Summary
Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.
Abstract
A dissociação celular tem sido um procedimento essencial para estudos no nível de células individuais e/ou a nível de população celular (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e cultura celular primária). Produzir células viáveis e saudáveis em grandes quantidades é crítico, e as condições ideais para fazê-lo são dependentes de tecidos. As populações celulares no epitélio da língua e no tecido mesenquime/conjuntivo subjacente são heterogêneas e as estruturas teciduais variam em diferentes regiões e em diferentes estágios de desenvolvimento. Testamos protocolos para isolar células do epitélio da língua do rato e do tecido mesenquime/conjuntivo nas fases de desenvolvimento inicial [dia embrionário 12.5 (E12.5)] e jovens adultos (8 semanas). Uma separação limpa entre o epitélio e o tecido mesenquime/conjuntivo subjacente foi fácil de realizar. No entanto, para processar e isolar ainda mais as células, produzir células saudáveis viáveis em grandes quantidades, e seleção cuidadosa de tampão de digestão enzimática, tempo de incubação e velocidade e tempo de centrifugação são críticos. Incubação de epitélio separado ou tecido conjuntivo/mesenquime subjacente em 0,25% Trippsin-EDTA por 30 min a 37 °C, seguido por centrifugação a 200 x g por 8 min resultou em um alto rendimento de células a uma alta taxa de viabilidade (>90%) independentemente dos estágios do rato e regiões da língua. Além disso, descobrimos que tanto células epiteliais dissociadas quanto mesenquimais/conjuntivas de línguas embrionárias e adultas poderiam sobreviver no meio baseado na cultura celular por pelo menos 3 h sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Os protocolos serão úteis para estudos que requerem a preparação de células isoladas de línguas de camundongos em estágios de desenvolvimento precoce (E12,5) e jovens adultos (8 semanas) que requerem dissociação celular de diferentes compartimentos teciduais.
Introduction
A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células individuais, que é projetado para entender o transcriptome de tecido complexo em uma resolução unicelular1,2,3,4. A cultura celular primária tem sido comprovadamente uma ferramenta útil para estudar a função e diferenciação de células-tronco/progenitoras para as papilas gustativas5,6. Esses estudos requerem uma grande quantidade de populações de células isoladas de alta qualidade (por exemplo, número celular total suficiente com concentração adequada e alta viabilidade).
Assim, é necessário isolar células de diferentes regiões dos tecidos linguais e em diferentes estágios de desenvolvimento. Atualmente, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e tecido mesenquime/conjuntivo subjacente. Aqui, relatamos um método otimizado de dissociação celular para preparar células para experimentos que requerem uma alta qualidade de células vivas, como para sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Descobrimos que a seleção de tampão de digestão enzimática, pipetação suave, seleção de meio de resuspensão e tempo e velocidade de centrifugação ideais são cruciais para gerar essas grandes quantidades de células de alta qualidade.
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Protocol
O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa.
1. Uso de animais
NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.
- Designe meio-dia do dia da detecção de plugue vaginal em camundongos como embrionário (E) dia 0,5. Use embriões em E12,5 e camundongos pós-natais com 8 semanas de idade para os seguintes experimentos.
2. Preparação antes do experimento
NOTA: Os instrumentos necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
- Instrumentos autoclave antes do experimento. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador de contas durante o experimento.
- Limpe a área cirúrgica, o microscópio de dissecação e o armário de biossegurança usando 70% de lenços de etanol. Ligue a luz UV do armário de biossegurança e mantenha-a acesa por 20 minutos antes do procedimento experimental.
- Prepare uma mistura enzimática de 1:1 dispase (5.0 mg/mL) e colagenase (2,0 mg/mL) para uma concentração final de 2,5 e 1,0 mg/mL, respectivamente, e filtre a solução usando filtro de seringa 0,22 μm7.
- Prepare 1 mL de mistura enzimápica para uma língua adulta ou 0,5 mL para uma região específica da língua (por exemplo, posterior ou língua anterior).
- Prepare 2 mL de mistura enzimápica para línguas embrionárias.
- Faça 10 mL de 2,5% BSA em 0,1 M PBS e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.
- Faça 500 μL de 5% de FBS em DMEM/F12.
- Faça 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.
3. Separação do epitélio da língua do mesenquime/tecido conjuntivo subjacente
- Separação do epitélio do mesenquime de uma língua de rato E12.5
- Eutanize camundongos gestantes cronometrado carregando embriões E12,5 colocando-o em uma câmara de CO2 seguido de luxação cervical.
NOTA: Os embriões de camundongos no E12.5 são coletados após as 12:00 (tarde) no 12º dia após a detecção do plugue vaginal nos camundongos gestantes. - Transfira ratos para a área cirúrgica. Molhe o abdômen do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.
- Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam embriões. Disseque os chifres uterinos usando tesouras dissecando e transfira para 15 mL de solução fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
- Dissecar os embriões (Figura 1A1) a partir de chifres uterinos sob um microscópio dissecando usando mini-tesouras e fórceps finos.
- Abra cuidadosamente a cavidade da boca, usando fórceps finos e dissecando a língua fora da mandíbula usando mini-tesoura(Figura 1A2).
- Lave as línguas usando 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
- Transfira os tecidos para 2 mL de mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) em um prato de cultura de 35 mm com espátula e fórceps finos em um armário de biossegurança. Incubar por 20 min a 37 °C.
- Transfira as línguas para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm e remova suavemente o mesenquime do epitélio do lado ventral usando fórceps finos.
NOTA: As folhas epiteliais podem ser separadas sem força mecânica durante a incubação. - Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.
NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).
- Eutanize camundongos gestantes cronometrado carregando embriões E12,5 colocando-o em uma câmara de CO2 seguido de luxação cervical.
- Separação do epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de camundongos adultos
- Eutanize o rato com 8 semanas de idade colocando-o em uma câmara de CO2. Confirme se o mouse é eutanizado sem respiração e resposta de pressão dianteira.
- Transfira os ratos para a área cirúrgica. Molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que os peles entrem na cavidade oral.
- Corte os cantos da boca ao longo da bochecha usando uma tesoura dissecando para abrir a cavidade oral. Dissecar a língua com mandíbula(Figura 1B1) e coloque-a em um prato plástico com uma camada de plástico.
- Utilizando fórceps cirúrgicos para segurar a língua sob um microscópio dissecando, injete a mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) no espaço sub-epitelial da língua através da borda de corte(Figura 1B1, setas) da língua posterior.
- Injete 1 mL de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido tanto da língua anterior quanto posterior.
- Injete 0,5 mL de mistura de enzima localmente à língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para a coleta de tecido de papila circunvaltada.
NOTA: A língua vai inchar à medida que a enzima se acumula(Figura 1B2). A injeção suave da enzima pode evitar que a pressão danifique o epitélio e mantenha o máximo de enzimas possível na língua.
- Enrole a língua com plástico e incubar a língua por 30 min a 37 °C.
- Use mini-tesoura para dissecar a ponta da língua e/ou papila circunvaltada, e use espátula e fórceps finos para transferir tecido para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
- Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço sub-epitelial digerido pela enzima usando mini-tesouras. Corte os tecidos em um tamanho adequado de acordo com a exigência de experimentos a jusante.
- Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.
NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).
4. Dissociação celular
NOTA: O protocolo de dissociação celular descrito aqui pode ser aplicado ao epitélio da língua e ao tecido mesenquime/conjuntivo em camundongos embrionários E12,5 e 8 semanas de idade. Para reduzir a perda de celular durante a agitação e transferência de suspensão celular, use dicas comerciais de pipeta de baixa retenção ou pontas de pipeta pré-revestidas com 2,5% de BSA em 0,1 M PBS no pH 7.48.
- Transfira os tecidos usando espátula e fórceps finos para 3 mL de 0,25% trypsin-EDTA em um novo prato de cultura de 35 mm por 30 min a 37 °C. Agitar suavemente tecidos a cada 5 minutos com pontas de pipeta de 1 mL.
NOTA: Não corte a ponta da pipeta, pois a borda de corte pode danificar fisicamente as células dissociadas. - Adicione 500 μL de 5% de FBS no DMEM/F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de 5 mL.
- Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente e remova o supernasce.
- Suspenda suavemente as células em 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA usando pontas de pipeta de 1 mL e filtre as células usando um coador de células de 70 μm, seguido por um coador de células de 35 μm.
- Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente. Remova a maior parte do meio e deixe 50-300 μL como o volume final para re-suspender as células.
NOTA: Ajuste a concentração das células de acordo com os requisitos dos experimentos a jusante alterando o volume final de suspensão de célula única.
5. Teste de contagem de células e viabilidade usando hemótmetro
NOTA: Para melhorar a precisão da medição, são recomendadas 3 réplicas técnicas para cada amostra.
- Misture suavemente 5-10 μL da suspensão de célula única com um volume igual de azul Trypan e adicione ao hemócito.
NOTA: Limpe bem o hemótmetro usando 70% de etanol antes de usar. As partículas de poeira no hemócito ficarão manchadas em azul escuro e afetarão a precisão do teste de viabilidade. Verifique o hemótmetro sob um microscópio. - Conte o número total de células, o número de células vivas (brancas) e o número de células mortas (azul escuro) manchadas pelo azul Trypan(Figura 2, setas) respectivamente em 4 quadrados com 16 grades(Figura 2) usando microscópio invertido com sistema de imagem.
- Calcule a concentração celular:
Concentração celular =
- Calcule a viabilidade:
Viabilidade =
- Calcule a viabilidade:
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Representative Results
Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacente
Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação.
Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B2), o que sugere que a enzima pode ser mantida pela língua. A inserção insuficiente da enzima e/ou da agulha profunda na mesenquime e/ou na penetração epitelial da língua pela agulha induzirá um inchaço parcial da área de injeção ou nenhum inchaço. Após a digestão da enzima, os tecidos conjuntivos subjacentes com digestão enzimada adequada ficam soltos e pegajosos. Uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível ao levantar suavemente a borda da folha epitelial.
Efeito da dissociação celular no número total do celular e viabilidade
Com o passo 4, línguas E12,5, as folhas epiteliais e finas camadas de mesenquime imediatamente sob o epitélio das línguas foram agrupadas, respectivamente. A contagem manual de células utilizando um hemócito (Figura 2) demonstrou que o protocolo produziu 63.917 células no total com uma viabilidade de 95,2% das folhas epiteliais (cerca de 0,3 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1A3), e 294.333 células no total com viabilidade de 96,3% do mesenquime (cerca de 0,3 mm2 de tamanho por língua) (Figura 1A4).
Usando 10 línguas adultas com 8 semanas de idade, foram agrupadas as camadas de tecido contélio da ponta da língua (onde as papilas gustativas são densamente distribuídas), folhas epiteliais de papilas circunvalladas e finas camadas de tecido conjuntivo imediatamente sob o epitélio das papilas circunvaloladas, respectivamente. Uma contagem manual de células utilizando o hemocitômetro (Figura 2) demonstrou que o protocolo produziu 187.333 células no total com uma viabilidade de 95,4% de folhas epiteliais de ponta da língua (cerca de 0,075 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B3), 544.000 células no total com uma viabilidade de 96,3% de folhas epiteliais de papilas circunvaloladas (cerca de 0,1 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B5), e 150.500 células no total com uma viabilidade de 93% de tecidos conjuntivos (cerca de 0,1 mm2 em tamanho por língua) (Figura 1B6).
Figura 1. Preparação tecidual para dissociação celular. A) Imagens representativas de um embrião inteiro E12,5 (A1),visão dorsal da língua dissecada (A2),e folhas epiteliais (A3) e mesenquime (A4) separadas das línguas. B) Imagens representativas de uma língua adulta antes (B1) e após injeção de enzima (B2). Vista dorsal de uma folha epitelial (B3) e mesenquime (B4) de ponta de língua, e uma folha epitelial (B5) e tecido conjuntivo subjacente (B6) de papila circunvallada. Barras de escala: 1 mm em A1, A3, A4, B1, B2; 200 μm em A2; 100 μm em B3,B4, B5 e B6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens representativas de células isoladas visualizadas no hemócito. A) Células isoladas de folhas epiteliais (A1) e mesenquime (A2) de embriões em E12,5. B) Células isoladas de folhas epiteliais (B1) e núcleos de tecido conjuntivo subjacente (B2) de papilas circunvaloladoras aos 8 semanas de idade. As linhas tracejadas circundam as grades amplificadas no canto superior direito. Flechas apontam para células mortas manchadas pelo azul Trypan. Barras de escala: 100 μm para B1, B2,B3e B4; 25 μm para imagens de alta potência no canto superior direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Até o momento, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e do tecido conjuntivo/mesenquime subjacente. Este protocolo de dissociação celular atual fornece um procedimento reprodutível para gerar uma única suspensão celular com uma alta viabilidade celular (>90%) de tecidos de língua de camundongos, incluindo folhas epiteliais e tecidos mesenquime/conjuntivos em estágios embrionários e pós-natais, embora células isoladas de E12,5 e camundongos adultos sejam diferentes em tamanho. Por exemplo, células isoladas do epitélio e mesenquime das línguas do rato E12.5 são consistentes e pequenas em contraste com uma grande variabilidade (de pequenas a grandes) de células da língua do rato de 8 semanas. Com a vantagem da alta viabilidade (>90%) de células isoladas, a suspensão celular única pode facilitar os experimentos a jusante que requerem alta qualidade de células viáveis (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e culturas celulares primárias).
Para garantir a alta viabilidade das células, deve-se prestar atenção a vários fatores importantes. Um tempo adequado de digestão com mistura de dispase e colagenase pode efetivamente separar o epitélio do tecido conjuntivo mesenquime/subjacente, preservando as células viáveis. Recomenda-se uma incubação de 20 minutos para a língua embrionária e uma incubação de 30 minutos para a língua adulta. Embora as folhas epiteliais possam ser facilmente descascadas após a digestão enzimática, recomenda-se o corte com uma tesoura para a separação, o que pode preservar a população de células-tronco na área basal do epitélio da língua9. A escolha de 0,25% de trypsin-EDTA apenas sobre trippsina é altamente recomendada para dissociar células, pois 0,25% trypsin-EDTA pode dissociar células de forma mais eficiente e manter as células em separação em comparação apenas com a trippsina. O uso de meio baseado em cultura celular (DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA) para re suspendir células após digestão enzimática é crucial e contribui para a maior viabilidade das células isoladas em comparação com o meio de suspensão celular (por exemplo, 1% BSA em 0,1 M PBS). Além disso, as células isoladas têm maior taxa de sobrevivência nesse meio ao longo do tempo: pelo menos 3h sem diminuição significativa da viabilidade celular. A técnica de pipetação é outro fator crítico para garantir uma alta viabilidade celular. Aspirar suavemente as células supernascentes e re-suspender usando uma pipeta pode reduzir a perda celular extra e danos físicos às células.
A concentração de células isoladas em uma única suspensão celular é outra consideração importante para experimentos a jusante. Em um número celular total, a concentração celular pode ser ajustada com base no volume final da solução resuspended. Para o primeiro teste, quando o número total de células é desconhecido, a ressuspensão de células isoladas deve começar em um volume baixo. Em seguida, células isoladas podem ser diluídas com base nos requisitos de experimentos a jusante. Note-se que, em nossa solução de média cultura, foram encontrados agregados celulares quando a concentração foi superior a 4000 células/μL (cerca de 200 células por quadrado no hemócito). As concentrações ideais variam de 500 a 2500 células/μL.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, número de subvenção R01DC012308 e R21DC018089 para HXL. Agradecemos a Brett Marshall (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) e Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por assistência técnica e consulta sobre a dissociação celular; para Francisca Gibson Burnley (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) para edição em inglês.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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