Summary
Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.
Abstract
In de afgelopen tien jaar heeft de vooruitgang in genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GESI's) een revolutie in in vivo functionele beeldvorming bevorderd. Met behulp van calcium als een proxy voor neuronale activiteit, bieden deze technieken een manier om de reacties van individuele cellen binnen grote neuronale ensembles op een verscheidenheid aan stimuli in realtime te volgen. Wij, en anderen, hebben deze technieken toegepast om de reacties van individuele geniculate ganglionneuronen op smaakprikkels toegepast op de tongen van levende verdoofde muizen in beeld te brengen. Het geniculate ganglion bestaat uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren, evenals enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren. Het in beeld brengen van de smaak-opgeroepen reacties van individuele geniculate ganglion neuronen met GCaMP heeft belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen, evenals een manier om perifere smaak misdrainende fenotypes in genetisch gemanipuleerde muizen te detecteren. Hier demonstreren we de chirurgische procedure om het geniculate ganglion bloot te leggen, GCaMP fluorescentiebeeldacquisitie, eerste stappen voor gegevensanalyse en probleemoplossing. Deze techniek kan worden gebruikt met transgeen gecodeerde GCaMP of met AAV-gemedieerde GCaMP-expressie en kan worden gewijzigd om bepaalde genetische subsets van belang in beeld te brengen (d.w.z. Cre-gemedieerde GCaMP-expressie). Over het algemeen is in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglionneuronen een krachtige techniek voor het monitoren van de activiteit van perifere smaakneuronen en biedt het aanvullende informatie aan meer traditionele chorda tympani-opnames van de hele zenuw of smaakgedragstests.
Introduction
Een belangrijk onderdeel van het perifere smaaksysteem van zoogdieren is het geniculate ganglion. Naast enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren, bestaat het geniculate uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren. Net als andere perifere sensorische neuronen zijn de geniculate ganglionneuronen pseudo-unipolair met een lang axon dat perifeer projecteert naar de smaakpapillen en centraal naar de hersenstamkern van het solitaire kanaal1. Deze neuronen worden voornamelijk geactiveerd door de afgifte van ATP door smaakreceptorcellen die reageren op smaakprikkels in de mondholte2,3. ATP is een essentiële neurotransmitter voor smaaksignalering en P2rx-receptoren uitgedrukt door de smaakganglionneuronen zijn nodig voor hun activering4. Gezien het feit dat smaakreceptorcellen specifieke smaakreceptoren uitdrukken voor een bepaalde smaakmodaliteit (zoet, bitter, zout, umami of zuur), is verondersteld dat smaakganglionneuronreacties op smaakprikkels ook nauw afgestemd zouden zijn5.
Hele zenuwopnamen hebben aangetoond dat zowel de chorda tympani als de grotere superieure petrosale zenuwen smaaksignalen geleiden die alle vijf smaakmodaliteiten vertegenwoordigen voor het geniculate ganglion6,7. Dit liet echter nog steeds vragen over de specificiteit van neuronale reacties op een bepaalde smaakstof: als er smaakmodaliteitsspecifieke neuronen, polymodale neuronen of een mengsel van beide zijn. Enkelvoudige vezelopnamen geven meer informatie over de activiteit van individuele vezels en hun chemische gevoeligheden8,9,10,maar deze methodologie is beperkt tot het verzamelen van gegevens van kleine aantallen vezels. Evenzo geven in vivo elektrofysiologische opnames van individuele ratgeniculate ganglionneuronen informatie over de reacties van individuele neuronen11,12,13, maar verliezen nog steeds de activiteit van de populatie en leveren relatief weinig neuronregistraties per dier op. Om de responspatronen van neuronale ensembles te analyseren zonder de activiteit van individuele neuronen uit het oog te verliezen, moesten nieuwe technieken worden gebruikt.
Calciumbeeldvorming, vooral met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren zoals GCaMP, heeft deze technische doorbraakopgeleverd 14,15,16,17,18. GCaMP gebruikt calcium als een proxy voor neuronale activiteit, waardoor groene fluorescentie toeneemt naarmate het calciumgehalte in de cel stijgt. Nieuwe vormen van GCaMP worden nog steeds ontwikkeld om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de bindingskinetiek aan te passen en aan te passen voor gespecialiseerde experimenten19. GCaMP biedt resolutie van één neuron, in tegenstelling tot hele zenuwopname, en kan tegelijkertijd reacties van ensembles van neuronen meten, in tegenstelling tot enkelvoudige vezel- of enkele celregistratie. Calciumbeeldvorming van de geniculate ganglia heeft al belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen16,20, en heeft perifere smaakmisdrading fenotypes geïdentificeerd in genetisch gemanipuleerde muizen18.
Een grote moeilijkheid bij het toepassen van in vivo calciumbeeldvormingstechnieken op het geniculate ganglion is dat het is ingekapseld in de benige trommelvliesbula. Om optische toegang tot het geniculate te verkrijgen, is delicate chirurgie vereist om de lagen botten te verwijderen, terwijl het ganglion intact blijft. Voor dat doel hebben we deze gids gemaakt om andere onderzoekers te helpen toegang te krijgen tot het geniculate ganglion en de GCaMP-gemedieerde fluorescerende reacties van deze neuronen op smaakstimuli in vivo in beeld te brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of Texas San Antonio.
1. Pre-operatieve installatie
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de eerste installatie van apparatuur hier niet wordt behandeld, omdat deze varieert op basis van het gebruikte pompsysteem, microscoop, camera en beeldbewerkingssoftware. Raadpleeg voor installatie-instructies het instructiemateriaal van de leverancier van de apparatuur. Voor apparatuur die door de auteurs wordt gebruikt, zie de tabel met materialen.
- Zorg ervoor dat er vloeistof door alle voertuig (water) en smaakleidingen stroomt. Als de lijn is geblokkeerd, koppelt u de verbinding los en spoelt u deze met water. Als de lijn geknikt is, masseer dan totdat er vloeistof stroomt. Zorg ervoor dat de vloeistof start en stopt op cue.
- Zodra alle lijnen zijn gedeblokkeerd, laat u het voertuig gedurende 10 s lopen en sluit u vervolgens alle kleppen.
- Zorg ervoor dat de beeldbewerkingssoftware klaar is met alle vereiste variabelen (bijv. proeflengte, bestandsnamen, framesnelheid, enz.). Met behulp van μManager, een open-source softwarepakket voor beeldacquisitie, voert u 200 ms in het veld exposure time in voor een frame per seconde van 5Hz, selecteert u x2 onder binningen drukt u op de knop met het label Live. Wanneer de video wordt gestart, drukt u op de knop aan de linkerkant met het label ROI. Dit resulteert in een gezichtsveld van 512x512.
2. Het dier verdoven en immobiliseren
OPMERKING: Het volgende protocol is een terminale procedure die is geoptimaliseerd voor muizen van beide geslachten met een gewicht van 18-35 g. Het wordt aanbevolen voor gebruik met dieren tussen de 10 en 12 weken oud. Het kan worden gebruikt met transgene dieren die genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs) tot expressie brengt, zoals de Snap25-GCaMP6s, of dieren die stereotaxisch zijn geïnjecteerd met virale GECIs. Handschoenen, laboratoriumjas en gezichtsmasker moeten gedurende het hele protocol worden gedragen.
- Scruff dier en voer een intraperitoneale injectie van Ketamine (100 mg / kg) en Xylazine (10 mg / kg). Beoordeel de diepte van de anesthesie via teenknijpen voordat u doorgaat.
- Scheer de bovenkant van het hoofd en het operatiegebied aan de voorkant van de nek.
- Zet het verwarmingskussen aan en plaats het dier op het kussen.
- Breng zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging van de ogen te voorkomen.
- Maak een incisie (~ 1 cm) in de middellijn van het hoofd om de schedel van het dier bloot te leggen. Verwijder bindweefsel met een steriel wattenstaafje zodat het blote bot toegankelijk is. Gebruik een applicator met katoenen punt om ervoor te zorgen dat de schedel droog is.
- Breng dierenartsbinding aan op de schedel. Zorg ervoor dat u de blootgestelde schedel bedekt. Wacht tot de lijm is droog.
- Meng in een petrischaaldeksel en breng een laag tandcement aan op de schedel. De achterkant van de applicator met katoenen punt die in stap 2.5 wordt gebruikt, werkt goed voor dit proces. Plaats de hoofdpost bovenop het tandcement en breng een tweede laag tandcement aan om de hoofdpost op zijn plaats op de schedel te sandwichen.
- Laat het zitten totdat het tandcement droog en stevig is. Breek de applicator met katoenen punt in tweeën en gebruik de puntige uiteinden om het tandcement te prikken om te testen. Als het tandcement niet toegeeft om te worden geprikt, kan het dier in rugligging worden gedraaid.
3. Tracheotomie
- Breng pre-chirurgische scrub aan op het operatiegebied. Maak na het scrub een middellijnincisie ~ 2 cm in de huid van de keel van het borstbeen tot de kin.
- Trek de huid en sub-maxillaire klieren terug en zorg ervoor dat de digastrische spieren volledig worden blootgesteld.
- Zoek de naad in de paratracheale musculatuur, scheid deze met stompe dissectie en trek deze open.
- Snijd voorzichtig een opening in de bovenkant van de luchtpijp die groot genoeg is om polyethyleenbuizen te passen (I.D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm). Snijd niet meer dan halverwege de diameter van de luchtpijp. Steek slangen in de luchtpijp richting de longen.
- Herpositioneer retractors om paratracheale musculatuur vrij te maken en de submaxillaire klieren in te trekken.
- Lijm paratracheale spieren aan elkaar over slangen met een minimale hoeveelheid veterinaire lijm (zie figuur 1A).
4. De trommelvliesbula openbreken
- Plaag zachtjes de gewenste digastrische spier (links of rechts) omhoog en trek het bindweefsel uit elkaar. Snijd aan het voorste uiteinde van de spier, vermijd bloedvaten en trek je naar achteren terug totdat je vrij bent van de trommelvliesbula.
- Kantel het hoofd iets naar achteren om de trommelvliesbula op te tillen. Lokaliseer de tak van de halsslagader anterieur naar het achterste inbrengpunt van de digastrische spier. Voel je net achter dit bloedvat voor de bolle structuur van de trommelvliesbula.
- Zoek op deze locatie naar een naad in de musculatuur (zie figuur 1B). Met behulp van twee sets fijne tang, stomp ontleden bij de naad totdat het bot van de trommelvlies bulla zichtbaar is. Gebruik retractors om een duidelijk zicht te houden op de trommelvlies bulla.
- Zoek de naad die van voor naar achter loopt op de bulla (zie figuur 1C). Prik met behulp van een chirurgische sonde een gat in het bot in het midden van deze naad. Gebruik een set fijne eindscharen om een cirkelvormig gebied in het bot te knippen, waarbij u ervoor zorgt dat de bloedvaten niet vooraan, achterste en diep onder de bulla worden afgesneden.
5. Het geniculate blootstellen
- In dit gat zit een boll stukje bot, dit is het slakkenhuis. Voor het slakkenhuis bevindt zich een spier, de tensor tympani (zie figuur 1D). Knip met de veerschaar de tensor tympani en verwijder deze.
- Voer een teenknijp uit. Als het dier reageert, geef dan een ketamine / xylazine-mengsel in een dosis van 1/3 om opnieuw te proberen.
- Bereid irrigatievloeistof en een zuigleiding voor. Prik met behulp van de chirurgische sonde een gat in het cochleaire voorgebergte. Irrigeer onmiddellijk de vloeistof die eruit stroomt en verwijder deze met afzuiging. Deze vloeistof zal vanaf dit punt min of meer continu stromen en zal periodiek moeten worden aangepakt.
- Vergroot het gat in het slakkenhuis. Wees voorzichtig met het bloedvat dat het slakkenhuis omringt tot aan de achterste en laterale rand.
- Kantel de kop van de muis naar voren. Lokaliseer het gat in het temporale bot onder wat het slakkenhuis was (zie figuur 1E). Let op de richel voorin dit gat, deze richel zit direct boven de zevende zenuw.
- Steek een chirurgische sonde in het gat en til het temporale bot voorzichtig op om de zevende zenuw bloot te leggen (zie figuur 1F). Inventariseer hoeveel van de zevende zenuw zichtbaar is en als het geniculate niet volledig is blootgesteld, kantel dan het hoofd van het dier naar achteren en probeer bot op te trekken van de voorste naar de zenuw.
- Als het ganglion nog steeds niet volledig zichtbaar is, trek dan meer bot van onderaf omhoog. Wees heel voorzichtig om de sonde niet diep onder het bot te plaatsen, omdat dit het geniculate kan beschadigen.
Figuur 1: Chirurgische blootstelling van het geniculate ganglion. (A) Afbeelding van de nekholte van de muis na tracheotomie. Arrow wijst naar de digastrische spier die over het operatiegebied ligt dat in de rest van de figuur wordt onderzocht. (B) Afbeelding van regio onder de eerder aangegeven digastrische spier. Pijl geeft de naad in musculatuur aan voor stompe dissectie. (C) Afbeelding van de Tympanic Bulla. Pijl geeft aan dat de naad in het bot moet breken met een chirurgische sonde. (D) Afbeelding van chirurgisch gebied na het openen van de bulla. Pijl linksonder geeft het slakkenhuis aan, bovenste pijl wijst naar de tensor tympani. De regel in het kader geeft het gebied in (E) en (F) aan. (E) Afbeelding van chirurgisch gebied nadat het slakkenhuis is gebroken en de inhoud is verwijderd. Witte pijl geeft aan waar chirurgische sonde moet worden plaats waarnaar wordt verwezen in protocolstap 5.6. (F) Een afbeelding van het blootgestelde geniculate ganglion. Pijl geeft het lichaam van de zevende zenuw aan, onderbroken driehoek omringt het geniculate ganglion. Panelen A-B, Schaal = 5 mm. Panelen C-F, Schaal = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Voer het smakelijke paneel uit
- Gebruik zuigkracht om vloeistof over het geniculate te verwijderen. Plaats eventueel een absorberend punt om kwel te verminderen en te helpen bij microscoopnavigatie.
- Plaats het dier op absorberend kussen onder de microscoop. Lokaliseer het geniculate ganglion: nuttige oriëntatiepunten zijn het gat in de bulla, het gat in het temporale bot en de zevende zenuw. Controleer met behulp van het FITC/GFP-filter op de epifluorescentiescope op individuele GCaMP-tot expressie brengende geniculate ganglionneuronen. Een 10x objectief (werkafstand 10mm) biedt voldoende resolutie om de activiteit van individuele cellen te volgen, maar een 20x objectief (werkafstand 12 mm) kan ook worden gebruikt.
- Plaats de doseernaald voor smakelijke lijn stevig in de mond van het dier. Plaats een petrischaaltje onder de mond van het dier om vocht op te vangen.
- Zorg ervoor dat de camera het gezichtsveld van de microscoop bekijkt. Synchroniseer het begin van de video-opname met het begin van de smakelijke presentatie.
- Bekijk tijdens het opnemen live feed voor reacties, drift en kwel.
- Als er kwel optreedt, zuigt u de vloeistof af totdat het zicht op het geniculate helder is en herhaalt u dit. Als er drift optreedt, controleer dan of alle delen van de koppaal stevig zijn aangespannen. Als er geen reacties optreden, controleer dan of er vloeistof stroomt en of de microscoop en camera op de juiste locatie zijn gericht zonder dat het gezichtsveld wordt verduisterd.
- Herhaal dit totdat het gewenste aantal video's is verkregen. Maak de retractors voorzichtig gemakkelijk en herhaal vervolgens stap 3-6 aan de andere kant.
- Nadat de gewenste video's zijn verkregen voor alle gewenste ganglia, euthanaseer het dier via cervicale dislocatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol werd een transgeen Snap25-GCaMP6s-dier verdoofd, geniculate ganglia werden blootgesteld en tastant werd op de tong aangebracht terwijl video werd opgenomen. Het doel van het experiment was om te definiëren welke smaakstoffen reacties uitlokten van elke cel. Tastanten (30 mM AceK, 5 mM Kinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Citroenzuur)18 werden opgelost in DI-water en werden gedurende 2 s gescheiden door 13 s DI-water op de tong aangebracht.
Figuur 2: Reacties van geniculate ganglionneuronen op smaakstoffen met behulp van in vivo GCaMP6s-beeldvorming. (A) Epifluorescent beeld van het geniculate ganglion van een Snap25-GCaMP6s transgene muis tijdens baseline als water over de tong wordt geperfundeerd. Stippellijnen geven de geschatte grenzen van het geniculate ganglion aan. De zevende hersenzenuw wordt als zodanig bestempeld. (B) Momentopname van hetzelfde ganglion in (A) als een zoet smaakstof (AceK 30 mM) wordt aangebracht op de tong van de muis. Merk op dat verschillende individuele neuronen toenemen in fluorescentie-intensiteit. Het vak Met de stippellijn geeft de sweet responding-cel aan die wordt gebruikt in (C) end. (C)Sporen van vijf neuronen die de amplitude van hun GCaMP6s gemedieerde fluorescentie aangeven als reactie op een panel van smaakstoffen bestaande uit zoet (30 mM acesulfaam K), bitter (5 mM kinine); zout (60 mM NaCl); umami (50 mM monokaliumglutamaat en 1mM inosinemonofosfaat); en zuur (50 mM citroenzuur). Gekleurde balken tonen de plaatsing en duur (2 s) van de stimulus gedurende het tijdsverloop van het experiment. Deze representatieve gegevens omvatten geen reactie op umami. Individuele neuronen reageren vaak op zowel bittere als zure stimuli (onderste spoor) 16,18,20. Panelen A-B, Schaal = 5 mm. Paneel C, horizontale schaalbalk geeft 6,5 seconden aan, verticale schaalbalk geeft drempel aan van 4% dF/F. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals te zien is in figuur 2,zouden smaakprikkels die op de tong worden toegepast, moeten resulteren in een snelle, voorbijgaande toename van GCaMP-fluorescentie, waardoor een merkbare verandering in helderheid tussen reagerende neuronen ontstaat. De video kan worden geanalyseerd met een verscheidenheid aan softwarepakketten om sporen te produceren die de veranderingen in fluorescentie ten opzichte van baseline (dF / F) in de loop van de tijd van individuele interessegebieden (zoals individuele neuronen) weergeven, waardoor de reacties van elke cel op het smakelijke paneel worden weergegeven. In een succesvolle operatie, in een Snap25-GCaMP6s transgene lijn, is het typisch om reacties te zien in 20-40 neuronen binnen een enkel ganglion / gezichtsveld. Dit kan veranderen afhankelijk van de gebruikte transgene lijn of als in plaats daarvan AAV-GCaMP wordt gebruikt. Merk op dat baseline fluorescentie kan worden beïnvloed door een aantal factoren, waaronder het expressieniveau van de GCaMP en mogelijke schade aan de cellen tijdens de operatie. Veranderingen in fluorescentie-intensiteit boven een drempelniveau (typisch df/f > 3-voudig boven de gemiddelde ruis)20,21 wordt als een positieve respons beschouwd.
Om de timing van de stimulusafgifte te bepalen, moet de tijd die nodig is om vloeistof door de lijnen te laten stromen, worden gemeten om te weten wanneer een vloeistofverandering daadwerkelijk contact maakt met de tong. Om deze vertraging te verminderen, gebruikt u een gematigde stroomsnelheid (5-10 ml /min) en een korte lengte van de slang die van het perfusiespruitstuk naar de mondholte leidt. Typisch, met de hier beschreven stimuli, begint fluorescentie bijna onmiddellijk nadat tastant op de tong is aangebracht en zal bijna onmiddellijk beginnen te vervagen nadat het tastant is gestopt en de mondholte is gewassen met voertuigoplossing. Bij het werken met een onbekende stimulus kan het nuttig zijn om de verandering in fluorescentie van een regio te observeren zonder neuronen te reageren om algemene veranderingen in het beeld te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft een stapsgewijs protocol om het geniculate ganglion operatief bloot te leggen en de activiteit van zijn neuronen visueel vast te leggen met GCaMP6s. Deze procedure lijkt erg op die eerder beschreven17, met een paar opmerkelijke uitzonderingen. Ten eerste zorgt het gebruik van een hoofdpost voor een eenvoudige aanpassing van de hoofdpositie tijdens de operatie. Ten tweede, met betrekking tot stimulusafgifte, stroomt de aanpak van Wu en Dvoryanchikov smaakprikkels door slokdarmbuizen17, terwijl dit protocol vloeistof rechtstreeks in de mond afgeeft met een doseernaald. Beide methoden kunnen worden gebruikt om met succes geniculate ganglionneuronreacties op te roepen door de fungiforme en palatale smaakpapillen te stimuleren.
Een opmerking over het handhaven van een duidelijk beeldvormingsveld: na het breken van het slakkenhuis zal er continu vocht in de holte worden doorgesijpeld, ook direct over het ganglion van het geniculate. Het is ook mogelijk dat bloedingen het geniculate ganglion zullen verduisteren. Hoewel een kleine hoeveelheid kwel mogelijk niet voldoende is om beeldvorming te voorkomen, kunnen zelfs kleine hoeveelheden bloed de ganglia volledig afsluiten. Deze problemen kunnen op verschillende manieren worden aangepakt. Ten eerste, als kwel relatief klein is, kan het worden verwijderd met behulp van een zuigleiding uitgerust met een stompe doseernaald tussen de proeven. Als alternatief kan vloeistof ook van het veld worden afgevoerd door zorgvuldig absorberende punten achteraan of lateraal naar de zevende zenuw te plaatsen. Als de stroming bijzonder slecht is, kan het nodig zijn om tijdens het afbeelden zuigkracht op de holte aan te brengen. Een zorgvuldig geplaatste zuigleiding kan de ganglia vrij houden terwijl deze op een laterale locatie wordt aangebracht, om te voorkomen dat de ganglia tijdens het afbeelden wordt verduisterd.
De beeldvorming zelf kan worden bereikt met behulp van verschillende stijlen van microscoopstellingen, elk met de bijbehorende voordelen en beperkingen. Bij gebruik van een epifluorescentie scope18,21, is het alleen mogelijk om de meer oppervlakkige neuronen in beeld te brengen. Een ander probleem met epifluorescentie beeldvorming is dat signalen van diepere cellen naar buiten komen als veranderingen in achtergrondfluorescentie (onscherp licht), dus wees voorzichtig met de analyse om geen fluorescentieveranderingen van andere cellen in de ROI op te pikken. Voor bijzonder dunne structuren, zoals de geniculate ganglia, zijn deze problemen mogelijk niet problematisch. Het gebruik van een 2-foton16 of confocale20 microscoop kan mogelijk beeldvormingscellen in diepere lagen mogelijk maken.
Het is belangrijk om een paar kritieke stappen en manieren te benadrukken om veelvoorkomende problemen op te lossen. Ten eerste moet worden opgemerkt dat de analyse aanzienlijk zal variëren, afhankelijk van de gebruikte software. De open-source software, ImageJ biedt tools die voldoende zijn voor voorlopige analyse. Verwijder eerst kleine bewegingsartefacten met behulp van de Image Stabilizer-plug-in22, gebruik vervolgens ImageJ om de verandering in fluorescentie te berekenen gedeeld door basisfluorescentie (dF / F). Dit kan worden bereikt met behulp van een van de vele open source macro's voor ImageJ23, de macro waarnaar wordt verwezen, biedt gedetailleerde installatienotities. Voor andere macro's raadpleegt u hun documentatie. Gebruik na het corrigeren voor dF/F de knoppen vooruit en achteruit onderaan de afbeeldingsstapel om celreacties op stimuli te observeren. Selecteer met het gereedschap lasso op de werkbalk fluorescerende cellen afzonderlijk. Nadat u een cel hebt geselecteerd, gebruikt u Afbeelding | Stapels | Plot-Z-As. Dit levert voldoende informatie op om responsprofielen te bepalen en de tijdgerelateerde gebeurtenissen van elke regio van belang (ROI) te analyseren. Meer geavanceerde analyse was lang het domein van aangepaste scripts in Matlab, R, enz. De populariteit van calciumbeeldvorming heeft echter geleidelijk geleid tot de ontwikkeling van meerdere open-source bronnen voor analyse, waaronder CaImAn, EZCalcium en meer24,25.
Calciumbeeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de activiteit van neurale ensembles met een enkele neuronresolutie. Vanwege de kleine omvang van het geniculate ganglion is dit protocol bijzonder krachtig omdat het hele ganglion binnen één veld kan worden gevisualiseerd. Er zijn echter enkele beperkingen aan deze techniek. Naast de beperkingen die alle calciumbeeldvormingsexperimenten gemeen hebben, is de hier beschreven chirurgische aanpak invasief en moet deze onder anesthesie worden uitgevoerd. Dit is een terminale procedure - het dier moet onmiddellijk na beeldvorming worden geëuthanaseerd. Daarom is deze chirurgische aanpak niet geschikt voor wakkere / gedragen opnames.
In de afgelopen jaren hebben onderzoekers deze techniek gebruikt om responsprofielen van de neuronen van het geniculate ganglion16,20,18te bestuderen. Recent werk heeft zich gericht op potentiële genetische markers die kunnen worden gebruikt om subpopulaties binnen de ganglia te manipuleren en heeft aangetoond hoe transgene Cre-driverlijnen en Cre-afhankelijke GCaMP kunnen worden gebruikt om de responsprofielen van deze populaties te identificeren26. Ander werk kan GCaMP gebruiken met foto-geactiveerde eiwitten zoals pa-mCherry om eerst cellen te identificeren en vervolgens te markeren die door smaakstoffen worden geactiveerd om vervolgens te worden gebruikt in immunohistochemie of in situ hybridisatie27. Het kan ook mogelijk zijn om calciumafhankelijke foto-converteerbare eiwitten zoals CaMPARI met hetzelfde effect te gebruiken, terwijl experimentele methoden worden gebruikt die sterk lijken op die hier worden beschreven28. Ongeacht de specifieke vragen en experimenten, biedt calciumbeeldvorming een krachtig hulpmiddel voor het verkennen van de responsprofielen van neuronen die betrokken zijn bij een aantal activiteiten, en het nut ervan bij het verkennen van het smaaksysteem is nog maar net begonnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
De auteurs bedanken S. Humayun voor de muizenhouderij. Financiering voor dit werk is gedeeltelijk verstrekt door UTSA's Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) en NIH-SC2-GM130411 aan L.J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing - 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M.
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html (2008).
- Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
