Функциональная характеристика эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 человека

Susan Treves; Thierry Girard; Francesco Zorzato

doi:10.3791/62196

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Функциональная характеристика эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 человека

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62196

⸱

9 июня 2021 г.

Susan Treves¹^,² , Thierry Girard³ , Francesco Zorzato¹^,²

¹Department of Biomedicine, Basel University Hospital, ²Department of Life Sciences, University of Ferrara, ³Department of Anesthesia, Basel University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.

Аннотация

Более 700 вариантов гена RYR1 были идентифицированы у пациентов с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии, основные миопатии и центроядерную миопатию. Из-за различных фенотипов, связанных с мутациями RYR1, крайне важно охарактеризовать их функциональные эффекты, чтобы классифицировать варианты, переносимые пациентами для будущих терапевтических вмешательств, и идентифицировать непатогенные варианты. Многие лаборатории были заинтересованы в разработке методов функциональной характеристики мутаций RYR1, экспрессируемых в клетках пациентов. Такой подход имеет многочисленные преимущества, в том числе: мутации эндогенно экспрессируются, RyR1 не переэкспрессируется, использование гетерологичных клеток, экспрессирующих RyR1, избегается. Однако, поскольку у пациентов могут присутствовать мутации в разных генах, кроме RYR1, важно сравнивать результаты биологического материала от людей, имеющих одну и ту же мутацию, с разным генетическим фоном. В настоящей рукописи описаны методы, разработанные для изучения функциональных эффектов эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 в: (а) вирус Эпштейна Барра увековечил человеческие В-лимфоциты и (б) клетки-сателлиты, полученные из биопсии мышц и дифференцированные в миотрубы. Затем контролируют изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением фармакологических активаторов RyR1. Выбранный тип клеток нагружается ратиометрическим флуоресцентным индикатором кальция, а внутриклеточные [Ca²⁺] изменения контролируются либо на уровне одной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием спектрофлуорометра. Затем кривые реакции агониста агониста в состоянии покоя [Ca^2+]сравниваются между клетками здорового контроля и пациентами, имеющими варианты RYR1, что приводит к пониманию функционального эффекта данного варианта.

Введение

На сегодняшний день более 700 вариантов RYR1 были идентифицированы в человеческой популяции и связаны с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии (MHS), рабдомиолиз, индуцированный физической нагрузкой, заболевание центрального ядра (CCD), многомикровое заболевание (MmD), центроядерную миопатию (CNM)^1,^2,³ ; тем не менее, исследования по характеристике их функциональных эффектов отстают, и только около 10% мутаций были протестированы функционально. Различные экспериментальные подходы могут быть использованы для оценки вли....