Summary
هنا الأساليب المستخدمة لدراسة التأثير الوظيفي للطفرات RYR1 أعرب عنها محليا في فيروس إبشتاين بار خلدت الإنسان B-الخلايا الليمفاوية وخزعة العضلات المستمدة من خلايا الأقمار الصناعية المتمايزة في myotubes توصف.
Abstract
وقد تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات في الجين RYR1 في المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيثة التعرض, اعتلال عضلي الأساسية واعتلال عضلي سنترونوي. بسبب الأنماط الظاهرية المتنوعة المرتبطة بطفرات RYR1 ، من الأساسي توصيف آثارها الوظيفية لتصنيف المتغيرات التي يحملها المرضى للتدخلات العلاجية المستقبلية وتحديد المتغيرات غير المسببة للأمراض. وقد اهتمت العديد من المختبرات بتطوير طرق لتوصيف وظيفيا طفرات RYR1 المعبر عنها في خلايا المرضى. هذا النهج له العديد من المزايا، بما في ذلك: يتم التعبير عن الطفرات الذاتية، RyR1 لا يتم التعبير عن أكثر من ذلك، يتم تجنب استخدام الخلايا التعبير عن heterologous RyR1. ومع ذلك ، لأن المرضى قد يقدمون طفرات في جينات مختلفة جانبا RYR1 ، فمن المهم مقارنة النتائج من المواد البيولوجية من الأفراد الذين يأوون نفس الطفرة ، مع خلفيات وراثية مختلفة. تصف المخطوطة الحالية الطرق التي تم تطويرها لدراسة الآثار الوظيفية لمتغيرات RYR1 المعبر عنها محليا في: (أ) خلد فيروس إبشتاين بار الخلايا الليمفاوية B البشرية و(ب) الخلايا الساتلية المشتقة من خزعات العضلات والمتمايزة في الميوتوب. ثم يتم رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجمة عن إضافة المنشطات RyR1 الدوائية. يتم تحميل نوع الخلية المحددة بمؤشر الكالسيوم الفلوري الفلورسنت النسبة ويتم رصد التغيرات داخل الخلايا [Ca2+] إما على مستوى الخلية الواحدة عن طريق المجهر الفلوري أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الطيف. يستريح [Ca2 +] ، ثم تتم مقارنة منحنيات استجابة الجرعة الناهضة بين الخلايا من الضوابط الصحية والمرضى الذين يؤوون المتغيرات RYR1 مما يؤدي إلى نظرة ثاقبة التأثير الوظيفي للمتغير معين.
Introduction
حتى الآن تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات RYR1 في السكان البشرية وربطها باضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيث (MHS)، ممارسة انحلال الربيدات المستحثة، الأمراض الأساسية المركزية (CCD)، مرض متعدد النوى (MmD)، اعتلال عضلة القلب المركزي (CNM)1،2،3 ; ومع ذلك، فإن الدراسات التي تميز آثارها الوظيفية متخلفة وتم اختبار ما يقرب من 10٪ فقط من الطفرات وظيفيا. يمكن استخدام نهج تجريبية مختلفة لتقييم تأثير متغير RyR1 معين، بما في ذلك نقل خلايا heterologous مثل HEK293 و COS-7 الخلايا مع ترميز البلازميد لWT وRYR1 متحولة cDNA4،5، نقل الخلايا الليفية الماوس خلل التنسيب مع البلازميدات وناقلات ترميز لWT وRYR1 متحولة cDNA ، تليها التحويل مع ميو دال والتمايز في myotubes6 ، جيل من نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا تحمل متحولة RyR1s7،8،9، توصيف الخلايا من المرضى الذين يعبرون عن البديل RYR1 الذاتية10،11،12. وقد ساعدت هذه الأساليب على تحديد كيفية تأثير الطفرات المختلفة وظيفيا على قناة RyR1 Ca2+ .
هنا، يتم وصف الأساليب التي تم تطويرها لتقييم الآثار الوظيفية لطفرات RYR1. يتم التحقيق في معلمات مختلفة من التوازن الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البشرية التعبير عن الذاتية قناة الكالسيوم RyR1، بما في ذلك الميوتوب وفيروس ابشتاين بار (EBV) خلدت الخلايا الليمفاوية B. يتم الحصول على الخلايا من المرضى، وتوسيع نطاقها في الثقافة وتحميلها مع النسبة الفلورسنت الكالسيوم المتهمين مثل Fura-2 أو الهندو-1. يتم قياس المعلمات التي تم الإبلاغ عن تغييرها بسبب طفرات RYR1 المسببة للأمراض بما في ذلك الراحة [Ca2 +] ، والحساسية تجاه ناهضات دوائية مختلفة وحجم مخازن Ca2 + داخل الخلايا إما على مستوى الخلية الواحدة ، باستخدام المجهر الفلوري ، أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الفلوريتر. ثم تتم مقارنة النتائج التي يتم الحصول عليها في الخلايا من ناقلات الطفرات بتلك التي تم الحصول عليها من أفراد عائلة التحكم السليم. وقد أثبت هذا النهج أن: (1) العديد من الطفرات المرتبطة MHS تؤدي إلى زيادة في يستريح [Ca2+] والتحول إلى اليسار في منحنى استجابة الجرعة إما إلى إزالة الاستقطاب الناجم عن KCl أو تنشيط RyR1 الدوائية مع 4-chloro-m-cresol10,11,12,13; '2' الطفرات المرتبطة اتفاقية مكافحة الارتهاق تؤدي إلى انخفاض في الذروة [Ca2 +] صدر عن طريق التنشيط الدوائي من RyR1 وانخفاض حجم إذا كان Ca2 + داخل الخلية مخازن12،13،14،15؛ '3' بعض المتغيرات لا تؤثر على Ca2 + التوازن13. مزايا هذا النهج التجريبي هي: بروتين RyR1 ليس مفرطا في التعبير والمستويات الفسيولوجية موجودة ، ويمكن تخليد الخلايا (كل من خلايا العضلات والخلايا الليمفاوية B) التي توفر خطوط الخلايا التي تحتوي على طفرات. بعض المساوئ تتعلق بحقيقة أن المرضى قد تحمل الطفرات في أكثر من جين واحد ترميز البروتينات المشاركة في التوازن الكالسيوم و / أو اقتران انكماش الإثارة (ECC) وهذا قد يعقد الاستنتاجات التجريبية. على سبيل المثال، تم تحديد اثنين من المتغيرات JP-45 في MHS والسكان السيطرة وتبين وجودها للتأثير على حساسية مستقبلات ثنائي هيدروبيريدين (DHPR) لتنشيط16. ويحتاج المرضى إلى أن يكونوا متاحين، وإلى جمع المواد البيولوجية حديثا، وإلى الحصول على تصاريح أخلاقية من المجالس الأخلاقية المحلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكولات المذكورة أدناه تتوافق مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية من Ethikkommission Nordwest - أوند Zentralschweiz EKNZ.
1. إعداد إبشتاين بار خلدت خطوط خلايا الخلايا الليمفاوية B11
- بعد الموافقة المستنيرة، اجمع 30 مل من الدم الكامل في أنابيب معقمة معالجة من EDTA من البروباند الذي يحمل طفرة RYR1 ومن أفراد الأسرة الأصحاء دون طفرة.
ملاحظة: حافظ على جميع الحلول معقمة واعمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. - عزل الخلايا أحادية النوى من الدم كله بواسطة وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة (على سبيل المثال، Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
- ضع 30 مل من الدم العقيم في أنبوب معقم مخروطي سعة 50 مل.
- ضع طرف ماصة باستور التي تحتوي على وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة في الجزء السفلي من الأنبوب وطبقة 20 مل معقمة من محلول وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ببطء تحت الدم.
- جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 900 × ز عند 18°-20 درجة مئوية، دون انقطاع.
ملاحظة: تظهر طبقة الخلية أحادية العدد كحلقة غائمة عند الطور الفاصل بين طبقة وسائط الطرد المركزي المتدرجة للكثافة والطبقة العليا التي تحتوي على البلازما الغنية بالصفائح الدموية.
- مع ماصة معقمة بلطف إزالة طبقة بين المراحل التي تحتوي على خلايا أحادية نووية (حوالي 3-5 مل) ونقل الحل إلى أنبوب مخروطي معقم نظيف 50 مل.
- إضافة 20 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لشطف الخلايا، والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 600 × ز في درجة حرارة الغرفة وإعادة إنفاق بيليه في برنامج تلفزيوني. كرر ما مجموعه ثلاث مرات؛ وهذا يضمن إزالة كافة الوسائط.
- بعد الغسيل الأخير ، إعادة الإنفاق الخلايا في 1-2 مل من الأنسجة المتوسطة (RPMI المتوسطة تكملها 10 ٪ مصل العجل الجنيني ، 2 م ل الجلوتامين ، و 100 وحدة من البنسلين والستريبتوميسين). ضع خلايا أحادية نووية (حوالي 1 × 106 خلايا) في قارورة زراعة الأنسجة T125 التي تحتوي على 20 مل من متوسط زراعة الأنسجة.
- تصيب الخلايا أحادية النووية بفيروس إبشتاين بار.
- استخدام المضادات الفائقة من B95.8 ثقافاتخط الخلية (التي تحتوي على 10 2-103 وحدات تحويل / مل مخزنة في -80 درجة مئوية) كمصدر لEBV.
- Resuspend 1 × 106 خلايا أحادية نووية من الخطوة 1.5 في 20 مل من الأنسجة المتوسطة والثقافة ويعرضها ل2 مل من supernatant من خط الخلية B95.8 في وجود السيكلوسبورين A (0.2 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) للعدوى.
- ضع القارورة في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية والسماح للخلايا بالنمو. بعد أسبوع واحد تغيير الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: بمجرد أن تبدأ الخلايا B في الانتشار ، فإنها تشكل كتلا يمكن التعرف عليها وتنمو بسرعة بحيث يمكن توسيع الثقافات وتجميدها. - استخراج الحمض النووي الجينومي من EBV خلدت خطوط الخلية B-الليمفاوية11 لتأكيد وجود أو عدم وجود طفرة معينة.
2. قياسات Ca2+ داخل الخلايا
ملاحظة: يمكن رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في خطوط خلايا الخلايا الليمفاوية B-lymphocyte المحولة من EBV في مجموعات الخلايا، مع مقياس الطيف المجهز بحامل التحريك المغناطيسي والكوفيت الذي تم ضبطه على 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك يمكن رصد التغيرات Ca2 + في خلايا واحدة عن طريق المجهر الفلوري. في كلتا الحالتين تتم إزالة الخلايا من قارورة زراعة الأنسجة، وغسلها مرتين مع محلول كريبس رينغر (140 mM NaCl، 5 mM KCl، 1 mM MgCl2، 20 mM HEPES، 1 mM NaHPO4، 5.5 mM الجلوكوز، pH 7.4 تحتوي على 1 mM CaCl2) وتحسب .
- للتجارب في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الطيف11،13،14
- خلايا ريسوسبند بتركيز نهائي من 1 × 107 خلايا / مل في محلول كريبس رينغر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع تركيز نهائي من 5 ميكرومتر Fura-2/AM.
- خلايا الطرد المركزي في 900 x ز لمدة 10 دقيقة وإعادة إنفاقها في محلول كريبس رينغر بتركيز 2 × 106 خلايا / مل.
- قياس التغيرات الفلورية (نسبة 340/380 نانومتر) باستخدام مقياس الطيف مجهزة ستيرر المغناطيسي تعيين في السرعة القصوى وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
- قبل التجربة تدور الخلايا في 900 × ز لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد الدقيق وإعادة إنفاق بيليه بسرعة في 1.5 مل من الحل كريبس رينغر مع 0.5 M M EGTA ولكن لا وأضاف كا2 +.
- ضع الخلايا في 3 مل من الطيف الزجاجي ومقياس الطيف وسجل نسبة الفلورسينس (340 نانومتر/380 نانومتر من الإثارة، انبعاث 510 نانومتر).
- تحقيق خط قاعدة مستقرة (حوالي 30 ثانية)، إضافة تركيز مختارة من ناهض RyR1 (4-chloro-m-cresol، أو 4-cmc) وتسجيل عابر الكالسيوم.
ملاحظة: يتم استخدام محلول مخزون 300 مللي متر من 4 cmc في DMSO كمكشف البداية. يمكن إجراء هذا الحل مقدما، aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. - إجراء تجارب لتركيزات 4 cmc مختلفة.
ملاحظة: تشمل 75 ميكرومتر، 150 ميكرومتر، 300 ميكرومتر، 450 ميكرومتر، 600 ميكرومتر، 750 ميكرومتر إلى 1 م لتوليد منحنى استجابة الجرعة من ناهض مقابل تغيير في [Ca2+]. يتم الحصول على تركيزات 4 cmc المختلفة عن طريق إضافة الحجم المناسب من 4 cmc من محلول المخزون ، مباشرة إلى cuvette التي تحتوي على الخلايا المحملة Fura-2. على سبيل المثال، لتركيز نهائي من 300 ميكرومتر 4-cmc، يتم إضافة 1.5 ميكرولتر من محلول المخزون إلى cuvette التي تحتوي على 1.5 مل من الخلايا في محلول كريبس رينغر. بالنسبة للتركيزات الناهضة المنخفضة، يجب تخفيف محلول مخزون 300 مللي متر إلى 75 مللي متر مع DMSO وإضافة الحجم المناسب إلى الكوفيت الذي يحتوي على 1.5 مل من الخلايا في محلول كريبس رينغر. - إضافة 400 nM thapsigargin إلى الخلايا لحساب المبلغ الإجمالي للCa2 + موجودة في مخازن داخل الخلايا. سجل ذروة Ca2+.
- رسم ذروة الكالسيوم الناجم عن تركيز 4 cmc معين مقابل ذروة الكالسيوم الناجم عن thapsigargin، والذي يعتبر 100٪ وبناء منحنى استجابة جرعة 4 cmc مقارنة الخلايا من proband وقريب صحي
- للتجارب على خلايا مفردة13
- تمييع بولي-L-ليسين 1:10 في H2O معقمة وقبل علاج الأغطية الزجاجية لمدة 30 دقيقة. السماح للهواء الجاف تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة العقيمة.
- إعادة تعليق EBV تحويل الخلايا الليمفاوية B إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل في محلول كريبس رينغر التي تحتوي على 1 mM CaCl2 وإضافة تركيز نهائي من 5 ميكرومتر Fura-2/AM.
- ضع 1 مل من الخلايا على الأغطية المعالجة بولي-ل-ليسين واحتضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلايا الرطبة لمدة 30 دقيقة للسماح لخلايا EBV بالتمسك بزلة الغطاء الزجاجي أثناء التحميل.
- ضع غطاء في غرفة التشوه وابدأ التشوه (بمعدل 2 مل/دقيقة) مع محلول كريبس رينغر الذي يحتوي على 1 mM Ca2+.
- استخدم مجهر فلوري مقلوب (مجهز بهدف غمر الزيت 40x (فتحة رقمية 0.17)، والمرشحات (BP 340/380، FT 425، BP 500/530) لتسجيل القياسات عبر الإنترنت، مع مرفق كاميرا جهاز اقتران الشحنة التي يتم التحكم فيها بالبرامج (CCD).
- الحصول على الصور على فترات 1 ق في وقت التعرض الثابت (100 مللي ثانية لكل من 340- و 380 نانومتر أطوال موجية الإثارة. استخدم برنامج التصوير لتحليل التغيرات في الفلورسينس. قياس متوسط قيمة بكسل لكل خلية في أطوال موجية الإثارة من 340 و 380 نانومتر13.
- لتحقيق تحفيز الخلية، استخدم محفز تغلغل الخلية مع 12 صماما وإضافة تركيزات مختلفة من 4 cmc. صمام تدفق يحتوي على حل كريبس رينغر مع عدم إضافة Ca2 + بالإضافة إلى 100 μM La3 + لمراقبة إطلاق الكالسيوم من المتاجر داخل الخلايا فقط.
- بناء منحنى استجابة الجرعة من 4 cmc مقابل التغيير في [Ca2 +] ، كما هو موضح أعلاه.
3. إعداد myotubes الإنسان من خزعات العضلات10،12،15
ملاحظة: استخدمت مختبرات مختلفة أساليب مختلفة للحصول على الخلايا الميوبلاستة الميوباتية المشتقة بالخلايا الساتلية والميوتوب. وفيما يلي وصف للطريقة المستخدمة في بازل.
- شطف خزعة العضلات مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم الزائد وقطع إلى شظايا صغيرة من حوالي 0.5-1 ملم.
- إعداد 6 أطباق زراعة الأنسجة جيدا مع إدراج. إضافة 1.5 مل من نمو العضلات البشرية المتوسطة لكل بئر و 0.5 مل من نمو العضلات البشرية المتوسطة لكل إدراج.
ملاحظة: يتكون متوسط النمو على النحو التالي: 500 مل من متوسط النسر المعدل في Dulbecco مع ارتفاع الجلوكوز، أو DMEM (4.5 ملغم / مل) ، تحتوي على مصل حصان 10 ٪ ، 5 نانوغرام / مل الأنسولين ، 3 مللي متر الجلوتامين ، 600 نانوغرام / مل البنسلين G والستريبتوميسين ، و 7 M HEPES ، درجة الحموضة 7.4. ويمكن أيضا المتاحة تجاريا الهيكل العظمي نمو العضلات المتوسطة يمكن استخدامها. - ضع 2-3 شظايا العضلات الصغيرة في كل إدراج (الشكل 1A) ووضع أطباق الثقافة في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية). بعد ما يقرب من 8-10 أيام يمكن رؤية خلايا الأقمار الصناعية تنمو من ومحيط خزعة العضلات، تعلق على إدراج(الشكل 1،B و C، والسهام).
- إطلاق عدد كاف من الخلايا من الخزعة (بعد حوالي 10-14 يوما)، حاول على النحو التالي:
- إزالة كل ثقافة المتوسطة، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 0.5 مل من حل تريبسين / EDTA (0.025٪ تريبسين و 0.01٪ EDTA) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من متوسط النمو إلى الخلايا لتحييد تأثير التريبسين ونقل خلايا الأقمار الصناعية إلى قارورة جديدة لثقافة الخلايا T25؛ إضافة 3 مل من متوسط النمو ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
- تغيير متوسط النمو في اليوم التالي لإزالة EDTA وتغيير المتوسط مرة واحدة في الأسبوع.
- عندما تكون الخلايا الميوبلاستية التقاء 75٪ تقريبا، جرب ونقلها إلى غطاء الزجاج المعالج بالنعناع.
ملاحظة: كنسبة، يجب نقل الخلايا التي تنمو في قارورة T25 واحدة على غطاء زجاجي واحد معالج بالنعناع قطره 43 مم. يجب وضع غطاء الزجاج داخل لوحة زراعة الأنسجة قطرها 60 ملم تحتوي على 3 مل من متوسط النمو. - تنمو الخلايا على غطاء الزجاج في المتوسط النمو في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية) تغيير المتوسط مرة واحدة في الأسبوع. في التقاء 90٪، والتحول إلى التمايز المتوسطة تتكون على النحو التالي: ارتفاع الجلوكوز DMEM (4.5 ملغ / مل)، 0.5٪ ألبوم مصل البقري، 10 نانوغرام/ مل عامل نمو البشرة، 0.15 ملغم/مل الكرياتين، 5 نانوغرام/مل الأنسولين، 200 مللي متر الجلوتامين، 600 نانوغرام/مل البنسلين G والستريبتوميسين، و 7 مللي متر HEPES، pH 7.4). ويمكن أيضا استخدام وسيطة التمايز المتاحة تجاريا. تغيير وسيط التمايز مرة واحدة في الأسبوع.
- بعد 7-10 أيام في المتوسط التمايز، myotubes متعددة النوى مرئية. تقييم للتغيرات في [Ca2+] في غضون أسبوع واحد، كما هو موضح أدناه.
4. [Ca2 +]i قياسات النسبة المحددة مع Fura-2
- تحميل الزجاج coverlip نمت myotubes مع Fura-2/AM (التركيز النهائي من 5 ميكرومتر) المخفف في DMEM لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. لفترة وجيزة، وإزالة وسيطة التمايز من الخلايا المزروعة coverlip الزجاج وإضافة 2 مل متوسط التمايز الطازجة. إضافة 10 ميكرولتر من Fura-2 AM من محلول مخزون 1 mM واحتضان 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
- نقل الزجاج coverlip إلى غرفة التغلغل وشطف الخلايا مع محلول كريبس رينجر التي تحتوي على 2 MM CaCl2.
- إجراء قياسات على الإنترنت [Ca2+] كما هو موضح أعلاه في قسم الخلية الواحدة EBV باستخدام هدف FLUAR غمر الماء 20x (0.17 فتحة رقمية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i القياسات في مجموعات من الخلايا الليمفاوية B EBV الخالدة
الخلايا الليمفاوية B الأولية التعبير عن ايزوفورم RyR1 التي تعمل كقناة Ca2 + الافراج خلال مستقبلات مستضد الخلية B حفز عمليات الإشارات17. تخليد الخلايا B مع EBV، وهو إجراء يستخدم بشكل روتيني من قبل علماء الوراثة للحصول على خطوط الخلايا التي تحتوي على معلومات الجينوم للمرضى، ويوفر ميزة توليد خطوط الخلايا التي تعبر عن متحولة RyR1 Ca2 + قنوات في المرضى الذين يؤوون الطفرات RYR111،13. [Ca2+] أنا التغييرات الناجمة عن إضافة ناهضات RyR1 محددة مثل 4-chloro-m-cresol18 والكافيين يمكن رصدها بسهولة من أجل تحديد ما إذا كانت طفرة RYR1 معينة يغير الحساسية لناهض، وكمية الكالسيوم صدر، يستريح [Ca2 +]، أو غيرها من المعلمات التي أظهرت أن تتأثر الطفرات. [Ca2+] ويمكن رصد التغيرات أنا إما في مجموعات من الخلايا محملة Fura-2 في تعليق مع مقياس الطيف أو على مجموعات من الخلايا تعلق على الأغطية الزجاجية وفحصها عن طريق epifluorescence. ويبين الشكل 2 تجربة تمثيلية أجريت على تعليق الخلايا. مباشرة قبل وضعها في cuvette, نسج خلايا لإزالة Fura-2 التي قد تسربت; ثم أعيد إنفاق الخلايا إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل في الحارة (37 درجة مئوية) حل كريبس رينغر لا تحتوي على مزيد من Ca2 + زائد 0.5 M EGTA ووضعها في مقياس الطيف. تم تشغيل الستيرر المغناطيسي إلى الموضع 4 (أعلى موضع) للحفاظ على الخلايا في التعليق وتم تسجيل الفلورسينس. بعد الحصول على أثر مستقر، أضيف ناهض مختارة (في الشكل 2A كان هذا 300 ميكرومتر 4-chloro-m-cresol) مما أدى إلى زيادة سريعة Ca2 + التي انخفضت ببطء ثم العودة إلى مستويات الراحة. الطبيعة العابرة للتغيير في الفلورسينس مهمة لأنها تشير إلى (1) أنه ليس قطعة أثرية ناجمة عن إضافة مركب فلوري أو إخماد ، (2) أنه ليس بسبب ربط الكالسيوم ب Fura-2 خارج الخلية و (3) أن الخلايا صحية ويمكن أن تزيل الكالسيوم بنشاط من السيتوبلازم الخاص بها.
نفس التجربة تحتاج إلى تكرار عدة مرات لتحليلها إحصائيا. لكل خط الخلية وكل يوم، يتم إجراء التجارب والكمية الإجمالية من الكالسيوم الإفراج بسرعة في مخازن يحتاج إلى تحديد عن طريق إضافة مثبط SERCA thapsigargin11،13،14. كما هو مبين في الشكل 2B، فإن إضافة 400 nM thapsigargin يسبب عابر الكالسيوم كبيرة تصل إلى ذروة قيمة مضان 2.4 وحدات التعسفي (a.u.); وبالتالي فإن الكمية الإجمالية من الكالسيوم التي يمكن إطلاقها من مخازن داخل الخلايا من EBV الخالدة B- الخلايا المبينة في الشكل 2B يساوي 2.4 a.u. (ذروة thapsigargin) - 1.45 a.u. (نسبة الراحة) أو 0.95 واعتبرت هذه القيمة الفلورية 100٪ عند بناء منحنى استجابة الجرعة هو مبين في الشكل 2C.
خلية واحدة [Ca2+]i قياسات في الخلايا الليمفاوية B التي خلدها EBV
يعتمد هذا النهج الثاني على توافر مجهر مضان وميكروفوسيون تم إعداده للسماح بتحفيز خلية واحدة أو مجموعات صغيرة من الخلايا مع تركيز معين من ناهض والتسجيل المتزامن للتغيرات الفلورية. يتم تحميل المحاقن من نظام microperfusion مع تركيزات مختلفة من ناهض RyR1 مختارة (إما الكافيين أو 4-chloro-m-cresol) والتي سيتم استخدامها لتوليد منحنيات استجابة الجرعة. في المثال المبين في الشكل 3، تم تحفيز الخلايا مع الكافيين 0.5-10 mM المذاب في محلول كريبس رينغر الذي لا يحتوي على الكالسيوم المضاف بالإضافة إلى 100 ميكرومتر La3 + من أجل مراقبة إطلاق Ca2 + من المتاجر داخل الخلايا. يتم وضع الأغطية الزجاجية التي تم السماح للخلايا الليمفاوية B التي تم تحميل Fura-2 بها بإرفاقها في غرفة التشويش وتغلغلت مع محلول كريبس رينغر الذي يحتوي على 1 mM Ca2 +. معظم الخلايا قد التزمت بولي L-lysine معالجة coverslip وينبغي تحديد مجموعات صغيرة من الخلايا وفحصها لتحميل Fura-2. يتم وضع طرف نظام التغلغل بالقرب من الخلايا للاستحمام بها (وليس كل الخلايا على غطاء) مع الكافيين. عادة ما يتم تحفيز الخلايا بدءا من أدنى إلى أعلى تركيز الكافيين; لكل تركيز، يتم تحديد خلية جديدة أو مجموعة من الخلايا. يتم تسجيل قياسات الفلورسينس القياس (الإثارة في 340 نانومتر و 380 نانومتر، والانبعاثات في 510 نانومتر) كل ثانية لمدة تصل إلى 2 دقيقة. يتم الحصول على عدد قليل من الصور قبل التغلغل من أجل الحصول على خط أساس ثابت ، في وقت لاحق يتم بدء تغلغل الخلايا ، أولا عن طريق مسح الخلايا مع حل محلول كريبس رينجر الذي يحتوي على 100 μM La3 + لمدة 5 ثوان. هذا لا ينبغي أن يؤدي إلى تغيير في فلوريسنس وهو عنصر تحكم لضمان أن الخلية (ق) التمسك coverslip طوال التجربة; بعد ذلك يتم مسح محلول يحتوي على تركيز ناهض مختارة على الخلية (الخلايا). في المثال المبين في الشكل 3A، تم تحفيز الخلايا مع الكافيين 5 MM لمدة 20 ثانية. السهم هو مبين يشير إلى متى تم فتح صمام الكافيين وهذا يؤدي إلى زيادة فورية في نسبة الفلورسنت 340/380 نانومتر. بعد 20 ثانية، يغلق صمام الكافيين، ويتم مسح الخلايا مع محلول كريبس رينغر التي تحتوي على 100 ميكرومتر La3+؛ يتم تسجيل الفلورسينس حتى يتم الوصول إلى خط الأساس. لكل تركيز الكافيين و ΔF, وهذا هو ذروة الكافيين الناجمة 340/380 نانومتر مضان - يتم حساب يستريح الأولي 340/380 نانومتر مضان وتستخدم لبناء منحنى استجابة الجرعة كما هو مبين في الشكل 3B. متوسط ΔF من 5-10 خلايا متوسط لكل تركيز الكافيين. كما يمكن مراقبة كمية الكالسيوم في المتاجر داخل الخلايا. في هذه الحالة، يتم شطف الخلايا مع محلول كريبس رينغر التي تحتوي على 0.5 M M EGTA وحل 1 ميكرومتر thapsigargin، 1 ميكرومتر أيونوميسين و0.5 م EGTA يضاف باليد إلى الخلايا (وليس من خلال نظام microperfusion كما العصي الأيونوميسين إلى الأنابيب ولا يمكن غسلها) ويتم تسجيل مضان لمدة 4-5 دقائق تقريبا. لحساب ΔF، يتم الحصول على منطقة اهتمام (ROI) تحدد الخلية ويتم حساب التغيرات في الفلورسينس داخل عائد الاستثمار باستخدام برنامج التصوير.
باختصار، عند استخدام EBV خلدت الخلايا B لقياس حساسية RyR1 لناهض معين، ينبغي إجراء تجارب متكررة على خلايا من فرد واحد، في أيام مختلفة. بالنسبة للقياسات على مجموعات الخلايا ، يجب تقييم حالة مخازن الكالسيوم داخل الخلايا ويتم رسم إطلاق الكالسيوم المستحث EC50 إلى ناهض نسبة إلى إجمالي كمية الكالسيوم التي يمكن إطلاقها من المتاجر. وتتمثل إحدى مزايا استخدام هذا النهج في أن استجابة ملايين الخلايا [Ca2+]متوسطة؛ بالإضافة إلى ذلك ، لا يوجد نظام microperfusion والمجاهر الفلورية ضرورية. تسمح طريقة الخلية الواحدة باستخدام عدد أقل من الخلايا والتصور على الإنترنت للتغييرات في [Ca2+] للخلايا المحددة.
خلية واحدة [Ca2 +]I القياسات في خلية الأقمار الصناعية البشرية المستمدة myotubes
يتم تحميل الزجاج coverlip المزروعة والمتمايزة myotubes مع Fura-2، ونقلها إلى غرفة التغلغل واستحم في حل كريبس رينغر التي تحتوي على 2 MM Ca2 + كما هو موضح أعلاه لخلايا EBV. تمتلئ المحاقن من نظام التغلغل مع ناهض مختارة ويتم تحفيز myotubes كما هو موضح أعلاه. نظرا لأن الخلايا الموجودة على الغطاء ليست جميعها عبارة عن ميوتوبات متعددة النوى ، فمن المهم تحديد الخلية (الخلايا) المناسبة التي سيتم قياسها. يمكن تحفيز مجموعات صغيرة من الميوتوب في وقت واحد. في المثال المبين في الشكل 4، تم مسح myotube واحد مع محلول يحتوي على KCl ، يتم بناء تركيزات مختلفة من 4-chloro-m-cresol وأخيرا الكافيين ، ومع ذلك ، عادة ما يتم بناء منحنيات استجابة الجرعة لناهضات ، كما هو مبين في القسم السابق ، من أجل مقارنة الحساسية الناهضة للخلايا من مختلف الأفراد12،15،16 . يستخدم KCl كوسيلة لنزع الاستقطاب عن غشاء البلازما. في الهيكل العظمي، يتم استشعار إزالة الاستقطاب غشاء البلازما العضلات من قبل DHPR استشعار الجهد الذي يخضع بذلك تغيير تشكيلي مما يؤدي إلى تفعيل وفتح RyR1. من ناحية أخرى، 4-chloro-m-كريسول والكافيين هي المنشطات الدوائية المباشرة من RyR1.
الشكل 1:يتم وضعجيل من الثقافات العضلية العضلية المشتقة من خزعة العضلات البشرية الأولية. (A) يتم وضع أجزاء صغيرة من العضلات (الأسهم) في إدراج تحتوي على 0.5 مل متوسط النمو. بعد 7-14 يمكن رؤية خلايا الأقمار الصناعية (الأسهم الصغيرة) المتاخمة للأنسجة العضلية وتنمو في الجزء السفلي من إدراج. الصورة التي اتخذت من خلال هدف 10x (ب) و 20x الهدف (ج). واستخدمت الصناديق الرمادية في اللوحة A لتغطية هوية المريض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تجارب إطلاق الكالسيوم في EBV خلدت الخلايا الليمفاوية B. نسبة [Ca2+]i القياسات في مجموعة من الخلايا محملة Fura-2 في التعليق. أ) إضافة 300 ميكرومتر 4-chloro-m-cresol (السهم) يسبب زيادة فورية في السيتوبلازمي [Ca2+] ، والذي يتحلل لاحقا إلى مستويات الراحة في غضون 500 ثانية. في هذا المثال ΔF الناجمة عن إضافة 300 ميكرومتر 4-chloro-m-cresol هو 1.7 وحدات مضان- 1.4 وحدات مضان = 0.3 وحدات مضان. ب) إضافة مثبط SERCA thapsigargin (400 nM، السهم) يسبب زيادة أكبر في نسبة الفلورية Fura-2 التي تبلغ ذروتها في 2.4 وحدات مضان، وتتحلل في وقت لاحق إلى مستويات الراحة في 1.45 وحدات مضان. و thapsigargin المستحثة [Ca2 +] عابر يمثل المبلغ الإجمالي للكالسيوم الإفراج بسرعة في مخازن داخل الخلايا الموجودة في السكان الخلية. يستخدم ذروة عابرة تم الحصول عليها (2.4-1.45 = 0.95 وحدة) لحساب النسبة المئوية للكالسيوم الصادرة بتركيز معين من 4-chloro-m-cresol. ج) منحنيات الاستجابة الجرعة التمثيلية التي تربط ΔF كنسبة مئوية من إجمالي كمية الكالسيوم القابلة للافراج بسرعة في مخازن داخل الخلايا. بالنسبة ل 300 ميكرومتر 4-chloro-m-cresol، تكون هذه القيمة 0.3/0.95x100=31.6٪. يمثل كل رمز متوسط± SEM٪ من قيم 5-10 من خلايا EBV الخالدة من عنصر تحكم (دوائر مغلقة، خط منقط) وفردي MHS (مربعات مغلقة، خط مستمر) يحمل طفرة RYR1. تم إنشاء المنحنيات باستخدام وظيفة منحنى الجرعة استجابة sigmoidal. تم تكييف الفريقين A و B من جيرارد وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إطلاق Ca2+ الناجم عن الكافيين في الخلايا الليمفاوية B الفردية التي خلدها EBV من فرد التحكم. أ) لوحات أعلى، صور الفاصل الزمني(أ)المرحلة التباين؛ (B-E)، خلية واحدة [Ca2+]أنا قياسات الخلايا الليمفاوية EBV محملة 2- FURA: (B) ر = 0، (C) t = 36 s، (D) t = 50 s و (E) t = 77 s بعد تطبيق الكافيين 5 mM. تم تحفيز الخلايا بشكل فردي من خلال إضافة الكافيين المخفف في محلول كريبس رينغر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. لوحة أسفل, أثر تمثيلية تم الحصول عليها بعد تحفيز خلية واحدة مع الكافيين 5 mM (السهم). ب) منحنيات استجابة الجرعة التي تظهر التغير المعتمد على الكافيين في [Ca2+]i، معبرا عنه كتغير في نسبة الفلورسينس (نسبة الذروة 340/380 نانومتر - نسبة الراحة 340/380 نانومتر). تمثل كل نقطة متوسط ± SEM للتغيير في الفلورسينس من 4-15 خلية. تم إنشاء المنحنيات باستخدام وظيفة منحنى الجرعة استجابة sigmoidal. مربعات مغلقة، خط منقط، خلايا تحكم؛ مثلثات مغلقة، خط مستمر، MHS الفردية التي تحمل طفرة RYR1. هذا الرقم هو التكيف من Ducreuxوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إطلاق الكالسيوم حفزها KCl، 4-chloro-m-cresol والكافيين في myotubes الإنسان من فرد التحكم. اللوحات اليسرى: A) تباين المرحلة (B-H)، خلية واحدة داخل الخلية Ca2+ قياسات من الميوتوبات البشرية محملة Fura-2. ب) يستريح [Ca2+]i ; ج) ر = 2 ثانية بعد تطبيق 150 mM KCl. D) ر = 2 ثانية بعد تطبيق 150 ميكرومتر 4-chloro-m-cresol; ه) ر = 2 ثانية بعد تطبيق 300 ميكرومتر 4-الكلورو-م-كريسول; F) ر = 2 ثانية بعد تطبيق 600 ميكرومتر 4-الكلورو-م-كريسول; G) ر = 2 ق بعد تطبيق الكافيين 10 mM; ح) ر = 20 ق بعد تطبيق الكافيين. لوحة الحق: مؤامرة من الوقت (ق) مقابل نسبة الفلورسينس (340/380 نانومتر) في الخلية المحفزة. تم تحفيز Myotubes بشكل فردي من خلال إضافة ناهض في عازل كريبس-رينجر الذي يحتوي على 100 ميكرومتر La3 +، وبالتالي فإن الزيادة في [Ca2 +]أنا يمثل فقط إطلاق الكالسيوم من المتاجر داخل الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت بنجاح البروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة من قبل العديد من المختبرات لدراسة تأثير الطفرات RYR1 على التوازن الكالسيوم. وتتناول الخطوات الحاسمة للنهج المبينة في هذه الورقة العقم ومهارات وتقنيات زراعة الخلايا وتوافر المواد البيولوجية. من حيث المبدأ ، فإن استخدام الخلايا الليمفاوية B التي خلدها EBV أبسط ويسمح للمرء بتوليد خطوط الخلايا التي تحتوي على قنوات RyR1 المتحولة. يمكن تجميد الخلايا وتخزينها في النيتروجين السائل لسنوات عديدة ويمكن إعادة بدء الثقافات في أي وقت. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن يختار ما إذا كان لرصد التوازن الكالسيوم في مجموعات الخلايا أو على مستوى الخلية الواحدة. الطريقة الأولى أبسط ، لا تتطلب مجهر مضان وتسمح للمحقق باختبار خطوط الخلايا الناتجة عن أفراد مختلفين في غضون فترة قصيرة من الزمن. الحد من سرعة نمو الخلايا وتوافر مجهزة تجهيزا كاملا (ساخنة ومع stirrer المغناطيسي) الطيفية. كنهج بديل تدفق قياس الخلايا في تركيبة مع مؤشرات الكالسيوم الفلورية يمكن استخدامها لقياس تدفق الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية B EBV الخالدة; في مثل هذه الطريقة يمكن تحديد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا19. إذا كان المجهر الفلوري وغرفة التغلغل ونظام التروية الدقيقة متوفرة ، فإن تصوير الخلية الواحدة له ميزة كونه أكثر حساسية وإعطاء معلومات أكثر تفصيلا بما في ذلك تقلب الخلية إلى الخلية والتحليل الحركي وتحديد المجالات دون الخلوية المشاركة في إطلاق الكالسيوم. والنهج الأخير أكثر تحديا من الناحية التقنية ويتطلب المزيد من المعدات.
هناك مزايا متعددة لاستخدام الخلايا الليمفاوية B التي خلدها EBV ، بما في ذلك أن المعلمات الأخرى جانبا [Ca2 +]i homeostasis يمكن قياسها. على سبيل المثال 4-الكلورو-م-كريسول التحمض المستحث للخلايا B وقد استخدمت لتمييز الخلايا من الأفراد السيطرة من المرضى MHS20,21. ومع ذلك يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا (ط) أن الخلايا B لا تعبر عن العديد من البروتينات المشاركة في اقتران تقلص العضلات الهيكل العظمي التي قد تؤثر بشكل غير مباشر على إطلاق الكالسيوم، (2) فهي خلايا غير مثيرة وبالتالي لا يمكن تفعيلها من الناحية الفسيولوجية عن طريق إزالة الاستقطاب غشاء البلازما، وأخيرا تقرير من قبل مونييه وآخرون وجدت أن طفرة تم تحديدها في المريض لم يتم التعبير عنها في الخلايا B EBV الخالدة بسبب موقع لصقخفي 22.
وقد استخدمت المريض المستمدة من الثقافات خلايا العضلات الأولية من قبل العديد من المجموعات المهتمة في دراسة تأثير الطفرات في الجينات المختلفة ترميز البروتينات المشاركة في التوازن الكالسيوم10,23,24. يمكن تمييز هذه الخلايا إلى ميوتوبات متعددة النوى ، والاستجابة لإلغاء الاستقطاب في غشاء البلازما ويمكن تقييمها بوسائل كهربية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تخليدها من أجل الحصول على خطوط الخلية التي تحمل الطفرات RYR125،على الرغم من أن الإجراء هو أكثر تعقيدا بكثير من الخلايا الليمفاوية B. في حين أنه من الصحيح أيضا أن الخلايا العضلية بطيئة النمو والوقت اللازم من أخذ خزعة إلى وجود عدد كاف من الخلايا يمكن أن يكون أكثر من شهر واحد، فمن الممكن أيضا لتخزين قطع صغيرة من خزعات العضلات في تجميد المتوسطة في النيتروجين السائل من أجل الحصول على myoblasts سنوات في وقت لاحق. أوقات زراعة طويلة لديها خطر إضافي من التلوث من البكتيريا والخمائر أو قوالب وبمجرد الحصول على عدد كبير بما فيه الكفاية من الخلايا الميوبلاست، من المهم تجميد وتخزينها في النيتروجين السائل. وقد طبقت مختبرنا بنجاح نفس التقنية المبينة أعلاه لميوتوبس، لدراسة تغيرات الكالسيوم في الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري الناجمة عن الميو دي ومتمايزة في myotubes26. وقد تم ذلك لدراسة التأثير الوظيفي للطفرات RYR1 عندما العضلات المستمدة من خزعة myoblasts لم تكن متاحة. أما بالنسبة للخلايا الليمفاوية B، 4-chloro-m-cresol الناجم عن تحمض الميوتوب من المرضى الذين يعانون من طفرات RYR1 المرتبطة MHS تم اختبارها بنجاح27.
في الختام ، فإن استخدام المواد البيولوجية من المرضى لدراسة ارتباط النمط الجيني الظاهري له العديد من المزايا العيب ويمكن استخدامه بنجاح لدراسة تأثير الطفرات في RYR1. عند استخدام هذا النهج ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الطفرات الموجودة في الجينات الأخرى قد تؤثر على التوازن الكالسيوم. لذلك ، يجب إجراء استخدام خلايا من عائلات مختلفة تؤوي نفس الطفرة وكذلك من أفراد الأسرة الذين لا يأوون طفرة RYR1 كعناصر تحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة بمنح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNF) ومؤسسة العضلات السويسرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
