Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/62187
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3, 1
1School of Life Science, University of Warwick, 2Institute of Microbiology and Infection, University of Birmingham, 3Warwick Antimicrobial Screening Facility, School of Life Science, University of Warwick
* These authors contributed equally

Summary

זרימת עבודה זו יכולה לשמש לביצוע בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות מודל ex vivo הוקמה של ביופילם חיידקי בריאות של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. שימוש במודל זה יכול לשפר את התוקף הקליני של MBEC (ריכוז מיגור ביופילם מינימלי) מבחנים.

Abstract

המרשם היעיל של אנטיביוטיקה עבור biofilms חיידקי נוכח בתוך הריאות של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) מוגבל על ידי מתאם גרוע בין בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה (AST) תוצאות באמצעות שיטות אבחון סטנדרטיות (למשל, microdilution מרק, דיפוזיה דיסק, או Etest) ותוצאות קליניות לאחר טיפול אנטיביוטי. ניסיונות לשפר את AST על ידי שימוש בפלטפורמות צמיחה של ביופילם מחוץ למדף מראים שיפור מועט בתוצאות. היכולת המוגבלת של מערכות ביופלם במבחנה לחקות את הסביבה הפיזיוכימית של ריאת CF, ולכן פיזיולוגיה חיידקית וארכיטקטורת ביופילם, משמשת גם כבלם לגילוי טיפולים חדשניים לזיהום CF. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע AST של פתוגנים CF גדל כמו בוגרת, בביופילמים דמויי vivo במודל ריאות CF אקס vivo המורכב רקמת ברונכיולר חזיר ליחה CF סינתטי (ריאות חזיר אקס ויוו, EVPL).

מספר מבחני חוץ קיימים לבדיקות רגישות לביופילם, באמצעות מדיום מעבדה סטנדרטי או ניסוחים שונים של ליחה סינתטית CF בלוחות מיקרוטיטר. הן צמיחה בינונית מצע biofilm (צלחת פוליסטירן לעומת רקמת הסימפונות) צפויים להשפיע על סובלנות אנטיביוטית biofilm. אנו מראים סובלנות משופרת של פסאודומונס aeruginosa קליני סטפילוקוקוס aureus מבודד במודל אקס ויוו; ההשפעות של טיפול אנטיביוטי של biofilms אינו בקורלציה עם ריכוז מעכבות מינימלי (MIC) ב מבחני microdilution סטנדרטיים או סיווג רגיש / עמיד מבחני דיפוזיה דיסק.

פלטפורמת ex vivo יכול לשמש עבור AST biofilm העידו של דגימות המטופל כפלטפורמת בדיקה משופרת עבור סוכני אנטיביופילם פוטנציאליים במהלך מחקר ופיתוח תרופות. שיפור המרשם או האצה של גילוי תרופות אנטיביופילם באמצעות פלטפורמות בדיקה כמו vivo יותר יכול לשפר באופן דרסטי את התוצאות הבריאותיות עבור אנשים עם CF, כמו גם להפחית את העלויות של טיפול קליני ומחקר גילוי.

Introduction

זיהומים כרוניים בביופילם משפיעים על אנשים שההגנות החיסוניות הרגילות שלהם נפגעות. קבוצות בסיכון כוללות אלה עם מצב גנטי סיסטיק פיברוזיס (CF)1. קולוניזציה של ריר עבה באופן חריג, דבק בדרכי הנשימה בינקות מוקדמת מוביל זיהומים biofilm עקשן של הסמפונות2,3. הצמיחה של חיידקים כמו biofilms מטריצה-encapsulated נרחב הוא גורם אחד המבדיל זיהומים כרוניים של אנשים immunocompromised מזיהומים חריפים של מארחים בריאים ואת מצב biofilm הן מגן על חיידקים מפני חשיפה לאנטיביוטיקה (עקב דיפוזיה מופחתת דרך המטריצה) ומקטין את הרגישות לאנטיביוטיקה שלהם (למשל, באמצעות אינדוקציה של השבתה או upregulation של משאבות efflux)4,5. עם זאת, שינויים ספציפיים למחלות בפיזיולוגיה וכימיה של רקמות מארחות משנים עוד יותר את הפיזיולוגיה החיידקית מזה שנצפה בזיהומים חריפים או בתנאי צמיחה סטנדרטיים במעבדה. דוגמאות מרכזיות ב- CF כוללות שימוש במקורות פחמן יוצאי דופן, כגון חומצות שומן וחומצות אמינו המשתחררות מחשיפה לריאות ומיוצרות על ידי השפלה מיקרוביאלית של mucin, שחרור של micronutrients, כגון ברזל מרקמות פגומות, microaerobiosis6,7,8.

התנאים הפיזיוכימיים הספציפיים בהקשר מסוים של זיהום ביופילם יכולים אפוא להשפיע על תגובות לאנטיביוטיקה. ראשית, המבנה והעומק של המטריצה החוץ-תאית תלויים בתנאים סביבתיים מקומיים, כגון חומרים מזינים או כוחות גזירה. שנית, רמזים סביבתיים יכולים לעורר ביטוי של גנים ספציפיים עמידות לאנטיביוטיקה. לדוגמה, פתוגן CF Pseudomonas aeruginosa מראה ביטוי מוגבר של בטא לקטמה וביטוי מופחת של פורינים ב ליחה CF לעומת במבחנה9, בעוד פתוגן CF אחר, Burkholderia cenocepacia, upregulates בטא לקטמסה ומשאבות efflux כאשר גדל בליחה CF10. שלישית, תנאים מארחים יכולים לסמן מעבר פיזיולוגי או גנטי לפנוטיפים עמידים לאנטיביוטיקה, שקשה לשחזר במבחנה. אלה כוללים גרסאות מושבה קטנות של פתוגן CF סטפילוקוקוס אוראוס11,12.

כל הנתונים הללו מצביעים על כך שכאשר מעבדות אבחון מבודדות שיבוטים בודדים מביופילם פתוגניים ומבצעות AST על תרבויות גדלות פלנקטוניות או אגר-צלחת במדיית מעבדה סטנדרטית (microdilution מרק, דיפוזיה דיסק או Etest), התוצאות לעתים קרובות אינן מנבאות אילו אנטיביוטיקה תעבוד למעשה vivo. גם אם במבחנה biofilm assays משמשים, הם לא יכולים אות פנוטיפ biofilm דמוי vivo בשל הבדלים במשטח בינוני התקשרות בשימוש, כך מבחנים באמצעות תאי זרימה או פלטפורמות microplate תפוקה גבוהה יכול להעריך יתר על המידה רגישות לאנטיביוטיקה13. אותה בעיה חלה גם על חוקרים באקדמיה ובתעשייה המבקשים לפתח סוכני אנטיביופילם חדשים: בדיקת פוטנציאל התרופה באמצעות פלטפורמות חוץ גופיות כמו תאי זרימה, צלחות מיקרוטיטר או כורי ביופילם של המרכז לבקרת מחלות עשויה להציב את רף היעילות של הביופילם נמוך מדי ולייצר תוצאות חיוביות שגויות בצנרת המחקר והפיתוח.

המתאם המסכן בין תוצאות AST לבין תוצאה קלינית לאחר טיפול אנטיביוטי ב- CF ידוע היטב. רופאים רבים פשוט להתעלם AST מעבדת אבחון כמו אין אחיד, CF הנחיות ספציפיות לפרש את התוצאות האלה במקום לקבל החלטות מקרה אחר מקרה עבור מרשם. נעשו ניסיונות לשפר את CF AST באמצעות מכשיר הביופילם קלגרי, המשתמש בביופילמים הגדלים על פני השטח של יתדות פלסטיק שנקבעו בתוך בארות של מיקרופלטה המכילה מדיום AST סטנדרטי (למשל, מרק מולר-הינטון מותאם קטיון)14,15. בדיקה זו אינה טובה יותר בחיזוי אילו אנטיביוטיקה תעבוד vivo מאשר AST פלנקטוני סטנדרטי16. ההשפעה על חולים עם CF היא בולטת. למרות מתן אנטיביוטיקה חוזרת ונשנית (אנטיביוטיקה בשאיפה רגילה וחציון של 27 ימים בשנה קבלת אנטיביוטיקה תוך ורידי עבור אנשים עם CF בבריטניה)17, פרקים תכופים ובלתי צפויים של החמרה ריאתי חריפה להוביל נזק ריאות פרוגרסיבי, בערך 90% מהמקרים, מוות מכשל נשימתי. בניתוח שנערך לאחרונה, זיהום ריאות חיידקי היה המנבא החזק ביותר של עלויות תרופות ב- CF, והוסיף בממוצע € 3.6K / חולה / שנה כדי ישירות עלויות הבריאות18,19.

עבור זיהומים חריפים של אנשים בריאים אחרת, המחקר הנוכחי ומדיניות התמקדות AST מהיר מבוסס, למשל, נקודת טיפול חיזוי גנומי הוא אידיאלי20. אבל במקרה של זיהומים כרוניים CF, ברור כי גישה שונה יש צורך: היישום של AST במודלים מחקה מארח כי טוב יותר לסכם את הסביבה vivo ומצב מטבולי פתוגן ולאפשר היווצרות של מבנה ביופילם מציאותי.

פיתחנו בעבר מודל ביופילם CF הכולל קטעים של ברונכיולה חזיר דגירה בליחה סינתטי CF נגוע P. aeruginosa או S. aureus. EVPL נגוע שומרת על היסטופתולוגיה נורמלית במשך 7 ימים אבל מעבדה או מבודדים קליניים של P. aeruginosa ו S. aureus טופס רבייה אגרגטים דמויי vivo סביב הרקמה, מחקה את האטיולוגיה של זיהום CF21,22,23. אנו מציגים פרוטוקול לשימוש זה בתוקף גבוה, מודל תפוקה גבוהה כפלטפורמת AST biofilm מותאם אישית עבור CF ולהציג תוצאות למופת מראה את הסובלנות הגבוהה של ביופילמים פתוגן לאנטיביוטיקה בשימוש קליני כאשר גדל במודל. המודל יכול בקלות להיות משולב במחקר, צינורות פיתוח לניהול או מניעה של היווצרות biofilm ופוטנציאל לתוך AST אבחון. רוב הציוד המשמש (ראה טבלה של חומרים) ניתן למצוא בקלות במעבדה מיקרוביולוגית טיפוסית, אם כי מקצף חרוזים הוא חיוני, ומצאנו מעבודה עם משתפי פעולה כי ארון germicidal אולטרה סגול מתאים ייתכן שיהיה צורך גם לרכוש. מכיוון שהריאות מגיעות מקצבים מסחריים או מבתי מטבחיים, המודל אינו מציג חששות אתיים.

Protocol

פרוטוקול זה משתמש בריאות חזיר שמקורן בבית מטבחיים מסחרי המספק בשר לצריכה אנושית. על פי החקיקה בבריטניה, שימוש בשאריות רקמה מבעלי חיים שנשחטו לבשר אינו דורש אישור אתי; אנו ממליצים לקוראים לבדוק חוקים מקומיים רלוונטיים והנחיות מוסדיות לפני תחילת העבודה.

1. הכנת מדיה סינתטית של ליחה CF (SCFM)

  1. כדי להפוך SCFM לשימוש עם רקמת EVPL, בצע את המתכון המתואר על ידי Palmer et al.24 עם השינוי כי גלוקוז מוסר מן המתכון.
    הערה: המתכון של Palmer et al.s מכיל חומצות אמינו חופשיות, קטיונים, אניונים ולקטאט בריכוזים המייצגים את הריכוזים הממוצעים שנמצאו במבחר דגימות ליחה מחולי CF. הוכח כי הוא מרמז על מסלולי שימוש דומים בפחמן וביטוי של אותות חישת מניין על ידי P. aeruginosa PA14 לצמיחה במדיום עשוי כיח המטופל lyophilised24. מתכון 1 L שונה SCFM מסופק בטבלה S1.
  2. מסננים לעקר את SCFM מיד לאחר ההכנה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.

2. ניתוח וזיהום של רקמת ריאה חזירה אקס ויוו (EVPL)

  1. לפני הניתוח, הכינו צלחת אגר/ים של זן/ים חיידקיים נדרשים לזיהום באמצעות כל אגר שהוא סטנדרטי במעבדה עבור P. aeruginosa/S. aureus (למשל, מרק lysogeny + 1.2% אגר).
  2. לחשב כמה חתיכות רקמת הסימפונות חזיר נדרשים לניסוי, כולל חתיכות רקמת בקרה לא מושפעות. הכפל מספר זה בשתיים כדי לחזור על הניסוי בשתי ריאות משוכפלות כדי לאשר חזרה על התוצאות.
  3. להכפיל את המספר הכולל של חתיכות רקמה הנדרשים על ידי 0.5 כדי לקבוע את נפח SCFM agarose (mL) צריך לעשות רפידות agarose לעשות מספיק בינוני עבור 400 μL / פיסת רקמה בתוספת רזרבי SCFM אגר להסביר כל שגיאות pipetting או אידוי במהלך ההכנה.
  4. הוסף 0.12 גרם של agarose לכל 15 מ"ל של SCFM נדרש כדי להפוך את הנפח הכולל הרצוי של SCFM עם 0.8% משקל / נפח agarose.
  5. מחממים את תמיסת ה-SCFM agarose עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין. מומלץ לעשות מיקרוגל ביתי בהספק נמוך. הזמן הנדרש תלוי בהספק של המיקרוגל. אפשר agarose להתקרר כ 50 מעלות צלזיוס (חם למגע אבל נוח להחזיק). אין לאפשר להתקרר עוד.
  6. באמצעות פיפטה, להוסיף 400 μL של SCFM agarose לבאר אחת של צלחת 24-well לכל פיסת רקמה הדרושה.
  7. לעקר את SCFM agarose המכיל 24-צלחת / s היטב תחת אור אולטרה סגול במשך 10 דקות.
  8. הכן שלושה שטיפות שכפול עבור כל ריאה שלם להיות מנותח באמצעות 20 מ"ל של בינוני הנשר שונה של Dulbecco סטרילי (DMEM) בתוספת 20 מ"ל של מכון הזיכרון סטרילי רוזוול פארק (RPMI) 1640 בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמיטצילין.
  9. הפוך aliquot של 40 מ"ל SCFM כמו לשטוף הסופי עבור כל ריאה שלם להיות מנותח. כל הכביסה ניתן לאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס או בשימוש מיידי.
  10. להשיג ריאות מהמקור המיועד בהקדם האפשרי לאחר השחיטה, להבטיח שהם נשמרים קרים על ידי הובלה למעבדה בקופסת קרירות ביתית.
    הערה: ריאות קרובות יותר ליום השחיטה מראות פחות שטפי דם מאחסון, אך ניתן להשתמש גם ברקמות שנשמרו על אחסון קר עד 4 ימים מהשחיטה. כמו coolbox צריך להילקח לתוך החנות של הקצב או בית מטבחיים, זה חייב להיות decontaminated בעקבות הנחיות המעבדה המקומית לאחר כל שימוש ומאוחסן מחוץ למעבדה מיקרוביולוגיה כאשר לא בשימוש, כדי להפחית את הסיכון לזיהום והפרת בלימה.
  11. עובדים על משטח מעוקר ומתחת ללהבה, מניחים את הריאות על קרש חיתוך פלסטיק נקי מכוסה רדיד אלומיניום autoclaved. תבדוק שהסמפונות נשארים שלמים. אם נגרם נזק בבית המטבחיים או במהלך ההובלה הריאות אינן מתאימות לשימוש.
  12. מחממים סכין לוח מתחת ללהבה ונוגעים בקצרה בסכין לאזור הריאה המקיף את הסמפונות כדי לעקר את פני השטח של הרקמה.
  13. חותכים את רקמת פני השטח המקיפה את הסמפונות באמצעות סכין גילוח רכוב סטרילי. הפוך חתכים במקביל הסמפונות כדי למנוע נזק.
  14. לאחר ברונכיול נחשף, לעשות חתך חתך דרך הסמפונות בנקודה הגבוהה ביותר גלוי לשחרר את הסמפונות.
  15. באמצעות מלקחיים סטריליים, להחזיק קלות את הקצה החופשי של הסמפונות לחתוך כל רקמה לא רצויה שנותרה באמצעות סכין גילוח רכוב סטרילי. בצע חתך חתך סופי על פני הסמפונות לפני כל הסתעפות גלוי להסיר את הסמפונות מן הריאות.
  16. מניחים את הסמפונות בשטיפת DMEM/RPMI 1640 הראשונה. השאירו את הסמפונות בכביסה וחזרו על שלבים 2.11-2.14 כדי לקצור חלקים נוספים של הסמפונות מאותה ריאה כנדרש כדי להניב מספיק קטעי רקמה לניסוי המתוכנן.
  17. מניחים את כל חלקי הסימפונות הנוספים מאותה ריאה לתוך הכביסה (שלב 2.16). השאירו בכביסה לפחות 2 דקות.
  18. הסר את הסמפונות מן לשטוף DMEM / RPMI הראשון 1640 ומניחים את הדגימות בצלחת פטרי סטרילי.
  19. החזק כל ברונכיול קלות באמצעות מלקחיים סטריליים, הקפד לא לפגוע ברקמה. הסר כמה שיותר רקמות רכות שנותרו וחתך את הרקמה לתוך ~ 5 מ"מ רצועות רחבות באמצעות מספריים ניתוח סטרילי.
  20. מניחים את כל רצועות רקמת הסימפונות לתוך לשטוף DMEM / RPMI 1640 השני. השאירו בכביסה לפחות 2 דקות.
  21. הסר את רצועות הרקמה מהכביסה השנייה באמצעות מלקחיים סטריליים, תוך דאגה לא לפגוע ברקמה. מניחים את הרקמה בצלחת פטרי נקייה וסטרילית.
  22. הסר את כל הרקמות הרכות הנותרות המחוברות לסימפונות וחתך את הרצועות לריבועים (~ 5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות מספריים סטריליים.
  23. הוסף את הכביסה השלישית DMEM / RPMI 1640 לתוך צלחת פטרי. מערבבים קלות את חתיכות הרקמה בכביסה על ידי מערבולת המנה.
  24. יוצקים את הכביסה השלישית מתוך צלחת פטרי מבלי להסיר את חתיכות הרקמה.
  25. מוסיפים את שטיפת SCFM הסופית לצלחת פטרי המכילה רקמות, ומבטיחים שכל חתיכות הרקמה מכוסות.
  26. לעקר את חתיכות הרקמה ב SCFM תחת אור UV במשך 5 דקות.
  27. השתמש מלקחיים סטריליים להעביר כל חתיכת רקמת ברונכיולר מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת 24-well/s המכיל רפידות SCFM agarose.
  28. כדי להדביק כל פיסת רקמה בזן החיידקי הרצוי, גע במושבה הגדלה על צלחת אגר עם קצה של מחט 29 גרם המחוברת למזרק אינסולין סטרילי של 0.5 מ"ל. ואז לגעת במושבה על פיסת הרקמה, בעדינות דקירת פני השטח של הרקמה.
    הערה: שימוש במזרק אינסולין המצויד במחט 29 G מאפשר להחזיק את המחט בצורה מדויקת ובנוחות תוך שמירה על מרחק בטוח מהמחוט ורקמת הריאה. ניתן לבצע שלב זה באמצעות 29 G מחטים שאינן מחוברות מזרק, אבל זה דורש גרגרנות גדולה יותר ומגביר את הסיכון לפגיעה במחט. מזרקי אינסולין זמינים.
  29. עבור פקדים שאינם מושפעים, בעדינות לדקור את פני השטח של כל פיסת הרקמה עם קצה של מחט 29 G מחובר מזרק אינסולין סטרילי 0.5 מ"ל.
  30. השתמש פיפטה להוסיף 500 μL של SCFM לכל באר.
  31. לעקר קרום איטום נושם עבור כל צלחת 24-באר תחת אור אולטרה סגול במשך 10 דקות(שולחן החומרים).
  32. מוציאים את המכסה/ים מהצלחת/ים של 24 באר ומחליפים בקרום הנשימה.
  33. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עבור הדגירה הרצויה (זיהום) זמן בלי לרעוד. בדוק כי אין צמיחה גלויה של פתוגן מחוסן על חתיכות שליטה לא מזוהמים (בקרת זיהום).
    הערה: אם תרצה, ניתן להוסיף אמפצילין לרפידות ה-SCFM agarose בשלב 2.5 ולכסות SCFM בשלב 2.30 לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל. זה ידכא את הצמיחה של חיידקים אנדוגני ביותר על הריאות מבלי להשפיע על P. aeruginosa או S. aureus צמיחה אבל, כמו נוכחות של ampicillin עשוי להשפיע על רגישות לאנטיביוטיקה אחרים, הקורא נשאר לעשות את הבחירה הזאת בהתאם זנים ואנטיביוטיקה הם רוצים לבדוק.

3. קביעת יעילות אנטיביוטית

הערה: סכמטי המפרט את השלבים של הודעה זו מסופק באיור S1.

  1. כדי למדוד סובלנות אנטיביוטית של biofilms נוצר על EVPL, לשכפל קבוצות של חתיכות ריאות, מלפחות שתי ריאות עצמאיות, יש להגדיר במהלך הניתוח וזיהום. קבוצה אחת של חתיכות נדרשת לשליטה שלילית (ללא טיפול אנטיביוטי), וקבוצה אחת נדרשת כדי שכל ריכוז של אנטיביוטיקה ייבדק.
  2. לאחר 48 שעות של דגירה, לבדוק חזותית את חתיכות רקמה לא מושפע. צמיחה מסוימת של חיידקים אנדוגני לריאת החזיר אולי התרחשה, מוביל SCFM סביב סעיפים אלה להיות עכור. אם צמיחה אופיינית של מיני המחקר שנבחרו נצפו (למשל, אבחון פיגמנטציה כחול-ירוק של P. aeruginosa), להתחיל מחדש את הניסוי עם ריאות טריות.
  3. אם מקטעי הרקמה שאינם מושפעים מראים צמיחה חיידקית מינימלית או רק מינימלית, הכינו צלחת שטיפה אחת של 24 באר וצלחת טיפול אחת של 24 באר, שכל אחת מהן מכילה 500 μL של SCFM טרי ללא אנטיביוטיקה או עם אנטיביוטיקה של עניין לכל כלי רקמת ריאה.
  4. הסר כל חתיכת רקמה נגועה מצלחת הדגירה עם מלקחיים מעוקרים להבה, מערבולת בקצרה בבאר טרייה של צלחת לשטוף כדי להסיר את כל התאים חיידקי שאינם biofilm הקשורים, ולהעביר את הבאר המתאימה של צלחת הטיפול.
  5. לאטום את צלחות הטיפול עם קרום נושם טרי.
  6. דגירה צלחת הטיפול / s ב 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד במשך 18-24 שעות.
  7. באמצעות מלקחיים מעוקרים להבה, להסיר כל חתיכת ריאה מצלחת 24-well ולשים צינור הומוגניזציה סטרילי 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מלוחים פוספט-אגירה (PBS) ו 1 גרם של חרוזי מתכת(שולחן החומרים).
  8. חרוז לנצח במשך 40 שניות ב 4 m/s.
    הערה: מכות חרוזים עם חרוזים והומוגניזר ספציפיים המוצעים בטבלת החומרים אינם גורמים לתזה משמעותית של חיידקים, אך כל מעבדה המשתמשת בפרוטוקול צריכה לבדוק את ההשפעות של החרוזים וההומוגניזר הנבחרים שלהם לפני תחילת מבחני AST.
  9. לדלל באופן סדרתי את הריאה הומוגנית באמצעות PBS וצלחת על מרק Lysogeny (LB) אגר כדי לקבוע את המושבה להרכיב יחידות (CFU) בודדים לא מטופלים אנטיביוטיקה רקמות חתיכות על פי שיטות ציפוי סטנדרטי.
    הערה: אופציונלי: הכן לוחות כפולים במדיה סלקטיבית כדי לאשר זהויות מושבה; לדוגמה, שימוש באגר מלח מניטול עבור S. aureus.

Representative Results

דגם ה-EVPL מספק פלטפורמת בדיקות תפוקה גבוהה, המאפשרת לסנן מספר רב של מבודדים חיידקיים לרגישות לאנטיביוטיקה בו זמנית (איורים 1 ו-2)או לסנן זנים כנגד מגוון ריכוזי אנטיביוטיקה בניסוי אחד (איור 3). עם תרגול, מצאנו כי כ 200 מקטעי רקמת הסימפונות ניתן להכין מן הריאות בתוך 2 שעות. ניתן להשלים את הניסוי כולו עבור AST בתוך שעות עבודה רגילות. הצמיחה של Pseudomonas aeruginosa ו Staphylococcus aureus מבודד והקמת 48 h biofilm במודל הוא אמין, כאשר מנוטר על ידי ספירת תאים קיימא, מייצר עומסים חיידקיים עקביים (איורים 1 ו -2). תמונות של ביופילמים הקשורים לרקמות של פסאודומונס ארוגינוסה וסטפילוקוקוס אוראוס הגדלים ב- EVPL ניתן למצוא, יחד עם פרוטוקולים להכנת מיקרוסקופיה קלה וכתמים היסטולוגיים, בפרסומים שלנו21,23. עם זאת, הרבייה של ספירת CFU משתנה עבור מינים חיידקיים שונים. ניתן לכמת זאת באמצעות חישובי חזרות סטנדרטיים לאחר ANOVA25; מצאנו כי יש בדרך כלל וריאציה גדולה יותר בין CFU בשכפול דגימות ריאות עבור S. aureus מאשר עבור P. aeruginosa. אנו ממליצים כי, על אימוץ המודל על ידי מעבדה, חישובים חוזרים נערכים על ניסויי פיילוט כדי לייעל טכניקות ניסיוניות ולקבוע דגימות גדלים לשמש בניסויים סופיים (דוגמה לכך ניתן למצוא תוספת נתונים עבור סוויני ואח'26).

כאשר גדלים ב- EVPL, ביופילמים של P. aeruginosa ו- S. aureus מפגינים עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה בהשוואה לרגישות ב- MIC מרק סטנדרטי המאושר בתעשייה (איור 1) ושיחות דיסק באמצעות מדיה סטנדרטית (איור 2). ההשפעות השונות של אנטיביוטיקה שונה על ביופילם מבוסס EVPL ניתנות להבחנה, למשל P. aeruginosa הרג מושגת EVPL עם ציפרופלוקסאצין MIC 4-16X אבל לא עם 4-8X MIC כלוראמפניקול (איור 1). מנה יומית כפולה של 600 מ"ג linezolid משיג ריכוז סרום מעל MIC90 עבור פתוגנים רגישים (4 מיקרוגרם / מ"ל)27 והוא נחשב חשיפה נאותה ללא תופעות לוואי שליליות28. נתונים המוצגים באיור 2 מראים כי אוכלוסיות S. aureus, הרגישות ל- linezolid במח"ש הדיסק, מסוגלות לשרוד ריכוזי סרום יעד, וגבוהות יותר (12 מיקרוגרם למ"ל), ב- EVPL. אין מתאם ברור בין השפעות MIC ואנטיביוטיקה על ביופילמים שגודלו ב-EVPL עבור P. aeruginosa (איור 1). השגת מדד מדויק יותר של עמידות אנטיביוטית in vivo חשוב כי מנון תת אופטימלי של אנטיביוטיקה יכול להגביר את הסיכון של בחירה עבור עמידות בזיהום כרוני.

זה ידוע היטב כי מצב biofilm של צמיחה יכול להפחית באופן משמעותי את הרגישות החיידקית לאנטיביוטיקה. זה הוביל להתפתחות של מבחני ביופילם במבחנה רבים והשימוש בריכוז מיגור ביופילם מינימלי (MBEC)14,15 במקום MIC כמנבא מדויק יותר של רגישות בזיהום כרוני. השימוש ב- SCFM (בניסוחים משתנים) הומלץ גם לשימוש בבדיקות MIC או MBEC29. כאן אנו מראים שאפילו מבחני חוץ ממוטבים אינם יכולים לחזות במדויק את הרגישות של P. aeruginosa לקוליסטין ב- EVPL. כמות האנטיביוטיקה הנדרשת להשגת 3לוגים 10 הרג של חיידקים שגודלו ב- EVPL גבוהה לעתים קרובות באופן משמעותי מהמיקרופון או מה- MBEC המחושב ממטעני במבחנה סטנדרטיים, גם כאשר SCFM משמש עבור מבחנים אלה (איור 3). זה עולה בקנה אחד עם סקירה קוקרן שדיווחה כי היישומים הנוכחיים של בדיקות רגישות biofilm במבחנה אינם מספקים כל כוח חיזוי מוגבר עבור מרשם אנטיביוטי ב- CF לעומת בדיקות רגישות סטנדרטית16.

זה גם פשוט להשתמש במודל כדי להעריך את ההשפעה של אנטיביוטיקה על חיידקים biofilm לאורך זמן, כמו חתיכות העתק מספיק של הריאה ניתן לחסן כדי לאפשר דגימה הרסנית. בנוסף להבדלים בין חומרים מיקרוביאליים, המודל יכול להדגיש שינויים ברגישות בשלבי צמיחה חיידקיים שונים או בגיל של ביופילם ובמרווחי מינון אנטיביוטיקה שונים. איור 4 ממחיש את הסובלנות הגוברת של ביופילמים של P. aeruginosa למרופנם ככל שהם מתבגרים. זה יכול להיות שימושי כדי לקבוע את היעילות של סוכנים חדשים, למשל אם הם יעילים יותר במהלך חלוקת תאים מהירה. זה עשוי להיות גם שיקול חשוב בעת הגדרת האילוצים של ניסוי, שכן ייתכן שיהיה צורך לתקנן ולאמת גיל biofilm, כדי למנוע את הגיל יש השפעה על התוצאות.

באיור 5, הישרדות S. aureus נמדדה ב 4 שעות ו 24 שעות לאחר חשיפה flucloxacillin וניתן היה להבחין בהבדלים בהפחתה לספירת תאים חיידקיים לאורך זמן ובין מבודדים. זה עשוי להיות שימושי עבור פיתוח תרופות, למשל בעת הגדרת פרמטרים פרמקוקינטיים פרמקודינמיים או כאשר מבהירים את אופן הפעולה של סוכן הרומן.

וריאציות בעומס חיידקי לעתים קרובות להגדיל עם זמני תרבות מורחבת. ניתן לראות זאת בבקרה הלא מטופלת באיור 5 לאחר פיתוח ביופילם של 48 שעות וחשיפה נוספת של 24 שעות לחשבון על מרווח מנון אנטיביוטי. וריאציה היא מהותית למודל; כל דגימת ריאה אינה תלויה באחרים ומשקפת את השונות הטבעית של הריאות. לכן, חשוב לוודא שמספר מספיק של עותקים משוכפלים נכלל כדי לאפשר אימות ופרשנות מדויקת של התוצאות. אנו מפנים את הקורא בחזרה להמלצתנו לבצע חישובים חוזרים על הנתונים כדי לאפשר בחירה של גדלי מדגם חזקים.

לפשטות, הצגנו נתונים מייצגים שנלקחו מקטעי רקמה משוכפלים שנרכשו מזוג ריאות יחיד בכל ניסוי, אך בפועל יש צורך לבצע ניסויים חוזרים על מקטעי רקמות שנלקחו מבעלי חיים משוכפלים. זה צריך להיעשות על מנת להסביר כל וריאציה ביולוגית בין חזירים בודדים, ואנו מפנים את הקורא לעבודה שפורסמה שלנו לדוגמאות של כמה עקבי התוצאות יכולות להיות בין רקמות שנלקחו חזירים משכפלים וכיצד וריאציה זו נלקחת בחשבון בניתוח סטטיסטי של נתונים באמצעות ניתוח של שונות (ANOVA)/ מודלים ליניאריים כלליים (GLM)21,26.

Figure 1
איור 1. סה"כ CFU של 11 CF Pseudomonas aeruginosa מבודדים קליניים התאושש מודל EVPL בעקבות טיפול באנטיביוטיקה. תוצאות מייצגות של טיפול אנטיביוטי של P. aeruginosa במודל EVPL. כל זן גדל על רקמת EVPL במשך 48 שעות ולאחר מכן הועבר אנטיביוטי (משולשים) או PBS כפקד (עיגולים) במשך 18 שעות ואת CFU / ריאות נקבע. ה- MIC עבור האנטיביוטיקה המתאימה שנקבעה ב- MHB מותאם קטיון סטנדרטי מוצג בסוגריים ליד כל זן (ציר x). הזנים מסודרים על-ידי הגדלת ערכי MIC. הנתונים נותחו באמצעות בדיקות T בעת הצורך ובדיקות Mann-Whitney U עבור ערכות נתונים לא פרמטריות. הבדלים משמעותיים בין רקמות שטופלו באנטיביוטיקה ורקמות לא מטופלות מסומנים על ידי כוכביות(P < 0.05). א. ספירות קיימא התאוששו P. aeruginosa biofilms גדל במודל EVPL וטופלו 64 מיקרוגרם / מ"ל כלורמפניקול (ערך MIC הגבוה ביותר שנרשם). עבור כל מבודד, ההבדל הממוצע הסטנדרטי ב- CFU בין מקטעי רקמה שטופלו בכלורמפניקול לבין מקטעי רקמה לא מטופלים חושב באמצעות d של כהן. לא היה מתאם בין ערך MIC במבחן הסטנדרטי לבין הירידה במספר התאים הקיימים במודל EVPL כפי שנמדד על ידי d של כהן (מתאם הדירוג של ספירמן, rs = 0.45, p = 0.16) B. תוצאות של ביופילמים P. aeruginosa גדל במודל EVPL וטופלו 64 מיקרוגרם / מ"ל ציפרופלוקסאצין (ערך MIC הגבוה ביותר שנרשם). הערכים מתחת לקו המקווקו היו מתחת לגבול הזיהוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. סה"כ CFU של 8 סטפילוקוקוס אוראוס CF מבודדים קליניים התאוששו מודל EVPL לאחר טיפול עם linezolid. כל זן גדל על רקמת EVPL במשך 48 שעות ואז הועבר linezolid (משולשים) במשך 24 שעות או לא טופלו כפקד (עיגולים). כל הזנים נמצאו רגישים linezolid באמצעות מבחני דיפוזיה דיסק סטנדרטי בעקבות הנחיות EUCAST30 (אזור של עיכוב > 21 מ"מ). הנתונים נותחו באמצעות בדיקות T בעת הצורך ובדיקות Mann-Whitney U עבור ערכות נתונים לא פרמטריות(P < 0.05). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בין אנטיביוטיקה שטופלה לבין טיפול לא מטופל עבור כל אחד מהזן. הערכים מתחת לקו המקווקו היו מתחת לגבול הזיהוי. א. תוצאות של S. aureus biofilms במודל EVPL שטופלו 4 מיקרוגרם / מ"ל linezolid (נקודת שבירה קלינית רגיש / עמיד על פי סיווג EUCAST31). ב. ב. תוצאות של S. aureus biofilms במודל EVPL שטופלו 12 מיקרוגרם / מ"ל linezolid (נתונים לשכפל מ Sweeney et al23). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. בר קיימא Pseudomonas aeruginosa ספירת תאים של זן המעבדה PA14 ו 4 CF מבודדים קליניים התאושש מודל EVPL לאחר טיפול עם ריכוזים הולכים וגדלים של קוליסטין. כל זן גדל על רקמת EVPL במשך 48 שעות ואז נחשף קוליסטין במשך 18 שעות. ה- MIC הנקבע באמצעי MHB מותאם ייעוד סטנדרטי מוצג בסוגריים מרובעים לצד כל שם זן. הקווים האנכיים מציגים את ערך MBEC שנקבע ב- MHB (מלא) וב- SCFM (מקווקו), למעט SED6, שבו הערך היה זהה בשני המדיה. נקודות הנתונים שלא מולאו מייצגות את הריכוז הנמוך ביותר של קוליסטין שנבדק וכתוצאה מכך ≥ 3-log10 הפחתה ב- CFU / lungcompared לדגימות לא מטופלות (0 מיקרוגרם / מ"ל קוליסטין) (נתונים ששוחזרו מ Sweeney et al26). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. נציג קיימא Pseudomonas aeruginosa תא ספירות מתוך מהלך זמן של צמיחה על מודל EVPL מעל 24 שעות, וטיפול לאחר מכן עם 64 מיקרוגרם / מ"ל meropenem. זן המעבדה P. aeruginosa PA14 ו 3 CF מבודדים קליניים גדלו על רקמת EVPL לזמן המוצג על ציר x, ולאחר מכן הועבר meropenem (משולשים) עבור 24 שעות או שמאל מטופל כפקד (עיגולים). CFU / ריאה נקבעה אז. ה- MIC שנקבע באמצעי MHB מותאם-קטיון מוצג בסוגריים מרובעים לצד כל שם זן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. נציג קיימא Staphylococcus aureus ספירת תאים בעקבות צמיחה על מודל EVPL לאחר מכן מטופלים עם 5 מיקרוגרם / מ"ל flucloxacillin על פני קורס זמן 24 שעות. זן הבקרה ATCC29213 ושני מבודדים קליניים CF גדלו על רקמת EVPL במשך 48 שעות ולאחר מכן הועבר flucloxacillin (משולשים) או לא מטופל כפקד (עיגולים) עבור 4 שעות ו 24 שעות, לפני CFU / ריאה נקבעה (נתונים לשכפל מ Sweeney et al23). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור S1. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.  

שולחן S1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.  

Discussion

מודל הריאות ex vivo הוא תפוקה גבוהה וזולה, ומכיוון שהוא משתמש בפסולת פוסט-צרכנית מתעשיית הבשר, הוא אינו מציג חששות אתיים. הוא נועד לחקות דרכי הנשימה האנושיות הנגועות כרונית CF טוב יותר מאשר זמין כיום, במחיצים פלטפורמות AST. התוצאות המוצגות כאן מראות כי זה עשוי לחזות בצורה מדויקת יותר רגישות לאנטיביוטיקה בנסיבות אלה.

שלבים קריטיים בפרוטוקול, שיבטיחו תוצאות אמינות וניתן לשחזור כוללים את הפעולות הבאות:

  1. השתמש בשיטות זמן ואחסון עקביות בין שחיטה, איסוף ועיבוד של דגימות ריאות. חשוב להשתמש בריאות בהקדם האפשרי לאחר השחיטה ולשמור על פוטנציאל הזיהום למינימום. הבדלים ביכולת של תרבויות ניסיוניות לגדול בריאות אם הם לא טריים ככל האפשר נצפו.
  2. שמירה על סטריליות בייצור של SCFM וניתוק של חתיכות ריאות הוא חיוני. ריאות בריאות אינן סטריליות ולכן נוכחותם של חיידקים קומנסליים עשויה לשקף סביבה 'טבעית' לזיהום כרוני. עם זאת, כפי שצוין קודם לכן, אינטראקציות חיידקיות בתוך אוכלוסיות multispecies עשוי לשנות את התוצאות ואת הרגישות לאנטיביוטיקה, ולכן זיהום יש להימנע ריאות צריך להיות מעוקר לפני השימוש. אנו תומכים בשימוש עיקור UV, כפי שהוא לא נראה לגרום לשינויים שלמות רקמת הפח, ואם יש צורך, שטיפות אנטיביוטיקה נוספות. עם זאת, אנטיביוטיקה יש להשתמש בזהירות, כפי שהם עשויים להשפיע על התוצאות על ידי החדרת לחצים סלקטיביים ועשויים לשנות ביטוי גנים באוכלוסיות חיידקי הבדיקה.
  3. השתמש דגימות רקמת שליטה שלילית מדומה צלחות ספירת תאים גדל על לא סלקטיבי, מדיום עשיר כדי להדגיש את הצמיחה של כל חיידקים מזהמים או commensal שלא הוסרו במהלך עיקור. זה חיוני כדי למתן עבור כל השפעה של חיידקים אלה על AST. זה גם מועיל לייצר כפול, אגר סלקטיבי, לוחות ספירת תאים ספציפיים לאורגניזם של עניין, כמו צלחות כפולות להאיץ זיהוי המושבה וספירת תאים.
  4. בצע ניסויי פיילוט בעת השימוש הראשון במודל וכאשר משתמשים בו עם זנים חדשים או גנוטיפ של חיידקים כדי להעריך וריאציות CFU biofilm בין מקטעי רקמות, המאפשר את הבחירה של גדלי מדגם ניסיוני אופטימלי (למשל, כמה קטעי רקמה לשכפל לרכוש מכמה ריאות לשכפל) באמצעות חישובי כוח.
  5. ה- assay משתמש באינוקולום לא סטנדרטי, שכן הדבר מאפשר חיסון מהיר לאחר 48 שעות של דגירה והיווצרות עומסי ביופילמים עקביים יחסית (במיוחד עבור P. aeruginosa). כדי להמעיט ביעילות אנטיבקטריאלי בשלבי צמיחה מוקדם של ביופילם, שקול לחסוס עם CFU מתוקננת של חיידקים הגדלים במושבה מושעה ASM. אנחנו לא ממליצים לחדור לחיידקים פלנקטוניים: ניסויי פיילוט מוקדמים הראו כי זה מוביל לצמיחה חריפה ופולשנית לא היווצרות ביופילם אמינה.

פרוטוקול זה מייצר מודל אב טיפוס חזק לשימוש עם P. aeruginosa, עם פוטנציאל גדול לפיתוח לשימוש עם S. aureus, אבל יש לו כמה מגבלות כי יהיה צורך לטפל עבור יישומים מסוימים בעתיד. רקמה חוסן ממושבות בודדות כדי לאפשר התפתחות של אוכלוסיות שיבוטים. התוצאות מראות כי, עבור P. aeruginosa, זה יש השפעה מועטה על מספרי התאים ב 48 שעות. עם זאת, שונות גדולה יותר בעומס החיידקים נצפתה עבור S. aureus, ובהתחשב בכך חיידקים שונים עשויים לגדול באופן שונה בתוך המודל, inoculum התחלה מתוקננת וייצור קפדני של דגימות רקמה בגודל ומשקל זהים עשוי להיות תלוי האורגניזם של המחקר. ייתכנו גם הבדלים בין מעבדות עקב הבדלים בטכניקות ניתוח/זיהום מדויקות או גזע חזירים מקומי/לנדאיס. כדי להעריך את הרבייה של אוכלוסיות חיידקים עבור יישומים בודדים של המודל, אנו מציעים את השימוש בחישובי חזרה כחלק מהניתוח הסטטיסטי של תוצאות25 ושימוש בחישובי חזרה/כוח המבוססים על ניסויי פיילוט לחישוב גודל המדגם האופטימלי לשימושם בניסויים סופיים.

אחד היתרונות העיקריים של EVPL על פני מבחני צלחת מסורתיים הוא שבמקום לבדוק חיידקים הגדלים בפלנקטון או על משטחים אביוטיים, זה מאפשר מבנה מרחבי של ביופילמים חיידקיים בסביבה מארחת ועם בידול תאים. יש לכך השלכות חשובות על התחשבות בהשפעה של שיפוע פיזיוכימי וחומרים מזינים על פעילותם של סוכנים מיקרוביאליים, כמו גם על משלוח וזמינות של טיפולים פעילים במיקרו-וירוסים שונים בתוך זיהום כרוני ואינטראקציה בין תאים בין חיידקים. נקודה זו היא משמעותית במיוחד, כמו זיהומים multispecies נצפים באופן שגרתי CF והם הופכים חשובים יותר ויותר זיהומים הקשורים למצבים נשימתיים אחרים, כגון אסטמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית. יש פוטנציאל לפתח מודל זה עבור AST עבור דגימת כיח המטופל מותאם אישית באבחון הקליני. ניסוי מקביל כבר בעיצומו באמצעות מודל חיקוי פצעים במבחנה לצמיחה ו- AST של ביופילם הרוס מפצעים כרוניים (המרכז האזורי לטיפול בפצעים בדרום מערב לובוק, טקסס, ד"ר ר. וולקוט).

יתר על כן, המודל משתמש ברקמה שלאחר המוות, ולכן ההשפעה של התגובה החיסונית המארחת על רגישות לאנטיביוטיקה מוגבלת. מודלים נוכחיים במבחנה גם אינם מסבירים תגובות חיסוניות מארחות, ולכן איננו רואים בכך מחסום לשימוש העתידי במודל ביישומי AST. עם זאת, התגובה החיסונית נלקחת בחשבון כאשר פרמטרים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים והנחיות מינון אנטיביוטי נקבעים. למרות שהמחקרים שלנו הראו עדויות של שאריות תאים חיסוניים ותגובות בתוך הרקמה23 (ו S. Azimi, תקשורת אישית), זהו אזור מעולה עבור אופטימיזציה נוספת ופיתוח של המודל אם התאמה גדולה יותר לתנאי vivo רצוי.

מתן AST תקף יותר קלינית עבור CF יעזור לעמוד בהמלצה מרכזית של הבריאות בבריטניה, טיפול חברתי חוק 2008 כי "נהלים צריכים להיות במקום כדי להבטיח מרשם זהיר וניהול מיקרוביאלית." אנו מאמינים כי EVPL הוא מודל מועמד אידיאלי כדי לעזור לענות על צורך זה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לכל מחברינו על המאמרים המקוריים מהם לקחנו תוצאות למופת. העבודה מומנה על ידי מענק מחקר חוקר חדש של MRC (מספר מענק MR/R001898/1)שהוענק ל- FH; על ידי סטודנטיות לדוקטורט מהשותפות לאימון ביולוגי אינטגרטיבית (MIBTP) של BBSRC Midlands שהוענקה ל-NEH ול-IA; ועל ידי אוניברסיטת וורוויק לתואר ראשון מחקר תמיכה פרס FA לנהל פרויקט מחקר חופשת הקיץ. אנו מודים לסטיב קוויגלי, בנים (קובינגטון, וורוויקשייר) וג'ון טיילור, בן (ארלסדן, קובנטרי) על אספקת הריאות. ברצוננו גם להכיר את עזרתו של מתקן הכנת המדיה בבית הספר למדעי החיים באוניברסיטת וורוויק, עם תודה מיוחדת לסרית האריס וקרוליין סטיוארט, ועזרתה של אניטה קת'רווד במתקן ההקרנה האנטי-מיקרוביאלי של וורוויק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes MP Biomedicals 116004500 FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates Diversified Biotech BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner 
Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes  Thermo Fisher 15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads Thermo Fisher 15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached. VWR BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit Thermo Fisher 10474415 For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elborn, J. S. Cystic fibrosis. The Lancet. 388 (10059), 2519-2531 (2016).
  2. Høiby, N., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 125, 339-343 (2017).
  3. Bjarnsholt, T., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).
  4. Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  5. Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. 20 (4), 5286 (2015).
  6. Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients. Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).
  7. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
  8. Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O'Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).
  9. Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).
  10. Drevinek, P., et al. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 8, 121 (2008).
  11. Goerke, C., Wolz, C. Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection. International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).
  12. Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
  13. Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).
  14. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  15. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).
  16. Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).
  17. Trust, C. F. Annual Data Report 2019. , (2019).
  18. Angelis, A., et al. Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom. BMC Health Services Research. 15 (1), 428 (2015).
  19. Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany. Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).
  20. Longitude Prize. , Available from: http://longitudeprize.org (2020).
  21. Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. Building a better biofilm - Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection. Biofilm. 2, 100024 (2020).
  22. Harrison, F., Diggle, S. An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).
  23. Sweeney, E., et al. An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection. Microbiology. , DOI: 10.1099/mic.0.000987 (2020).
  24. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  25. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists. Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).
  26. Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).
  27. Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).
  28. Ager, S., Gould, K. Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).
  29. Kirchner, S., et al. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
  30. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 8.0. , Available from: www.eucast.org (2020).
  31. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. , Available from: http://www.eucast.org (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 167 בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם סיסטיק פיברוזיס זיהום MBEC מיקרופון
בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של <em>פסאודומונס aeruginosa</em> ו <em>Staphylococcus aureus</em> Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harrington, N. E., Sweeney, E.,… More

Harrington, N. E., Sweeney, E., Alav, I., Allen, F., Moat, J., Harrison, F. Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (167), e62187, doi:10.3791/62187 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter