Summary
Denne arbeidsflyten kan brukes til å utføre antibiotika mottakelighet testing ved hjelp av en etablert ex vivo modell av bakteriell biofilm i lungene til personer med cystisk fibrose. Bruk av denne modellen kan forbedre den kliniske gyldigheten av MBEC (minimal biofilm utryddelse konsentrasjon) analyser.
Abstract
Den effektive resepten av antibiotika for bakterielle biofilmer som er tilstede i lungene til personer med cystisk fibrose (CF) er begrenset av en dårlig sammenheng mellom antibiotika mottakelighetstesting (AST) resultater ved hjelp av standard diagnostiske metoder (f.eks. buljongmikrodilusjon, diskdiffusjon eller Etest) og kliniske resultater etter antibiotikabehandling. Forsøk på å forbedre AST ved bruk av off-the-shelf biofilm vekstplattformer viser liten forbedring i resultatene. Den begrensede evnen til in vitro biofilmsystemer til å etterligne det fysisk-kjemiske miljøet i CF-lungen, og derfor bakteriell fysiologi og biofilmarkitektur, fungerer også som en bremse på oppdagelsen av nye terapier for CF-infeksjon. Her presenterer vi en protokoll for å utføre AST av CF-patogener dyrket som modne, i vivo-lignende biofilmer i en ex vivo CF lungemodell bestående av gris bronkiolarvev og syntetisk CF-sputum (ex vivo gris lunge, EVPL).
Det finnes flere in vitro-analyser for biofilm mottakelighetstesting, enten ved hjelp av standard laboratoriemedium eller ulike formuleringer av syntetisk CF-sputum i mikrotiterplater. Både vekstmedium og biofilmsubstrat (polystyrenplate vs. bronchiolarvev) vil sannsynligvis påvirke biofilm antibiotikatoleranse. Vi viser forbedret toleranse for klinisk Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus isolerer i ex vivo-modellen; effektene av antibiotikabehandling av biofilmer er ikke korrelert med minimum hemmende konsentrasjon (MIC) i standard mikrodilusjonsanalyser eller en sensitiv/resistent klassifisering i diskdiffusjonsanalyser.
Ex vivo-plattformen kan brukes til skreddersydd biofilm AST av pasientprøver og som en forbedret testplattform for potensielle antibiofilmmidler under farmasøytisk forskning og utvikling. Forbedring av reseptbelagte eller akselerasjon av antibiofilm narkotika oppdagelse gjennom bruk av mer in vivo-lignende testplattformer kan drastisk forbedre helseutfallene for personer med CF, samt redusere kostnadene ved klinisk behandling og oppdagelsesforskning.
Introduction
Kroniske biofilminfeksjoner påvirker personer hvis normale immunforsvar er kompromittert. Risikogrupper inkluderer de med den genetiske tilstanden cystisk fibrose (CF)1. Kolonisering av unormalt tykt, limslim i luftveiene tidlig i barndommen fører til intractable biofilminfeksjoner i bronkiolene2,3. Veksten av bakterier som omfattende matrise-innkapslede biofilmer er en faktor som skiller kroniske infeksjoner av immunkompromitterte mennesker fra akutte infeksjoner hos friske verter, og biofilmstaten beskytter begge bakterier mot antibiotikaeksponering (på grunn av redusert diffusjon gjennom matrisen) og reduserer deres antibiotikasceptibilitet (f.eks. gjennom induksjon av passivitet eller oppregulering av eflukspumper)4,5. Imidlertid endrer sykdomsspesifikke endringer i vertsvevsfysiologi og kjemi ytterligere bakteriell fysiologi fra det som observeres ved akutte infeksjoner eller i standard laboratorievekstforhold. Viktige eksempler i CF inkluderer bruk av uvanlige karbonkilder, som fettsyrer og aminosyrer frigjort fra lungeoveraktivt middel og produsert ved mikrobiell nedbrytning av mucin, frigjøring av mikronæringsstoffer, som jern fra skadede vev og mikroaerobiosis6,7,8.
De spesifikke fysisk-kjemiske forholdene i en bestemt biofilminfeksjonskontekst kan derfor påvirke responsen på antibiotika. For det første avhenger strukturen og dybden av den ekstracellulære matrisen av lokale miljøforhold, for eksempel næringsstoffer eller skjærkrefter. For det andre kan miljøsignaler utløse uttrykk for spesifikke antibiotikaresistensgener. For eksempel viser CF-patogenet Pseudomonas aeruginosa økt uttrykk for en beta-laktamase og redusert uttrykk for poriner i CF sputum versus in vitro9, mens et annet CF-patogen, Burkholderia cenocepacia, upregulaterer beta-laktamaser og effluxpumper når de vokser i CF sputum10. For det tredje kan vertsforhold signalisere en fysiologisk eller genetisk bryter til antibiotikatolerante fenotyper, som er vanskelige å rekapitulere in vitro. Disse inkluderer små kolonivarianter av CF-patogenet Staphylococcus aureus11,12.
Alle disse dataene indikerer at når diagnostiske laboratorier isolerer individuelle kloner fra patogen biofilm og utfører AST på planktoniske eller agarplatevokste kulturer i standard laboratoriemedier (buljongmikrodilusjon, diskdiffusjon eller Etest), forutsier resultatene ofte ikke hvilke antibiotika som faktisk vil fungere i vivo. Selv om in vitro biofilmanalyser brukes, kan det hende at de ikke signaliserer en in vivo-lignende biofilmfenotype på grunn av forskjeller i medium- og festeoverflaten som brukes, slik at analyser ved hjelp av strømningsceller eller mikroplateplattformer med høy gjennomstrømning kan overberegne antibiotikafølsomhet13. Det samme problemet gjelder forskere i akademia og industri som ønsker å utvikle nye antibiofilmmidler: testing av legemiddelpotensial ved bruk av in vitro-plattformer som strømningsceller, mikrotiterplater eller Biofilmreaktorer fra Center for Disease Control kan sette biofilmeffektlinjen for lav og produsere falske positiver i forskningen, utviklingsrørledningen.
Den dårlige sammenhengen mellom AST-resultater og klinisk utfall etter antibiotikabehandling i CF er velkjent. Mange klinikere ignorerer ganske enkelt diagnostisk lab AST, da det ikke er noen ensartede, CF-spesifikke retningslinjer for å tolke disse resultatene og i stedet ta avgjørelser fra sak til sak for forskrivning. Det er gjort forsøk på å forbedre CF AST ved hjelp av Calgary biofilm-enheten, som bruker biofilmer dyrket på overflaten av plastpinner satt i brønnene til en mikroplate som inneholder standard AST-medium (f.eks. kationjustert Muller-Hinton buljong)14,15. Denne analysen gjør det ikke bedre å forutsi hvilke antibiotika som vil fungere in vivo enn standard planktonic AST16. Innvirkningen på pasienter med CF er sterk. Til tross for gjentatt antibiotikaadministrasjon (vanlig inhalert antibiotika og en median på 27 dager / år mottar intravenøs antibiotika for personer med CF i Storbritannia)17, hyppige og uforutsigbare episoder av akutt lungeforverring fører til progressiv lungeskade og, i ca 90% av tilfellene, død av respiratorisk svikt. I en nylig analyse var bakteriell lungeinfeksjon den sterkeste prediktoren for legemiddelkostnader i CF, og la i gjennomsnitt € 3,6 K / pasient / år til direkte helsekostnader18,19.
For akutte infeksjoner av ellers friske individer, nåværende forskning og politikk med fokus på rask AST basert på for eksempel punkt-of-care genomisk prediksjon er ideell20. Men når det gjelder kroniske CF-infeksjoner, er det klart at en annen tilnærming er nødvendig: implementeringen av AST i verts-etterlignende modeller som bedre rekapitulerer in vivo-miljøet og patogenmetabolismen og tillater dannelse av realistisk biofilmstruktur.
Vi har tidligere utviklet en CF biofilm modell som består av deler av gris bronkiol inkubert i syntetisk CF sputum og infisert med P. aeruginosa eller S. aureus. Uinfektert EVPL beholder normal histopatologi i 7 dager, men lab eller kliniske isolerer P. aeruginosa og S. aureus reproduserer reprodusly form i vivo-lignende aggregater rundt vevet, etterligner etiologien til CF-infeksjon21,22,23. Vi presenterer en protokoll for bruk av denne modellen med høy validitet og høy gjennomstrømning som en skreddersydd BIOFILM AST-plattform for CF og presenterer eksemplariske resultater som viser den høye toleransen for patogenbiofilmer til klinisk brukte antibiotika når de vokser i modellen. Modellen kan lett innlemmes i forskning, utviklingsrørledninger for styring eller forebygging av biofilmdannelse og potensielt i diagnostisk AST. Det meste av utstyret som brukes (se Materialfortegnelse) kan lett bli funnet i et typisk mikrobiologisk laboratorium, selv om en perle beater er viktig, og vi har funnet ut fra arbeid med samarbeidspartnere at et passende ultrafiolett bakteriedreiende skap også må anskaffes. Ettersom lungene er hentet fra kommersielle slaktere eller abattoirer, presenterer modellen ingen etiske bekymringer.
Protocol
Denne protokollen bruker gris lunger hentet fra en kommersiell abattoir som leverer kjøtt til konsum. I henhold til britisk lovgivning krever bruk av rester av vev fra dyr slaktet for kjøtt ikke etisk godkjenning; Vi anbefaler leserne å sjekke relevante lokale lover og institusjonelle retningslinjer før de starter arbeidet.
1. Fremstilling av syntetiske CF Sputum Media (SCFM)
- For å lage SCFM for bruk med EVPL-vev, følg oppskriften skissert av Palmer et al.24 med modifikasjonen at glukose fjernes fra oppskriften.
MERK: Palmer et al.s oppskrift inneholder gratis aminosyrer, kasjoner, anioner og laktat ved konsentrasjoner som er representative for de gjennomsnittlige konsentrasjonene som finnes i et utvalg av sputumprøver fra CF-pasienter. Det har vist seg å cue sammenlignbare karbonbruksveier og uttrykk for quorum sensing signaler av P. aeruginosa PA14 til vekst i medium laget av lyofilisert pasient sputum24. En oppskrift på 1 L modifisert SCFM leveres i Tabell S1. - Filtrer steriliser SCFM umiddelbart etter tilberedning og oppbevar ved 4 °C i opptil 1 måned.
2. Disseksjon og infeksjon av ex vivo gris lunge (EVPL) vev
- Før disseksjon, forberede en agar plate / s av nødvendig bakteriell stamme / s for infeksjon ved hjelp av hva agar er standard i laboratoriet for P. aeruginosa/S. aureus (f.eks, lysogeni buljong + 1,2% agar).
- Beregn hvor mange porcine bronchiolar vev stykker er nødvendig for eksperimentet, inkludert uinferte kontroll vev stykker. Multipliser dette tallet med to for å gjenta eksperimentet i to replikere lunger for å bekrefte repeterbarhet av resultater.
- Multipliser det totale antallet vevsstykker som kreves av 0,5 for å bestemme volumet av SCFM agarose (mL) som trengs for å lage agarose pads for å lage nok medium til 400 μL / vev stykke pluss ekstra SCFM agar for å ta hensyn til eventuelle pipetteringsfeil eller fordampning under forberedelsen.
- Tilsett 0,12 g agarose til hver 15 ml SCFM som kreves for å gjøre ønsket totalvolum av SCFM med 0,8% vekt / volum agarose.
- Varm opp SCFM-agaroseløsningen til agarose er fullstendig oppløst. En innenlandsk mikrobølgeovn med lav effekt anbefales. Tiden som kreves avhenger av mikrobølgens wattstyrke. La agarose avkjøles til ca. 50 °C (varm til berøring, men behagelig å holde). Ikke la det avkjøles ytterligere.
- Bruk en pipette, tilsett 400 μL av SCFM-agarose til en brønn av en 24-brønns plate per vevsstykke som trengs.
- Steriliser SCFM agaroseholdige 24-brønnsplate/-er under ultrafiolett lys i 10 min.
- Forbered tre replikeringsvasker for hver intakte lunge som dissekeres ved hjelp av 20 ml sterilt Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) pluss 20 ml steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplert med 50 μg/ml ampicillin.
- Lag en aliquot på 40 ml SCFM som en siste vask for hver intakt lunge som dissekeres. Alle vasker kan oppbevares over natten ved 4 °C eller brukes umiddelbart.
- Få lunger fra den angitte kilden så snart som mulig etter slakting, og sørg for at de holdes kalde ved å transportere til laboratoriet i en husholdningskjøleboks.
MERK: Lunger nærmere slaktedagen viser mindre blåmerker fra lagring, men vev holdt på kald lagring i opptil 4 dager fra slakting kan også brukes. Siden kjøleboksen må tas inn i slakterens butikk eller abattoir, må den dekontamineres etter lokale laboratorieretningslinjer etter hver bruk og lagres utenfor mikrobiologilaboratoriet når den ikke er i bruk, for å redusere risikoen for forurensning og brudd på inneslutningen. - Arbeid på en sterilisert overflate og under en flamme, plasser lungene på et rent plast hakkebrett dekket med autoklavert aluminiumsfolie. Kontroller at bronkiolene forblir intakte. Hvis det har vært noen skade på abattoiret eller under transport, er lungene ikke egnet for bruk.
- Varm en palettkniv under en flamme og berør veldig kort kniven til lungeområdet rundt bronkiolen for å sterilisere overflaten av vevet.
- Skjær bort overflatevevet rundt bronkiolen ved hjelp av et sterilt montert barberblad. Gjør snitt parallelt med bronkiolen for å forhindre skade.
- Når bronkiolen har blitt utsatt, gjør du et tverrsnitts snitt gjennom bronkiolen på det høyeste punktet som er synlig for å frigjøre bronkiolen.
- Bruk sterile tang, hold lett den frie enden av bronkiolen og kutt bort gjenværende uønsket vev ved hjelp av et sterilt montert barberblad. Lag et siste tverrsnitts snitt over bronkiolen før noen forgrening er synlig for å fjerne bronkiolen fra lungene.
- Plasser bronkiolen i den første DMEM/RPMI 1640-vasken. La bronkiolen stå i vasken og gjenta trinn 2.11-2.14 for å høste flere deler av bronkiol fra samme lunge som nødvendig for å gi tilstrekkelige vevsseksjoner for det planlagte eksperimentet.
- Plasser eventuelle ekstra bronkiolarseksjoner fra samme lunge i vasken (trinn 2.16). La det stå i vasken i minst 2 min.
- Fjern bronkiolene fra den første DMEM/RPMI 1640 vasken og legg prøvene i en steril Petri-tallerken.
- Hold hver bronkiol lett ved hjelp av sterile tang, sørg for ikke å skade vevet. Fjern så mye gjenværende bløtvev som mulig og skjær vevet i ~ 5 mm brede strimler ved hjelp av steril disseksjonssaks.
- Plasser alle bronkolarvevsstrimlene i den andre DMEM/RPMI 1640-vasken. La det stå i vasken i minst 2 min.
- Fjern vevsstrimlene fra den andre vasken ved hjelp av sterile tang, pass på at du ikke skader vevet. Legg vevet i en ren, steril Petri-tallerken.
- Fjern eventuelt gjenværende bløtvev festet til bronkiolen og skjær strimlene i firkanter (~ 5 mm x 5 mm) ved hjelp av steril disseksjonssaks.
- Tilsett den tredje DMEM/RPMI 1640 vasken i Petri-retten. Bland lett vevsstykkene i vasken ved å virvle parabolen.
- Hell den tredje vasken ut av Petri-parabolen uten å fjerne vevstykkene.
- Tilsett den endelige SCFM-vasken i den vevholdige Petri-retten, og sørg for at alle vevsstykkene er dekket.
- Steriliser vevstykkene i SCFM under UV-lys i 5 min.
- Bruk sterile tang til å overføre hvert steriliserte bronkolarvevsstykke til individuelle brønner i en 24-brønns plate/s som inneholder SCFM agarose pads.
- For å infisere hvert vevsstykke med ønsket bakteriestamme, berør en koloni dyrket på en agarplate med spissen av en 29 G nål festet til en steril 0,5 ml insulinsprøyte. Berør deretter kolonien på vevsstykket, og prikk forsiktig vevsoverflaten.
MERK: Ved hjelp av en insulinsprøyte utstyrt med en 29 G nål kan nålen holdes nøyaktig og komfortabelt mens du holder fingrene i sikker avstand fra både nål- og lungevevet. Det er mulig å utføre dette trinnet ved hjelp av 29 G nåler som ikke er festet til en sprøyte, men dette krever større fingerferdighet og øker risikoen for en nålestikkskade. Insulin sprøyter er lett tilgjengelig. - For de uinfiserte kontrollene stikker du forsiktig overflaten på hvert av vevstykket med spissen av en 29 G nål festet til en steril 0,5 ml insulinsprøyte.
- Bruk en pipette for å legge til 500 μL SCFM til hver brønn.
- Steriliser en pustende tetningsmembran for hver 24-brønnsplate under ultrafiolett lys i 10 min (Materialbord).
- Fjern lokket/dekslene fra 24-brønnsplaten/-ene og erstatt dem med den pustende membranen.
- Inkuber platene ved 37 °C for ønsket inkubasjonstid (infeksjon) uten risting. Kontroller at det ikke er noen synlig vekst av det inokulerte patogenet på de uinferte kontrollstykkene (forurensningskontroll).
MERK: Hvis ønskelig, kan ampicillin legges til SCFM agarose pads i trinn 2.5 og dekker SCFM i trinn 2.30 til en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml. Dette vil undertrykke veksten av de fleste endogene bakterier på lungene uten å påvirke P. aeruginosa eller S. aureusvekst, men ettersom tilstedeværelsen av ampicillin kan påvirke følsomheten for andre antibiotika, blir leseren igjen for å gjøre dette valget avhengig av belastningene og antibiotika de ønsker å teste.
3. Bestemmelse av antibiotika effekt
MERK: En skjematisk oversikt over trinnene i denne analysen er angitt i figur S1.
- For å måle antibiotikatoleranse for biofilmer dannet på EVPL, må replikere sett med lungestykker, fra minst to uavhengige lunger, settes opp under disseksjonen og infeksjonen. Ett sett med brikker er nødvendig for en negativ kontroll (ingen antibiotikabehandling), og ett sett er nødvendig for hver konsentrasjon av antibiotika som skal testes.
- Etter 48 timers inkubasjon, inspiser visuelt de uinfiserte vevsstykkene. Noe vekst av bakterier endogene til gris lungen kan ha skjedd, noe som fører til at SCFM rundt disse seksjonene blir uklart. Hvis det observeres vekst som er typisk for de utvalgte studieartene (f.eks. blågrønn pigmenteringsdiagnostisering av P. aeruginosa), start eksperimentet på nytt med friske lunger.
- Hvis de uinfiserte vevsdelene ikke viser noen eller bare minimal bakterievekst, lag en 24-brønns vaskeplate og en 24-brønns behandlingsplate, som hver inneholder 500 μL fersk SCFM uten antibiotika eller med antibiotika av interesse per brønn per lungevevsstykke.
- Fjern hvert infiserte vevsstykke fra inkubasjonsplaten med flammesteriliserte tang, virvle kort i en frisk brønn på vaskeplaten for å fjerne ikke-biofilmrelaterte bakterieceller, og overfør til riktig brønn av behandlingsplaten.
- Forsegle behandlingsplatene med frisk pustende membran.
- Inkuber behandlingsplaten/-platene ved 37 °C uten å riste i 18-24 timer.
- Bruk flammesteriliserte tang, fjern hvert lungestykke fra 24-brønnsplaten og legg i et sterilt 2 ml homogeniseringsrør som inneholder 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og 1 g metallperler (Materialbord).
- Perle slo i 40 sekunder ved 4 m/s.
MERK: Perleslag med de spesifikke perlene og homogenisatoren som er foreslått i materialtabellen, forårsaker ikke signifikant lysis av bakterier, men hvert laboratorium som bruker protokollen, bør sjekke effekten av de valgte perlene og homogenisatoren før de starter AST-analyser. - Fortynn lungehomogenatet serielt ved hjelp av PBS og plate på Lysogeny Broth (LB) agar for å bestemme kolonidannende enheter (CFU) i individuelle ubehandlede og antibiotikabehandlede vevsstykker i henhold til standard platingmetoder.
MERK: Valgfritt: Forbered dupliserte plater på selektive medier for å bekrefte koloniidentiteter; f.eks. bruke mannitol salt agar for S. aureus.
Representative Results
EVPL-modellen gir en høy gjennomstrømningsanalyseplattform, noe som gjør det mulig å screene et stort antall bakterielle isolasjoner for antibiotikafølsomhet på en gang (figur 1 og 2) eller å screene stammer mot en rekke antibiotikakonsentrasjoner i ett eksperiment (figur 3). Med praksis har vi funnet ut at ca 200 bronkiolar vev seksjoner kan fremstilles fra lunger i 2 timer. Hele eksperimentet for AST kan fullføres innen normal arbeidstid. Veksten av Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus isolerer og etableringen av 48 h biofilm i modellen er pålitelig, og når den overvåkes av levedyktig celleantall, produserer konsistent bakteriebelastning (Figur 1 og 2). Bilder av vevsrelaterte biofilmer av Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus dyrket i EVPL kan bli funnet, sammen med protokoller for forberedelse til lysmikroskopi og histologisk farging, i våre publikasjoner21,23. Reproduserbarheten av CFU-tellinger varierer imidlertid for forskjellige bakteriearter. Dette kan kvantifiseres ved hjelp av standard repeterbarhetsberegninger etter ANOVA25; vi har funnet ut at det vanligvis er større variasjon mellom CFU i replikere lungeprøver for S. aureus enn for P. aeruginosa. Vi anbefaler at ved bruk av modellen av et laboratorium utføres gjentatte beregninger på piloteksperimenter for å optimalisere eksperimentelle teknikker og for å bestemme prøvestørrelser som skal brukes i endelige eksperimenter (et eksempel på dette finnes i datatillegget for Sweeney et al26).
Når de vokser i EVPL, viser biofilmer av P. aeruginosa og S. aureus økt toleranse for antibiotika sammenlignet med følsomhet i standard, industrigodkjent kjøttkraft MIC (figur 1) og plateanalyser ved hjelp av standardmedier (figur 2). De ulike effektene av forskjellige antibiotika på EVPL etablert biofilm er skille, for eksempel P. aeruginosa drap oppnås i EVPL med 4-16X MIC ciprofloxacin, men ikke med 4-8X MIC kloramfenikol (Figur 1). En to ganger daglig dose på 600 mg linezolid oppnår en serumkonsentrasjon over MIC90 for mottakelige patogener (4 μg/ml)27 og regnes som tilstrekkelig eksponering uten bivirkninger28. Data presentert i figur 2 viser at S. aureuspopulasjoner, utsatt for linezolid i plateanalysen, er i stand til å overleve målserumkonsentrasjoner, og høyere (12 μg/ml), i EVPL. Det er ingen klar sammenheng mellom MIC og antibiotikaeffekter på EVPL-dyrkede biofilmer for P. aeruginosa (figur 1). Å få et mer nøyaktig mål på in vivo antibiotikatoleranse er viktig fordi sub-optimal dosering av antibiotika kan øke risikoen for seleksjon for resistens ved kronisk infeksjon.
Det er velkjent at biofilmmodusen for vekst kan redusere bakteriell følsomhet for antibiotika betydelig. Dette har ført til utvikling av mange in vitro biofilmanalyser og bruk av minimum biofilm utryddelse konsentrasjon (MBEC)14,15 i stedet for MIC som en mer nøyaktig prediktor for følsomhet i kronisk infeksjon. Bruk av SCFM (i varierende formuleringer) er også anbefalt for bruk i MIC- eller MBEC-testing29. Her viser vi at selv en optimalisert in vitro-analyse ikke nøyaktig kan forutsi P. aeruginosa mottakelighet for colistin i EVPL. Mengden antibiotika som kreves for å oppnå 3 logg10 drap på EVPL-dyrkede bakterier er ofte betydelig høyere enn MIC eller MBEC beregnet fra standard in vitro-analyser, selv når SCFM brukes til disse analysene (Figur 3). Dette er i samsvar med en Cochrane-gjennomgang som rapporterte at nåværende implementeringer av in vitro biofilm mottakelighetstesting ikke gir noen økt prediktiv kraft for antibiotikaforskrivning i CF sammenlignet med standard følsomhetstesting16.
Det er også enkelt å bruke modellen til å vurdere effekten av antibiotika på biofilmbakterier over tid, da tilstrekkelige kopistykker av lunge kan inokulere for å tillate destruktiv prøvetaking. I tillegg til å skille forskjeller mellom antimikrobielle midler, kan modellen markere endringer i følsomhet i ulike bakterielle vekststadier eller biofilmalder og for forskjellige antibiotika doseringsintervaller. Figur 4 illustrerer den økende toleransen for P. aeruginosa biofilmer til meropenem etter hvert som de modnes. Dette kan være nyttig for å bestemme effekten av nye midler, for eksempel om de er mer effektive under rask celledeling. Det kan også være en viktig vurdering når man setter begrensningene i et eksperiment, da det kan være nødvendig å standardisere og validere biofilmalder for å unngå at alderen påvirker resultatene.
I figur 5ble S. aureusoverlevelse målt til 4 t og 24 timers posteksponering for flukloksacillin, og det var mulig å observere forskjeller i reduksjonen for bakterieceller over tid og mellom isolasjoner. Dette kan være nyttig for narkotikautvikling, for eksempel ved definering av farmakokinetiske og farmakodynamiske parametere eller ved belysning av virkningsmåten til et nytt middel.
Variasjoner i bakteriebelastningen øker ofte med utvidet kulturtid. Dette kan ses i ubehandlet kontroll i figur 5 etter 48 timers biofilmutvikling og ytterligere 24 timers eksponering for å ta høyde for antibiotisk doseringsintervall. Variasjon er iboende for modellen; hver lungeprøve er uavhengig av andre og gjenspeiler den naturlige variasjonen av lunger. Det er derfor viktig å sikre at et tilstrekkelig antall replikeringer inkluderes for å muliggjøre validering og en nøyaktig tolkning av resultatene. Vi henviser leseren tilbake til vår anbefaling om å utføre gjentatte beregninger på dataene for å muliggjøre valg av robuste utvalgsstørrelser.
For enkelhets skyld har vi presentert representative data hentet fra replikere vevsseksjoner hentet fra et enkelt par lunger i hvert eksperiment, men i praksis er det nødvendig å utføre gjentatte eksperimenter på vevsseksjoner tatt fra replikere dyr. Dette bør gjøres for å gjøre rede for enhver biologisk variasjon mellom enkelte griser, og vi henviser leseren til vårt publiserte arbeid for eksempler på hvor konsistent resultatene kan være mellom vev tatt fra replikere griser og hvordan denne variasjonen er gjort rede for i statistisk analyse av data ved hjelp av variansanalyse (ANOVA)/generelle lineære modeller (GLM)21,26.
Figur 1. Total CFU av 11 CF Pseudomonas aeruginosa kliniske isolasjoner gjenvunnet fra EVPL-modellen etter behandling med antibiotika. Representative resultater av antibiotikabehandling av P. aeruginosa i EVPL-modellen. Hver stamme ble dyrket på EVPL-vev i 48 timer og deretter overført til antibiotika (trekanter) eller PBS som en kontroll (sirkler) i 18 timer og CFU / lungen bestemt. MIC for riktig antibiotika bestemt i standard kationjustert MHB er vist i parentes ved siden av hver stamme (x-akse). Stammene bestilles ved å øke MIC-verdiene. Data ble analysert ved hjelp av t-tester når det var hensiktsmessig, og Mann-Whitney U-tester for ikke-parametriske datasett. Signifikante forskjeller mellom antibiotikabehandlet og ubehandlet vev er betegnet med stjerner (P < 0,05). A. Gjenvunnet levedyktige tellinger fra P. aeruginosa biofilmer dyrket i EVPL-modellen og behandlet med 64 μg / ml kloramfenikol (høyeste MIC-verdi registrert). For hver isolat ble den standardiserte gjennomsnittlige forskjellen i CFU mellom kloramfenikolbehandlede og ubehandlede vevsseksjoner beregnet ved hjelp av Cohens d. Det var ingen sammenheng mellom MIC-verdien i standardtesten og reduksjonen i levedyktige cellenumre i EVPL-modellen målt ved Cohens d (Spearmans rangeringskorrelasjon, rs = 0,45, p = 0,16) B. Resultater av P. aeruginosa biofilmer dyrket i EVPL-modellen og behandlet med 64 μg/ml ciprofloxacin (høyeste MIC-verdi registrert). Verdier under den stiplede linjen var under deteksjonsgrensen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Total CFU av 8 Staphylococcus aureus CF kliniske isolasjoner gjenvunnet fra EVPL-modellen etter behandling med linezolid. Hver stamme ble dyrket på EVPL-vev i 48 timer og deretter overført til linezolid (trekanter) i 24 timer eller ble ubehandlet som en kontroll (sirkler). Alle stammer ble funnet å være følsomme for linezolid ved hjelp av standard diskdiffusjonsanalyse etter EUCAST-retningslinjene30 (hemmingssone > 21 mm). Data ble analysert ved hjelp av t-tester når det var hensiktsmessig, og Mann-Whitney U-tester for ikke-parametriske datasett (P < 0,05). Det ble ikke funnet signifikante forskjeller mellom antibiotikabehandlet og ubehandlet for noen av stammene. Verdier under den stiplede linjen var under deteksjonsgrensen. A. Resultater av S. aureus biofilmer i EVPL-modellen behandlet med 4 μg/ml linezolid (klinisk stoppunkt for sensitiv/resistent i henhold til EUCAST-klassifisering31). B. Resultater av S. aureus biofilmer i EVPL-modellen behandlet med 12 μg/ml linezolid (data gjengitt fra Sweeney et al23). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Levedyktige Pseudomonas aeruginosa celle teller laboratoriestammen PA14 og 4 CF kliniske isolasjoner gjenvunnet fra EVPL-modellen etter behandling med økende konsentrasjoner av colistin. Hver stamme ble dyrket på EVPL-vev i 48 timer og deretter utsatt for colistin i 18 timer. MIKROFONEN som bestemmes i standard kationjustert MHB-medium, vises i parentes ved siden av hvert strekknavn. De loddrette linjene viser MBEC-verdien som er bestemt i MHB (heldekkende) og SCFM (stiplet), med unntak av SED6, der verdien var den samme i begge medier. De ufylte datapunktene representerer den laveste konsentrasjonen av colistin testet som resulterte i ≥ 3-logg10 reduksjon i CFU / lungekomponert til ubehandlede prøver (0 μg / ml colistin) (data gjengitt fra Sweeney et al26). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Representativ levedyktig Pseudomonas aeruginosa celle teller fra et tidsforløp for vekst på EVPL-modellen over 24 timer, og etterfølgende behandling med 64 μg / ml meropenem. Laboratoriestammen P. aeruginosa PA14 og 3 CF kliniske isolasjoner ble dyrket på EVPL-vev for tiden vist på x-aksen, deretter overført til meropenem (trekanter) i 24 timer eller forlatt ubehandlet som en kontroll (sirkler). CFU/lungen ble deretter bestemt. MIC som bestemmes i kationjustert MHB-medium, vises i parentes ved siden av hvert strekknavn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Representativ levedyktig Staphylococcus aureuscelle teller etter vekst på EVPL-modellen og deretter behandlet med 5 μg / ml flucloxacillin over et 24 timers tidsforløp. Kontrollstammen ATCC29213 og to CF kliniske isolasjoner ble dyrket på EVPL-vev i 48 timer og deretter overført til flucloxacillin (trekanter) eller forlatt ubehandlet som en kontroll (sirkler) i 4 timer og 24 timer, før CFU / lunge ble bestemt (data gjengitt fra Sweeney et al23). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Tabell S1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Ex vivo lungemodellen er høy gjennomstrømning og billig, og fordi den bruker post-forbrukeravfall fra kjøttindustrien, presenterer den ingen etiske bekymringer. Den er designet for å etterligne kronisk infiserte menneskelige CF-luftveier bedre enn for tiden tilgjengelige, in vitro AST-plattformer. Resultatene som presenteres her viser at det mer nøyaktig kan forutsi antibiotika mottakelighet under disse omstendighetene.
Kritiske trinn i protokollen, som vil sikre, pålitelige og reproduserbare resultater inkluderer følgende:
- Bruk konsistente tids- og lagringsmetoder mellom slakting, innsamling og behandling av lungeprøver. Det er viktig å bruke lunger så snart som mulig etter slakting og for å holde potensialet for forurensning til et minimum. Forskjeller i eksperimentelle kulturers evne til å vokse i lungene hvis de ikke er så friske som mulig, er observert.
- Det er viktig å opprettholde steriliteten i produksjonen av SCFM og disseksjon av lungestykker. Friske lunger er ikke sterile, og tilstedeværelsen av kommensale bakterier kan gjenspeile et "naturlig" miljø for kronisk infeksjon. Likevel, som tidligere nevnt, kan bakterielle interaksjoner innen multiarterpopulasjoner endre resultater og følsomhet for antibiotika, så forurensning bør unngås og lungene bør steriliseres før bruk. Vi tar til orde for bruk av UV-sterilisering, da det ikke ser ut til å forårsake endringer i tinnvevsintegriteten og om nødvendig ytterligere antibiotikavasker. Antibiotika bør imidlertid brukes med forsiktighet, da de kan påvirke resultatene ved å innføre selektivt trykk og kan endre genuttrykk i testbakterielle populasjoner.
- Bruk mock-infiserte, negative kontrollvevsprøver og celletellingsplater dyrket på et ikke-selektivt, rikt medium for å markere veksten av eventuelle forurensnings- eller kommensale bakterier som ikke er fjernet under sterilisering. Dette er viktig for å redusere for enhver innvirkning av disse bakteriene på AST. Det er også nyttig å produsere dupliserte, selektive agar-, celletellingsplater som er spesifikke for organismen av interesse, da dupliserte plater fremskynder koloniidentifikasjon og celleopplisting.
- Utfør piloteksperimenter når du først bruker modellen og når du bruker den med nye stammer eller genotype bakterier for å vurdere biofilm CFU-variasjoner mellom vevsseksjoner, slik at valg av optimale eksperimentelle prøvestørrelser (f.eks. hvor mange replikerer vevsseksjoner for å skaffe seg fra hvor mange replikere lunger) gjennom bruk av kraftberegninger.
- Analysen bruker et ikke-standardisert inokulum, da dette tillater rask inokulasjon etter 48 timers inkubasjon og dannelse av relativt konsistente biofilmer (spesielt for P. aeruginosa). For å analyse antibakteriell effekt i tidlige biofilmvekststadier, bør du vurdere å inokulere med en standardisert CFU av kolonidyrkede bakterier suspendert i ASM. Vi anbefaler ikke å inokulere med planktoniske bakterier: tidlige pilotforsøk viste at dette fører til akutt, invasiv vekst ikke pålitelig biofilmdannelse.
Denne protokollen produserer en robust prototypemodell for bruk med P. aeruginosa, med et stort potensial for utvikling for bruk med S. aureus, men den har noen begrensninger som må løses for visse applikasjoner i fremtiden. Vev ble inokulert fra enkeltkolonier for å tillate utvikling av klonale populasjoner. Resultatene viser at for P. aeruginosahar dette liten innvirkning på celletallene ved 48 timer. Imidlertid ble det observert større variasjon i bakteriebelastning for S. aureus, og gitt at forskjellige bakterier kan vokse annerledes i modellen, kan en standardisert startulum og streng produksjon av vevsprøver av identisk størrelse og vekt være avhengig av studieorganismen. Det kan også være forskjeller mellom laboratorier på grunn av forskjeller i presise disseksjons-/infeksjonsteknikker eller lokal grisras/landrace. For å vurdere reproduserbarheten av bakteriepopulasjoner for individuelle implementeringer av modellen, foreslår vi bruk av repeterbarhetsberegninger som en del av den statistiske analysen av resultater25 og bruk av repeterbarhet / kraftberegninger basert på pilotforsøk for å beregne den optimale utvalgsstørrelsen for bruk i endelige eksperimenter.
En av de viktigste fordelene med EVPL over tradisjonelle plateanalyser er at i stedet for å teste for bakterier som vokser planktonisk eller på abiotiske overflater, tillater det romlig strukturering av bakterielle biofilmer i et vertsmiljø og med celledifferensiering. Dette har viktige implikasjoner for å vurdere effekten av fysiokjemiske og næringsmessige gradienter på aktiviteten til antimikrobielle midler, samt levering og tilgjengelighet av aktive terapier ved ulike mikromiljøet i en kronisk infeksjon og cellecelleinteraksjon mellom bakterier. Dette siste punktet er spesielt viktig, da multiarter infeksjoner rutinemessig observeres i CF og blir stadig viktigere for infeksjoner forbundet med andre luftveissykdommer, som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom. Det er potensial for å utvikle denne modellen for AST for individualisert pasientsputumprøvetaking i den kliniske diagnostikken. En analog studie er allerede i gang med en sår-etterlignende in vitro-modell for vekst og AST av debrided biofilm fra kroniske sår (Southwest Regional Wound Care Center i Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).
Videre bruker modellen post-mortem vev, slik at påvirkningen av vertens immunrespons på antibiotika mottakelighet er begrenset. Nåværende in vitro-modeller tar heller ikke hensyn til vertsimmuneresponser, så vi ser ikke dette som en barriere for fremtidig bruk av modellen i AST-applikasjoner. Imidlertid tas immunresponsen i betraktning når farmakokinetiske og farmakodynamiske parametere og retningslinjer for dosering av antibiotika bestemmes. Selv om våre studier har vist bevis på gjenværende immunceller og responser ivevet 23 (og S. Azimi, personlig kommunikasjon), er dette et ypperlig område for videre optimalisering og utvikling av modellen hvis en større match til in vivo forhold er ønsket.
Å tilby mer klinisk gyldig AST for CF vil bidra til å oppfylle en viktig anbefaling fra UK Health, Social Care Act 2008 om at "prosedyrer bør være på plass for å sikre forsvarlig forskrivning og antimikrobiell forvaltning." Vi mener at EVPL er en ideell kandidatmodell for å bidra til å møte dette behovet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle våre medforfattere på de originale papirene som vi har tatt eksemplariske resultater fra. Arbeidet ble finansiert av et MRC New Investigator Research Grant (tilskuddsnummer MR/R001898/1) tildelt FH; av ph.d.-studenter fra BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) tildelt NEH og IA; og av University of Warwick Undergraduate Research Support Scheme's pris til FA for å gjennomføre et sommerferieforskningsprosjekt. Vi takker Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) og John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) for å ha levert lunger. Vi vil også gjerne anerkjenne hjelp fra Media Preparation Facility i School of Life Sciences ved University of Warwick, med spesiell takk til Cerith Harries og Caroline Stewart, og hjelp av Anita Catherwood ved Warwick Antimicrobial Screening Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
| 24-well culture plates | |||
| 70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
| Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
| Agarose | |||
| Aluminum foil - pre-sterilised by autoclaving - to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
| Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
| Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
| Bunsen burner | |||
| Chopping board - we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
| Coolbox to transport lungs to lab | |||
| Dissection scissors in different sizes | |||
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
| Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
| Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
| Germicidal UV cabinet | |||
| Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
| Large pallet knife | |||
| LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
| Mounted razor blades | |||
| Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
| Petri dishes | |||
| Phosphate-buffered saline | |||
| Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
| SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
| Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
| Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
| Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |
References
- Elborn, J. S.
- Høiby, N., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 125, 339-343 (2017).
- Bjarnsholt, T., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).
- Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. 20 (4), 5286 (2015).
- Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients. Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O'Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).
- Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).
- Drevinek, P., et al. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 8, 121 (2008).
- Goerke, C., Wolz, C. Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection. International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).
- Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
- Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).
- Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).
- Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).
- Trust, C. F. Annual Data Report 2019. , (2019).
- Angelis, A., et al. Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom. BMC Health Services Research. 15 (1), 428 (2015).
- Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany. Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).
- Longitude Prize. , Available from: http://longitudeprize.org (2020).
- Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. Building a better biofilm - Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection. Biofilm. 2, 100024 (2020).
- Harrison, F., Diggle, S. An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).
- Sweeney, E., et al. An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection. Microbiology. , DOI: 10.1099/mic.0.000987 (2020).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists. Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).
- Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).
- Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).
- Ager, S., Gould, K. Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).
- Kirchner, S., et al. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 8.0. , Available from: www.eucast.org (2020).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. , Available from: http://www.eucast.org (2020).
