Summary
İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.
Abstract
Damak gelişiminin gelişimi, dilin yanındaki bilateral damak raflarının dikey büyümesini ve ardından dilin üzerinde yükselme ve füzyonu içeren dinamik bir süreçtir. Bu süreçteki kusurlar, yaygın bir doğum kusuru olan yarık damağa yol açar. Son çalışmalar, palatal raf yüksekliğinin, rafın yönünü dikeyden yataya dönüştüren bir yeniden şekillendirme işlemi içerdiğini göstermiştir. Bu dinamik tadilatta palatal raf mezenkimal hücrelerin rolü üzerinde çalışmak zor olmuştur. Zaman atlamalı görüntüleme tabanlı nicel analiz son zamanlarda primer fare embriyonik palatal mezenkimal (MEPM) hücrelerinin kendi kendine kolektif bir harekete dönüşebileceğini göstermek için kullanılmaktadır. Nicel analizler, mutant MEPM hücrelerindeki farklılıkları damak yükselme kusurları olan bir fare modelinden belirleyebilir. Bu makalede, MEPM hücrelerini E13.5 embriyolarından izole etme ve kültürleme yöntemleri açıklanmaktadır- özellikle zaman atlamalı görüntüleme için- ve akış oluşumu, şekil hizalaması ve yönün kalıcılığı için önlemler de dahil olmak üzere kolektif hareketin çeşitli hücresel özelliklerini belirlemek. MEPM hücrelerinin dinamik yükselme sürecinde palatal raf mezenkiminin rolünü incelemek için bir proxy modeli olarak hizmet edebileceği öne sunun. Bu nicel yöntemler, kraniofasiyal alandaki araştırmacıların kontrol ve mutant hücrelerdeki kolektif hareket niteliklerini değerlendirmelerine ve karşılaştırmalarına izin verecek ve bu da palatal raf yükselmesi sırasında mezenkimal yeniden şekillendirmenin anlaşılmasını artıracaktır. Ayrıca, MEPM hücreleri genel olarak kolektif hücre hareketinin araştırılması için nadir bir mezenkimal hücre modeli sağlar.
Introduction
Damak gelişimi, palatogenezdeki kusurlar, izole vakalarda veya yüzlerce sendromun bir parçası olarak ortaya çıkan yarık damak-yaygın bir doğum kusuru olduğu için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir1,2. Embriyonik damak gelişimi embriyonik dokunun hareketini ve füzyonunu içeren dinamik bir süreçtir. Bu işlem dört ana adıma ayrılabilir: 1) palatal rafların indüksiyonu, 2) dilin yanındaki palat raflarının dikey büyümesi, 3) dil üzerindeki palat raflarının yükselmesi ve 4) orta çizgideki palatal rafların füzyonu1,3,4. Son birkaç on yılda, yarık damak 5 ,6,7,8. Bu modellerin karakterizasyonu palatal raf indüksiyonu, çoğalma ve füzyon adımlarında kusurlar olduğunu belirtmiştir; ancak, palatal raf yükselmesi kusurları nadirdir. Bu nedenle, damak raf yüksekliğinin dinamiklerini anlamak ilgi çekici bir araştırma alanıdır.
Palatal raf yükselmesi kusurları olan bazı fare mutantlarının dikkatli analizi, mevcut modelin palatal rafın çok ön bölgesinin yukarı doğru çevrildiğini gösterirken, damak1,3,4'ünorta kısmında yatay hareket veya palat raflarının "yeniden şekillendirilme" meydana geldiğinigösterdi. 9,10,11. Palatal rafın medial kenar epitelleri, daha sonra palatal raf mezenkim tarafından sürülen bu tadilat için gerekli sinyalizasyonu başlatır. Son zamanlarda, birçok araştırmacı palatal rafları içeren geçici oral yapışıklıklar gösteren fare modellerinde palatal raf yükselmesi gecikmesi tespit etti12,13. Mezenkimal remodeling, hücrelerin yatay yönde bir şişkinlik oluşturmak için yeniden düzenlenmesini içerirken, aynı zamanda palatal rafı dikey yönde geri çekme9,10,14. Palatal raf yüksekliğini ve altta yatan mezenkimal remodeling'i etkilemek için önerilen çeşitli mekanizmalar arasında hücre çoğalması15,16,17, kemotaktik gradyanlar18ve hücre dışı matris bileşenleri19,20vardır. Önemli bir soru ortaya çıktı: Specc1leksikliği olan farelerde gözlenen palatal raf yükselme gecikmesi de kısmen palatal raf tadilatındaki bir kusurdan kaynaklanıyor mu ve bu tadilat kusuru birincil MEPM hücrelerinin davranışında içsel bir kusurda ortaya çıkabilirmi 21?
Birincil MEPM hücreleri kraniyofasiyal alanda gen ekspresyasyonu22 , 23,24,25,26,27,28,29ve çoğalma 30,31ve göç 25,31 ,32 içeren birçok çalışma için kullanılmıştır. , ancak kolektif hücre davranışı analizi için yok. MEPM hücrelerinin zaman atlamalı görüntülemesi, MEPM hücrelerinin yönlü hareket gösterdiğini ve toplu hareketin yoğunluğa bağlı hücre akışlarını oluşturduğunu göstermek için 2B kültür ve yara onarım tahlillerindegerçekleştirildi 21. Ayrıca, Specc1l mutant hücreleri daha dar hücre akışları oluşturdu ve oldukça değişken hücre göç yörüngeleri gösterdi. Bu koordineli hareketlilik eksikliği Specc1l mutant embriyolarında damak yükselmesi gecikmesine katkıda bulunmak için kabul edilir13,21. Bu nedenle, birincil MEPM hücrelerini kullanan bu nispeten basit tahliller, palatal raf yüksekliği sırasında mezenkimal remodeling'i incelemek için bir proxy görevi görebilebilir. Bu makalede, birincil MEPM hücrelerinin izolasyonu ve kültürünün yanı sıra 2B ve yara onarım tahlilleri için zaman atlamalı görüntüleme ve analiz açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm deneyler, kumc Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol ile, kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Protokol Numarası: 2018-2447).
1. Hasat E13.5 embriyoları
- Hamile dişi fareleri CO2 inhalasyon odası kullanarak veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir prosedürle ötenazi yaptırın. Hemen diseksiyona devam edin.
- Cildi ve peritonları çıkararak karın boşluğunun alt yarısını açığa çıkarın. E13.5 embriyolarını içeren uterusun her iki boynuzu da dışarı atılır.
- Fazla kan, saç veya diğer kalıntıları durulamak için uterusu önceden ısıtılmış 37 °C steril fosfat tamponlu saline (PBS) yerleştirin. Uterusun steril PBS ile dolu steril 10 cm'lik bir kabına yerleştirin.
- Küçük makas kullanarak, uterusun uzunluğu boyunca uterus duvarını keserek her embriyoyu hala yumurta sarısı kesesinde açığa çıkar. Embriyoyu çevreleyen yumurta sarısı kesesini çıkarın, ancak gerekirse genotipleme için sakla. Embriyolar çıkarıldıkça, her embriyoyu PBS ile dolu 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin.
2. Embriyolardan palatal rafların diseksiyonu (Şekil 1)
NOT: Paslanmaz çelik diseksiyon aletlerini (Malzeme Tablosunabakınız) her embriyoyu işlendikten sonra, aletleri önce %100 etil alkol (EtOH) kabına, ardından 10 sn için 350 °C'de bir alet sterilizatörüne yerleştirip% 100 EtOH'luk ikinci bir beherde soğutarak sterilize edin.
- Sterilize edilmiş delikli bir kaşık kullanarak embriyoyu Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin (4 mM L-Glu) ve antibiyotik-penisilin ve streptomisin (50 birim/mL) içeren minimum esansiyel ortamından (DMEM) oluşan MEPM kültür ortamı ile dolu 10 cm'lik yeni bir yemeğe yerleştirin.
- Steril makas kullanarak embriyonun çene hattının hemen altında kafasını koparın(Şekil 1A, kırmızı noktalı çizgi). Sterilize edilmiş ince #5'in bir noktasını ağza sokarak alt çeneyi çıkarın ve yanağın hemen içinde tutun. Eklenen kümes parmaklarının noktasını kafatasının arkasından çıkana kadar itin.
- Şekil 1B'dekisarı çizgi boyunca, kümesleri yönlendirin, böylece kümeslerin diğer tarafı (hala embriyonun dışındadır) kulak kanalının hemen üzerinde gezinir, ardından dokuyu kesmek içinpsleri kıstırın. Gerekirse, kıskaç tarafından tamamen kesilmemiş herhangi bir dokuyu kesmek için şimdi kapalı olan önktüslerin dikişi boyunca başka bir ince toka çalıştırın.
- Embriyo kafasının diğer tarafı için önceki adımı tekrarlayın. Kafatasının alt çenesini, dilini ve alt kısmını tamamen çıkarmak ve palatal rafları ortaya çıkarmak için kıstırma işlemine devam edin.
- Şekil 1C'de (yeşil çizgi) gösterildiği gibi, gözlerin hemen üstünden keserek kafatasının kafatasını çıkarın. Başı sol veya sağ tarafına yerleştirerek ve küçük paslanmaz çelik makasın noktalarını embriyonun göz seviyesinin hemen üstünde kafatasının önüne ve arkasına yerleştirerek bunu yapın. Kafatasının üst kısmını makasın hızlı bir yudumuyla kesin, daha sonraki adımlarda stabilite için önemli olacak ve yandan bakıldığında Şekil 1D gibi görünmesi gereken düz bir yüzey oluşturun.
- Başın kalan kısmını baş aşağı yerleştirin, başın üst yönü (kafatası çıkarılmış) çanağın altına düz bir şekilde yaslanmış, bu da damak rafının çıkarılması için sabit bir yüzey sağlayacaktır. Şimdi açıkta ve yukarı bakan ve başın ön yarısında merkezi bir oluğun her iki tarafında iki yükseltilmiş sırt olarak görünecek olan palatal rafları tanımlamak için bir dakika ayırın (Şekil 1E).
- Raflar çıkarılırken hareketsiz hale getirmek için başın kalan kısmını kabın içine sabitlayın. Bunu, başın burun bölgesine yakın dokudan ince bir tokanın bir noktasını, ön kısmını damak raflarına sokarak ve tokaların diğer noktasını kafatasının tabanından, arkasını damak raflarına sokarak yapın. Palatal rafların eksizyonini gerçekleştirirken bunları yerinde tutun.
- Başı bir elinizle hareketsiz hale getirin, önce çıkarmak için iki raftan herhangi birini seçin ve ikinci bir çift ince toparlakın her iki noktasını da rafın yan yüzeyinin tabanındaki dokuya yerleştirin ve dokuyu kesmek için kıstırın (Şekil 1F). Bunu rafın medial yüzeyinin tabanı boyunca ve daha sonra kafadan ayırmak için rafın hem ön hem de arka uçlarında tekrarlayın.
- Rafı yavaşça kaldırın, gerektiğinde ek tutamlar yaparak rafı çevredeki dokudan tamamen boşaltın.
- İkinci damak rafını çıkarmak için önceki iki adımı tekrarlayın.
- Palatal raflar artık çevredeki dokudan arındırılmış ve PBS'ye (Şekil G)yerleştirilmişken, pipetteki rafları çekmek için steril bir plastik ampul transfer-pipeti kullanın ve bunları yaklaşık 500 μL PBS ile birlikte 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çöplerin geri kalanı aynı şekilde işlendiği için palatal raflar içeren tüpleri buz üzerinde tutun.
NOT: Alternatif olarak, raflar diseksiyondan hemen sonra (buza yerleştirmek yerine) önceden ısıtılan tripsin (%0,25) içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerlenebilir. Örnekler daha taze olacaktır, ancak örneklerin topluca tedavi edilmesi yerine her bir numune için tüm işlem adımlarını zamanlamak için dikkatli olunmalıdır.
3. MEPM hücrelerinin kültürü
NOT: Burada açıklanan koşullar altında, damak epitel hücreleri ilk pasajdan sağ çıkamaz ve saf damak mezenkimal hücre kültürü ile sonuçlanır. Bir doku kültürü davlumbazındaki tüm adımları gerçekleştirmek için steril tekniği kullanın.
- PBS'yi 1,5 mL'lik tüpten aspire edin ve atın, bu süreçte rafları atmamaya dikkat edin. Hemen palatal raflar içeren her tüpe 200 μL önceden ısıtılmış (37 °C) tripsin (%0,25) ekleyin. Trypsinizasyonu hızlandırmak için 1000 μL pipet ucu kullanarak rafları trypsin'de kısa bir süre yukarı ve aşağı borulayın.
- Tüpleri 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın, ardından dokuyu parçalamaya yardımcı olmak için her numuneyi tekrar yukarı ve aşağı borun. Tüpleri 37 °C'de 5 dakika daha kuluçkaya yatırın ve dokunun ayrışmasını tamamlamak için bir kez daha yukarı ve aşağı borulayın.
NOT: Raflar tamamen veya neredeyse tamamen ayrışmalı ve tripin içinde görünür doku parçaları kalmadan askıya alınmalıdır. - Her 1,5 mL tüpe 800 μL MEPM kültür ortamı (adım 2,1) ekleyin. Hücreleri peletmek için 1,5 mL'lik tüpü 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Üstnatant çıkarın ve hücre peletini 1 mL MEPM kültür ortamında yeniden diriltin.
- MEPM hücrelerini MEPM kültür ortamı içeren 6 kuyu doku kültürü ile işlenmiş bir plakaya dönüştürin. Hücrelerin% 5 CO 2'li bir inkübatörde 37 ° C'de12saat boyunca plastik yüzeye yapışmasına izin verin.
NOT: Gece kuluçkadan sonra, hücrelerin büyük çoğunluğu (~%90) bağlanır. Bu noktada, yapışık hücreler üçgen veya hafifçe uzatılmış bir şekle sahip oldukça homojen görünecektir. - Eski ortamı hafifçe aspire ederek ve hemen 1 mL kalsiyum veya magnezyum olmadan 1 mL sıcak steril PBS ile değiştirerek ortamı her gün değiştirin ~ 1 dakika. PBS'yi aspire edin ve 3 mL önceden ısıtılan MEPM kültür ortamı ile değiştirin.
- Hücreleri %100 birleştikten sonra geçiştirin.
NOT: MEPM hücreleri neredeyse her gün sayıyı ikiye katlayarak çoğalmalıdır.- Hücreleri geçirmek için, eski ortamı hafifçe aspire edin ve hemen ~1 dakika kalsiyum veya magnezyum olmadan ılık PBS ile değiştirin. PBS'yi aspire edin ve 0,5 mL önceden ısınmış % 0,25 tripsin ile değiştirin.
- ~5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya ya da hücreler elle hafifçe sallandığında çanak yüzeyinden kopana kadar kuluçkaya yaslanın. Hücreler ayrıldıktan sonra, trypsinized hücrelerine hemen 5 mL önceden ısıtılan MEPM kültür ortamı ekleyin.
- 10 mL serolojik pipet kullanarak, hücreleri 15 mL konik bir tüpte hafifçe toplayın ve hücreleri peletmek için tüpü 200 × g'da 5 dakika santrifüjlayın. Trypsin ve ortamı aspire edin ve hücreleri 3 mL önceden ısıtılan MEPM kültür ortamında yeniden biriktirin. 1 mL'lik hücreleri 6 kuyulu bir yemeğin tek bir kuyusuna hafifçe borulayın ve toplam hacmi 3 mL'ye çıkarmak için 2 mL MEPM kültür ortamı ekleyin.
NOT: Bu, hücrelerin 1:3 bölünmeini oluşturur. MEPM'ler en fazla üç kez geçiş yapılabilir. MEPM'lerin tohumlama yoğunluğu biraz esnektir ve mevcut hücre sayısı kültleme kabına bağlı olarak değişir. Bununla birlikte, MEPM'ler çok seyrek bölündüklerinde düzgün bir şekilde çoğalmaz ve yapıştıktan sonra yeni yemeklerinde en az% 20-25 birleştiğinde olmalıdır.
4. MEPM hücrelerinin kriyoprezervasyonu
- Trypsinized MEPM hücreleri peletlendikten sonra, ~ 1 × 106 hücre / mL konsantrasyon elde etmek için MEPM kültür ortamındaki hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri cryovials içine boru ve hücre stoğunda% 5 dimetilsüllfoksit son konsantrasyon ekleyin. Cryovial'ı kaplayın, ters çevirerek kısa bir süre karıştırın ve şişeleri hemen 1 °C / dk hızında soğuyan bir dondurucu kaba yerleştirin.
- Soğutucuyu gece boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirin. Ertesi gün, kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı bir azot tankına taşıyın.
- Cryopreserved MEPM hücrelerini çözme
- Cryovials sıvı azot tankından çıkarın ve içeriği sıvı olmaya başlayana kadar oda sıcaklığında çözün. İçeriği, 9 mL önceden ısıtılan MEPM kültür ortamı içeren 15 mL konik bir tüpe boşaltın.
- Hücreleri peletmek için tüpü 200 × g'da santrifüj edin. Hücreleri 1 mL MEPM kültür ortamında yeniden biriktirin ve hücreleri 6 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusuna boru haline koyun. Toplam hacmi 3 mL'ye çıkarmak için 2 mL sıcak MEPM kültür ortamı ekleyin.
- %5 CO2'libir inkübatörde 37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Ortamı günlük olarak değiştirin.
5. MEPM hücrelerinin canlı görüntülenmesi - 2B toplu göç tahlilleri (Şekil 2)
- Canlı görüntüleme için kullanmak üzere bir plaka hazırlayın.
- Steril 2 kuyulu silikon kesici ucu ~1 mm yüksekliğe kısaltmak için küçük cerrahi makas veya keskin bir neşter kullanın. Kullanılan her örnek için bir kesici uç hazırlayın.
- Uzun uçları kullanarak, kısaltılmış 2 kuyulu silikon kesici ucu 6 kuyulu bir plakanın kuyusunun ortasına yerleştirin. Tamamen yapışıldığından emin olmak için tüm kenarlara bastırın.
- Bu protokolün bölüm 4.3'teki adımları izleyerek kriyoprezer korunmuş hücreleri çözün. MEPM hücrelerini sayın ve kısaltılmış silikon kesici uçların tohum 300 hücresi/mm2'si kuyu başına toplam 40-50 μL MEPM kültür ortamı hacminde. Hücreleri% 5 CO2ile bir inkübatörde 37 ° C'de bir gecede kültür edin.
- Ertesi gün, canlı zaman atlamalı görüntüleme için hazırlanın.
- Sahne içi inkübatör ve otomatik görüntüleme özelliğine sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanın. Kültür ortamının buharlaşmasını azaltmak için sahnedeki inkübatör rezervuara su ekleyin; sıcaklığı 37 °C ve CO2'yi % 5'e ayarlayın. Sahnedeki inkübatöre 6 kuyulu tabağı yerleştirmeden önce nemin birikmesi için ~30 dakika izin verin.
- Zaman atlamalı görüntüleme için aşağıdakine eşdeğer ayarları kullanın.
- Geniş görüş alanlarına ve faz kontrast filtresine sahip olmak için 4x hedefini seçin.
NOT: Otomatik netleme, Otomatik bulma örneği, z yığını ve otomatik aydınlatma genellikle gerekli değildir. - Kısaltılmış silikon uçların lümenini yakalamak için kuyu başına iki mikroskobik alan seçin. Tüm görüntüleme konumlarının doğru netlemede olduğundan emin olun.
NOT: Görüntü düzlemleri görüntüleme sırasında ayarlanabilir, ancak bu ayarlama genellikle gerekli değildir. - İstediğiniz görüntü çıktısı dosya türünü seçin, ardından otomatik video oluşturma ve filigranlar gibi görüntüleme sonrası seçenekleri istediğiniz gibi seçin veya devre dışılayın. Varsa, görüntüleme modu olarak faz karşıtlığını seçin.
NOT: Filigranların kullanılması sonraki görüntü işleme adımlarını engelleyebilir. - Kaydın süresini 72 saat olarak ayarlayın. Programı her 10 dakikada bir görüntü yakalayacak şekilde ayarlayın.
NOT: Genellikle sadece 48 saat görüntüleme gereklidir, ancak görüntüleme, zaten çekilmiş olan görüntüleri kaybetmeden 72 h işaretinden önce herhangi bir noktada durdurulabilir. - Çevre odasının 5.3.1'de gerektiği gibi çalışır durumda olduğundan emin olun. Bu ayarları (yordamı) kaydedinve görüntülemeye başlayın.
- Geniş görüş alanlarına ve faz kontrast filtresine sahip olmak için 4x hedefini seçin.
- Görüntülemeye 72 saate (veya belirtilen süreye) kadar devam edin.
6. Mepm Hücrelerinin yara onarım testinde canlı görüntülenmesi (Şekil 3)
- Canlı görüntüleme için kullanmak üzere bir plaka hazırlayın. Tostiyarı kullanarak, 6 kuyulu bir plakanın kuyusunun ortasına steril bir 2 kuyu silikon kesici uç yerleştirin ve tamamen yapışıldığından emin olmak için tüm kenarlar boyunca bastırın. Kullanılan her örnek için bir adet 2 kuyulu kesici uç hazırlayın.
- Bu protokolün bölüm 4.3'teki adımları izleyerek kriyoprezer korunmuş hücreleri çözün. MEPM hücrelerini sayın ve gerekirse hücreleri en az 350 hücre/μL'ye konsantre edin.
- Kuyu başına 100 μL MEPM kültür ortamı hacminde silikon kesici uçlara 1400 hücre/mm2 tohum. %5 CO2'libir inkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca hücreleri kültüre edin ve ortamı her gün değiştirin.
- 48 saat sonra, 5.3 ve 5.4 bölümlerinde açıklandığı gibi canlı zaman atlamalı görüntüleme için bir mikroskop hazırlayın. Hücreleri sahnedeki inkübatöre yerleştirmeden hemen önce, kuyuya (ancak kesici uçların dışında) 3 mL önceden ısıtilmiş MEPM kültür ortamı ekleyin ve ardından silikon uçları dikkatlice çıkarın.
NOT: 2 hazneyi ayıran duvar "yara" olan bir boşluk bırakır. - 5.4'te açıklandığı gibi zaman atlamalı görüntülemeye aşağıdaki farklarla başlayın:
- Daha yüksek bir büyütme (örneğin, 10x) hedefi kullanın. Yara kapatmayı yakalamak için, her yara boyunca 5 görüş alanı seçin, böylece yara görüntünün dikey ekseniyle paralel olur.
- 72 saat sonra veya yaralar tamamen kapandığında görüntülemeyi bırakın.
7. Zaman atlamalı görüntü dizilerinin hesaplama analizi
NOT: Python yorumlayıcısı, C derleyicisi ve kabuk gibi standart hesaplama araçlarıyla donatılmış bir bilgisayarda aşağıdaki yordamları gerçekleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Konfülerlik analizi
NOT: Bu prosedür seyrek bir kültür içinde hücre çoğalmasını tahmin etmek veya yara kapatma deneylerini ölçmek için kullanılabilir. Hücrelerin kapladığı alanları algılamak için, görüntü parlaklığının yerel standart sapması için bir segmentasyon eşiği uygulanır. Kod daha önce Wu ve ark.33 ve Neufeld ve ark.34 tarafından tanımlanmıştır ve http://github.com/aczirok/cellconfluency mevcuttur.- Görüntüler için segmentasyon eşiğini belirleyin. Örnek olarak, eşik 4 olan segmentasyonu görmek için
segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test çıktısı.jpg
ve sonra çıktıyı kontrol edin (çıkış.jpg).
NOT: Eşik çok düşükse, mikro grafikteki arka plan alanları hücre kaplı olarak sınıflandırılır. Buna karşılık, eşik çok yüksekse, hücre kaplı alanlar bu şekilde sınıflandırılmamıştır. En uygun eşik değeri her iki hatayı da en az düzeyde tutar. - Bir dizi görüntü için izdiah değerlerini hesaplamak için sağlanan area.sh komut dosyasını kullanın
area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > bir izdiah.dat
NOT: Ayrımcılık eşiği değeri 4, adım 1'de doğrulanır ve sonuçlar dosya konfluency.dat. Görüntüleri uygun klasörler halinde sıralayarak, görüntü dosyası adlarının listesi joker karakter belirtimiyle değiştirilebilir:
area.sh -S4 *.jpg > konfluensi.dat - Yara kapatma deneyleri için, konflüens verilerini A(t)-zaman içinde yara kenarı yayılma hızı V'nin bir işlevi olarak ifade edilen hücre kaplı alanın boyutunu
burada w alanın genişliğini gösterir ve dA/dt, A(t) zaman türevidir, yani hücre kaplı alanın genişleme hızıdır.
- Görüntüler için segmentasyon eşiğini belirleyin. Örnek olarak, eşik 4 olan segmentasyonu görmek için
- Hücre hareketliliği haritası
- Hücre hareketliliğini karakterize etmek için bir parçacık görüntü velosimetrisi (PIV) algoritması yürütün ve görüntü çiftleri arasındaki yerel hareketin "optik akışı" kapsamını çıkarın, ancak tek tek hücreleri tanımlamak için değil.
NOT: Burada, Zamir ve ark. 35 ve Czirok ve ark. 36 tarafından ayrıntılı olarakaçıklandığı gibi,50 μm'lik bir başlangıç pencere boyutu kullanılır. PIV analizi, her görüntü çerçevesi t ve konum (görüntü içinde) x için v(x,t) hız alanı verir. - Hücre hareketliliğinin ortalama hızını v(x,t)'den, bölüm 7.1'de belirlendiği gibi, hücrenin işgal ettiği alan üzerinde hesaplanan uzamsal ortalama olarak çıkarın.
- Hücre hareketliliğini karakterize etmek için bir parçacık görüntü velosimetrisi (PIV) algoritması yürütün ve görüntü çiftleri arasındaki yerel hareketin "optik akışı" kapsamını çıkarın, ancak tek tek hücreleri tanımlamak için değil.
- El ile hücre izleme
NOT: PIV analizi hücre hareketliliğinin otomatik bir değerlendirmesini sağlarken, tek tek hücrelerin davranışlarına odaklanmak genellikle manuel izleme gerektirir. Birkaç araç bu işlevselliği sağlarken, manuel olarak konumlandırılmış işaretleyicilerin ilk yerleşimlerinden sonra değiştirilip değiştirilemeyeceği ve izlemenin zaman içinde hem ileri hem de geri gerçekleştirilebilmesi çok yararlıdır.- Yörünge segmentlerini silme gibi temel düzenleyici işlevlerini de sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir python aracıyla (http://github.com/donnagreta/cm_track) hücre izleme gerçekleştirin.
NOT: Bu el ile izleme aracı, bir metin dosyasındaki t hücresinin P(i,t) konumlarını verir ve
cm_track.py -i images/ -o parça.dat
zaman atlamalı görüntülerin klasör görüntülerinde/ / ve konum verilerinin dosya parçalarında toplandığı durumlarda.dat (Şekil 4).
- Yörünge segmentlerini silme gibi temel düzenleyici işlevlerini de sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir python aracıyla (http://github.com/donnagreta/cm_track) hücre izleme gerçekleştirin.
Şekil 4: Tek tek hücre yörüngelerinin analizi. (A) Faz kontrastlı zaman atlamalı mikrografiler, hücreleri (yeşil noktalar) işaretleyen manuel bir izleme prosedürüne(B, C)tabi tutulur. (D) Hücre konumları (x,y) kimliği ile ayırt edilen her hücre için saklanır ve her kare için f. (E) Yörüngeleri mikrografiler üzerinde kaplanabilir ve zamansal bilgileri belirtmek için renk kodlu olabilir. Örnek olarak, her yörüngede, maviden kırmızıya renk paleti, sırasıyla ilk ve son hücre konumlarını işaretleyen kırmızı ve mavi ile aşamalı olarak daha sonraki yörünge segmentlerini gösterir. (F) Ortalama kare yer değiştirme gibi yörüngelerin çeşitli istatistiksel özellikleri ayıklanabilir ve bu örnekte wildtype (wt, mavi) ve knockdown (kd, red) MEPM hücrelerini içeren çeşitli hücre popülasyonlarının hareketliliğini karakterize etmek için kullanılabilir. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder.
- İkinci bir araç kullanarak görüntülerdeki yer paylaşımı yörüngeleri,
visdat.py -d parça.dat -i images/ -o kaplama/ -l999 -r3 -C2 - Klasör yer paylaşımına yer kaplayan yörüngeleri olan görüntüleri toplayın.
NOT: Bu örnekte, zaman atlamalı görüntü sırası klasör görüntüleri içindeyken, hücre konumu verileri dosya izleme.datdepolanır. Parametrelerin geri kalanı çizilen yörüngelerin (-l), sembollerin (-r) boyutunu ve kullanılan renk düzenini (-C) maksimum uzunluğunu kontrol eder.
- Tek tek hücre yörüngelerinin analizi
- Yörüngeleri toplam yol uzunluğuna göre karakterize etme
,
ve yaraya doğru net yer değiştirme
,
burada X, P'nin yaraya dik yöndeki projeksiyonunu gösterir: yara y eksenine paralel olduğunda pozisyonların x koordinatı. - Her hücre i
ve zaman noktası t37için olduğu gibi rehberlik verimliliğini hesaplayın. Kültürleri, uygun bir zaman noktasında değerlendirilen bu tek hücreli önlemlerin nüfus ortalaması ile karakterize edin t.
- Yörüngeleri toplam yol uzunluğuna göre karakterize etme
- Hücrelerin toplu akış hareketi
- Hücre hareketlerinin yerel uzamsal korelasyonlarını, daha önce açıklandığı gibi hareketli bir hücrenin çevresindeki diğer hücrelerin ortalama hızı ile karakterizeedin 38,39.
NOT: Hesaplama kodu https://github.com/aczirok/flowfield.- Bir referans sistemini ön, arka, sol ve sağ yönleriyle her vektör v(x,t) (Şekil 5A)ile hizalayın. Çevredeki hücrenin veya PIV hızı vektörün her birini referans sisteminin uygun uzamsal hücresine atayın (Şekil 5B). Her vektör referans sistemlerinin kaynağı olarak hizmet ettiği için prosedürü tekrarlayın (Şekil 5C,D) böylece belirli bir hız vektörü birden çok depo gözüne atanır.
NOT: Bir veri noktası bir vektörün önünde ve başka bir vektörün solunda olabilir. - Referans sistemlerini ortak bir yönde döndürün (Şekil 5C, F) ve bunları bir kenara alın ( Şekil5G).
NOT: Havuza alınan hız verilerinin her bir kutusunun ortalaması, uzamsal korelasyonun göstergesi olan bir hız vektörüdür (U): ortalama paylaşılan bir hız bileşeninin ölçüsüdür (Şekil 5H). - U(x) akış alanlarını üstel bir işlevle
sığdırın , burada a, x0 ve U0 parametreleri sığdırır. Üç bağlantı parametresi arasından, lokal hız-hız korelasyonlarının kaybolduğu karakteristik mesafe olan korelasyon uzunluğu (Şekil 5I,J) olan x0'a odaklanın.
- Bir referans sistemini ön, arka, sol ve sağ yönleriyle her vektör v(x,t) (Şekil 5A)ile hizalayın. Çevredeki hücrenin veya PIV hızı vektörün her birini referans sisteminin uygun uzamsal hücresine atayın (Şekil 5B). Her vektör referans sistemlerinin kaynağı olarak hizmet ettiği için prosedürü tekrarlayın (Şekil 5C,D) böylece belirli bir hız vektörü birden çok depo gözüne atanır.
- Hücre hareketlerinin yerel uzamsal korelasyonlarını, daha önce açıklandığı gibi hareketli bir hücrenin çevresindeki diğer hücrelerin ortalama hızı ile karakterizeedin 38,39.
,
,
ve zaman noktası t37için olduğu gibi rehberlik verimliliğini hesaplayın. Kültürleri, uygun bir zaman noktasında değerlendirilen bu tek hücreli önlemlerin nüfus ortalaması ile karakterize edin t.
sığdırın , burada a, x0 ve U0 parametreleri sığdırır. Üç bağlantı parametresi arasından, lokal hız-hız korelasyonlarının kaybolduğu karakteristik mesafe olan korelasyon uzunluğu (Şekil 5I,J) olan x0'a odaklanın.
Şekil 5: Kültürlü hücrelerin akış oluşumunun karakterizasyonu. (A,D) Şekil 4A'dan faz kontrastı zaman atlamalı görüntüler hücre hareketlerini tanımlamak için kullanılır. Her hareketli hücre için, bitişik hücreleri önde, arkada, solda veya sağda olarak kategorize etmek için bir referans çerçevesi (mavi) ve uzamsal kutular (beyaz) birlikte hizalandı. (B,E) Bitişik hücrelerin (siyah vektörler) hızı aynı referans çerçevesiyle(C,F) ilişkiliydi. Bu prosedür her hücre ve zaman noktası için tekrarlandı. (G) Bu yerel bilgileri biriktikten sonra, her depo gözü, ortalama bir hareketli hücreye göre çeşitli konumlarda ortalama birlikte hareket eden hızı (macenta okları) belirlemek için ortalama alınabilen birden fazla hız vektörü (gri) içerecektir. (H) Ortalama hız haritası böylece hareketli bir hücreye göre çeşitli yerlerdeki tipik hücre hızlarını karakterize eder. (I,J) Son olarak, bu alan ön-arka (paralel) eksen boyunca ve ayrıca sol-sağ (dik) eksen boyunca örneklenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Palatal rafların diseksiyonu Şekil 1'degösterilmiştir. Kesi dizisi, dokunun kaymasını en aza indirmek için tasarlanmıştır. Başın çıkarılmasından sonra (Şekil 1A,B), alt çene çıkarılır (Şekil 1B,C). Başın üst kısmının kesisi (Şekil 1C,D) baş aşağı yerleştirildiğinde dokuyu stabilize etmek içinyapılır (Şekil 1E,noktalı çizgiler), kıstırma (Şekil 1F) ve tüketim (Şekil 1G) palatal raflar.
Tek bir embriyodan ekscised palatal raf çifti, 35 mm'lik bir tabakta veya 6 kuyulu bir tabakta denenmiş ve kültürlenmiştir. Hücre yoğunluğu optimal büyüme için çok düşük olduğu için daha büyük yemekler tercih edilir. Birleştiğinde, her kuyudaki hücreler denenerek 35 mm eşdeğeri üç kuyuya iletilir (geçiş #1). #1 geçidinden gelen birleştiği hücreler daha sonra 1 × 106 hücre/mL'lik aliquotlara dondurulabilir. Dondurulmuş aliquots daha sonra 35 mm eşdeğeri bir tabakta yetiştirilir ve birleştiğinde yetiştirilir. Hücreler daha sonra denenerek (pasaj #2) ve deneye göre tohumlanır. Donmuş aliquotların oluşturulması ve kullanılması, özellikle hücre yoğunluğu açısından koşulların normalleştirilmesine yardımcı oldu. Taze MEPM hücrelerinin kullanımı, yeni kültürlerde yaşanabilir veya alt canlı hücrelerin değişken bir oranından kaynaklandığına inanılan deneylerde nihai hücre yoğunluğunda daha fazla değişkenlik ile sonuçlandı. Buna ek olarak, MEPM hücre pasajlarının sayısı bu deneyler için kesinlikle iki (yukarıda listelenmiştir) ile sınırlandırıldı.
a) Hücre yoğunluğunun kritik olduğu düşünüldüğünde, b) Tek embriyodan alınan MEPM hücreleri sınırlıydı ve c) Görüntüleme optikleri büyük bir tabakta daha iyiydi, 2 kuyulu silikon kesici uçlar kullanıldı (Şekil 2 ve Şekil 3). Yara onarım tahlilleri için, MEPM hücreleri 2 kuyulu silikon kesici uçlarda yüksek izdihama kadar yetiştirildi, daha sonra kesici uçlar çıkarıldı ve yara kapanmaya kadar görüntülendi (Şekil 3). Bununla birlikte, 2B kültürü için, MEPM hücrelerinin büyüdükçe görüntülemeye ihtiyacı vardı, bu nedenle 2 kuyulu silikon ekler, net görüntülemeye izin vermek için boylarının 1/3rd'sine kadar kesildi ( Şekil2C). 2D hareketlilik analizi için 35 mm'lik tabaklarda40 adet küçük 3D baskılı halkalar da kullanılmıştır(Şekil 2D).
MEPM yörüngeleri (Şekil 4E) kalıcıdır: hücre hareketliliğinin yönü birkaç saat boyunca korunur. Ortalama yer değiştirme ve zaman analizi (Şekil 4F) yer değiştirme biçimindeki kalıcılığın geçen zamanla orantılı olduğunu gösterir. MEPM hücrelerinin doku kültürü plastik yüzeyindeki tipik hızı olan 10 μm/h, hücre kültürünün kalite kontrolü için de kullanılabilir. Hareketlilik verilerinin akış analizi, MEPM hücrelerinin birlikte hareket eden kümelerinin ~300 μm boyutunda olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 5I,J). Temsili sonuçlar ayrıca vahşi tip ve mutant MEPM hücreleri arasında derin bir hareketlilik farkı olduğunu göstermektedir. Wildtype ve mutant karşılaştırmasına ek olarak, hem 2D hem de yara onarım tahlilleri çeşitli biyokimyasal tedavilerle birleştirilebilir. Örneğin, PI3K-AKT yol aktivatörleri, daha önce açıklandığı gibi MEPM hücreleriyle birlikte kullanılmıştır 21.
Şekil 1: Mezenkimal hücreleri izole etmek için embriyonik palatal rafların diseksiyonu. (A) Boyun boyunca (kırmızı çizgi) kesilerek bir E13.5 fare embriyo kafası çıkarılır. (B) Daha sonra, alt çene ve dil ağız boşluğu boyunca, üst ve alt çeneler arasında (sarı çizgi) kesilerle çıkarılır. (C) Palatal rafın çıkarılması için dokuyu stabilize etmek için başın üst kısmı ekssizyon (yeşil çizgi). (D) Ortaya çıkan parçalanmış üst çene bölgesi, palat raflarını (siyah noktalı çizgiler) görselleştirmek için baş aşağı (E) yerleştirilir. (F) Bireysel palatal rafların eksizyonu, tek tek çıkıntılı rafların (sarı) maksilladan (mavi) kıstırıldığı şematik olarak tasvir edilir. (G) Tek bir embriyodan ekscised palatal raf çifti, daha sonra 35 mm'lik bir tabakta veya 6 kuyulu bir tabakta denenebilir ve kültürlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 2D MEPM hücre kültürünün deneysel kurulumu. (A) MEPM hücrelerinin donmuş bir aliquotunu çözün ve (B) hücreleri 35 mm'lik bir tabakta veya 6 kuyulu bir tabakta kültüre edin. Birleştiğinde, hücreleri deneyin ve protokolde açıklandığı gibi 35 mm'lik bir tabakta (C) 2 kuyulu silikon ekler veya 3D baskılı halkalarla (D) tohumlayın. Küçük bir kültür alanı, çok sayıda MEPM hücresine olan ihtiyacı en aza indirir. Kırpılmış silikon uçların veya 3D baskılı halkaların düşük profili, hale etkisi olmadan doğrudan görüntülemeye izin verir. Zaman atlamalı görüntüleme, istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar devam edebilir ve bu da 72 saate kadar çıkabilir. Temsili görüntüler (E) 0 h, (F) 24 saat ve (G) 45 saat zaman noktalarında gösterilir. Görüntüler 4x hedefi kullanılarak çekildi. E, F, G = 300 μm için ölçek çubukları. Kısaltmalar: 2D = iki boyutlu; MEPM = fare embriyonik palatal mezenkim; 3D = üç boyutlu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MEPM hücreleri kullanılarak yara kapatma testinin deneysel kurulumu. (A) MEPM hücrelerinin donmuş bir aliquotunu çözün ve (B) kültür hücrelerini 35 mm'lik bir tabakta veya 6 kuyulu bir tabakta çözün. Birleştiğinde, hücreleri trypsinize edin ve (C) 35 mm'lik bir tabakta 2 kuyu silikon ekler tohumlayın. İstenilen izdiham elde edilene kadar kesici uçtaki hücreleri kültüre edin (~48 h), ardından silikon kesici ucu ve görüntüyü çıkarın. Temsili görüntüler (D) kesici ucun çıkarılmasından hemen sonra, (E) 24 saat sonra ve (F) 40 saat sonra gösterilir. Yara kapatma yaklaşık 36 saat sürer. Görüntüler 10x hedefi kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu 300 μm'dir. Kısaltmalar: MEPM = fare embriyonik palatal mezenkim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Palatal raf yüksekliği dikeyden yataya yeniden şekillendirme olayı1, 3,4,9,11oluşturur. Bu tadilat işleminin palatal raf mezenkimal hücrelerin koordineli davranmasını gerektirdiği açıktır. Wildtype MEPM hücreleri ile yapılan analizler, bu hücre davranışının içsel olduğunu ve21. Bu nedenle, bu tahliller, yarık damak yeni ve mevcut fare modellerinde birincil damak rafı yükseklik kusurlarını ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bölüm 1 ve 2'de özetlenen yöntemler, araştırmacıların birincil MEPM hücrelerinin aliquotlarını izole etmelerine, kültüre etmelerine ve dondurmalarına izin vermelidir. Bu hücreler daha sonra burada açıklanan 2D kültürü ve yara onarım tahlilleri de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. 2B kültür, zaman atlamalı görüntüleme ile birleştirildiğinde, bir dizi hücre yoğunluğu üzerinden temel hücre özniteliklerini belirlemek için basit bir yöntem sunar. Burada sunulan, kolektif hücre hareketinin nitelikleri olan hücre hizalamasını ve hücre akışı oluşumunu değerlendirmek için bir yöntemdir (Şekil 4). Yara kapatma tahlilleri genellikle hücre göç41 , 42,43'ü değerlendirmek için kullanılır. "Yaranın" hücresiz bölgesi, çevredeki hücrelerin yönlü hareketi için bir işaret sağlar. Bu sürecin hızlandırılmış görüntülemesi, geçiş sırasında hücre yörüngelerinin belirlenmesini ve değerlendirilmesini sağladı. Bu hücre yörüngeleri, sırayla, hücre geçiş hızını ve yönlülüğünü belirler (Şekil 5).
Önce yalnızca wildtype MEPM hücrelerini kullanarak kültür ve tahlil koşullarını optimize etmek önemlidir. Palatal raflar başarıyla denendikten ve ortaya çıkan tek hücreli süspansiyon bir gecede kaplandıktan sonra, hücrelerin büyük çoğunluğu (~% 90) yemeğin büyüme yüzeyine kolayca yapışacaktır. Hücreler kolayca yapışmazsa, kültür koşullarında bir sorun olabilir. Başlangıçta, yapışık hücreler üçgen veya hafifçe uzatılmış bir şekle sahip oldukça homojen görünecektir, ancak yüksek yoğunluğa büyüdükçe, daha iğ şeklinde ve uzun hale gelir (Şekil 2). Hücreler büyük ölçüde büyük veya çok sayıda olursa, deneyler için kullanılmamalıdır. Bu optimizasyon ayrıca başarılı büyüme (izdiham zamanı) ve yara onarımı (kapanma zamanı) için temel wildtype parametrelerini de oluşturacaktır. Hücreler neredeyse her gün ve zaman atlamalı görüntülerde sayıca iki katına çıkararak çoğalmalı, ~5-10 μm / s hareketlilik göstermelidir. Benzer şekilde, wildtype-mutant karşılaştırması içeren sonraki herhangi bir deneyde, bu temel parametreler wildtype hücreleri tarafından karşılanmazsa, deneyin analizden dışlanmaları gerekebilir. Örneğin, wildtype MEPM hücrelerinin 2 kuyulu silikon uçları kullanarak yarayı tamamen kapatması 36-40 saat sürer. Bir deneyde, wildtype hücrelerinin yarayı kapatması 40 saatten önemli ölçüde uzun sürerse, tüm deney şüpheli olacaktır. MEPM hücrelerinden gelen düşük performans, 1) zayıf dondurulmuş aliquot kalitesi, 2) zayıf canlanma veya 3) aşırı farklılaşmadan kaynaklanabilir. Farklılaştırılmış veya senescent hücreler çok büyüdükçe ve bölünmedikçe görsel olarak tespit edilebilir. Bu tür hücrelerin çok sayıda olduğu bir kültürden kaçınılmalıdır. Genel olarak, 10x hedefin görüş alanında anormal hücreler olmamalıdır (Şekil 3); görüş alanı dışındaki bir veya iki hücre analizi maddi olarak etkilememelidir. Analizin yalnızca iki hücre geçişiyle (yukarıda) sınırlandırılması, MEPM hücrelerinin kalitesinin korunmasına büyük ölçüde yardımcı olur.
Birincil MEPM hücrelerini kullanan hem 2B kültür hem de yara onarım tahlilleri için, başarı için temel gereksinim yüksek bir başlangıç hücre yoğunluğuydu. Bu gereksinim ilk olarak, hücrelerin >1400 hücre/mm2'detohumlandığının yara onarım testinin optimizasyonu sırasında belirlendi. Yaraya göç eden hücrelerin yoğunluğu daha sonra 2D kültür tahlillerinde tohumlama yoğunluğu olarak kullanılmıştır. ~300 hücre/mm2 tohumlama yoğunluğu hücre akışları oluştururken, hücre yörüngelerinin otomatik analizine izin verdi. 300 hücre/mm2'den yüksek yoğunluklar, gözle görselleştirilebilen, ancak bireysel hücre takibini zorlaştıran daha canlı akışlar oluşturma eğilimindedir. Wildtype ve mutant embriyolardan birincil MEPM hücreleri karşılaştırılırken, yara kapatma gecikmesi hesaplamalı analiz yapılmadan değerlendirilebilse de, akış oluşumu ve yönlülük farklılıkları gözle ayırt edilemeyebilir. Hücre yoğunluğu çok yüksekse veya görüntü kalitesi zayıf/bulanıksa, örneğin odak kaybı nedeniyle otomatik hücre takibi zor olabilir. Böyle bir durumda, ImageJ kullanarak yara onarım tahlillerinde hücre yörüngelerini belirlemek için manuel hücre izleme kullanmak mümkündür. Hücre takibini kolaylaştırmak için çok düşük bir Hoechst nükleer leke konsantrasyonu (MEPM kültür ortamında 3 μL / mL 20 mM çözelti) de kullanılabilir; bununla birlikte, floresan lazer toksisitesi uzun süreli kullanımda bir sorun olabilir.
Manuel izleme için, yüksek hücre yoğunluğu daha fazla izlemeyi gizleyene kadar, hücreleri yara kapatmanın sonundan mümkün olduğunca geriye doğru izlemek daha kolaydı. Kısmi hücre yörüngeleri bile, bir hücre popülasyonu için birleştirildiğinde bilgilendiriciydi. Yara onarım testlerinin aksine, 2D hücre kültürü analizi için otomatik hücre takibi gereklidir, bu da ara hücre yoğunluklarının seçilmesinin bir nedenidir. Son olarak, damak yüksekliğini etkileyebilecek bileşikleri ve yolları tanımlamak için hassas birincil MEPM tabanlı analizler kullanılabilir. Önceki çalışmalar, PI3K-AKT yolunun aktivasyonunun Specc1l mutant MEPM hücrelerinin hem hücre hızını hem de yönlülüğünü geliştirdiğinibelirtmiştir 21. Diğer MEPM çalışmaları da aşağı akış sinyal basamaklarını uyarmak veya çoğalma değerlendirmek için çeşitli büyüme faktörü veya ilaç tedavileri kullanmıştır22,29,30,44,45. Bu nedenle, MEPM tabanlı analizler, daha sonra vivo olarak doğrulanabilen daha birçok olumlu veya olumsuz düzenleyici faktörü belirlemek için hızlı bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu proje kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri TARAFıNDAN DE026172 (I.S.) ve GM102801 (A.C.) hibeleri tarafından desteklendi. I.S. ayrıca kısmen Biyomedikal Araştırma Mükemmelliği Merkezi (COBRE) hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM104936), Kansas IDeA Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Ağı hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM103418) ve Kansas Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (KIDDRC) hibesi (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development) tarafından desteklendi. HD090216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C.
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D.
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).
