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Immunology and Infection

सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म्स के एक पूर्व वीवो मॉडल में एंटीबायोटिक प्रभावकारिता परीक्षण

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/62187
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3, 1
1School of Life Science, University of Warwick, 2Institute of Microbiology and Infection, University of Birmingham, 3Warwick Antimicrobial Screening Facility, School of Life Science, University of Warwick
* These authors contributed equally

Summary

सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले व्यक्तियों के फेफड़ों में बैक्टीरियल बायोफिल्म के एक स्थापित पूर्व वीवो मॉडल का उपयोग करके एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण करने के लिए इस कार्यप्रवाह का उपयोग किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग एमबीईसी (न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता) परख की नैदानिक वैधता को बढ़ा सकता है।

Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) वाले व्यक्तियों के फेफड़ों के भीतर मौजूद बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का प्रभावी नुस्खा एंटीबायोटिक उपचार के बाद मानक नैदानिक विधियों (जैसे, शोरबा माइक्रोडिल्यूशन, डिस्क प्रसार, या एटेस्ट) और नैदानिक परिणामों का उपयोग करके एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) परिणामों के बीच एक खराब संबंध से सीमित है। ऑफ-द-शेल्फ बायोफिल्म विकास प्लेटफार्मों के उपयोग से एएसटी में सुधार के प्रयास परिणामों में थोड़ा सुधार दिखाते हैं। सीएफ फेफड़ों के भौतिक रसायन वातावरण की नकल करने के लिए इन विट्रो बायोफिल्म सिस्टम की सीमित क्षमता और इसलिए बैक्टीरियल फिजियोलॉजी और बायोफिल्म आर्किटेक्चर, सीएफ संक्रमण के लिए उपन्यास चिकित्सा की खोज पर ब्रेक के रूप में भी कार्य करता है। यहां, हम एक पूर्व वीवो सीएफ फेफड़ों के मॉडल में परिपक्व के रूप में उगाए जाने वाले सीएफ रोगजनकों के एएसटी को करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसमें सुअर ब्रोंकिओलर ऊतक और सिंथेटिक सीएफ थूक (पूर्व वीवो सुअर फेफड़े, ईवीपीएल) शामिल थे।

बायोफिल्म संवेदनशीलता परीक्षण के लिए कई इन विट्रो परख मौजूद हैं, जो या तो मानक प्रयोगशाला माध्यम या माइक्रोटिटर प्लेटों में सिंथेटिक सीएफ थूक के विभिन्न योगों का उपयोग करते हैं। दोनों विकास माध्यम और बायोफिल्म सब्सट्रेट (पॉलीस्टीरिन प्लेट बनाम ब्रोनचिओलर ऊतक) बायोफिल्म एंटीबायोटिक सहिष्णुता को प्रभावित करने की संभावना है। हम पूर्व वीवो मॉडल में नैदानिक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस आइसोलस की बढ़ी हुई सहिष्णुता दिखाते हैं; बायोफिल्म्स के एंटीबायोटिक उपचार का प्रभाव मानक माइक्रोडिल्यूशन परख में न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) या डिस्क प्रसार परख में संवेदनशील/प्रतिरोधी वर्गीकरण से सहसंबद्ध नहीं है ।

पूर्व वीवो मंच का उपयोग रोगी नमूनों के बेस्पोक बायोफिल्म एएसटी के लिए और दवा अनुसंधान और विकास के दौरान संभावित एंटीबायोफिल्म एजेंटों के लिए एक उन्नत परीक्षण मंच के रूप में किया जा सकता है। वीवो जैसे परीक्षण प्लेटफार्मों में अधिक के उपयोग के माध्यम से एंटीबायोफिल्म दवा खोज के पर्चे या त्वरण में सुधार करने से सीएफ वाले व्यक्तियों के लिए स्वास्थ्य परिणामों में काफी सुधार हो सकता है, साथ ही नैदानिक उपचार और खोज अनुसंधान की लागत को कम किया जा सकता है।

Introduction

क्रोनिक बायोफिल्म संक्रमण व्यक्तियों को प्रभावित करते हैं जिनकी सामान्य प्रतिरक्षा सुरक्षा से समझौता किया जाता है। जोखिम में समूहों आनुवंशिक स्थिति सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)1के साथ उन शामिल हैं । प्रारंभिक प्रारंभिक अवस्था में श्वसन तंत्र में असामान्य रूप से मोटी, चिपकने वाले बलगम का उपनिवेशीकरण ब्रोंकिओल्स2, 3के असभ्य बायोफिल्म संक्रमणों की ओरजाताहै। व्यापक मैट्रिक्स-एनकैप्सुलेटेड बायोफिल्म्स के रूप में बैक्टीरिया का विकास एक कारक है जो इम्यूनोसमझीज़ के पुराने संक्रमणों को स्वस्थ मेजबानों के तीव्र संक्रमणों से अलग करता है और बायोफिल्म राज्य दोनों एंटीबायोटिक एक्सपोजर (मैट्रिक्स के माध्यम से कम प्रसार के कारण) बैक्टीरिया को बचाता है और उनकी एंटीबायोटिक संवेदनशीलता (जैसे, प्रेरण क्विसेंस या अलक्स पंपों के अपरज्येशन के माध्यम से)4,5. हालांकि, मेजबान ऊतक शरीर विज्ञान और रसायन विज्ञान में रोग-विशिष्ट परिवर्तन तीव्र संक्रमणों या मानक प्रयोगशाला विकास स्थितियों में देखे गए बैक्टीरियल फिजियोलॉजी को और बदल देते हैं। सीएफ में प्रमुख उदाहरणों में असामान्य कार्बन स्रोतों का उपयोग शामिल है, जैसे कि फेफड़ों के सर्फेक्टेंट से जारी फैटी एसिड और अमीनो एसिड और म्यूसिन के माइक्रोबायल क्षरण, सूक्ष्म पोषक तत्वों की रिहाई, जैसे क्षतिग्रस्त ऊतकों से लोहा, और माइक्रोएरोबियोसिस6,7,8।

एक विशेष बायोफिल्म संक्रमण संदर्भ में विशिष्ट भौतिक रसायन की स्थिति इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है। सबसे पहले, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की संरचना और गहराई स्थानीय पर्यावरणीय स्थितियों पर निर्भर करती है, जैसे पोषक तत्व या कतरनी बल। दूसरा, पर्यावरण संकेत विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की अभिव्यक्ति को ट्रिगर कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, सीएफ रोगजनक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सीएफ थूक बनाम इन विट्रो9में बीटा-लैक्टामाज़ की अभिव्यक्ति और कम अभिव्यक्ति दिखाता है, जबकि एक अन्य सीएफ रोगजनक, बर्कहोल्डरिया सेनोसेपिया,सीएफ थूक10में उगाए जाने पर बीटा-लैक्टामास और एफ्लक्स पंपों को बढ़ा देता है। तीसरा, इन-होस्ट स्थितियां एंटीबायोटिक-सहिष्णु फेनोटाइप के लिए एक शारीरिक या आनुवंशिक स्विच को क्यू कर सकती हैं, जो विट्रो में पुनः दोहराना मुश्किल है। इनमें सीएफ रोगजनक स्टेफिलोकोकस ऑरियस11,12के छोटे कॉलोनी वेरिएंट शामिल हैं ।

इन सभी आंकड़ों से संकेत मिलता है कि जब नैदानिक प्रयोगशालाएं रोगजनक बायोफिल्म से व्यक्तिगत क्लोन को अलग करती हैं और मानक प्रयोगशाला मीडिया (शोरबा माइक्रोडिल्यूशन, डिस्क प्रसार या एटेस्ट) में प्लैंक्टोनिक या एगर-प्लेट उगाई गई संस्कृतियों पर एएसटी प्रदर्शन करती हैं, तो परिणाम अक्सर यह भविष्यवाणी नहीं करते हैं कि कौन सी एंटीबायोटिक्स वास्तव में वीवो में काम करेंगी। यहां तक कि अगर इन विट्रो बायोफिल्म परख का उपयोग किया जाता है, तो वे उपयोग की जाने वाली मध्यम और लगाव सतह में मतभेदों के कारण वीवो-जैसे बायोफिल्म फेनोटाइप में क्यू नहीं कर सकते हैं, इसलिए प्रवाह कोशिकाओं या उच्च-थ्रूपुट माइक्रोप्लेट प्लेटफार्मों का उपयोग करके परख एंटीबायोटिक संवेदनशीलता13का अनुमान लगा सकते हैं। यही समस्या शिक्षा और उद्योग के शोधकर्ताओं पर लागू होती है जो नए एंटीबायोफिल्म एजेंटों को विकसित करने की मांग करते हैं: प्रवाह कोशिकाओं, माइक्रोटिटर प्लेटों, या सेंटर फॉर डिजीज कंट्रोल बायोफिल्म रिएक्टरों जैसे इन विट्रो प्लेटफार्मों का उपयोग करके दवा क्षमता का परीक्षण बायोफिल्म प्रभावकारिता बार को बहुत कम सेट कर सकता है और अनुसंधान, विकास पाइपलाइन में झूठी सकारात्मक का उत्पादन कर सकता है।

सीएफ में एंटीबायोटिक उपचार के बाद एएसटी परिणामों और नैदानिक परिणामों के बीच खराब सहसंबंध अच्छी तरह से जाना जाता है। कई चिकित्सकों बस नैदानिक प्रयोगशाला AST की अनदेखी के रूप में वहां कोई समान, CF इन परिणामों की व्याख्या के लिए विशिष्ट दिशा निर्देश है और इसके बजाय निर्धारित करने के लिए मामला द्वारा मामले निर्णय करते हैं । कैलगरी बायोफिल्म डिवाइस का उपयोग करके सीएफ एएसटी में सुधार करने के प्रयास किए गए हैं, जो मानक एएसटी माध्यम (जैसे, सीईन-समायोजित मुलर-हिंटन शोरबा)14, 15वाले माइक्रोप्लेट के कुओं के भीतर सेट प्लास्टिक खूंटे की सतह पर उगाए गए बायोफिल्म का उपयोग करता है। यह परख यह भविष्यवाणी करने में बेहतर नहीं है कि कौन सी एंटीबायोटिक्स वीवो में मानक प्लैंक्टोनिक एएसटी16की तुलना में काम करेंगी । सीएफ के साथ रोगियों पर प्रभाव स्टार्क है । दोहराया एंटीबायोटिक प्रशासन के बावजूद (नियमित रूप से सांस एंटीबायोटिक दवाओं और 27 दिनों की एक औसत/यूनाइटेड किंगडम में CF के साथ व्यक्तियों के लिए नसों में एंटीबायोटिक दवाओं प्राप्त)17,तीव्र फेफड़े की तीव्रता के लगातार और अप्रत्याशित एपिसोड प्रगतिशील फेफड़ों की क्षति के लिए सीसा और, मामलों के लगभग ९०% में, श्वसन विफलता से मौत । हाल ही में एक विश्लेषण में, जीवाणु फेफड़ों के संक्रमण CF में दवा की लागत का सबसे मजबूत कारक था, औसत € 3.6K/रोगी/वर्ष पर जोड़ने के लिए सीधे स्वास्थ्य देखभाल लागत18,19।

अन्यथा स्वस्थ व्यक्तियों के तीव्र संक्रमणों के लिए, वर्तमान अनुसंधान और नीति तेजी से एएसटी पर ध्यान केंद्रित कर रही है, उदाहरण के लिए, पॉइंट-ऑफ-केयर जीनोमिक भविष्यवाणी आदर्श20है। लेकिन क्रोनिक सीएफ संक्रमणों के मामले में, यह स्पष्ट है कि एक अलग दृष्टिकोण की आवश्यकता है: मेजबान-नकल करने वाले मॉडलों में एएसटी का कार्यान्वयन जो वीवो पर्यावरण और रोगजनक मेटाबोलिक राज्य में बेहतर पुनर्पूंजीकरण करता है और यथार्थवादी बायोफिल्म संरचना के गठन के लिए अनुमति देता है।

हमने पहले एक सीएफ बायोफिल्म मॉडल विकसित किया है जिसमें सिंथेटिक सीएफ थूक में इनक्यूबेटेड सुअर ब्रोंकिओल के खंड शामिल हैं और पी एरुगिनोसा या एस ऑरियससे संक्रमित हैं। असंक्रमित ईवीपीएल 7 दिनों तक सामान्य हिस्टोपैथोलॉजी को बरकरार रखता है लेकिन पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस के प्रयोगशाला या नैदानिक आइसोले ऊतक के चारों ओर वीवो जैसे समुच्चय में पुन: रूप देते हैं, जो सीएफ संक्रमण21, 22,23के एटियोलॉजी की नकल करतेहैं। हम इस उच्च वैधता, उच्च थ्रूपुट मॉडल का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सीएफ के लिए एक सिलवाया बायोफिल्म एएसटी प्लेटफॉर्म के रूप में है और मॉडल में उगाए जाने पर रोगजनक बायोफिल्म की उच्च सहनशीलता को चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उच्च सहिष्णुता दिखाने वाले अनुकरणीय परिणाम प्रस्तुत करते हैं। मॉडल आसानी से अनुसंधान में शामिल किया जा सकता है, प्रबंधन या बायोफिल्म गठन की रोकथाम के लिए विकास पाइपलाइनों और संभावित नैदानिक एएसटी में । उपयोग किए गए अधिकांश उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) आसानी से एक विशिष्ट माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में पाए जा सकते हैं, हालांकि एक मनका डिब्बा आवश्यक है, और हमने सहयोगियों के साथ काम से पाया है कि एक उपयुक्त पराबैंगनी रोगाणुगतिशील कैबिनेट को भी खरीदने की आवश्यकता हो सकती है। के रूप में फेफड़ों वाणिज्यिक कसाई या बूचड़खानों से sourced हैं, मॉडल कोई नैतिक चिंताओं को प्रस्तुत करता है ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक बूचड़खाना है कि मानव उपभोग के लिए मांस की आपूर्ति से sourced सुअर फेफड़ों का उपयोग करता है । ब्रिटेन के कानून के तहत, मांस के लिए वध जानवरों से बचे हुए ऊतकों का उपयोग नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं है; हम पाठकों को काम शुरू करने से पहले प्रासंगिक स्थानीय कानूनों और संस्थागत दिशा-निर्देशों की जांच करने की सलाह देते हैं ।

1. सिंथेटिक सीएफ थूक मीडिया (एससीएफएम) की तैयारी

  1. EVPL ऊतक के साथ उपयोग के लिए SCFM बनाने के लिए, संशोधन के साथ पामर एट अल द्वारा उल्लिखित नुस्खा का पालन करें कि ग्लूकोज नुस्खा से हटा दियाजाता है ।
    नोट: पामर एट अल नुस्खा सीएफ रोगियों से थूक के नमूनों के चयन में पाया औसत सांद्रता के प्रतिनिधि पर मुफ्त अमीनो एसिड, cations, anions और लैक्टेट होता है । यह तुलनीय कार्बन उपयोग के रास्तों और पी एरुगिनोसा PA14 द्वारा कोरम संवेदन संकेतों की अभिव्यक्ति को lyophilised रोगी थूक24से बने मध्यम में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है । टेबल S1में 1 एल संशोधित एससीएफएम के लिए एक नुस्खा की आपूर्ति की जाती है।
  2. फिल्टर तैयार करने के तुरंत बाद एससीएफएम को स्टरलाइज करें और 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. विच्छेदन और पूर्व वीवो सुअर फेफड़े (EVPL) ऊतक के संक्रमण

  1. विच्छेदन से पहले, पी एरुगिनोसा/एसऑरियस (जैसे, lysogeny शोरबा + १.२% आगर) के लिए प्रयोगशाला में जो कुछ भी आगर मानक है का उपयोग कर संक्रमण के लिए आवश्यक जीवाणु तनाव/एस की एक आगर प्लेट/एस तैयार करें ।
  2. गणना करें कि प्रयोग के लिए कितने पोर्सिन ब्रोनचिओलर ऊतक टुकड़े की आवश्यकता होती है, जिसमें असंक्रमित नियंत्रण ऊतक टुकड़े शामिल हैं। परिणामों की पुनरावृत्ति की पुष्टि करने के लिए दो दोहराने वाले फेफड़ों में प्रयोग को दोहराने के लिए इस संख्या को दो से गुणा करें।
  3. 400 माइक्रोनल/ऊतक टुकड़ा प्लस अतिरिक्त एससीएफएम आगर के लिए पर्याप्त माध्यम बनाने के लिए एग्रेंज पैड बनाने के लिए आवश्यक एससीएफएम एगर (एमएल) की मात्रा निर्धारित करने के लिए 0.5 द्वारा आवश्यक ऊतक टुकड़ों की कुल संख्या को गुणा करें।
  4. 0.8% वजन/वॉल्यूम एगर उठे के साथ एससीएफएम की वांछित कुल मात्रा बनाने के लिए आवश्यक एससीएफएम के हर 15 एमएल में 0.12 ग्राम एग्राडेड जोड़ें।
  5. गर्मी एससीएफएम उत्पन्न समाधान जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो गया है। कम शक्ति पर एक घरेलू माइक्रोवेव की सिफारिश की जाती है। आवश्यक समय माइक्रोवेव की वाट पर निर्भर करता है। एगर उठे को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें (स्पर्श के लिए गर्म लेकिन पकड़ने के लिए आरामदायक)। आगे ठंडा न होने दें।
  6. एक पिपेट का उपयोग करके, एससीएफएम के 400 माइक्रोन को जोड़ें, जो आवश्यक ऊतक टुकड़े के अनुसार 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में उठा।
  7. 10 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत एससीएफएम agarose-युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट/एस बंध्याकरण ।
  8. बाँझ Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के 20 मिलील का उपयोग कर विच्छेदित किया जा रहा है हर बरकरार फेफड़ों के लिए तीन दोहराने वॉश तैयार करें और बाँझ रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) १६४० के 20 एमएल ५० μg/mL ampicillin के साथ पूरक ।
  9. हर बरकरार फेफड़ों के विच्छेदन के लिए एक अंतिम धोने के रूप में 40 एमएल एससीएफएम का एक aliquot बनाओ। सभी वॉश को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या तुरंत उपयोग किया जा सकता है।
  10. वध के बाद जितनी जल्दी हो सके निर्धारित स्रोत से फेफड़ों को प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि उन्हें घरेलू कूलबॉक्स में प्रयोगशाला में ले जाकर ठंडा रखा जाए।
    नोट: वध के दिन के करीब फेफड़ों भंडारण से कम चोट दिखाने के लिए, लेकिन वध से 4 दिनों तक के लिए कोल्ड स्टोरेज पर रखा ऊतक भी इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि कूलबॉक्स को कसाई की दुकान या बूचड़खाने में ले जाने की आवश्यकता है, इसलिए इसे प्रत्येक उपयोग के बाद स्थानीय प्रयोगशाला दिशानिर्देशों के बाद दूषित किया जाना चाहिए और उपयोग में नहीं आने पर माइक्रोबायोलॉजी लैब के बाहर संग्रहीत किया जाना चाहिए, ताकि संदूषण के जोखिम और रोकथाम के उल्लंघन को कम किया जा सके ।
  11. एक निष्फल सतह पर और एक लौ के नीचे काम करना, फेफड़ों को ऑटोक्लेव एल्यूमीनियम फॉयल से ढके एक साफ प्लास्टिक चॉपिंग बोर्ड पर रखें। चेक करें कि ब्रोंकिओल्स बरकरार रहते हैं। यदि बूचड़खाने में या परिवहन के दौरान कोई नुकसान हुआ है तो फेफड़े उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
  12. एक लौ के नीचे एक पैलेट चाकू गर्म करें और ऊतक की सतह को स्टरलाइज करने के लिए ब्रोंकिओल के आसपास के फेफड़ों के क्षेत्र में चाकू को बहुत संक्षेप में छूएं।
  13. एक बाँझ घुड़सवार रेजर ब्लेड का उपयोग कर ब्रोंकियोल आसपास की सतह ऊतक को काट लें। किसी भी नुकसान को रोकने के लिए ब्रोंकिओल के समानांतर चीरों को बनाएं।
  14. एक बार ब्रोंकिओल उजागर हो जाने के बाद, ब्रोंकियोल को मुक्त करने के लिए दिखाई देने वाले उच्चतम बिंदु पर ब्रोंकियोल के माध्यम से क्रॉस-सेक्शनल चीरा बनाएं।
  15. बाँझ संदंश का उपयोग करना, हल्के से ब्रोंकियोल के मुक्त अंत पकड़ और दूर एक बाँझ घुड़सवार रेजर ब्लेड का उपयोग कर किसी भी शेष अवांछित ऊतक काट । फेफड़ों से ब्रोंकियोल को हटाने के लिए किसी भी ब्रांचिंग दिखाई देने से पहले ब्रोंकिओल में अंतिम क्रॉस-सेक्शनल चीरा बनाएं।
  16. पहले डीएमईएम/आरपीएमआई 1640 वॉश में ब्रोंकिओल रखें। ब्रोंकिओल को धोने में छोड़ दें और नियोजित प्रयोग के लिए पर्याप्त ऊतक अनुभागों को उत्पींट करने के लिए आवश्यक एक ही फेफड़े से ब्रोंकियोल के अतिरिक्त वर्गों की कटाई के लिए चरण 2.11-2.14 दोहराएं।
  17. एक ही फेफड़े से किसी भी अतिरिक्त ब्रोंकिओलर वर्गों को धोने (चरण 2.16) में रखें। कम से कम 2 मिनट के लिए धोने में छोड़ दें।
  18. पहले DMEM/RPMI १६४० धोने से bronchioles निकालें और एक बाँझ पेट्री पकवान में नमूनों जगह है ।
  19. प्रत्येक ब्रोंकियोल को बाँझ संदंश का उपयोग करके हल्के से पकड़ें, जिससे ऊतक को नुकसान न पहुंचे। जितना संभव हो उतना शेष नरम ऊतक निकालें और बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करके ऊतक को ~ 5 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में काट लें।
  20. दूसरे DMEM/RPMI १६४० धोने में bronchiolar ऊतक स्ट्रिप्स के सभी प्लेस । कम से कम 2 मिनट के लिए धोने में छोड़ दें।
  21. टिश्यू को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखते हुए बाँझ संदंश का उपयोग करके दूसरे वॉश से टिश्यू स्ट्रिप्स निकालें। टिश्यू को साफ, बाँझ पेट्री डिश में रखें।
  22. ब्रोंकिओल से जुड़े किसी भी शेष नरम ऊतक को हटा दें और बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करके स्ट्रिप्स को वर्गों (~ 5 मिमी x 5 मिमी) में काट लें।
  23. पेट्री डिश में तीसरा डीएमईएम/आरपीएमआई 1640 वॉश जोड़ें। डिश को घूमता हुआ धोने में टिश्यू के टुकड़ों को हल्के से मिलाएं।
  24. टिश्यू के टुकड़ों को हटाए बिना पेट्री डिश से तीसरा वॉश बाहर डालें।
  25. ऊतक युक्त पेट्री डिश में अंतिम एससीएफएम वॉश जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी ऊतक टुकड़े कवर किए गए हैं।
  26. यूवी लाइट के तहत एससीएफएम में टिश्यू के टुकड़ों को 5 मिनट के लिए स्टरलाइज करें।
  27. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में प्रत्येक निष्फल ब्रोंकिओलर ऊतक टुकड़ा हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें/
  28. वांछित जीवाणु तनाव के साथ प्रत्येक ऊतक टुकड़े को संक्रमित करने के लिए, एक बाँझ 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज से जुड़ी 29 जी सुई की नोक के साथ एक आगर प्लेट पर उगाई गई कॉलोनी को स्पर्श करें। फिर ऊतक टुकड़े पर कॉलोनी को स्पर्श करें, धीरे-धीरे ऊतक सतह को चुभें।
    नोट: एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग एक 29 जी सुई से लैस सुई सही और आराम से आयोजित किया जा करने के लिए, जबकि उंगलियों दोनों सुई और फेफड़ों के ऊतकों से एक सुरक्षित दूरी रखते हुए अनुमति देता है । सिरिंज से जुड़ी नहीं हैं कि 29 जी सुई का उपयोग कर इस कदम को करने के लिए संभव है, लेकिन यह अधिक निपुणता की आवश्यकता है और एक सुई की चोट का खतरा बढ़ जाता है। इंसुलिन सीरिंज आसानी से उपलब्ध हैं।
  29. असंक्रमित नियंत्रण के लिए, धीरे-धीरे एक बाँझ 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज से जुड़ी 29 जी सुई की नोक के साथ ऊतक टुकड़ा के प्रत्येक की सतह चुभन।
  30. प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन एससीएफएम जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  31. 10 मिनट(सामग्रीकी तालिका) के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत प्रत्येक 24-अच्छी प्लेट के लिए एक सांस सीलिंग झिल्ली को स्टरलाइज करें।
  32. 24-अच्छी प्लेट/एस से ढक्कन/एस निकालें और सांस झिल्ली के साथ बदलें ।
  33. बिना हिलाए वांछित इनक्यूबेशन (संक्रमण) समय के लिए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जांच करें कि असंक्रमित नियंत्रण टुकड़ों (संदूषण नियंत्रण) पर टीका रोगजनक का कोई दिखाई देने वाला विकास नहीं है।
    नोट: यदि वांछित, एम्पीसिलिन को स्टेप 2.5 में एससीएफएम एगरल्ड पैड में जोड़ा जा सकता है और 20 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए चरण 2.30 में एससीएफएम को कवर किया जा सकता है। यह पी एयरोग्नोसा या एस ऑरियस विकास को प्रभावित किए बिना फेफड़ों पर अधिकांश अंतर्जात बैक्टीरिया के विकास को दबा देगा, लेकिन, एम्पिसिलिन की उपस्थिति अन्य एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है, पाठक को उन उपभेदों और एंटीबायोटिक दवाओं के आधार पर इस विकल्प को बनाने के लिए छोड़ दिया जाता है जो वे परीक्षण करना चाहते हैं।

3. एंटीबायोटिक प्रभावकारिता का निर्धारण

नोट: इस परख के चरणों का ब्यौरा एक योजनाबद्ध चित्रा S1में प्रदान की गई है ।

  1. EVPL पर गठित बायोफिल्म्स की एंटीबायोटिक सहिष्णुता को मापने के लिए, विच्छेदन और संक्रमण के दौरान कम से दो स्वतंत्र फेफड़ों से फेफड़ों के टुकड़ों के सेट को दोहराने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई एंटीबायोटिक उपचार) के लिए टुकड़ों का एक सेट आवश्यक है, और एंटीबायोटिक की प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक सेट का परीक्षण किया जाना आवश्यक है।
  2. इनक्यूबेशन के 48 घंटे के बाद, नेत्रहीन असंक्रमित ऊतक टुकड़ों का निरीक्षण करें। सुअर फेफड़ों के लिए अंतर्जात बैक्टीरिया के कुछ विकास हुआ हो सकता है, इन वर्गों के आसपास SCFM अग्रणी टर्बिड हो । यदि चयनित अध्ययन प्रजातियों की विशिष्ट वृद्धि देखी जाती है (उदाहरण के लिए, पी एरुगिनोसाका नीला-हरा पिगमेंटेशन डायग्नोस्टिक), ताजा फेफड़ों के साथ प्रयोग को फिर से शुरू करें।
  3. यदि असंक्रमित ऊतक वर्गों में कोई या केवल न्यूनतम जीवाणु विकास नहीं दिखा है, तो १ २४-अच्छी तरह से धोने की थाली और एक 24-अच्छी तरह से उपचार प्लेट तैयार करें, प्रत्येक एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा एससीएफएम के ५०० माइक्रोन युक्त या प्रति फेफड़ों के ऊतकों के टुकड़े के प्रति ब्याज की एंटीबायोटिक के साथ ।
  4. लौ निष्फल संदंश के साथ इनक्यूबेशन प्लेट से प्रत्येक संक्रमित ऊतक टुकड़ा निकालें, किसी भी गैर-बायोफिल्म से जुड़े बैक्टीरियल कोशिकाओं को हटाने के लिए वॉश प्लेट के एक ताजा कुएं में संक्षेप में घूमता है, और उपचार प्लेट के उचित कुएं में स्थानांतरित करता है।
  5. ताजा सांस झिल्ली के साथ उपचार प्लेटों को सील करें।
  6. 18-24 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर उपचार प्लेट/एस इनक्यूबेट।
  7. लौ निष्फल संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक फेफड़ों के टुकड़े को 24-अच्छी तरह से प्लेट से हटा दें और एक बाँझ 2 एमएल होमोजेनाइजेशन ट्यूब में डाल दें जिसमें 1 मिलीएमएल फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) और 1 ग्राम धातु मोती(सामग्री की तालिका) शामिल हैं।
  8. मनका 4 मीटर पर ४० सेकंड के लिए हराया
    नोट: सामग्री की तालिका में सुझाए गए विशिष्ट मोतियों और समरूपता के साथ मनका की धड़कन बैक्टीरिया की महत्वपूर्ण लाइसिस का कारण नहीं बनती है, लेकिन प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाली प्रत्येक प्रयोगशाला को AST परख शुरू करने से पहले अपने चुने हुए मोतियों और समरूप के प्रभावों की जांच करनी चाहिए।
  9. मानक चढ़ाना विधियों के अनुसार व्यक्तिगत अनुपचारित और एंटीबायोटिक-इलाज ऊतक टुकड़ों में कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीआईएफओ) को निर्धारित करने के लिए Lysogeny शोरबा (एलबी) आगर पर पीबीएस और प्लेट का उपयोग करके फेफड़ों के समरूप को क्रमिक रूप से पतला करें।
    नोट: वैकल्पिक: कॉलोनी पहचान की पुष्टि करने के लिए चयनात्मक मीडिया पर डुप्लिकेट प्लेटें तैयार करें; उदाहरण के लिए, एस ऑरियसके लिए मैनिटोल नमक एगर का उपयोग करना ।

Representative Results

EVPL मॉडल एक उच्च थ्रूपुट परख मंच प्रदान करता है, जिससे एक समय(आंकड़े 1 और 2)में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के लिए बड़ी संख्या में बैक्टीरियल आइसोले को स्क्रीन करना संभव हो जाता है या एक प्रयोग(चित्र 3)में एंटीबायोटिक सांद्रता की एक श्रृंखला के खिलाफ उपभेदों को स्क्रीन करना संभव हो जाता है। अभ्यास के साथ, हमने पाया है कि लगभग 200 ब्रोंकिओलर ऊतक वर्गों को 2 घंटे में फेफड़ों से तैयार किया जा सकता है। एएसटी के लिए पूरा प्रयोग सामान्य कार्य घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है। स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस आइसोलेस का विकास और मॉडल में 48 घंटे बायोफिल्म की स्थापना विश्वसनीय है और, जब व्यवहार्य सेल काउंट द्वारा निगरानी की जाती है, तो लगातार बैक्टीरियल लोड(आंकड़े 1 और 2)का उत्पादन होता है। ईवीपीएल में उगाए गए स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और स्टेफिलोकोकस ऑरियस के ऊतकों से जुड़े बायोफिल्म्स की छवियां हमारे प्रकाशनों21,23में प्रकाश माइक्रोस्कोपी और हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल के साथ पाई जा सकती हैं। हालांकि, सीआईएफयू की प्रजनन क्षमता विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए भिन्न होती है। इसकी मात्रा ANOVA25के बाद मानक पुनरावृत्ति गणना का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है; हमने पाया है कि पी एरुगिनोसाकी तुलना में एस ऑरियस के लिए फेफड़ों के नमूनों को दोहराने में सीएलयू के बीच आमतौर पर अधिक भिन्नता होती है । हम अनुशंसा करते हैं कि, प्रयोगशाला द्वारा मॉडल को अपनाने पर, प्रयोगात्मक तकनीकों को अनुकूलित करने और अंतिम प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले नमूनों के आकारों को निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों पर दोहराने की गणना की जाती है (इसका एक उदाहरण स्वीनी एट अल26के लिए डेटा पूरक में पाया जा सकता है)।

जब ईवीपीएल में उगाया जाता है, तो पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस की बायोफिल्म्स मानक में संवेदनशीलता की तुलना में एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति बढ़ी हुई सहिष्णुता का प्रदर्शन करती हैं, उद्योग ने मानक मीडिया (चित्रा2)का उपयोग करके शोरबा MIC(चित्रा 1)और डिस्क परख को मंजूरी दी। ईवीपीएल स्थापित बायोफिल्म पर विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न प्रभाव अलग-अलग हैं, उदाहरण के लिए पी एरुगिनोसा किलिंग ईवीपीएल में 4-16X MIC सिप्रोफ्लोक्सेसिन के साथ हासिल की जाती है लेकिन 4-8X MIC क्लोरम्फेनिकोल(चित्रा 1)के साथ नहीं। 600 मिलीग्राम लाइनजोलिड की दो बार दैनिक खुराक अतिसंवेदनशील रोगजनकों (4 μg/mL)27 के लिए एमआईसी90 के ऊपर सीरम एकाग्रता प्राप्त करती है और प्रतिकूल दुष्प्रभावों के बिना पर्याप्त जोखिम के रूप में माना जाता है28। चित्रा 2 में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि एस ऑरियस आबादी, डिस्क परख में linezolid के लिए अतिसंवेदनशील, लक्ष्य सीरम सांद्रता जीवित रहने में सक्षम हैं, और उच्च (12 μg/mL), EVPL में । पी एरुगिनोसा (चित्रा 1)के लिए ईवीपीएल-विकसित बायोफिल्म्स पर एमआईसी और एंटीबायोटिक प्रभावों के बीच कोई स्पष्ट संबंध नहीं है । वीवो एंटीबायोटिक सहिष्णुता में अधिक सटीक उपाय प्राप्त करना महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं का उप-इष्टतम खुराक पुराने संक्रमण में प्रतिरोध के लिए चयन के जोखिम को बढ़ा सकता है।

यह सर्वविदित है कि विकास की बायोफिल्म मोड एंटीबायोटिक दवाओं के लिए बैक्टीरियल संवेदनशीलता को काफी कम कर सकता है। इससे कई इन विट्रो बायोफिल्म परख का विकास हुआ है और पुराने संक्रमण में संवेदनशीलता के अधिक सटीक कारक के रूप में एमआईसी के बजाय न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (एमबीईसी)14,15 का उपयोग किया गया है। एमआईसी या एमबीईसी परीक्षण29में उपयोग के लिए एससीएफएम (अलग-अलग फॉर्मूलेशन में) के उपयोग की भी सिफारिश की गई है। यहां हम बताते हैं कि यहां तक कि एक अनुकूलित इन विट्रो परख भी ईवीपीएल में कोलिस्टिन के लिए पी एरुगिनोसा संवेदनशीलता की सटीक भविष्यवाणी नहीं कर सकती है। ईवीपीएल-ग्रोन बैक्टीरिया की 3 लॉग10 हत्या को प्राप्त करने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक की मात्रा अक्सर माइक या एमबीईसी की तुलना में काफी अधिक होती है, जो इन परखों(चित्रा 3)के लिए उपयोग की जाती है। यह एक कोचराणे समीक्षा के अनुरूप है जिसमें बताया गया है कि इन विट्रो बायोफिल्म संवेदनशीलता परीक्षण के वर्तमान कार्यान्वयन मानक संवेदनशीलता परीक्षण16की तुलना में सीएफ में एंटीबायोटिक विहित के लिए कोई बढ़ी हुई भविष्य कहनेवाला शक्ति प्रदान नहीं करते हैं ।

समय के साथ बायोफिल्म बैक्टीरिया पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए मॉडल का उपयोग करना भी सरल है, क्योंकि विनाशकारी नमूने की अनुमति देने के लिए फेफड़ों के पर्याप्त प्रतिकृति टुकड़े टीका लगाया जा सकता है। रोगाणुरोधी एजेंटों के बीच मतभेदों को अलग करने के अलावा, मॉडल विभिन्न जीवाणु विकास चरणों या बायोफिल्म की आयु और विभिन्न एंटीबायोटिक डोजिंग अंतराल के लिए संवेदनशीलता में परिवर्तन को उजागर कर सकता है। चित्रा 4 पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स की बढ़ती सहिष्णुता को मेरोपेनम के रूप में दिखाता है क्योंकि वे परिपक्व होते हैं। यह उपन्यास एजेंटों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए कि क्या वे रैपिड सेल डिवीजन के दौरान अधिक प्रभावी हैं। किसी प्रयोग की बाधाओं को स्थापित करते समय यह भी एक महत्वपूर्ण विचार हो सकता है, क्योंकि परिणामों पर प्रभाव पड़ने वाली उम्र से बचने के लिए बायोफिल्म आयु को मानकीकृत और मान्य करना आवश्यक हो सकता है।

चित्रा 5में, एस ऑरियस सर्वाइवल को 4 घंटे और 24 घंटे के बाद फ्ल्लोक्सीलिन के संपर्क में मापा गया था और बैक्टीरियल सेल के लिए कमी में अंतर का पालन करना संभव था समय भर में और आइसोले के बीच। यह दवा के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए जब फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक मापदंडों को परिभाषित करते हैं या उपन्यास एजेंट की कार्रवाई की विधा को स्पष्ट करते हैं।

बैक्टीरियल लोड में भिन्नता अक्सर विस्तारित संस्कृति समय के साथ बढ़ती है। यह 48 एच बायोफिल्म विकास के बाद चित्रा 5 में अनुपचारित नियंत्रण में देखा जा सकता है और एंटीबायोटिक डोजिंग अंतराल के लिए खाते में एक और 24 एच एक्सपोजर। भिन्नता मॉडल के लिए आंतरिक है; प्रत्येक फेफड़ों का नमूना दूसरों से स्वतंत्र है और फेफड़ों की प्राकृतिक भिन्नता को दर्शाता है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सत्यापन और परिणामों की सटीक व्याख्या की अनुमति देने के लिए पर्याप्त संख्या में प्रतिकृति शामिल है। हम पाठक को वापस हमारी सिफारिश करने के लिए डेटा पर दोहराने की गणना का संचालन करने के लिए मजबूत नमूना आकार के चयन को सक्षम करने के लिए देखें ।

सादगी के लिए, हमने प्रत्येक प्रयोग में फेफड़ों की एक जोड़ी से प्राप्त ऊतक वर्गों को दोहराने से लिया गया प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत किया है, लेकिन व्यवहार में जानवरों को दोहराने से लिए गए ऊतक वर्गों पर दोहराने के प्रयोग करना आवश्यक है। यह व्यक्तिगत सूअरों के बीच किसी भी जैविक भिन्नता के लिए खाते में किया जाना चाहिए, और हम पाठक को हमारे प्रकाशित कार्य के उदाहरणों के लिए संदर्भित करते हैं कि सूअरों को दोहराने से लिए गए ऊतकों के बीच परिणाम कितने सुसंगत हो सकते हैं और विचरण (ANOVA) /सामान्य रैखिक मॉडल (जीएलएम)21, 26के विश्लेषण का उपयोग करके डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण में इस भिन्नता का हिसाब कैसे है।

Figure 1
चित्रा 1। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार के बाद EVPL मॉडल से बरामद 11 CF स्यूडोमोनास एरुगिनोसा नैदानिक आइसोले के कुल सीएफएफओ। ईवीपीएल मॉडल में पी एरुगिनोसा के एंटीबायोटिक उपचार के प्रतिनिधि परिणाम। प्रत्येक तनाव EVPL ऊतक पर ४८ एच के लिए हो गया था तो एंटीबायोटिक (त्रिकोण) या PBS के लिए एक नियंत्रण (हलकों) के रूप में 18 एच और CFU/ मानक यान-समायोजित एमएचबी में निर्धारित उपयुक्त एंटीबायोटिक के लिए एमआईसी को प्रत्येक तनाव (एक्स-एक्सिस) के बगल में कोष्ठक में दिखाया गया है। एमआईसी मानों बढ़ाकर उपभेदों का आदेश दिया जाता है। गैर-पैरामेट्रिक डेटासेट के लिए उपयुक्त और मान-व्हिटनी यू परीक्षणों के दौरान टी-परीक्षणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। एंटीबायोटिक उपचारित और अनुपचारित ऊतकों के बीच महत्वपूर्ण अंतर तारक(पी < 0.05) द्वारा दर्शाया जाता है। A. ईवीपीएल मॉडल में उगाई गई पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स से व्यवहार्य गिनती बरामद की गई और ६४ μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल (उच्चतम एमआईसी मूल्य दर्ज) के साथ इलाज किया गया । प्रत्येक अलग के लिए, क्लोरम्फेनिकोल-इलाज और अनुपचारित ऊतक वर्गों के बीच सीएलयू में मानकीकृत मतलब अंतर की गणना कोहेन के डी का उपयोग करके की गई थी। मानक परीक्षण में MIC मूल्य और EVPL मॉडल में व्यवहार्य सेल संख्या में कमी के बीच कोई संबंध नहीं था जैसा कि कोहेन डी (स्पीयरमैन रैंक सहसंबंध, आरएस = 0.45, पी = 0.16) बी द्वारा मापा गया था। ईवीपीएल मॉडल में उगाए गए पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स के परिणाम और 64 μg/mL सिप्रोफ्लोक्सासिन (उच्चतम एमआईसी मूल्य दर्ज) के साथ इलाज किया गया। धराशायी रेखा के नीचे मूल्य पता लगाने की सीमा से नीचे थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। लाइनजोलिड के साथ उपचार के बाद ईवीपीएल मॉडल से 8 स्टेफिलोकोकस ऑरियस सीएफ नैदानिक आइसोलिट का कुल सीएफएफ। प्रत्येक तनाव 48 घंटे के लिए EVPL ऊतक पर उगाया गया था तो 24 घंटे के लिए linezolid (त्रिकोण) को स्थानांतरित या एक नियंत्रण (हलकों) के रूप में अनुपचारित थे। यूकास्ट दिशानिर्देश30 (21 मिमी के > अवरोध का क्षेत्र) के बाद मानक डिस्क प्रसार परख का उपयोग करके सभी उपभेदों को लाइनज़ोलिड के प्रति संवेदनशील पाया गया। डेटा का विश्लेषण टी-परीक्षणों का उपयोग करके किया गया था जब उपयुक्त और गैर-पैरामेट्रिक डेटासेट(पी < ०.०५) के लिए मान-व्हिटनी यू परीक्षण । एंटीबायोटिक इलाज और अनुपचारित के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर उपभेदों में से किसी के लिए पाया गया । धराशायी रेखा के नीचे मूल्य पता लगाने की सीमा से नीचे थे । A. ईवीपीएल मॉडल में एस ऑरियस बायोफिल्म्स के परिणाम 4 μg/एमएल लाइनजोलिड (यूकास्ट वर्गीकरण31के अनुसार संवेदनशील/प्रतिरोधी के लिए नैदानिक ब्रेकपॉइंट) के साथ इलाज किया गया । B. ईवीपीएल मॉडल में एस ऑरियस बायोफिल्म्स के परिणाम 12 μg/एमएल लाइनजोलिड (स्वीनी एट अल23से पुन: पेश किए गए डेटा) के साथ इलाज किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। प्रयोगशाला तनाव PA14 और 4 CF नैदानिक के व्यवहार्य स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सेल की गिनती कोलिस्टिन की बढ़ती सांद्रता के साथ उपचार के बाद ईवीपीएल मॉडल से बरामद की गई। प्रत्येक तनाव 48 घंटे के लिए EVPL ऊतक पर उगाया गया था तो 18 घंटे के लिए कोलिस्टिन के संपर्क में। मानक यान-समायोजित एमएचबी माध्यम में निर्धारित एमआईसी को प्रत्येक तनाव नाम के बगल में कोष्ठक में दिखाया गया है। ऊर्ध्वाधर लाइनें SED6 के अपवाद के साथ एमएचबी (ठोस) और एससीएफएम (धराशायी) में निर्धारित एमबीईसी मूल्य को दर्शाती हैं, जिसमें मूल्य दोनों मीडिया में समान था। बिना भरे डेटा अंक कोलिस्टिन परीक्षण की सबसे कम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसके परिणामस्वरूप सीएलयू में ≥ 3-लॉग10 की कमी हुई है (0 माइक्रोन/एमएल कोलिस्टिन) (स्वीनी एट अल26से पुन: पेश किए गए डेटा) से तुलना की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। प्रतिनिधि व्यवहार्य स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सेल 24 घंटे से अधिक EVPL मॉडल पर विकास के एक समय पाठ्यक्रम से गिना जाता है, और ६४ μg/mL meropenem के साथ बाद में उपचार । प्रयोगशाला तनाव पी aeruginosa PA14 और 3 CF नैदानिक आइसोलित एक्स-एक्सिस पर दिखाए गए समय के लिए EVPL ऊतक पर उगाए गए थे, फिर 24 घंटे के लिए meropenem (त्रिकोण) को स्थानांतरित कर दिया या एक नियंत्रण (हलकों) के रूप में अनुपचारित छोड़ दिया । इसके बाद सीएलयू/फेफड़े का निर्धारण किया गया । cation-समायोजित MHB माध्यम में निर्धारित MIC प्रत्येक तनाव नाम के बगल में कोष्ठक में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। प्रतिनिधि व्यवहार्य स्टेफिलोकोकस ऑरियस सेल ईवीपीएल मॉडल पर वृद्धि के बाद गिना जाता है, फिर 24 घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर 5 μg/l flucloxacillin के साथ इलाज किया जाता है । नियंत्रण तनाव ATCC29213 और दो CF नैदानिक आइसोलेट 48 एच के लिए EVPL ऊतक पर बड़े हो गए थे तो 48 घंटे के लिए flucloxacillin (त्रिकोण) को स्थानांतरित करदिया या 4 घंटे और 24 घंटे के लिए एक नियंत्रण (हलकों) के रूप में अनुपचारित छोड़ दिया, इससे पहले कि CFU/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पूर्व वीवो फेफड़ों मॉडल उच्च थ्रूपुट और सस्ती है और, क्योंकि यह मांस उद्योग से उपभोक्ता कचरे के बाद का उपयोग करता है, यह कोई नैतिक चिंताओं को प्रस्तुत करता है । यह लंबे समय से संक्रमित मानव CF एयरवेज वर्तमान में उपलब्ध से बेहतर नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इन विट्रो AST प्लेटफार्मों । यहां प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि यह अधिक सही इन परिस्थितियों में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की भविष्यवाणी कर सकते हैं ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, जो यह सुनिश्चित करेंगे, विश्वसनीय और प्रजनन योग्य परिणाम निम्नलिखित शामिल हैं:

  1. फेफड़ों के नमूनों के वध, संग्रह और प्रसंस्करण के बीच लगातार समय और भंडारण विधियों का उपयोग करें। वध के बाद जितनी जल्दी हो सके फेफड़ों का उपयोग करना और संदूषण की क्षमता को न्यूनतम रखना महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक संस्कृतियों की क्षमता में अंतर फेफड़ों में बढ़ने के लिए अगर वे के रूप में संभव के रूप में ताजा नहीं कर रहे है देखा गया है ।
  2. एससीएफएम के उत्पादन में बंध्यता बनाए रखना और फेफड़ों के टुकड़ों का विच्छेदन आवश्यक है। स्वस्थ फेफड़े बाँझ नहीं होते हैं और इसलिए कॉमेंसल बैक्टीरिया की उपस्थिति पुराने संक्रमण के लिए 'प्राकृतिक' वातावरण को प्रतिबिंबित कर सकती है। फिर भी, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, बहुप्रजाति आबादी के भीतर बैक्टीरियल इंटरैक्शन एंटीबायोटिक दवाओं के परिणामों और संवेदनशीलता को बदल सकता है, इसलिए संदूषण से बचा जाना चाहिए और फेफड़ों को उपयोग से पहले निष्फल किया जाना चाहिए। हम यूवी नसबंदी के उपयोग की वकालत करते हैं, क्योंकि यह टिन ऊतक अखंडता में परिवर्तन का कारण नहीं बनता है और यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त एंटीबायोटिक वॉश। हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि वे चयनात्मक दबाव शुरू करने से परिणामों को प्रभावित कर सकते है और परीक्षण जीवाणु आबादी में जीन अभिव्यक्ति बदल सकते हैं ।
  3. नसबंदी के दौरान हटाए गए किसी भी संदूषक या कॉमेंसल बैक्टीरिया के विकास को उजागर करने के लिए एक गैर-चयनात्मक, समृद्ध माध्यम पर उगाई जाने वाली नकली-संक्रमित, नकारात्मक नियंत्रण ऊतक नमूनों और सेल काउंट प्लेटों का उपयोग करें। यह AST पर इन बैक्टीरिया के किसी भी प्रभाव को कम करने के लिए आवश्यक है । यह डुप्लीकेट, चयनात्मक आगर, सेल काउंट प्लेटों को ब्याज के जीव के लिए विशिष्ट बनाने में भी सहायक है, क्योंकि डुप्लिकेट प्लेटें कॉलोनी पहचान और सेल गणना को गति देती हैं।
  4. पहली बार मॉडल का उपयोग करते समय और ऊतक वर्गों के बीच बायोफिल्म सीआईएफयू विविधताओं का आकलन करने के लिए बैक्टीरिया के नए उपभेदों या जीनोटाइप के साथ इसका उपयोग करते समय पायलट प्रयोगों का संचालन करें, जिससे इष्टतम प्रयोगात्मक नमूना आकारों के चयन की अनुमति दी जा सके (उदाहरण के लिए, बिजली गणना के उपयोग के माध्यम से कितने दोहराने वाले फेफड़ों से प्राप्त करने के लिए ऊतक अनुभागों को दोहराने के लिए कितने दोहराने वाले ऊतक अनुभाग।
  5. परख एक गैर-मानकीकृत इनोकुलम का उपयोग करती है, क्योंकि यह 48 घंटों के इनक्यूबेशन के बाद तेजी से टीका लगाने और अपेक्षाकृत लगातार बायोफिल्म लोड (विशेष रूप से पी एरुगिनोसाके लिए) के गठन की अनुमति देता है। प्रारंभिक बायोफिल्म विकास चरणों में जीवाणुरोधी प्रभावकारिता को परखने के लिए, एएसएम में निलंबित कॉलोनी-उगाए गए बैक्टीरिया के मानकीकृत सीएलयू के साथ अनुमान लगाने पर विचार करें। हम प्लैंक्टोनिक बैक्टीरिया के साथ अनुमान लगाने की सिफारिश नहीं करते हैं: शुरुआती पायलट प्रयोगों से पता चला है कि इससे तीव्र, आक्रामक विकास विश्वसनीय बायोफिल्म गठन नहीं होता है।

यह प्रोटोकॉल पी ऑरुगिनोसाके साथ उपयोग के लिए एक मजबूत प्रोटोटाइप मॉडल का उत्पादन करता है, जिसमें एस ऑरियसके साथ उपयोग के लिए विकास की एक बड़ी क्षमता है, लेकिन इसमें कुछ सीमाएं हैं जिन्हें भविष्य में कुछ अनुप्रयोगों के लिए संबोधित करने की आवश्यकता होगी। क्लोनल आबादी के विकास की अनुमति देने के लिए ऊतक को एकल उपनिवेशों से टीका लगाया गया था। परिणाम बताते है कि, पी aeruginosaके लिए, यह ४८ घंटे पर सेल संख्या पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है । हालांकि, एस ऑरियस के लिए बैक्टीरियल लोड में अधिक परिवर्तनशीलता देखी गई थी और यह देखते हुए कि विभिन्न बैक्टीरिया मॉडल के भीतर अलग-अलग बढ़ सकते हैं, एक मानकीकृत प्रारंभिक शुरुआती और समान आकार और वजन के ऊतकों के नमूनों का कठोर उत्पादन अध्ययन के जीव पर निर्भर हो सकता है। सटीक विच्छेदन/संक्रमण तकनीकों या स्थानीय सुअर नस्ल/लैंडरेस में अंतर के कारण प्रयोगशालाओं के बीच मतभेद भी हो सकते हैं । मॉडल के व्यक्तिगत कार्यान्वयन के लिए जीवाणु आबादी की प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए, हमपरिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के भाग के रूप में पुनरावृत्ति गणना के उपयोग और अंतिम प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए इष्टतम नमूना आकार की गणना करने के लिए प्रायोगिक प्रयोगों के आधार पर पुनरावृत्ति/शक्ति गणना के उपयोग का सुझाव देते हैं ।

पारंपरिक प्लेट परख पर EVPL के प्रमुख फायदों में से एक यह है कि, प्लैंकटोनिक रूप से या अजैविक सतहों पर बढ़ रहे बैक्टीरिया के लिए परीक्षण करने के बजाय, यह एक मेजबान वातावरण के भीतर और सेल भेदभाव के साथ बैक्टीरियल बायोफिल्म्स की स्थानिक संरचना के लिए अनुमति देता है। यह रोगाणुरोधी एजेंटों की गतिविधि पर फिजियोकेमिकल और पोषक तत्वों के ढाल के प्रभाव के साथ-साथ एक पुराने संक्रमण और बैक्टीरिया के बीच सेल-सेल बातचीत के भीतर विभिन्न माइक्रोएनवायरमेंट्स पर सक्रिय उपचारों की डिलीवरी और उपलब्धता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। यह उत्तरार्द्ध बिंदु विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि बहुप्रजाति संक्रमण नियमित रूप से सीएफ में देखे जाते हैं और अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज जैसी अन्य श्वसन स्थितियों से जुड़े संक्रमणों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं । नैदानिक निदान में व्यक्तिगत रोगी थूक नमूने के लिए एएसटी के लिए इस मॉडल को विकसित करने की क्षमता है। एक अनुरूप परीक्षण पहले से ही विकास के लिए विट्रो मॉडल में एक घाव नकल उतार रहा है और पुराने घावों से debrided बायोफिल्म के AST (दक्षिण पश्चिम क्षेत्रीय घाव देखभाल केंद्र Lubbock, टेक्सास, डॉ आर Wolcott में) ।

इसके अलावा, मॉडल पोस्टमार्टम ऊतक का उपयोग करता है, तो एंटीबायोटिक संवेदनशीलता पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रभाव सीमित है । वर्तमान इन विट्रो मॉडल भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए खाते में नहीं है, तो हम इसे एएसटी अनुप्रयोगों में मॉडल के भविष्य के उपयोग के लिए एक बाधा के रूप में नहीं देखते हैं । हालांकि, जब फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक पैरामीटर और एंटीबायोटिक डोजिंग दिशानिर्देश निर्धारित किए जाते हैं तो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ध्यान में रखा जाता है। यद्यपि हमारे अध्ययनों ने ऊतक23 (और एस अजीमी, व्यक्तिगत संचार) के भीतर अवशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रतिक्रियाओं के सबूत दिखाए हैं, यह मॉडल के आगे अनुकूलन और विकास के लिए एक प्रमुख क्षेत्र है यदि वीवो स्थितियों में अधिक से अधिक मैच वांछित है।

सीएफ के लिए अधिक चिकित्सकीय रूप से वैध तास्ट प्रदान करने से यूके स्वास्थ्य, सामाजिक देखभाल अधिनियम 2008 की एक प्रमुख सिफारिश को पूरा करने में मदद मिलेगी कि "प्रक्रियाएं विवेकपूर्ण विहित और रोगाणुरोधी प्रबंधन सुनिश्चित करने के लिए होनी चाहिए। हमारा मानना है कि EVPL इस जरूरत को पूरा करने में मदद करने के लिए एक आदर्श उम्मीदवार मॉडल है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने सभी सह-लेखकों को उन मूल पत्रों पर धन्यवाद देते हैं जिनसे हमने अनुकरणीय परिणाम लिए हैं । इस कार्य को एफएच को दिए गए एमआरसी न्यू इन्वेसक्रूज रिसर्च ग्रांट (अनुदान संख्या एमआर/आर001898/1)द्वारा वित्त पोषित किया गया था; बीएचएसआरसी मिडलैंड्स इंटीग्रेटिव बायोसाइंसेज ट्रेनिंग पार्टनरशिप (एमआईबीटीपी) से पीएचडी स्टूडेंटशिप द्वारा एनईएच और आईए को सम्मानित किया गया; और यूनिवर्सिटी ऑफ वारविक अंडरग्रेजुएट रिसर्च सपोर्ट स्कीम के अवार्ड द्वारा एफए को समर वेकेशन रिसर्च प्रोजेक्ट का संचालन करने के लिए । हम फेफड़ों की आपूर्ति के लिए स्टीव क्विग्ले, संस (क्यूबिंगटन, वार्विशायर) और जॉन टेलर, बेटे (अर्लस्डेन, कोवाट्री) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी वारविक विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान के स्कूल में मीडिया की तैयारी की सुविधा की मदद को स्वीकार करना चाहते हैं, सेरिथ Harries और कैरोलीन स्टीवर्ट के लिए विशेष धंयवाद के साथ, और वारविक एंटीमाइक्रोबियल स्क्रीनिंग सुविधा में अनीता कैथवुड की मदद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes MP Biomedicals 116004500 FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates Diversified Biotech BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner 
Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes  Thermo Fisher 15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads Thermo Fisher 15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached. VWR BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit Thermo Fisher 10474415 For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.

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References

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Harrington, N. E., Sweeney, E., Alav, I., Allen, F., Moat, J., Harrison, F. Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (167), e62187, doi:10.3791/62187 (2021).

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