Summary
Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.
Abstract
Диссоциация клеток была важной процедурой для исследований на уровне отдельных клеток и/или на уровне клеточной популяции (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичная клеточная культура). Получение жизнеспособных, здоровых клеток в больших количествах имеет решающее значение, и оптимальные условия для этого зависят от тканей. Клеточные популяции в эпителии языка и лежащей в его основе мезенхиме/ соединительной ткани являются гетерогенными, и тканевые структуры различаются в разных областях и на разных стадиях развития. Мы протестировали протоколы выделения клеток из эпителия языка мыши и мезенхимы/соединительной ткани на ранних стадиях развития [эмбриональный день 12,5 (E12,5)] и молодых взрослых (8 недель). Чистое разделение между эпителием и подлежащей мезенхимой/соединительной тканью было легко осуществить. Однако для дальнейшей обработки и изоляции клеток, дающих жизнеспособные здоровые клетки в больших количествах, и тщательный выбор ферментативного буфера пищеварения, времени инкубации и скорости и времени центрифугирования имеют решающее значение. Инкубация отделенного эпителия или подлежащей мезенхимы/соединительной ткани в 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 мин при 37 °C с последующим центрифугированием при 200 х г в течение 8 мин приводила к высокому выходу клеток при высокой скорости жизнеспособности (>90%) независимо от стадий мыши и областей языка. Более того, мы обнаружили, что как диссоциированные эпителиальные, так и мезенхимальные /соединительные клетки из эмбрионального и взрослого языков могут выживать в среде на основе клеточной культуры в течение не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Протоколы будут полезны для исследований, требующих подготовки изолированных клеток из языков мыши на ранних стадиях развития (E12.5) и молодых взрослых (8-недельных) стадиях, требующих диссоциации клеток из разных тканевых компартментов.
Introduction
Язык млекопитающих является сложным органом, критически важным для вкуса, речи и обработки пищи. Он состоит из нескольких типов высокоорганизованных тканей, разделенных мезенхимой / соединительной тканью и покрытых стратифицированным эпителиальным листом, содержащим вкусовые сосочки и вкусовые рецепторы. Клеточные популяции как в эпителии языка, так и в мезенхиме/соединительной ткани неоднородны. Чтобы лучше понять функции и распределение определенного типа клеток на языке, необходимы исследования с использованием диссоциированных клеток. Например, секвенирование одноклеточной РНК является мощным и высокопроизводительный методом транскриптомного профилирования в отдельных клетках, который предназначен для понимания транскриптома сложной ткани при одноклеточном разрешении1,2,3,4. Было доказано, что первичная клеточная культура является полезным инструментом для изучения функции и дифференцировки стволовых/прогениторных клеток для вкусовых рецепторов5,6. Эти исследования требуют большого количества высококачественных изолированных клеточных популяций (например, достаточное общее количество клеток при правильной концентрации и высокой жизнеспособности).
Таким образом, возникает необходимость выделения клеток из разных областей лингвальных тканей и на разных стадиях развития. В настоящее время не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Здесь мы сообщаем об оптимизированном методе диссоциации клеток для подготовки клеток к экспериментам, требующим высокого качества живых клеток, таких как секвенирование одноклеточной РНК и первичные культуры стволовых клеток. Мы обнаружили, что выбор ферментативного буфера пищеварения, щадящее пипетирование, выбор среды ресуспензии, а также оптимальное время и скорость центрифугирования имеют решающее значение для создания этих больших количеств высококачественных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных (мыши C57BL/6 на протяжении всего исследования) было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Джорджии и соответствовало Руководящим принципам Национального института здравоохранения по уходу и использованию животных для исследований.
1. Использование животными
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были выведены и содержались в животноводческом учреждении факультета животноводства и молочных наук в Университете Джорджии при 22 ° C при 12-часовых циклах дня и ночи.
- Назначают полудень дня обнаружения влагалищной пробки у мышей как эмбриональный (Е) день 0,5. Используйте эмбрионы в E12.5 и постнатальных мышей в возрасте 8 недель для следующих экспериментов.
2. Подготовка перед экспериментом
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты, необходимые для этого протокола, перечислены в Таблице материалов.
- Автоклавные приборы перед экспериментом. Стерилизуйте инструменты с помощью стерилизатора бисера во время эксперимента.
- Очистите хирургическую область, рассекающий микроскоп и шкаф биобезопасности, используя 70% этаноловые салфетки. Включите ультрафиолетовый свет шкафа биобезопасности и держите его в течение 20 минут до начала экспериментальной процедуры.
- Готовят ферментную смесь 1:1 диспазы (5,0 мг/мл) и коллагеназы (2,0 мг/мл) до конечной концентрации 2,5 и 1,0 мг/мл соответственно и фильтруют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм7.
- Приготовьте 1 мл ферментной смеси для взрослого языка или 0,5 мл для определенной области языка (например, заднего или переднего языка).
- Приготовить 2 мл ферментной смеси для эмбриональных языков.
- Сделайте 10 мл 2,5% BSA в 0,1 М PBS и отфильтруйте раствор с помощью шприца 1 мл и шприцевого фильтра 0,22 мкм.
- Сделайте 500 мкл 5% FBS в DMEM/F12.
- Сделайте 3 мл DMEM/F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, и процедить раствор с помощью шприца 1 мл и шприцевого фильтра 0,22 мкм.
3. Отделение эпителия языка от мезенхимы/подлежащей соединительной ткани
- Отделение эпителия от мезенхимы мышиного языка E12.5
- Усыпить беременных самок мышей, несущих эмбрионы E12.5, поместив их в камеру CO2 с последующим вывихом шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы мышей при E12.5 собирают после 12 часов дня (днем) на 12-й день после обнаружения влагалищной пробки у беременных самок мышей. - Перенесите мышей в хирургическую зону. Смочите брюшко мыши, используя 70% этанола, чтобы предотвратить попадание шерсти в место работы.
- Откройте живот с помощью рассекающих ножниц, чтобы обнажить рога матки, несущие эмбрионы. Рассеките рога матки с помощью рассекающих ножниц и переложите его на 15 мл свежего раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
- Рассекать эмбрионы(рисунок 1А1)из рогов матки под рассекающим микроскопом с помощью мини-ножниц и тонких щипцов.
- Осторожно широко откройте полость рта с помощью тонких щипцов и рассекайте язык от мандиблы с помощью мини-ножниц(рисунок 1А2).
- Вымойте языки, используя 15 мл свежего стерильного раствора Tyrode в 100 мм чашке для культуры.
- Переложить ткани на 2 мл ферментной смеси диспазы (2,5 мг/мл) и коллагеназы (1,0 мг/мл) в культурную посуду 35 мм с лопаткой и тонкими щипцами в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение 20 мин при 37 °C.
- Перенесите языки на 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде и аккуратно удалите мезенхиму из эпителия с вентральной стороны с помощью тонких щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные листы могут быть отделены без механической силы во время инкубации. - Отделенная эпителия и мезенхима вымыть дважды в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность диспазы и коллагеназы будет ингибироваться ЭДТА в процедуре диссоциации клеток (этап 4.1).
- Усыпить беременных самок мышей, несущих эмбрионы E12.5, поместив их в камеру CO2 с последующим вывихом шейки матки.
- Отделение эпителия языка от подлежащей соединительной ткани взрослых мышей
- Усыпить мышь в возрасте 8 недель, поместив ее в камеру CO2. Убедитесь, что мышь усыплена без дыхания и реакции защемления.
- Перенесите мышей в хирургическую область. Смочите голову мыши, используя 70% этанола, чтобы предотвратить попадание шерсти в ротовую полость.
- Срежьте уголки рта вдоль щеки с помощью рассекающих ножниц, чтобы открыть ротовую полость. Рассекните язык с помощью мандиблы(рисунок 1В1)и поместите его в пластиковую посуду со слоем полиэтиленовой пленки.
- Используя хирургические щипцы для удержания языка под рассекающим микроскопом, вводят ферментную смесь диспазы (2,5 мг/мл) и коллагеназы (1,0 мг/мл) в субэпителиальное пространство языка через режущую кромку(рисунок 1B1,стрелки) заднего языка.
- Равномерно ввести 1 мл ферментной смеси во весь язык для сбора тканей как с переднего, так и с заднего языка.
- Вводят 0,5 мл ферментной смеси локально в передний язык для сбора тканей с кончика языка или на задний язык для циркумвалляционного сбора ткани сосочков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Язык будет набухать по мере накопления фермента(рисунок 1B2). Мягкая инъекция фермента может предотвратить давление от повреждения эпителия и сохранить как можно больше фермента в языке.
- Оберните язык полиэтиленовой пленкой и высиживание языка в течение 30 мин при 37 °C.
- Используйте мини-ножницы для рассечения кончика языка и/ или околоколлеобразного сосочка, а также используйте шпатель и тонкие щипцы для переноса ткани в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
- Отделите эпителий от подлежащей соединительной ткани в переваренный ферментами субэпителиальном пространстве с помощью мини-ножниц. Обрежьте ткани до надлежащего размера в соответствии с требованиями последующих экспериментов.
- Вымойте отделенный эпителий и подлежащую соединительную ткань дважды в 15 мл свежего стерильного раствора Тирода в 100 мм культуральной посуде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность диспазы и коллагеназы будет ингибироваться ЭДТА в процедуре диссоциации клеток (этап 4.1).
4. Диссоциация клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол диссоциации клеток, описанный здесь, может быть применен к эпителию языка и мезенхиме/соединительной ткани как у эмбриональных, так и у 8-недельных мышей E12.5. Чтобы уменьшить потерю клеток при перемешивании и переносе клеточной суспензии, используйте коммерческие наконечники пипеток с низким удержанием или предварительно покрытые наконечники пипеток с 2,5% BSA в 0,1 М PBS при рН7,4 8.
- Переложить ткани с помощью шпателя и мелкодисперсных щипцов до 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в новой 35-мм культурной посуде в течение 30 мин при 37 °C. Осторожно перемешивать ткани каждые 5 минут кончиками пипеток 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не режут наконечник пипетки, так как режущая кромка может физически повредить диссоциированные клетки. - Добавьте 500 мкл 5% FBS в DMEM/F12, чтобы остановить реакцию и перенести среду в 5 мл низкосвязывающей центрифужной трубки.
- Центрифужная клеточная суспензия по 200 х г в течение 8 мин при комнатной температуре и удаление супернатанта.
- Осторожно повторно суспендируйте клетки в 3 мл DMEM/F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, используя наконечники пипетки 1 мл, и фильтруйте клетки с помощью клеточного ситечкового фильтра 70 мкм, а затем 35-мкм клеточного ситечко.
- Суспензия центрифужных ячеек по 200 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Удалите большую часть среды и оставьте 50-300 мкл в качестве конечного объема для повторной приостановки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию клеток в соответствии с требованиями последующих экспериментов путем изменения конечного объема одноклеточной суспензии.
5. Подсчет клеток и тест жизнеспособности с помощью гемоцитометра
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения точности измерений для каждого образца рекомендуется использовать 3 технические реплики.
- Аккуратно смешать 5-10 мкл одноклеточной суспензии с равным объемом трипана синего и добавить на гемоцитометр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите гемоцитометр, используя 70% этанола перед использованием. Частицы пыли на гемоцитометре будут окрашены в темно-синий цвет и повлияют на точность теста на жизнеспособность. Проверьте гемоцитометр под микроскопом. - Подсчитайте общее число клеток, количество живых клеток (белые) и количество мертвых клеток (темно-синий), окрашенных трипановским синим цветом(рисунок 2,стрелки) соответственно в 4 квадрата с 16 сетками(рисунок 2)с помощью инвертированного микроскопа с системой визуализации.
- Рассчитайте концентрацию клеток:
Концентрация в клетках =
- Рассчитайте жизнеспособность:
Жизнеспособность =
- Рассчитайте жизнеспособность:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Отделение эпителия языка от подлежащей мезенхимы/соединительной ткани
В эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов. Эпителиальные листы некоторых языков отделяются без механической силы во время инкубации.
На язык взрослой мыши успешная инъекция фермента указывает на отек в вводимых областях(рисунок 1B2),что говорит о том, что фермент может удерживаться языком. Недостаточное введение фермента и/или глубокой иглы в мезенхиму и/или эпителиальное проникновение иглой языка вызовет частичный отек области инъекции или отсутствие отека вообще. После ферментного переваривания подлежащие соединительные ткани при правильном переваривании ферментов становятся рыхлыми и липкими. Щель в субэпителиальном пространстве видна при осторожном поднятии края эпителиального листа.
Влияние диссоциации клеток на общее количество и жизнеспособность клеток
На шаге 4 были объединены языки E12.5, эпителиальные листы и тонкие слои мезенхимы непосредственно под эпителием языков. Ручной подсчет клеток с использованием гемоцитометра(рисунок 2)продемонстрировал, что протокол дал в общей сложности 63 917 клеток с жизнеспособностью 95,2% из эпителиальных листов (размером около 0,3 мм2 на язык)(рисунок 1A3)и 294 333 клетки в общей сложности с жизнеспособностью 96,3% из мезенхимы (около 0,3 мм2 в размере на язык)(рисунок 1A4).
Используя 10 взрослых языков в возрасте 8 недель, кусочки эпителиальных листов кончика языка (где вкусовые рецепторы плотно распределены), эпителиальные листы циркумваллатных сосочков и тонкие слои соединительной ткани непосредственно под эпителием циркумваллятных сосочков были объединены соответственно. Ручной подсчет клеток с использованием гемоцитометра(рисунок 2)показал, что протокол дал в общей сложности 187 333 клетки с жизнеспособностью 95,4% из эпителиальных листов кончика языка (около 0,075 мм2 в размере на язык)(рисунок 1B3),544 000 клеток в общей сложности с жизнеспособностью 96,3% из эпителиальных листов циркумваллятных сосочков (около 0,1 мм2 в размере на язык)(рисунок 1B5)и 150 500 клеток в общей сложности с жизнеспособностью 93% из соединительных тканей (около 0,1 мм2 в размере на язык)(рисунок 1B6).
Рисунок 1. Подготовка тканей к диссоциации клеток. А) Репрезентативные изображения целого эмбриона E12.5 (A1),дорсальный вид рассеченного языка (A2),а также эпителиальные листы (A3)и мезенхима (A4),отделенные от языков. B)Репрезентативные изображения взрослого языка до (B1)и после инъекции фермента (B2). Дорсальный вид эпителиального листа(В3)и мезенхимы(В4)кончика языка, а также эпителиального листа(В5)и лежащей в его основе соединительнойткани (В6)циркумваллятного сосочка. Шкала стержней: 1 мм в A1,A3, A4, B1,B2; 200 мкм вА2; 100 мкм в B3,B4, B5 и B6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Репрезентативные изображения изолированных клеток, визуализированные в гемоцитометре. A) Изолированные клетки из эпителиальных листов (A1)и мезенхимы (A2)эмбрионов при E12.5. B)Изолированные клетки из эпителиальных листов (B1)и лежащих в их основе соединительноткан(B2)циркумваллятных сосочков в возрасте 8 недель. Пунктирные линии окружают сетки, усиленные в правом верхнем углу. Стрелки указывают на мертвые клетки, окрашенные трипанским синим цветом. Шкала стержней: 100 мкм для B1,B2,B3и B4; 25 мкм для мощных изображений в правом верхнем углу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На сегодняшний день не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Этот протокол диссоциации текущих клеток обеспечивает воспроизводимую процедуру для создания одноклеточной суспензии с высокой жизнеспособностью клеток (>90%) из тканей языка мыши, включая эпителиальные листы и ткани мезенхимы/соединительной ткани как на эмбриональной, так и на постнатальной стадиях, хотя изолированные клетки от E12.5 и взрослых мышей различаются по размеру. Например, изолированные клетки из эпителия и мезенхимы языков мыши E12.5 являются последовательными и маленькими в отличие от большой изменчивости (от малого к большому) клеток из 8-недельного мышиного языка. С преимуществом высокой жизнеспособности (>90%) из изолированных клеток, даваемая одноклеточная суспензия может облегчить последующие эксперименты, требующие высокого качества жизнеспособных клеток (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичные клеточные культуры).
Чтобы гарантировать высокую жизнеспособность клеток, необходимо обратить пристальное внимание на несколько важных факторов. Правильное время переваривания со смесью диспазы и коллагеназы может эффективно отделить эпителий от мезенхимы / лежащей в основе соединительной ткани, сохраняя при этом жизнеспособные клетки. Рекомендуется 20-минутная инкубация для эмбрионального языка и 30-минутная инкубация для взрослого языка. Несмотря на то, что эпителиальные листы могут быть легко очищены после переваривания ферментов, рекомендуется разрезание ножницами для разделения, что может сохранить популяцию стволовых клеток в базальной области эпителия языка9. Выбор 0,25% трипсина-ЭДТА по сравнению с трипсином вместо одного трипсина настоятельно рекомендуется для диссоциации клеток, поскольку 0,25% трипсина-ЭДТА может диссоциировать клетки более эффективно и удерживать клетки в разделении по сравнению с трипсином в одиночку. Использование среды на основе клеточных культур (DMEM/F12, содержащей 10% FBS и 1% BSA) для повторной приостановки клеток после ферментативного пищеварения имеет решающее значение и способствует более высокой жизнеспособности изолированных клеток по сравнению с клеточной суспензионной средой (например, 1% BSA в 0,1 M PBS). Кроме того, изолированные клетки имеют более высокую выживаемость в этой среде с течением времени: не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Метод пипетирования является еще одним критическим фактором для обеспечения высокой жизнеспособности клеток. Мягкое аспирирование надпоменных и повторное суспендирование клеток с помощью пипетки может уменьшить потерю дополнительных клеток и физическое повреждение клеток.
Концентрация изолированных клеток в одноклеточной суспензии является еще одним важным соображением для последующих экспериментов. В общем заданном количестве клеток концентрация клеток может быть скорректирована на основе конечного объема повторно суспендированного раствора. Для первого испытания, когда общее количество клеток неизвестно, повторное суспенсение изолированных клеток должно начинаться с небольшого объема. Затем изолированные клетки могут быть разбавлены на основе требований последующих экспериментов. Следует отметить, что в нашем растворе на основе культуральная среда клеточные агрегаты были обнаружены, когда концентрация была выше 4000 клеток / мкл (около 200 клеток на квадрат в гемоцитометре). Оптимальные концентрации колеблются от 500 до 2500 клеток/мкл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не заявлен.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения, номер гранта R01DC012308 и R21DC018089 для HXL. Мы благодарим Бретта Маршалла (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) и Эгона Рангини (10X GENOMICS, Плезантон, Калифорния) за техническую помощь и консультации по поводу диссоциации клеток; Франциске Гибсон Бернли (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) для редактирования на английском языке.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
