkten gezeigt. Die Bilder wurden mit einem 4-fach Objektiv aufgenommen. Die Maßstabsbalken für E, F, G = 300 μm. Abkürzungen: 2D = zweidimensional; MEPM = embryonales palatales Mesenchym der Maus; 3D = dreidimensional. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Versuchsaufbau eines Wundverschlussassays unter Verwendung von MEPM-Zellen. (A) Tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von MEPM-Zellen auf und (B) Kulturzellen in einer 35-mm-Schale oder einem 6-Well-Teller. Wenn sie konfluent sind, trypsinisieren Sie die Zellen und(C)säen Sie sie in die 2-Well-Silikoneinsätze in einer 35-mm-Schale. Kultivieren Sie die Zellen im Insert, bis der gewünschte Zusammenfluss erreicht ist (~ 48 h), und entfernen Sie dann den Silikoneinsatz und das Bild. Repräsentative Bilder werden (D) unmittelbar nach dem Entfernen des Einsatzes, (E) nach 24 h und (F) nach 40 h gezeigt. Der Wundverschluss dauert ca. 36 h. Die Bilder wurden mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen. Der Maßstabsbalken entspricht 300 μm. Abkürzungen: MEPM = mausembryonales palatales Mesenchym. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Palatal-Regalhöhe stellt ein vertikales bis horizontales Umbauereignis1,3,4,9,11 dar. Es wird postuliert, dass dieser Remodeling-Prozess erfordert, dass sich gaumale Regal-Mesenchymzellen koordiniert verhalten. Die Analysen mit Wildtyp-MEPM-Zellen zeigen, dass dieses Zellverhalten intrinsisch ist und quantitiert werden kann21. Somit können diese Assays verwendet werden, um primäre Gaumenhalshöhendefekte in neuen und bestehenden Mausmodellen der Gaumenspalte aufzudecken. Die in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Methoden sollten es den Prüfern ermöglichen, Aliquots von primären MEPM-Zellen zu isolieren, zu kultivieren und einzufrieren. Diese Zellen können dann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der hier beschriebenen 2D-Kultur- und Wundreparaturassays. Die 2D-Kultur stellt in Kombination mit zeitrafferischer Bildgebung eine einfache Methode zur Bestimmung grundlegender Zellattribute über einen Bereich von Zelldichten dar. Vorgestellt wird hier eine Methode zur Beurteilung der Zellausrichtung und Zellstrombildung, die Attribute der kollektiven Zellbewegung sind (Abbildung 4). Wundverschluss-Assays werden häufig zur Beurteilung der Zellmigrationverwendet 41,42,43. Die zellfreie Region der "Wunde" liefert einen Hinweis für die gerichtete Bewegung von Zellen an der Peripherie. Die Zeitraffer-Bildgebung dieses Prozesses ermöglichte die Bestimmung und Bewertung von Zelltrajektorien während der Migration. Diese Zelltrajektorien bestimmen wiederum die Geschwindigkeit und Richtung der Zellmigration (Abbildung 5).
Es ist wichtig, zunächst die Bedingungen für Kultur und Assays zu optimieren, bei denen nur Wildtyp-MEPM-Zellen verwendet werden. Nachdem die Palatalregale erfolgreich trypsinisiert und die resultierende Einzelzellsuspension über Nacht plattiert wurde, wird sich die überwiegende Mehrheit (~ 90%) der Zellen leicht an die Wachstumsoberfläche der Schale anheften. Wenn die Zellen nicht leicht haften, kann mit den Kulturbedingungen etwas nicht stimmen. Anfangs sehen die anhaftenden Zellen ziemlich homogen aus, mit einer dreieckigen oder leicht länglichen Form, aber wenn sie zu einer hohen Dichte wachsen, werden sie spindelförmiger und länglicher (Abbildung 2). Wenn die Zellen dramatisch groß oder mehrkernig werden, sollten sie nicht für Experimente verwendet werden. Diese Optimierung wird auch grundlegende Wildtypparameter für ein erfolgreiches Wachstum (Zeit bis zum Zusammenfluss) und die Wundreparatur (Zeit bis zum Schließen) festlegen. Die Zellen sollten sich durch Verdoppelung der Anzahl fast täglich vermehren und in Zeitrafferbildern eine Motilität von ~5-10 μm/h aufweisen. Wenn in einem nachfolgenden Experiment mit einem Wildtyp-Mutanten-Vergleich diese grundlegenden Parameter von Wildtypzellen nicht erfüllt werden, muss das Experiment möglicherweise von der Analyse ausgeschlossen werden. Zum Beispiel brauchen Wildtyp-MEPM-Zellen 36-40 h, um die Wunde mit den 2-Well-Silikoneinsätzen vollständig zu verschließen. Wenn Wildtypzellen in einem Experiment deutlich länger als 40 h brauchen, um die Wunde zu schließen, wäre das gesamte Experiment verdächtig. Schlechte Leistung von MEPM-Zellen kann auf 1) schlechte gefrorene aliquote Qualität, 2) schlechte Wiederbelebung oder 3) übermäßige Differenzierung zurückzuführen sein. Differenzierte oder seneszente Zellen können visuell erkannt werden, da sie sehr groß werden und sich nicht teilen. Eine Kultur mit einer großen Anzahl solcher Zellen sollte vermieden werden. Im Allgemeinen sollten sich keine abnormalen Zellen im Sichtfeld eines 10-fachen Objektivs befinden (Abbildung 3); Ein oder zwei Zellen außerhalb des Sichtfelds sollten die Analyse nicht wesentlich beeinflussen. Die Beschränkung der Analyse auf nur zwei Zellpassagen (oben) trägt wesentlich dazu bei, die Qualität der MEPM-Zellen zu erhalten.
Sowohl für die 2D-Kultur als auch für die Wundreparaturassays mit primären MEPM-Zellen war die Hauptvoraussetzung für den Erfolg eine hohe anfängliche Zelldichte. Dieser Bedarf wurde erstmals bei der Optimierung des Wundreparaturassays bestimmt, bei demZellen bei >1400 Zellen/mm2 ausgesät wurden. Die Dichte der Zellen, die in die Wunde einwandern, wurde dann als Seeding-Dichte in 2D-Kulturassays verwendet. Eine Seeding-Dichte von ~300Zellen/mm2 bildete Zellströme, während sie gleichzeitig eine automatisierte Analyse der Zelltrajektorien ermöglichte. Dichten von mehr als 300Zellen/mm2 neigen dazu, lebhaftere Ströme zu bilden, die mit dem Auge visualisiert werden können, erschweren jedoch die Verfolgung einzelner Zellen. Beim Vergleich von primären MEPM-Zellen aus Wildtyp- und mutierten Embryonen können zwar die Verzögerung des Wundverschlusses ohne computergestützte Analyse beurteilt werden, obwohl Flussbildungs- und Richtungsunterschiede möglicherweise nicht mit dem Auge erkennbar sind. Wenn die Zelldichte zu hoch ist oder die Bildqualität schlecht/verschwommen ist, zum Beispiel aufgrund von Fokusverlust, kann eine automatisierte Zellverfolgung schwierig sein. In einem solchen Fall ist es möglich, das manuelle Zelltracking zu verwenden, um Zelltrajektorien in Wundreparaturassays mit ImageJ zu bestimmen. Eine sehr geringe Konzentration der Hoechst-Kernfärbung (3 μL/ml 20 mM-Lösung in MEPM-Kulturmedium) kann auch verwendet werden, um die Zellverfolgung zu erleichtern; Die Toxizität fluoreszierender Laser kann jedoch bei längerem Gebrauch ein Problem darstellen.
Für die manuelle Nachführung war es einfacher, zellen rückwärts vom Ende des Wundverschlusses so weit wie möglich rückwärts zu verfolgen, bis eine hohe Zelldichte die weitere Nachführung verdeckte. Sogar partielle Zelltrajektorien, wenn sie für eine Zellpopulation kombiniert wurden, waren informativ. Im Gegensatz zu Wundreparaturassays ist für die 2D-Zellkulturanalyse ein automatisiertes Zelltracking erforderlich, weshalb auch intermediäre Zelldichten gewählt wurden. Schließlich können empfindliche primäre MEPM-basierte Analysen verwendet werden, um Verbindungen und Signalwege zu identifizieren, die die Gaumenerhöhung beeinflussen können. Frühere Studien zeigten, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs sowohl die Zellgeschwindigkeit als auch die Richtungsabhängigkeit von Specc1l-mutierten MEPM-Zellen verbesserte21. Andere MEPM-Studien haben auch verschiedene Wachstumsfaktor- oder Arzneimittelbehandlungen verwendet, um nachgeschaltete Signalkaskaden zu stimulieren oder die Proliferation zu bewerten22,29,30,44,45. Somit bieten MEPM-basierte Analysen eine schnelle Methode, um viele weitere positive oder negative regulatorische Faktoren zu identifizieren, die dann in vivo validiert werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde zum Teil durch die National Institutes of Health Grants DE026172 (I.S.) und GM102801 (A.C.) unterstützt. I.S. wurde auch teilweise durch das Stipendium des Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), das Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence Grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) und das Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
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