Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62172
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, The University of Texas at San Antonio

Summary

Hier präsentieren wir, wie man das genikulierte Ganglion einer lebenden, betäubten Labormaus freilegt und wie man Kalziumbildgebung verwendet, um die Reaktionen von Ensembles dieser Neuronen auf Geschmacksreize zu messen, was mehrere Versuche mit verschiedenen Stimulanzien ermöglicht. Dies ermöglicht detaillierte Vergleiche, welche Neuronen auf welche Tastants reagieren.

Abstract

In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte bei genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) eine Revolution in der funktionellen In-vivo-Bildgebung gefördert. Mit Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität bieten diese Techniken eine Möglichkeit, die Reaktionen einzelner Zellen innerhalb großer neuronaler Ensembles auf eine Vielzahl von Reizen in Echtzeit zu überwachen. Wir und andere haben diese Techniken angewendet, um die Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen auf Geschmacksreize abbilden, die auf die Zungen lebender anästhesierierter Mäuse angewendet werden. Das geniculate Ganglion besteht aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren, sowie einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren. Die Abbildung der geschmacksbedingten Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen mit GCaMP hat wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen sowie eine Möglichkeit zum Nachweis peripherer Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen geliefert. Hier demonstrieren wir den chirurgischen Eingriff zur Freilegen des geniculaten Ganglions, die GCaMP-Fluoreszenzbildaufnahme, erste Schritte zur Datenanalyse und die Fehlerbehebung. Diese Technik kann mit transgen kodiertem GCaMP oder mit AAV-vermittelter GCaMP-Expression verwendet und modifiziert werden, um bestimmte genetische Untergruppen von Interesse abbilden (d. H. Cre-vermittelte GCaMP-Expression). Insgesamt ist die In-vivo-Calcium-Bildgebung von geniculaten Ganglien-Neuronen eine leistungsstarke Technik zur Überwachung der Aktivität peripherer Gustator-Neuronen und liefert ergänzende Informationen zu traditionelleren Ganznerven-Chorda-Tympani-Aufnahmen oder Geschmacksverhaltenstests.

Introduction

Eine Schlüsselkomponente des peripheren Geschmackssystems von Säugetieren ist das geniculate Ganglion. Zusätzlich zu einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren, besteht das Genikulat aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren. Ähnlich wie andere periphere sensorische Neuronen sind die geniculaten Ganglienneuronen pseudo-unipolar mit einem langen Axon, das peripher auf die Geschmacksknospen und zentral auf den Hirnstammkern des Solitärtraktsprojiziert 1. Diese Neuronen werden in erster Linie durch die Freisetzung von ATP durch Geschmacksrezeptorzellen aktiviert, die auf Geschmacksreize in der Mundhöhle reagieren2,3. ATP ist ein essentieller Neurotransmitter für die Geschmackssignalisierung, und P2rx-Rezeptoren, die von den gustatorischen Ganglienneuronen exprimiert werden, sind für ihre Aktivierung notwendig4. Angesichts der Tatsache, dass Geschmacksrezeptorzellen spezifische Geschmacksrezeptoren für eine bestimmte Geschmacksmodalität (süß, bitter, salzig, Umami oder sauer) exprimieren, wurde die Hypothese aufgestellt, dass gustatorische Ganglienneuronreaktionen auf Geschmacksreize ebenfalls eng abgestimmt wären5.

Ganze Nervenaufnahmen haben gezeigt, dass sowohl die Chorda-Tympani als auch die größeren oberen Petrosalnerven Gustatoriken leiten, die alle fünf Geschmacksmodalitäten zum geniculaten Ganglion6,7darstellen. Dies ließ jedoch immer noch Fragen über die Spezifität neuronaler Reaktionen auf ein bestimmtes Tastant offen: wenn es geschmacksmodalitätsspezifische Neuronen, polymodale Neuronen oder eine Mischung aus beidem gibt. Einzelfaseraufzeichnungen geben mehr Informationen über die Aktivität einzelner Fasern und ihre chemischenEmpfindlichkeiten 8,9,10, aber diese Methodik beschränkt sich auf die Erfassung von Daten aus einer kleinen Anzahl von Fasern. In ähnlicher Weise geben elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnungen einzelner Genikulat-Ganglienneuronen von Ratten Aufschluss über die Reaktionen einzelner Neuronen11,12,13, verlieren aber immer noch die Aktivität der Population und liefern relativ wenige Neuronenaufnahmen pro Tier. Um die Reaktionsmuster neuronaler Ensembles zu analysieren, ohne die Aktivität einzelner Neuronen aus den Augen zu verlieren, mussten neue Techniken eingesetzt werden.

Die Calcium-Bildgebung, insbesondere unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie GCaMP, hat diesen technischen Durchbruch gebracht14,15,16,17,18. GCaMP verwendet Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität und erhöht die grüne Fluoreszenz, wenn der Kalziumspiegel in der Zelle ansteigt. Neue Formen von GCaMP werden weiterhin entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, die Bindungskinetik anzupassen und sich für spezialisierte Experimente anzupassen19. GCaMP bietet im Gegensatz zur Aufzeichnung ganzer Nerven eine Auflösung einzelner Neuronen und kann im Gegensatz zur Einzelfaser- oder Einzelzellaufzeichnung gleichzeitig die Reaktionen von Ensembles von Neuronen messen. Die Calcium-Bildgebung der Genikulatganglien hat bereits wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen16,20geliefert und periphere Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen identifiziert18.

Eine große Schwierigkeit bei der Anwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebungstechniken auf das geniculate Ganglion besteht darin, dass es in der knöchernen Paukenbulle eingekapselt ist. Um einen optischen Zugang zum Genikulat zu erhalten, ist eine heikle Operation erforderlich, um die Knochenschichten zu entfernen und gleichzeitig das Ganglion intakt zu halten. Zu diesem Zweck haben wir diesen Leitfaden erstellt, um anderen Forschern den Zugang zum geniculaten Ganglion zu helfen und die GCaMP-vermittelten fluoreszierenden Reaktionen dieser Neuronen abbilden, um Reize in vivo zu schmecken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der University of Texas San Antonio überprüft und genehmigt.

1. Präoperative Einrichtung

HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Ersteinrichtung der Ausrüstung hier nicht behandelt wird, da sie je nach Verwendeten Pumpensystem, Mikroskop, Kamera und Bildgebungssoftware variiert. Anweisungen zur Einrichtung finden Sie in den Anleitungsmaterialien des Geräteherstellers. Für die von den Autoren verwendeten Geräte siehe Materialtabelle.

  1. Stellen Sie sicher, dass Flüssigkeit durch alle Fahrzeug- (Wasser-) und Tastantleitungen fließt. Wenn die Leitung blockiert ist, trennen Sie die Verbindung und spülen Sie sie mit Wasser. Wenn die Linie geknickt ist, massieren Sie, bis Flüssigkeit fließt. Stellen Sie sicher, dass Flüssigkeit auf Anhieb startet und stoppt.
  2. Sobald alle Leitungen entsperrt bestätigt sind, fahren Sie das Fahrzeug für 10 s und schließen Sie dann alle Ventile.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Imaging-Software mit allen erforderlichen Variablen (z. B. Testlänge, Dateinamen, Bildrate usw.) bereit ist. Geben Sie mit μManager, einem Open-Source-Bilderfassungssoftwarepaket, 200 ms in das Feld mit der Bezeichnung Belichtungszeit für ein Bild pro Sekunde von 5 Hz ein, wählen Sie x2 unter Binningaus und drücken Sie die Taste Live. Wenn das Video gestartet wird, drücken Sie die Taste auf der linken Seite mit der Bezeichnung ROI. Dies führt zu einem Sichtfeld von 512 x 512.

2. Betäubung und Immobilisierung des Tieres

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist ein terminales Verfahren, das für Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 18-35 g optimiert ist. Es wird für die Anwendung bei Tieren zwischen 10 und 12 Wochen empfohlen. Es kann bei transgenen Tieren verwendet werden, die genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) wie die Snap25-GCaMP6s exprimieren, oder bei Tieren, die stereotaxisch mit viralen GECIs injiziert werden. Handschuhe, Laborkittel und Gesichtsmaske sollten für das gesamte Protokoll getragen werden.

  1. Scruff Tier und führen eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie über Zehenklemmen, bevor Sie fortfahren.
  2. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes und den Operationsbereich an der Vorderseite des Halses.
  3. Schalten Sie das Heizkissen ein und legen Sie das Tier anfällig auf das Pad.
  4. Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
  5. Machen Sie einen Schnitt (~ 1 cm) in der Mittellinie des Kopfes, um den Schädel des Tieres freizulegen. Entfernen Sie das Bindegewebe mit einem sterilen Tupfer, damit der nackte Knochen zugänglich ist. Verwenden Sie einen Applikator mit Baumwollspitze, um sicherzustellen, dass der Schädel trocken ist.
  6. Tragen Sie die Tierarztbindung auf den Schädel auf. Achten Sie darauf, den freiliegenden Schädel zu bedecken. Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.
  7. In einem Petrischalendeckel mischen und eine Schicht Zahnzement auf den Schädel auftragen. Das hintere Ende des in Schritt 2.5 verwendeten Applikators mit Baumwollspitze funktioniert gut für diesen Prozess. Legen Sie den Kopfpfosten auf den Zahnzement und tragen Sie eine zweite Schicht Zahnzement auf, um den Kopfpfosten auf dem Schädel zu platzieren.
  8. Lassen Sie es sitzen, bis der Zahnzement trocken und fest ist. Brechen Sie den Applikator mit Baumwollspitze in zwei Hälften und verwenden Sie die spitzen Enden, um den Zahnzement zum Testen zu stochern. Wenn der Zahnzement dem Stochern nicht nachgibt, kann das Tier in Rückenlage gedreht werden.

3. Tracheotomie

  1. Tragen Sie das präoperative Peeling auf den Operationsbereich auf. Nach dem Peeling einen Mittellinienschnitt ~ 2 cm in der Haut des Halses vom Brustbein bis zum Kinn machen.
  2. Ziehen Sie die Haut und die Unterkieferdrüsen zurück und achten Sie darauf, die digastrischen Muskeln vollständig freizulegen.
  3. Finden Sie die Naht in der Paratrachealmuskulatur, trennen Sie sie mit stumpfer Dissektion und ziehen Sie sie offen zurück.
  4. Schneiden Sie vorsichtig eine Öffnung in der Oberseite der Luftröhre ab, die groß genug ist, um Polyethylenschläuche (I.D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm) zu montieren. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Durchmessers der Luftröhre. Führen Sie einen Schlauch in die Luftröhre in Richtung Lunge ein.
  5. Repositionieren Sie Retraktoren, um die paratracheale Muskulatur freizusetzen und die submaxillären Drüsen zurückzuziehen.
  6. Paratrachealmuskulatur mit einer minimalen Menge Veterinärkleber über Schläuche kleben (siehe Abbildung 1A).

4. Aufbrechen der Paukenbulle

  1. Den gewünschten Digastrinnenmuskel (links oder rechts) sanft nach oben necken und das Bindegewebe auseinanderziehen. Schneiden Sie am vorderen Ende des Muskels, vermeiden Sie Blutgefäße und ziehen Sie sich nach hinten zurück, bis die Paukenbulle frei ist.
  2. Neigen Sie den Kopf leicht nach hinten, um die Paukenbulle anzuheben. Lokalisieren Sie den Ast der Halsschlagader vor der hinteren Einstichstelle des Digastrinnenmuskels. Fühlen Sie sich nur hinter diesem Blutgefäß für die konvexe Struktur der Paukenbulle.
  3. Suchen Sie an dieser Stelle nach einer Naht in der Muskulatur (siehe Abbildung 1B). Mit zwei Sätzen feiner Zangen stumpf an der Naht sezieren, bis der Knochen der Paukenbulle sichtbar ist. Verwenden Sie Retraktoren, um eine klare Sicht auf die Paukenbulla zu haben.
  4. Finden Sie die Naht, die anterior bis posterior auf der Bulla verläuft (siehe Abbildung 1C). Stechen Sie mit einer chirurgischen Sonde ein Loch in den Knochen in der Mitte dieser Naht. Verwenden Sie eine feine Endschere, um einen kreisförmigen Bereich im Knochen zu schneiden, und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht vor, hinter und tief unter der Bulle zu schneiden.

5. Freilegen des Genikulats

  1. In diesem Loch befindet sich ein konvexes Stück Knochen, das ist die Cochlea. Anterior zur Cochlea befindet sich ein Muskel, der Tensor Tympani (siehe Abbildung 1D). Schneiden Sie mit der Federschere die Tensor-Pauken ab und entfernen Sie sie.
  2. Führen Sie eine Zehenklemme durch. Wenn das Tier reagiert, geben Sie eine Ketamin / Xylazin-Mischung in einer Dosis von 1/3 zur Umdosierung.
  3. Bereiten Sie Bewässerungsflüssigkeit und eine Saugleitung vor. Stechen Sie mit der chirurgischen Sonde ein Loch in das Cochlea-Vorgebirge. Bewässern Sie sofort die flüssigkeit, die ausströmt, und entfernen Sie sie mit Absaugung. Diese Flüssigkeit fließt von diesem Punkt an mehr oder weniger kontinuierlich und muss regelmäßig behandelt werden.
  4. Vergrößern Sie das Loch in der Cochlea. Achten Sie darauf, dass das Blutgefäß die Cochlea bis zum hinteren und seitlichen Rand umgibt.
  5. Neigen Sie den Mauskopf nach vorne. Suchen Sie das Loch im Schläfenbein unter der Cochlea (siehe Abbildung 1E). Beachten Sie den Grat vor diesem Loch, dieser Grat sitzt direkt über dem siebten Nerv.
  6. Führen Sie eine chirurgische Sonde in das Loch ein und heben Sie vorsichtig den Schläfenbein an, um den siebten Nerv freizulegen (siehe Abbildung 1F). Machen Sie eine Bestandsaufnahme, wie viel des siebten Nervs sichtbar ist, und wenn das Genikulat nicht vollständig freigelegt ist, neigen Sie den Kopf des Tieres nach hinten und versuchen Sie, Knochen von vorne zum Nerv zu ziehen.
  7. Wenn das Ganglion immer noch nicht vollständig sichtbar ist, ziehen Sie mehr Knochen von unten nach oben. Achten Sie sehr darauf, die Sonde nicht tief unter dem Knochen zu platzieren, da dies das Genikulat schädigen kann.

Figure 1
Abbildung 1: Chirurgische Exposition des Ganglionsgeniculat. (A) Bild der Halshöhle der Maus nach der Tracheotomie. Arrow zeigt auf den Digastrischen Muskel, der über dem Operationsbereich liegt, der im Rest der Figur erforscht wurde. (B) Bild der Region unter dem zuvor angegebenen Digastriummuskel. Pfeil zeigt die Naht in der Muskulatur für stumpfe Dissektion an. (C) Bild der Paukenbulla. Pfeil zeigt Naht im Knochen an, um mit einer chirurgischen Sonde zu brechen. (D) Bild des Operationsbereichs nach dem Öffnen der Bulla. Der untere linke Pfeil zeigt die Cochlea, der obere Pfeil zeigt auf den Tensor-Pauken. Boxed Line zeigt den Bereich in (E) und (F) an. (E) Bild des Operationsbereichs, nachdem Cochlea gebrochen und der Inhalt entfernt wurde. Der weiße Pfeil zeigt an, wo die chirurgische Sonde zu platzieren ist, auf die in Protokollschritt 5.6 verwiesen wird. (F) Ein Bild des freigelegten Genikulatganglions. Pfeil zeigt Körper des siebten Nervs an, gestricheltes Dreieck umgibt das geniculate Ganglion. Tafeln A-B, Maßstab = 5 mm. Paneele C-F, Maßstab = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Führen Sie das Tastant-Panel aus

  1. Verwenden Sie Absaugen, um Flüssigkeit über dem Genikulat zu entfernen. Platzieren Sie optional einen absorbierenden Punkt, um das Versickern zu verringern und die Mikroskopnavigation zu unterstützen.
  2. Legen Sie das Tier auf ein saugfähiges Pad unter dem Mikroskop. Lokalisieren Sie das geniculate Ganglion: Nützliche Orientierungspunkte sind das Loch in der Bulla, das Loch im Schläfenbein und der siebte Nerv. Überprüfen Sie mit dem FITC/GFP-Filter auf dem Epifluoreszenz-Scope auf einzelne GCaMP-exprimierende geniculate Ganglien-Neuronen. Ein 10-faches Objektiv (Arbeitsabstand 10 mm) bietet eine ausreichende Auflösung, um die Aktivität einzelner Zellen zu verfolgen, aber auch ein 20-faches Objektiv (Arbeitsabstand 12 mm) kann verwendet werden.
  3. Legen Sie die Dosiernadel für die Tastant-Linie fest in den Mund des Tieres. Legen Sie eine Petrischale unter den Mund des Tieres, um Flüssigkeit aufzufangen.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Kamera das Sichtfeld des Mikroskops betrachtet. Synchronisieren Sie den Start der Videoaufzeichnung mit dem Beginn der tasstanten Präsentation.
  5. Beobachten Sie während der Aufnahme den Live-Feed auf Antworten, Drift und Versickerung.
  6. Wenn Versickerung auftritt, saugen Sie die Flüssigkeit ab, bis die Sicht auf das Genikulat klar ist und wiederholen Sie sich. Wenn Drift auftritt, überprüfen Sie, ob alle Teile des Kopfpfostens fest angezogen sind. Wenn keine Reaktionen auftreten, überprüfen Sie, ob Flüssigkeit fließt und dass Mikroskop und Kamera an der richtigen Stelle fokussiert sind, ohne dass etwas das Sichtfeld verdeckt.
  7. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Videos erhalten wurde. Erleichtern Sie die Retraktoren vorsichtig und wiederholen Sie dann die Schritte 3-6 auf der gegenüberliegenden Seite.
  8. Nachdem die gewünschten Videos für alle gewünschten Ganglien erhalten wurden, euthanasieren Sie das Tier durch zervikale Dislokation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nach dem Protokoll wurde ein transgenes Snap25-GCaMP6s-Tier sediert, genulierte Ganglien wurden freigelegt und Tastant wurde während der Videoaufnahme auf die Zunge aufgetragen. Ziel des Experiments war es zu definieren, welche Tastants Reaktionen aus jeder Zelle hervorrief. Tastantien (30 mM AceK, 5 mM Chinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Zitronensäure)18 wurden in DI-Wasser gelöst und 2 s getrennt durch 13 s DI-Wasser auf die Zunge aufgetragen.

Figure 2
Abbildung 2: Reaktionen von genulären Ganglienneuronen auf Tastantien unter Verwendung von in vivo GCaMP6s-Bildgebung. (A) Epifluoreszierendes Bild des Genulatganglions einer transgenen Snap25-GCaMP6s-Maus während der Baseline, wenn Wasser über die Zunge gegossen wird. Gestrichelte Linien zeigen die ungefähren Grenzen des geniculaten Ganglions an. Der siebte Hirnnerv wird als solcher bezeichnet. (B) Schnappschuss desselben Ganglions in (A) als süßes Tastant (AceK 30 mM) wird auf die Zunge der Maus aufgetragen. Beachten Sie, dass mehrere einzelne Neuronen an Fluoreszenzintensität zunehmen. Das gestrichelte Linienfeld zeigt die süße Antwortzelle an, die am Ende (C) verwendet wird. (C) Spuren von fünf Neuronen, die auf die Amplitude ihrer GCaMP6-vermittelten Fluoreszenz als Reaktion auf ein Panel von Tastantien hinweisen, die süß (30 mM Acesulfam K), bitter (5 mM Chinin) enthalten; salzig (60 mM NaCl); Umami (50 mM Monokaliumglutamat und 1 mM Inosinmonophosphat); und sauer (50 mM Zitronensäure). Farbige Balken zeigen die Platzierung und Dauer (2 s) des Reizes im Laufe des Experiments. Diese repräsentativen Daten beinhalten keine Antwort an umami. Einzelne Neuronen reagieren häufig sowohl auf bittere als auch auf saure Reize (untere Spur) 16,18,20. Panels A-B, Scale = 5 mm. Panel C, horizontaler Skalenbalken zeigt 6,5 Sekunden an, vertikaler Skalenbalken zeigt Schwellenwert von 4% dF/F an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wie in Abbildung 2zu sehen ist, sollten Geschmacksreize, die auf die Zunge aufgetragen werden, zu einem schnellen, vorübergehenden Anstieg der GCaMP-Fluoreszenz führen, was zu einer spürbaren Helligkeitsänderung bei den reagierenden Neuronen führt. Das Video kann mit einer Vielzahl von Softwarepaketen analysiert werden, um Spuren zu erzeugen, die die Veränderungen der Fluoreszenz über die Baseline (dF / F) im Laufe der Zeit einzelner Regionen von Interesse (z. B. einzelne Neuronen) anzeigen und so die Reaktionen jeder Zelle auf das Tastant-Panel zeigen. Bei einer erfolgreichen Operation in einer transgenen Snap25-GCaMP6s-Linie ist es typisch, Reaktionen in 20-40 Neuronen innerhalb eines einzelnen Ganglions / Sichtfeldes zu sehen. Dies kann sich je nach verwendeter transgener Leitung oder wenn stattdessen AAV-GCaMP verwendet wird, ändern. Beachten Sie, dass die Ausgangsfluoreszenz durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst werden kann, einschließlich des Expressionsniveaus des GCaMP und möglicher Schäden an den Zellen während der Operation. Änderungen der Fluoreszenzintensität oberhalb eines Schwellenwertes (typischerweise df/f > 3-fach über dem durchschnittlichen Rauschen)20,21 gelten als positive Reaktion.

Um den Zeitpunkt der Reizabgabe zu bestimmen, sollte die Zeit gemessen werden, die Flüssigkeit benötigt, um durch die Linien zu fließen, um zu wissen, wann eine Flüssigkeitsänderung tatsächlich die Zunge kontaktiert. Um diese Verzögerung zu reduzieren, verwenden Sie eine moderate Durchflussrate (5-10 ml / min) und eine kurze Schlauchlänge, die vom Perfusionsverteiler zur Mundhöhle führt. Typischerweise beginnt die Fluoreszenz mit den hier beschriebenen Reizen fast unmittelbar nach dem Auftragen von Tastant auf die Zunge und beginnt fast sofort zu verblassen, nachdem das Tastant gestoppt und die Mundhöhle mit Vehikellösung gewaschen wurde. Bei der Arbeit mit einem unbekannten Reiz kann es hilfreich sein, die Veränderung der Fluoreszenz einer Region ohne Reaktion von Neuronen zu beobachten, um die Gesamtveränderungen im Bild zu vergleichen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diese Arbeit beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um das geniculate Ganglion chirurgisch freizulegen und die Aktivität seiner Neuronen mit GCaMP6s visuell aufzuzeichnen. Dieses Verfahren ist dem zuvor beschriebenen17sehr ähnlich, mit einigen bemerkenswerten Ausnahmen. Erstens ermöglicht die Verwendung eines Kopfpfostens eine einfache Anpassung der Kopfpositionierung während der Operation. Zweitens, in Bezug auf die Stimulusabgabe, fließt der Ansatz von Wu und Dvoryanchikov Geschmacksreize durch Speiseröhrenschläuche17, während dieses Protokoll Flüssigkeit direkt in den Mund mit einer Dosiernadel liefert. Beide Methoden können verwendet werden, um erfolgreich genikulierte Ganglien-Neuronen-Reaktionen hervorzurufen, indem die fungiformen und palatalen Geschmacksknospen stimuliert werden.

Ein Hinweis zur Aufrechterhaltung eines klaren Bildgebungsfeldes: Nach dem Brechen der Cochlea sickert kontinuierlich Flüssigkeit in den Hohlraum, auch direkt über dem Genikulatganglion. Es ist auch möglich, dass Blutungen das geniculate Ganglion verdecken. Während eine kleine Menge an Versickerung möglicherweise nicht ausreicht, um die Bildgebung zu verhindern, können selbst kleine Mengen Blut die Ganglien vollständig verschließen. Diese Probleme können auf verschiedene Arten angegangen werden. Erstens, wenn die Versickerung relativ gering ist, kann sie mit einer Saugleitung entfernt werden, die zwischen den Versuchen mit einer stumpfen Dosiernadel ausgestattet ist. Alternativ kann Flüssigkeit auch vom Feld weggewischt werden, indem absorbierende Punkte vorsichtig hinter oder seitlich zum siebten Nerv platziert werden. Wenn die Strömung besonders schlecht ist, kann es notwendig sein, den Hohlraum während der Bildgebung abzusaugen. Eine sorgfältig platzierte Saugleitung kann die Ganglien klar halten, während sie an einer seitlichen Stelle aufgetragen werden, um zu vermeiden, dass die Ganglien während der Bildgebung verdeckt werden.

Die Bildgebung selbst kann mit verschiedenen Arten von Mikroskop-Setups durchgeführt werden, von denen jeder seine damit verbundenen Vorteile und Einschränkungen hat. Bei Verwendung eines Epifluoreszenz-Scope18,21ist es nur möglich, die oberflächlicheren Neuronen abbilden. Ein weiteres Problem bei der Epifluoreszenz-Bildgebung ist, dass Signale von tieferen Zellen als Veränderungen der Hintergrundfluoreszenz (unsynschärfelicht) herauskommen, also seien Sie vorsichtig mit der Analyse, um keine Fluoreszenzänderungen von anderen Zellen im ROI aufzunehmen. Für besonders dünne Strukturen, wie die geniculaten Ganglien, sind diese Probleme möglicherweise nicht problematisch. Die Verwendung eines2-Photon-16- oder konfokalen20-Mikroskops kann möglicherweise die Abbildung von Zellen in tieferen Schichten ermöglichen.

Es ist wichtig, einige wichtige Schritte und Möglichkeiten zur Behebung häufiger Probleme hervorzuheben. Zunächst ist zu beachten, dass die Analyse je nach verwendeter Software erheblich variiert. Die Open-Source-Software ImageJ stellt Werkzeuge zur Verfügung, die für die Vorläufige Analyse ausreichen. Entfernen Sie zunächst kleine Bewegungsartefakte mit dem Image Stabilizer Plugin22,als nächstes verwenden Sie ImageJ, um die Änderung der Fluoreszenz dividiert durch die Basisfluoreszenz (dF / F) zu berechnen. Dies kann mit einem der vielen Open-Source-Makros für ImageJ23erreicht werden, das referenzierte Makro bietet detaillierte Installationshinweise. Weitere Makros finden Sie in deren Dokumentation. Verwenden Sie nach der Korrektur für dF / F die Vorwärts- und Rückwärtstasten am unteren Rand des Bildstapels, um die Zellreaktionen auf Reize zu beobachten. Wählen Sie mit dem Lasso-Werkzeug aus der Symbolleiste fluoreszierende Zellen einzeln aus. Verwenden Sie nach dem Auswählen einer Zelle Image | Stapel | Plot-Z-Achse. Dies liefert ausreichende Informationen, um Antwortprofile zu bestimmen und die zeitbezogenen Ereignisse jeder Region von Interesse (ROI) zu analysieren. Fortgeschrittenere Analysen waren lange Zeit die Domäne von benutzerdefinierten Skripten in Matlab, R usw. Die Popularität der Kalziumbildgebung hat jedoch allmählich zur Entwicklung mehrerer Open-Source-Ressourcen für die Analyse geführt, darunter CaImAn, EZCalcium und mehr24,25.
Die Calcium-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Aktivität neuronaler Ensembles mit Einzelneuronauflösung. Aufgrund der geringen Größe des Genikulatganglions ist dieses Protokoll besonders leistungsfähig, da das gesamte Ganglion in einem einzigen Feld visualisiert werden kann. Es gibt jedoch einige Einschränkungen für diese Technik. Zusätzlich zu den Einschränkungen, die allen Calcium-Bildgebungsexperimenten gemeinsam sind, ist der hier beschriebene chirurgische Ansatz invasiv und muss unter Anästhesie durchgeführt werden. Dies ist ein terminales Verfahren - das Tier muss sofort nach der Bildgebung eingeschläfert werden. Daher ist dieser chirurgische Ansatz nicht für Wach- / Verhaltensaufnahmen geeignet.

In den letzten Jahren haben Forscher diese Technik verwendet, um Reaktionsprofile der Neuronen des geniculaten Ganglions16,20,18zu untersuchen. Jüngste Arbeiten haben sich auf potenzielle genetische Marker konzentriert, die zur Manipulation von Subpopulationen innerhalb der Ganglien verwendet werden könnten, und haben gezeigt, wie transgene Cre-Treiberlinien und Cre-abhängige GCaMP verwendet werden können, um die Reaktionsprofile dieser Populationen zu identifizieren26. Andere Arbeiten können GCaMP mit photoaktivierten Proteinen wie pa-mCherry verwenden, um zuerst Zellen zu identifizieren und dann zu markieren, die durch Tastantien aktiviert werden, um dann in der Immunhistochemie oder In-situ-Hybridisierung verwendet zu werden27. Es kann auch möglich sein, kalziumabhängige photo-konvertierbare Proteine wie CaMPARI mit dem gleichen Effekt zu verwenden, während experimentelle Methoden verwendet werden, die den hier beschriebenen sehr ähnlichsind 28. Unabhängig von den spezifischen Fragen und Experimenten bietet die Kalziumbildgebung ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erforschung der Reaktionsprofile von Neuronen, die an einer beliebigen Anzahl von Aktivitäten beteiligt sind, und ihre Nützlichkeit bei der Erforschung des Geschmackssystems steht erst am Anfang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu melden.

Acknowledgments

Die Autoren danken S. Humayun für die Maushaltung. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde teilweise durch den Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) und NIH-SC2-GM130411 der UTSA an L.J.M bereitgestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x #5 Inox Forceps Fine Science Tools NC9792102
1ml Syringe with luer lock Fisher Scientific 14-823-30
2 x #3 Inox Forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
27 Gauge Blunt Dispensing Needle Fisher Scientific NC1372532
3M Vetbond Fisher Scientific NC0398332
4-40 Machine Screw Hex Nuts Fastenere 3SNMS004C
4-40 Socket Head Cap Screw Fastenere 3SSCS04C004
Absorbent Points Fisher Scientific 50-930-668
Acesulfame K Fisher Scientific A149025G
Artificial Tears Akorn 59399-162-35
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle Fisher Scientific 14-829-6D
Blunt Retractors FST 18200-09
Breadboard Thor Labs MB8
Citric Acid Fisher Scientific A95-3
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Contemporary Ortho-Jet Liquid Lang 1504
Contemporary Ortho-Jet Powder Lang 1520
Cotton Tipped Applicators Fisher 19-062-616
Custom Head Post Holder eMachineShop See attached file 202410.ems
Custom Metal Head Post eMachineShop See attached file 202406.ems
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted Hamamatsu C13440
Disection Scope Leica M80
Hair Clippers Kent Scientific CL7300-Kit
IMP Fisher Scientific AAJ6195906
Ketamine Ketaved NDC 50989-996-06
LED Cold Light Source Leica Mcrosystems KL300LED
Luer Lock 1/16" Tubing Adapters Fisher 01-000-116
Microscope Olympus BX51WI
Mini-series Optical Posts Thorlabs MS2R
MPG Fisher Scientific AAA1723230
MXC-2.5 Rotatable probe Clamp Siskiyou 14030000E
NaCl Fisher Scientific 50-947-346
petri dishes Fisher Scientific FB0875713A
Pressurized air Airgas AI Z300
Quinine Fisher Scientific AC163720050
Self Sticking Labeling Tape Fisher Scientific 159015R
Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) Automate Scientific 05-14
Sola SM Light Engine Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D JAX 025111
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical Probe Roboz Surgical Store RS-6067
Surgical Probe Holder Roboz Surgical Store RS-6061
Thread Gütermann 02776
BD Intramedic Tubing Fisher Scientific 22-046941
Two Stage Gas Regulator Airgas Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing - 1/16" Automate Scientific 05-11
Valvelink8.2 digital/manual controller Automate Scientific 01-18
Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System Automate Scientific 17-pp-54
Xylazine Anased NADA# 139-236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4 (2007).
  2. Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
  3. Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
  4. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
  5. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  6. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  7. Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
  8. Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
  9. Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
  10. Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
  11. Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).
  12. Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
  13. Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
  16. Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
  17. Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
  18. Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
  19. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  20. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  21. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  22. Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html (2008).
  23. Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014).
  24. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  25. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  26. Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
  27. Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
  28. Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).

Tags

Neurowissenschaften Ausgabe 168 Calcium-Bildgebung Geschmack geniculates Ganglion
In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fowler, B. E., Macpherson, L. J. In… More

Fowler, B. E., Macpherson, L. J. In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli. J. Vis. Exp. (168), e62172, doi:10.3791/62172 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter