Summary
Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.
Abstract
Более 700 вариантов гена RYR1 были идентифицированы у пациентов с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии, основные миопатии и центроядерную миопатию. Из-за различных фенотипов, связанных с мутациями RYR1, крайне важно охарактеризовать их функциональные эффекты, чтобы классифицировать варианты, переносимые пациентами для будущих терапевтических вмешательств, и идентифицировать непатогенные варианты. Многие лаборатории были заинтересованы в разработке методов функциональной характеристики мутаций RYR1, экспрессируемых в клетках пациентов. Такой подход имеет многочисленные преимущества, в том числе: мутации эндогенно экспрессируются, RyR1 не переэкспрессируется, использование гетерологичных клеток, экспрессирующих RyR1, избегается. Однако, поскольку у пациентов могут присутствовать мутации в разных генах, кроме RYR1, важно сравнивать результаты биологического материала от людей, имеющих одну и ту же мутацию, с разным генетическим фоном. В настоящей рукописи описаны методы, разработанные для изучения функциональных эффектов эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 в: (а) вирус Эпштейна Барра увековечил человеческие В-лимфоциты и (б) клетки-сателлиты, полученные из биопсии мышц и дифференцированные в миотрубы. Затем контролируют изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением фармакологических активаторов RyR1. Выбранный тип клеток нагружается ратиометрическим флуоресцентным индикатором кальция, а внутриклеточные [Ca2+] изменения контролируются либо на уровне одной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием спектрофлуорометра. Затем кривые реакции агониста агониста в состоянии покоя [Ca2+]сравниваются между клетками здорового контроля и пациентами, имеющими варианты RYR1, что приводит к пониманию функционального эффекта данного варианта.
Introduction
На сегодняшний день более 700 вариантов RYR1 были идентифицированы в человеческой популяции и связаны с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии (MHS), рабдомиолиз, индуцированный физической нагрузкой, заболевание центрального ядра (CCD), многомикровое заболевание (MmD), центроядерную миопатию (CNM)1,2,3 ; тем не менее, исследования по характеристике их функциональных эффектов отстают, и только около 10% мутаций были протестированы функционально. Различные экспериментальные подходы могут быть использованы для оценки влияния данного варианта RyR1, включая трансфекцию гетерологичных клеток, таких как HEK293 и КЛЕТКИ COS-7 с плазмидным кодированием для WT и мутантной КДНК RYR14,5,трансдукцию диспедических фибробластов мышей с плазмидами и векторами, кодирующими WT и мутантную кДНК RYR1, с последующей трансдукцией с мио-D и дифференцировкой в миотрубы6 , генерация трансгенных животных моделей, несущих мутантные RyR1s7,8,9,характеристику клеток у пациентов, экспрессирующих вариант RYR1 эндогенно10,11,12. Такие методы помогли установить, как различные мутации функционально влияют на канал RyR1 Ca2+.
Здесь описаны методы, разработанные для оценки функциональных эффектов мутаций RYR1. Различные параметры внутриклеточного гомеостаза кальция исследуются в клетках человека, эндогенно экспрессирующих кальциевый канал RyR1, включая миотрубки и увековеченные вирусом Эпштейна Барра (EBV) В-лимфоциты. Клетки получают от пациентов, расширяют в культуре и нагружают ратиометрическими флуоресцентными индикаторами кальция, такими как Fura-2 или indo-1. Параметры, которые, как сообщалось, были изменены из-за патогенных мутаций RYR1, включая покоящуюся [Ca2+],чувствительность к различным фармакологическим агонистам и размер внутриклеточных запасов Ca2+, измеряются либо на уровне одной клетки, с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием флуориметра. Результаты, полученные в клетках от носителей мутаций, затем сравниваются с результатами, полученными от здоровых членов контрольной семьи. Этот подход продемонстрировал, что: (i) многие мутации, связанные с MHS, приводят к увеличению покоя [Ca2+]и сдвигу влево кривой реакции дозы либо к KCl-индуцированной деполяризации, либо к фармакологической активации RyR1 с 4-хлор-м-крезолом10,11,12,13; (ii) мутации, связанные с ПЗС, приводят к снижению пика [Ca2+],высвобождаемого фармакологической активацией RyR1, и уменьшению размера, если внутриклеточный Ca2+ хранит12,13,14,15; (iii) некоторые варианты не влияют на гомеостаз Ca2+13. Преимущества этого экспериментального подхода заключаются в следующем: белок RyR1 не переэкспрессирован и физиологические уровни присутствуют, клетки могут быть увековечены (как мышечные клетки, так и В-лимфоциты), обеспечивая клеточные линии, содержащие мутации. Некоторые недостатки связаны с тем, что пациенты могут нести мутации в более чем одном гене, кодирующем белки, участвующие в гомеостазе кальция и / или связи сокращения возбуждения (ECC), и это может усложнить экспериментальные выводы. Например, два варианта JP-45 были идентифицированы в MHS и контрольной популяции, и было показано, что их присутствие влияет на чувствительность рецептора дигидропиридина (DHPR) к активации16. Пациенты должны быть доступны, биологический материал должен быть собран заново, а этические разрешения должны быть получены от местных этических советов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы, описанные ниже, соответствуют этическим принципам Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Препарат Эпштейна Барра увековечил клеточные линии В-лимфоцитов11
- После информированного согласия соберите 30 мл цельной крови в обработанных ЭДТА стерильных трубках из пробанда, несущего мутацию RYR1, и у здоровых членов семьи без мутации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все растворы стерильными и работайте в вытяжке для культивирования тканей. - Выделяют мононуклеарные клетки из цельной крови с помощью сред центрифугирования с градиентом плотности (например, Ficoll-Hypaque, 0,077 г/л).
- Поместите 30 мл стерильной крови в коническую стерильную трубку объемом 50 мл.
- Поместите наконечник пипетки Пастера, содержащей градиентную центрифугированную среду плотности, на дно трубки и слой 20 мл стерильного раствора центрифугирования градиентной плотности медленно под кровью.
- Центрифуга в течение 30 мин при 900 х г при 18°-20°C, без перерыва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слой мононуклеарных клеток выглядит в виде мутного кольца на межфазе между слоем центрифугирования с градиентом плотности и верхним слоем, содержащим обогащенную тромбоцитами плазму.
- Стерильной пипеткой аккуратно удаляют межфазный слой, содержащий мононуклеарные клетки (приблизительно 3-5 мл) и переносят раствор в чистую 50 мл стерильную коническую трубку.
- Добавьте 20 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) для промывки клеток, центрифуги в течение 10 мин при 600 х г при комнатной температуре и повторно суспендируйте гранулу в PBS. Повторите в общей сложности три раза; это гарантирует, что все носители будут удалены.
- После последней промывки повторно суспендируют клетки в 1-2 мл тканевой культуральной среды (среда RPMI дополнена 10% сывороткой для телят плода, 2 мМ L-глутамина и 100 единицами пенициллина и стрептомицина). Поместите мононуклеарные клетки (приблизительно 1 х 106 клеток) в колбу для культивирования тканей T125, содержащую 20 мл питательной среды ткани.
- Инфицировать мононуклеарные клетки вирусом Эпштейна-Барра.
- В качестве источника ВЭБ используют супернатанты из культур клеточных линий B95.8 (содержащих 102-10 3 трансформаторных единиц/мл при -80 °C).
- Повторно суспендировать 1 х10 6 мононуклеарных клеток со стадии 1,5 в 20 мл тканевой культуральной среды и подвергать их воздействию 2 мл супернатанта из клеточной линии B95,8 в присутствии циклоспорина А (конечная концентрация 0,2 мкг/мл) для инфекции.
- Поместите колбу в инкубатор для культивирования клеток при температуре 37 °C и дайте клеткам расти. Через неделю меняют культуральную среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только В-клетки начинают размножаться, они образуют узнаваемые сгустки и быстро растут, так что культуры могут быть расширены и заморожены. - Извлечение геномной ДНК из увековеченных клеточных линий В-лимфоцитов В-лимфоцитов11 для подтверждения наличия или отсутствия данной мутации.
2. Внутриклеточные измерения Ca2+
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения внутриклеточной концентрации кальция в клеточных линиях В-лимфоцитов, трансформированных в ВЭБ, могут контролироваться в клеточных популяциях с помощью спектрофлуорометра, оснащенного магнитной мешалкой и держателем кюветы, установленным на 37 °C. Альтернативно, изменения Ca2+ могут контролироваться в отдельных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. В обоих случаях клетки извлекают из колбы культуры тканей, дважды промывают раствором Кребса Рингера (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2,20 мМ HEPES, 1 мМ NaHPO4,5,5 мМ глюкозы, рН 7,4, содержащий 1 мМ CaCl2)и подсчитывают.
- Для экспериментов в клеточных популяциях с использованием спектрофторометра11,13,14
- Повторно суспендируют клетки в конечной концентрации 1х 10 7 клеток/мл в растворе Кребса Рингера и инкубируют при 37°С в течение 30 мин с конечной концентрацией 5 мкМ Фура-2/АМ.
- Центрифужные ячейки при 900 х г в течение 10 мин и повторное их суспендирование в растворе Кребса Рингера в концентрации 2 х 106 клеток/мл.
- Измерьте изменения флуоресценции (соотношение 340/380 нм) с помощью спектрофлуорометра, оснащенного магнитной мешалкой, установленной на максимальной скорости и установленной на 37 °C.
- Непосредственно перед экспериментом раскрутит клетки на 900 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге и быстро повторно суспендирует гранулу в 1,5 мл раствора Кребса Рингера с 0,5 мМ EGTA, но без добавления Ca2+.
- Поместите ячейки в стеклянную спектрофлуорометрическую кювету емкостью 3 мл и запишите коэффициент флуоресценции (возбуждение 340 нм/380 нм, эмиссия 510 нм).
- Достигните стабильной базовой линии (приблизительно 30 секунд), добавьте выбранную концентрацию агониста RyR1 (4-хлор-м-крезол или 4-cmc) и запишите переходный кальций.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве исходного реагента используется 300 мМ запасной раствор 4-cmc, изготовленный в ДМСО. Этот раствор можно сделать заранее, аликвотировать и хранить при -20 °C в течение нескольких месяцев. - Проводите эксперименты для различных концентраций 4-cmc.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включить 75 мкМ, 150 мкМ, 300 мкМ, 450 мкМ, 600 мкМ, 750 мкМ до 1 мМ для получения кривой реакции агониста дозы в сравнении с изменением [Ca2+]. Различные концентрации 4-cmc получают путем добавления соответствующего объема 4-cmc из исходного раствора непосредственно в кювету, содержащую нагруженные ячейки Fura-2. Например, для конечной концентрации 300 мкМ 4-cmc 1,5 мкл исходного раствора добавляют к кювете, содержащей 1,5 мл клеток в растворе Кребса Рингера. Для более низких концентраций агонистов исходный раствор 300 мМ следует разбавить до 75 мМ дМСО и добавить соответствующий объем в кювету, содержащую 1,5 мл клеток в растворе Кребса Рингера. - Добавьте 400 нМ тапсигаргина к клеткам, чтобы рассчитать общее количество Ca2+, присутствующего во внутриклеточных запасах. Запишите пик Ca2+.
- Построить график пика кальция, индуцированного заданной концентрацией 4-cmc, по сравнению с пиком кальция, индуцированным тапсигаргином, который считается 100%, и построить кривую реакции дозы 4-cmc, сравнивая клетки из пробанда и здорового родственника
- Для экспериментов на одиночных клетках13
- Разбавить поли-L-лизин 1:10 в стерильномH2Oи предварительно обработать стеклянные крышки в течение 30 мин. Дайте высохнуть на воздухе под стерильной культуральной вытяжкой.
- Повторно суспендировать EBV-трансформированные В-лимфоциты до конечной концентрации 1х 10 6 клеток/мл в растворе Кребса Рингера, содержащем 1 мМ CaCl2, и добавить конечную концентрацию 5 мкМ Fura-2/AM.
- Поместите 1 мл клеток на обработанные поли-L-лизином покровы и инкубируйте при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут, чтобы клетки EBV прилипали к стеклянному покровному листу во время загрузки.
- Поместите крышку в перфузионную камеру и начните перфузию (со скоростью 2 мл/мин) раствором Кребса Рингера, содержащим 1 мМ Ca2+.
- Используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп (оснащенный 40-кратным масляным иммерсионным объективом (числовая апертура 0,17), фильтры (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) для записи онлайн-измерений с программным управлением камерой с зарядовой связью (ПЗС).
- Получение изображений с интервалом 1 с фиксированной экспозицией (100 мс для длин волн возбуждения 340 и 380 нм). Используйте программное обеспечение для визуализации для анализа изменений флуоресценции. Измерьте среднее значение пикселя для каждой ячейки при длинах волн возбуждения 340 и 380 нм13.
- Для достижения стимуляции клеток используйте стимулятор перфузии клеток с 12 клапанами и добавляйте различные концентрации 4-cmc. Промывочный клапан содержит раствор Кребса Рингера без добавления Ca2+ плюс 100 мкМ La3+ для контроля высвобождения кальция только из внутриклеточных запасов.
- Построить кривую реакции дозы 4-cmc в сравнении с изменением [Ca2+],как описано выше.
3. Подготовка миотруб человека из биопсии мышц10,12,15
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лаборатории использовали различные методы для получения миобластов и миотуб, полученных из спутниковых клеток. Ниже приведено описание метода, используемого в Базеле.
- Промыть биопсию мышц стерильным PBS для удаления лишней крови и разрезать на мелкие фрагменты размером около 0,5-1 мм.
- Приготовьте 6 блюд для посева тканей с помощью вкладыша. Добавьте 1,5 мл среды роста мышц человека к каждой лунке и 0,5 мл среды роста мышц человека к каждой вставке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда состоит из 500 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's с высоким содержанием глюкозы или DMEM (4,5 мг / мл), содержащей 10% конской сыворотки, 5 нг / мл инсулина, 3 мМ глутамина, 600 нг / мл пенициллина G и стрептомицина и 7 мМ HEPES, рН 7,4. Также может быть использована коммерчески доступная среда для роста скелетных мышц. - Поместите 2-3 небольших мышечных фрагмента в каждуювставку (рисунок 1А)и поместите чашки для культивирования в инкубатор клеточных культур (5% CO2,37 °C). Примерно через 8-10 дней можно увидеть, как клетки-сателлиты растут из и вокруг биопсии мышц, прикрепленной к вставке(рисунок 1,B и C, стрелки).
- Высвободите достаточное количество клеток из биопсии (примерно через 10-14 дней), трипсинизируют следующим образом:
- Удалить всю культуральную среду, промыть клетки один раз 1 мл PBS, добавить 0,5 мл раствора трипсина/ЭДТА (0,025% трипсина и 0,01% ЭДТА) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавить 1 мл питательной среды к клеткам для нейтрализации эффекта трипсина и перенести клетки-сателлиты в новую колбу для культуры клеток Т25; добавить 3 мл питательной среды и поместить клетки в инкубатор клеточной культуры (5% CO2,37 °C).
- Измените питательную среду на следующий день, чтобы удалить ЭДТА, а затем измените среду один раз в неделю.
- Когда миобласты будут примерно на 75% сливаться, попробуйте и перенесите их на обработанные ламинином стеклянные крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве пропорции клетки, растущие в одной колбе T25, должны быть перенесены на одну стеклянную крышку диаметром 43 мм. Стеклянная крышка должна быть помещена в тканевую культуральную пластину диаметром 60 мм, содержащую 3 мл питательной среды. - Выращивайте клетки на стеклянном покровном листе в питательной среде в инкубаторе клеточной культуры (5% CO2,37 °C), меняя среду один раз в неделю. При 90% слиянии переходят на дифференцировочную среду, состоящую из следующих: высокий уровень глюкозы DMEM (4,5 мг/мл), 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, креатин 0,15 мг/мл, инсулин 5 нг/мл, 200 мМ глутамина, 600 нг/мл пенициллина G и стрептомицина и 7 мМ HEPES, рН 7,4). Также может быть использована коммерчески доступная дифференциационная среда. Меняйте дифференцирующую среду один раз в неделю.
- Через 7-10 дней в дифференцирующей среде видны многоядерные миотрубки. Оцените изменения в [Ca2+] в течение одной недели, как описано ниже.
4. [Ca2+] измерения соотношенияi, определяемые с помощью Fura-2
- Загрузить стеклянные покровы, выращенные миотрубами с Фура-2/АМ (конечная концентрация 5 мкМ), разбавленными в ДМЭМ в течение 30 мин при 37 °С. Вкратце, удалите дифференцировочную среду из стеклянных покровных клеток и добавьте 2 мл свежей дифференцировочной среды. Добавьте 10 мкл Fura-2 AM из исходного раствора 1 мМ и инкубируйте 30 мин в инкубаторе клеточной культуры (5% CO2,37 °C).
- Переложите стеклянную крышку в перфузионную камеру и промойте ячейки раствором Кребса Рингера, содержащим 2 мМ CaCl2.
- Выполняйте онлайн-измерения [Ca2+],как описано выше в одноэлементном разделе EBV с использованием объектива FLUAR с погружением в воду 20x (числовая апертура 0,17).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i измерения в популяциях УВ-увековеченных В-лимфоцитов
Первичные В-лимфоциты экспрессируют изоформу RyR1, которая функционирует как канал высвобождения Ca2+ во время сигнальных процессов, стимулируемых рецептором антигена В-клеток17. Увековечение В-клеток с помощью ВЭБ, процедура, обычно используемая генетиками для получения клеточных линий, содержащих геномную информацию пациентов, обеспечивает преимущество генерации клеточных линий, которые экспрессируют мутантные каналы RyR1 Ca2+ у пациентов с мутациями RYR111,13. [Около2+] Изменения, вызванные добавлением специфических агонистов RyR1, таких как 4-хлор-м-крезол18 и кофеин, можно легко контролировать, чтобы установить, изменяет ли данная мутация RYR1 чувствительность к агонисту, количество высвобождаемого кальция, остаток [Ca2+] или другие параметры, на которые повлияли мутации. [Около2+] Изменения могут контролироваться либо в популяциях нагруженных клеток Fura-2 в суспензии с помощью спектрофлуорометра, либо на группах клеток, прикрепленных к стеклянным покровам и исследованных путем эпифлуоресценции. На рисунке 2 показан репрезентативный эксперимент, проведенный на клеточных суспензиях. Непосредственно перед помещением в кювету клетки были раскручены, чтобы удалить Fura-2, который, возможно, просочился наружу; Затем клетки повторно суспендировали до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл в теплом (37°C) растворе Кребса Рингера, не содержащем дополнительного Ca2+ плюс 0,5 мМ EGTA, и помещали в спектрофторометр. Магнитную мешалку включали в положение 4 (самое высокое положение) для удержания клеток в суспензии и регистрировали флуоресценцию. После получения стабильного следа добавляли выбранный агонист (на рисунке 2А это было 300 мкМ 4-хлор-м-крезола), что приводило к быстрому увеличению Ca2+, которое затем медленно снижалось обратно к уровням покоя. Переходный характер изменения флуоресценции важен, поскольку он указывает на то, что (i) это не артефакт, вызванный добавлением флуоресцентного или закалочного соединения, (ii) что это не связано с связыванием кальция с внеклеточной Fura-2 и (iii) что клетки здоровы и могут активно удалять кальций из своей цитоплазмы.
Один и тот же эксперимент нужно повторить несколько раз, чтобы проанализировать статистически. Для каждой клеточной линии и каждого дня проводятся эксперименты и общее количество быстро высвобождаемого кальция в запасах необходимо определить путем добавления ингибитора SERCA тапсигаргина11,13,14. Как показано на фиг.2В,добавление 400 нМ тапсигаргина вызывает большой кальциевый переходный процесс, достигающий пикового значения флуоресценции 2,4 произвольных единиц (а.е.); таким образом, общее количество кальция, которое может быть высвобождено из внутриклеточных запасов УВ-увековеченных В-клеток, показанных на рисунке 2B, равно 2,4 а.е. (пик тапсигаргина) - 1,45 а.е. (коэффициент покоя) или 0,95 Это значение флуоресценции считалось 100% при построении кривой дозового ответа, показанной на рисунке 2C.
Одноклеточные [Ca2+]i измерения в УВ-увековеченных В-лимфоцитах
Этот второй подход основан на наличии флуоресцентного микроскопа и микроперфузионной установки, позволяющей стимулировать одну клетку или небольшие группы клеток с заданной концентрацией агониста и одновременную регистрацию флуоресцентных изменений. Шприцы системы микроперфузии нагружаются различными концентрациями выбранного агониста RyR1 (либо кофеина, либо 4-хлор-м-крезола), который будет использоваться для генерации кривых реакции дозы. В примере, показанном на Фиг.3,клетки стимулировали 0,5-10 мМ кофеина, растворенного в растворе Кребса Рингера, не содержащем добавленного кальция плюс 100 мкМ La3+, чтобы контролировать высвобождение Ca2+ из внутриклеточных запасов. Стеклянные крышки, на которые можно было прикреплять нагруженные Fura-2 Увековеченные EBV-увековеченные В-лимфоциты, помещаются в перфузионную камеру и перфузируют раствором Кребса Рингера, содержащим 1 мМ Ca2+. Большинство клеток будут прилипать к покрытию, обработанному поли-L-лизином, и небольшие группы клеток должны быть идентифицированы и проверены на нагрузку Fura-2. Кончик перфузионной системы помещается близко к клеткам, чтобы омыть их (а не все клетки на крышке) кофеином. В норме клетки стимулируются от самой низкой до самой высокой концентрации кофеина; для каждой концентрации выбирается новая ячейка или группа клеток. Измерения ратиометрической флуоресценции (возбуждение при 340 нм и 380 нм, излучение при 510 нм) регистрируются каждую секунду в течение 2 мин. Перед перфузией получают несколько изображений с целью получения устойчивого исходного уровня, впоследствии инициируется перфузия клеток, сначала путем промывки клеток раствором раствора Кребса Рингера, содержащего 100 мкМ La3+, в течение 5 секунд. Это не должно приводить к изменению цветения и является контролем, гарантирующим, что клетка (клетки) прилипает к покровному листу на протяжении всего эксперимента; впоследствии раствор, содержащий выбранную концентрацию агониста, смывают над клеткой (клетками). В примере, показанном на рисунке 3А,клетки стимулировали 5 мМ кофеина в течение 20 секунд. Показанная стрелка указывает, когда был открыт кофеиновый клапан, и это приводит к немедленному увеличению флуоресцентного соотношения 340/380 нм. Через 20 секунд кофеиновый клапан закрывается, и клетки промывают раствором Кребса Рингера, содержащим 100 мкМ La3+; флуоресценция регистрируется до тех пор, пока не будет достигнут исходный уровень. Для каждой концентрации кофеина рассчитывается ΔF, то есть индуцированный кофеином пик флуоресценции 340/380 нм - начальная флуоресценция в состоянии покоя 340/380 нм рассчитывается и используется для построения кривой дозового ответа, как показано на рисунке 3B. Средний ΔF из 5-10 клеток усредняется для каждой концентрации кофеина. Количество кальция во внутриклеточных запасах также можно контролировать. В этом случае клетки промывают раствором Кребса Рингера, содержащим 0,5 мМ EGTA и раствором из 1 мкМ тапсигаргина, 1 мкМ иономицина и 0,5 мМ EGTA добавляют вручную в клетки (не через систему микроперфузии, поскольку иономицин прилипает к трубке и не может быть смыт), и флуоресценция регистрируется в течение примерно 4-5 мин. Для расчета ΔF получается интересующая область (ROI), описывающая ячейку, и изменения флуоресценции в ROI рассчитываются с использованием программного обеспечения для визуализации.
Таким образом, при использовании ВЭБ увековеченных В-клеток для измерения чувствительности RyR1 к определенному агонисту следует проводить повторные эксперименты на клетках одного индивидуума, в разные дни. Для измерений на клеточных популяциях необходимо оценить состояние внутриклеточных запасов кальция и построить график высвобождения кальция, индуцированного агонистом EC50, относительно общего количества кальция, которое может быть высвобождено из запасов. Одним из преимуществ использования этого подхода является то, что ответ [Ca2+] миллионов клеток усредняется; кроме того, нет необходимости в микроперфузионной системе и флуоресцентных микроскопах. Одноклеточный метод позволяет использовать меньшее количество ячеек и on-line визуализацию изменений в [Ca2+] выбранных ячеек.
Измерения одной клетки [Ca2+]i в миотрубах, полученных из спутниковых клеток человека
Стеклянные покровы, выращенные и дифференцированные миотрубы, загружают Fura-2, переносят в перфузионную камеру и купают в растворе Кребса Рингера, содержащем 2 мМ Ca2+, как описано выше для клеток ВЭБ. Шприцы перфузионной системы заполняют выбранным агонистом и стимулируют миотрубы, как описано выше. Поскольку не все клетки на крышке являются многоядерными миотрубами, важно выбрать соответствующие клетки, которые будут измерены. Небольшие группы миотуб могут стимулироваться одновременно. В примере, показанном на рисунке 4,одну миотубу промывали раствором, содержащим KCl, различные концентрации 4-хлор-м-крезола и, наконец, кофеина, однако обычно кривые дозовой реакции на агонисты строятся, как указано в предыдущем разделе, чтобы сравнить чувствительность к агонистам клеток разных людей12,15,16 . KCl используется как способ деполяризации плазматической мембраны. В скелете деполяризация мышечной плазматической мембраны ощущается датчиком напряжения DHPR, который тем самым претерпевает конформационные изменения, приводящие к активации и открытию RyR1. С другой стороны, 4-хлор-м-крезол и кофеин являются прямыми фармакологическими активаторами RyR1.
Рисунок 1:Генерация первичных культур миобластов, полученных из биопсии мышц человека. (А) Небольшие фрагменты мышц (стрелки) помещают во вставки, содержащие 0,5 мл питательной среды. Через 7-14 дней можно увидеть клетки-сателлиты (маленькие стрелки), прилегающие к мышечной ткани и растущие на дне вставки. Изображение, сделанное через 10-кратный объектив(B)и 20-кратный объектив(C). Серые коробки на панели А использовались для сокрытия личности пациента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Эксперименты по высвобождению кальция в ВЭБ увековеченных В-лимфоцитах. Ратиометрические [Ca2+]i измерения в популяции вложенных ячеек Fura-2 в суспензии. А) Добавление 300 мкМ 4-хлор-м-крезола (стрелка) вызывает немедленное увеличение цитоплазматического [Ca2+], который впоследствии распадается обратно до уровней покоя в течение 500 секунд. В этом примере ΔF, индуцированный добавлением 300 мкМ 4-хлор-м-крезола, составляет 1,7 единицы флуоресценции - 1,4 единицы флуоресценции = 0,3 единицы флуоресценции. B) Добавление ингибитора SERCA тапсигаргина (400 нМ, стрелка) вызывает большее увеличение коэффициента флуоресценции Fura-2, который достигает пика в 2,4 единицы флуоресценции, а затем распадается до уровней покоя при 1,45 единицах флуоресценции. Переходный процесс, индуцированный тапсигаргином [Ca2+],представляет собой общее количество быстро высвобождаемого кальция во внутриклеточных запасах, присутствующих в клеточной популяции. Полученный пиковый переходный период (2,4-1,45= 0,95 единицы) используется для расчета процента кальция, высвобождаемого заданной концентрацией 4-хлор-м-крезола. C) Репрезентативные кривые дозового ответа, коррелирующие ΔF в процентах от общего количества быстро высвобождаемого кальция во внутриклеточных запасах. Для 300 мкМ 4-хлор-м-крезола это значение равно 0,3/0,95x100=31,6%. Каждый символ представляет собой среднее± SEM% от 5-10 значений от увековеченных EBV клеток из контрольной (замкнутые круги, пунктирная линия) и MHS индивидуума (замкнутые квадраты, непрерывная линия), несущего мутацию RYR1. Кривые были сгенерированы с использованием сигмоидальной функции кривой доза-реакция. Панели A и B адаптированы из Girard et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Кофеин-индуцированное высвобождение Ca2+ в отдельных УВ-увековеченных В-лимфоцитах от контрольного человека. А) Верхние панели, покадровые снимки(А)Фазоконтрастные; (B-E), одноклеточные [Ca2+]I измерения фура-2-нагруженных EBV-увековеченных лимфоцитов: (B) t=0, (C) t=36 с, (D) t=50 с и (E) t=77 с после применения 5 мМ кофеина. Клетки индивидуально стимулировали добавлением кофеина, разбавленного в растворе Кребса-Рингера. Шкала bar=10 мкм. Нижняя панель, репрезентативный след, полученный после стимуляции одиночной клетки 5 мМ кофеина (стрелка). B) Кривые дозового ответа, показывающие кофеинозависимое изменение в [Ca2+]i,выраженное как изменение коэффициента флуоресценции (пиковое отношение 340/380 нм- отношение покоя 340/380 нм). Каждая точка представляет собой среднюю ± SEM изменения флуоресценции 4-15 клеток. Кривые были сгенерированы с использованием сигмоидальной функции кривой доза-реакция. Замкнутые квадраты, пунктирная линия, контрольные ячейки; замкнутые треугольники, непрерывная линия, особь MHS, несущая мутацию RYR1. Этот рисунок является адаптацией из Ducreux et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Высвобождение кальция, стимулируемое KCl, 4-хлор-м-крезолом и кофеином в миотрубах человека у контрольного человека. Левые панели: A) фазовый контраст (B-H), одноклеточные внутриклеточные Ca2+ измерения Фура-2-нагруженных человеческих миотрубок. Б) отдых [Са2+]i; C) t=2 с после применения 150 мМ KCl. D) t= 2 с после применения 150 мкМ 4-хлор-м-крезола; E) t=2 с после применения 300 мкМ 4-хлор-м-крезола; F) t=2 с после применения 600 мкМ 4-хлор-м-крезола; G) t=2 с после применения 10 мМ кофеина; H) t=20 с после применения кофеина. Правая панель:График времени (с) и коэффициент флуоресценции (340/380 нм) в стимулируемой клетке. Миотрубы индивидуально стимулировали добавлением агониста в буфер Кребса-Рингера, содержащий 100 мкМ La3+,таким образом, увеличение [Ca2+]i представляет собой только высвобождение кальция из внутриклеточных запасов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, описанные в этой статье, были успешно использованы несколькими лабораториями для изучения влияния мутаций RYR1 на гомеостаз кальция. Важнейшие этапы подходов, изложенных в настоящем документе, касаются стерильности, навыков и методов культивирования клеток и доступности биологического материала. В принципе, использование В-увековеченных В-лимфоцитов проще и позволяет генерировать клеточные линии, содержащие мутантные каналы RyR1. Клетки могут быть заморожены и храниться в жидком азоте в течение многих лет, а культуры могут быть повторно запущены в любое время. Кроме того, можно выбрать, следует ли контролировать гомеостаз кальция в клеточных популяциях или на уровне одной клетки. Первый метод проще, не требует флуоресцентного микроскопа и позволяет исследователю тестировать клеточные линии, сгенерированные у разных людей в течение короткого периода времени. Ограничением является скорость роста клеток и наличие полностью оборудованного (с подогревом и с магнитной мешалкой) спектрофлуорометра. В качестве альтернативного подхода проточная цитометрия в сочетании с флуоресцентными показателями кальция может быть использована для измерения потоков кальция в В-увековеченных В-лимфоцитах; таким образом можно определить изменения внутриклеточной концентрации кальция19. Если доступны флуоресцентный микроскоп, перфузионная камера и микроперфузионная система, то одноклеточная визуализация имеет то преимущество, что она более чувствительна и дает более подробную информацию, включая изменчивость от клетки к клетке, кинетический анализ и идентификацию субклеточных доменов, участвующих в высвобождении кальция. Последний подход технически более сложен и требует большего количества оборудования.
Существует множество преимуществ использования УВ-увековеченных В-лимфоцитов, в том числе то, что можно измерить другие параметры, помимо [Ca2+]и гомеостаза. Например, 4-хлор-м-крезол-индуцированное подкисление В-клеток использовалось для дифференцировки клеток от контрольных лиц из пациентов с MHS20,21. Тем не менее, следует иметь в виду, что (i) В-клетки не экспрессируют многие белки, участвующие в связи сокращения возбуждения скелетных мышц, которые могут косвенно влиять на высвобождение кальция, (ii) они являются невозбудимыми клетками, поэтому не могут быть физиологически активированы деполяризацией плазматической мембраны, и, наконец, отчет Monnier et al. показал, что мутация, идентифицированная у пациента, не была экспрессирована в В-клетках, увековеченных EBV, из-за загадочного места сращивания22.
Полученные от пациента первичные культуры мышечных клеток использовались несколькими группами, заинтересованными в изучении влияния мутаций в различных генах, кодирующих белки, участвующие в гомеостазе кальция10,23,24. Эти клетки могут быть дифференцированы в многоядерные миотрубки, реагировать на деполяризацию плазматической мембраны и могут быть оценены электрофизиологическими средствами. Кроме того, они могут быть увековечены, чтобы получить клеточные линии, несущие мутации RYR125,хотя процедура намного сложнее, чем для В-лимфоцитов. Хотя также верно, что мышечные клетки медленно растут, и время, необходимое от взятия биопсии до наличия достаточного количества клеток, может составлять более одного месяца, также можно хранить небольшие кусочки биопсии мышц в морозильной среде в жидком азоте, чтобы получить миобласты спустя годы. Длительные сроки культивирования имеют дополнительный риск загрязнения бактериями, дрожжами или плесенью, и как только получено достаточно большое количество миобластов, важно заморозить и хранить их в жидком азоте. Наша лаборатория успешно применила ту же технику, описанную выше для миотруб, для изучения изменений кальция в фибробластах, полученных из кожи человека, трансдуцированных с myoD и дифференцированных в миотрубы26. Это было сделано для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, когда миобласты, полученные из биопсии мышц, были недоступны. Что касается В-лимфоцитов, то 4-хлор-м-крезол-индуцированное подкисление миотрубок у пациентов с мутациями RYR1, связанными с MHS, было успешно протестировано27.
В заключение, использование биологического материала от пациентов для изучения корреляции генотип-фенотип имеет много преимуществ недостатка и может быть успешно использовано для изучения влияния мутаций в RYR1. Однако при использовании этого подхода важно иметь в виду, что мутации, присутствующие в других генах, могут влиять на гомеостаз кальция; поэтому следует использовать клетки из разных семейств, имеющих одну и ту же мутацию, а также от членов семьи, не имеющих мутацию RYR1, в качестве контрольных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами Швейцарского национального научного фонда (SNF) и Швейцарского мышечного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
