Summary
Her metoder som brukes til å studere den funksjonelle effekten av RYR1 mutasjoner endogent uttrykt i Epstein Barr Virus udødeliggjort menneskelig B-lymfocytter og muskelbiopsi avledet satellittceller differensiert i myotubes er beskrevet.
Abstract
Mer enn 700 varianter i RYR1-genet er identifisert hos pasienter med forskjellige nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet, kjernemyopatier og centronuclear myopati. På grunn av de forskjellige fenotypene knyttet til RYR1-mutasjoner er det grunnleggende å karakterisere deres funksjonelle effekter for å klassifisere varianter som bæres av pasienter for fremtidige terapeutiske inngrep og identifisere ikke-patogene varianter. Mange laboratorier har vært interessert i å utvikle metoder for å funksjonelt karakterisere RYR1-mutasjoner uttrykt i pasientens celler. Denne tilnærmingen har mange fordeler, inkludert: mutasjoner uttrykkes endogært, RyR1 er ikke over-uttrykt, bruk av heterologe RyR1 uttrykkende celler unngås. Men siden pasienter kan presentere mutasjoner i forskjellige gener til side RYR1, er det viktig å sammenligne resultater fra biologisk materiale fra individer som har samme mutasjon, med forskjellig genetisk bakgrunn. Det nåværende manuskriptet beskriver metoder utviklet for å studere de funksjonelle effektene av endogene uttrykte RYR1-varianter i: (a) Epstein Barr-virus udødeliggjorte humane B-lymfocytter og (b) satellittceller avledet fra muskelbiopsier og differensiert i myotubes. Endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen utløst av tilsetning av en farmakologisk RyR1-aktivatorer overvåkes deretter. Den valgte celletypen er lastet med en forholdsmetrisk fluorescerende kalsiumindikator og intracellulære [Ca2+] endringer overvåkes enten på enkeltcellenivå ved fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et spektrofluorometer. Hvilen [Ca2+], agonistiske doseresponskurver sammenlignes deretter mellom celler fra sunne kontroller og pasienter som har RYR1-varianter som fører til innsikt i den funksjonelle effekten av en gitt variant.
Introduction
Til dags dato har mer enn 700 RYR1-varianter blitt identifisert i den menneskelige befolkningen og knyttet til ulike nevromuskulære lidelser, inkludert ondartet hypertermi mottakelighet (MHS), treningsindusert rabdomyolyse, sentral kjernesykdom (CCD), multi-minicore sykdom (MmD), centronuclear myopati (CNM)1,2,3 ; Likevel henger studier for å karakterisere deres funksjonelle effekter, og bare ca. 10% av mutasjonene har blitt testet funksjonelt. Ulike eksperimentelle tilnærminger kan brukes til å vurdere virkningen av en gitt RyR1-variant, inkludert transfeksjon av heterologiske celler som HEK293 og COS-7 celler med plasmid koding for WT og mutant RYR1 cDNA4,5, transduksjon av dyspediske musfibroblaster med plasmider og vektorer koding for WT og mutant RYR1 cDNA, etterfulgt av transduksjon med myo-D og differensiering i myotubes6 , generasjon av transgene dyremodeller som bærer mutant RyR1s7,8,9, karakterisering av celler fra pasienter som uttrykker RYR1-varianten endogent10,11,12. Slike metoder har bidratt til å fastslå hvordan forskjellige mutasjoner funksjonelt påvirker RyR1 Ca2+ kanalen.
Her beskrives metoder utviklet for å vurdere funksjonelle effekter av RYR1 mutasjoner. Ulike parametere av intracellulær kalsium homeostase undersøkes i humane celler endogent uttrykker RyR1 kalsiumkanal, inkludert myotubes og Epstein Barr Virus (EBV) udødeliggjort B-lymfocytter. Celler er hentet fra pasienter, utvidet i kultur og lastet med rasjonmetrisk fluorescerende kalsiumindiktorer som Fura-2 eller indo-1. Parametere som har blitt rapportert å bli endret på grunn av patogene RYR1-mutasjoner, inkludert hvile [Ca2+], følsomheten til forskjellige farmakologiske agonister og størrelsen på de intracellulære Ca2 + -butikkene måles enten på enkeltcellenivå, ved hjelp av fluorescensmikroskopi eller i cellepopulasjoner ved hjelp av et fluorimeter. Resultater oppnådd i celler fra mutasjonsbærere sammenlignes deretter med de som er oppnådd fra friske kontrollfamiliemedlemmer. Denne tilnærmingen har vist at: (i) mange mutasjoner knyttet til MHS fører til en økning i hvilen [Ca2+] og et skifte til venstre i doseresponskurven til enten KCl-indusert depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) mutasjoner knyttet til CCD fører til en reduksjon i toppen [Ca2 +] utgitt ved farmakologisk aktivering av RyR1 og redusert størrelse hvis den intracellulære Ca2 + lagrer12,13,14,15; (iii) noen varianter påvirker ikke Ca2+ homeostase13. Fordelene med denne eksperimentelle tilnærmingen er: RyR1-proteinet er ikke over-uttrykt og fysiologiske nivåer er til stede, celler kan udødeliggjøres (både muskelceller og B-lymfocytter) som gir cellelinjer som inneholder mutasjoner. Noen ulemper er knyttet til det faktum at pasienter kan bære mutasjoner i mer enn ett genkodingsproteiner involvert i kalsium homeostase og / eller eksitasjonskontraksjonskobling (ECC), og dette kan komplisere eksperimentelle konklusjoner. For eksempel ble to JP-45-varianter identifisert i MHS og kontrollpopulasjonen, og deres tilstedeværelse ble vist å påvirke følsomheten til dihydropyridinreseptoren (DHPR) til aktivering16. Pasienter må være tilgjengelige, biologisk materiale må samles inn på nytt og etiske tillatelser må innhentes fra de lokale etiske styrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollene beskrevet nedenfor overholder de etiske retningslinjene i Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Forberedelse av Epstein Barr udødeliggjort B-lymfocyttcellelinjer11
- Etter informert samtykke, samle 30 ml fullblod i EDTA-behandlede sterile rør fra probandet som bærer en RYR1 mutasjon og fra friske familiemedlemmer uten mutasjon.
MERK: Hold alle løsninger sterile og arbeid i en vevskulturhette. - Isoler mononukleære celler fra fullblod ved tetthet gradient sentrifugeringsmedier (f.eks. Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
- Plasser 30 ml sterilt blod i et konisk sterilt rør på 50 ml.
- Plasser spissen av en Pasteur pipette som inneholder tetthet gradient sentrifugeringsmediet nederst på røret og lag 20 ml sterilt av tetthet gradient sentrifugeringsmedieløsning sakte under blodet.
- Sentrifuge i 30 min ved 900 x g ved 18°-20°C, uten pause.
MERK: Det mononukleære cellelaget vises som en overskyet ring ved interfasen mellom tetthetsgradientens sentrifugeringsmedielag og det øverste laget som inneholder blodplateberiket plasma.
- Med en steril pipette fjern forsiktig det interfaselaget som inneholder mononukleære celler (ca. 3-5 ml) og overfør løsningen til et rent 50 ml sterilt konisk rør.
- Tilsett 20 ml fosfatbuffer saltvann (PBS) for å skylle celler, sentrifuge i 10 min ved 600 x g ved romtemperatur og resuspender pellets i PBS. Gjenta i totalt tre ganger. Dette sikrer at alle medier fjernes.
- Etter siste vask, resuspend celler i 1-2 ml vev kultur medium (RPMI medium supplert med 10% foster kalv serum, 2 mM L-glutamin, og 100 enheter penicillin og streptomycin). Plasser mononukleære celler (ca. 1 x 106 celler) i en T125 vevskulturflaske som inneholder 20 ml vevskulturmedium.
- Infiser mononukleære celler med Epstein-Barr-virus.
- Bruk supernatanter fra B95,8 cellelinjekulturer (som inneholder 102-103 transformerende enheter/ml lagerført ved -80 °C) som kilde til EBV.
- Resuspend 1 x 106 mononukleære celler fra trinn 1,5 i 20 ml vevskulturmedium og eksponere dem for 2 ml supernatant fra B95,8-cellelinjen i nærvær av ciklosporin A (0,2 μg / ml endelig konsentrasjon) for infeksjon.
- Plasser kolben i en 37 °C cellekulturinkubator og la cellene vokse. Etter en uke endre kulturmediet.
MERK: Når B-cellene begynner å spre seg, danner de gjenkjennelige klumper og vokser raskt slik at kulturene kan utvides og fryses. - Trekk ut det genomiske DNA-et fra EBV-udødeliggjorte B-lymfocyttcellelinjene11 for å bekrefte tilstedeværelsen eller fraværet av den gitte mutasjonen.
2. Intracellulære Ca2+ målinger
MERK: Endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen av EBV-transformerte B-lymfocyttcellelinjer kan overvåkes i cellepopulasjoner, med et spektrofluorometer utstyrt med magnetisk omrører og cuvetteholder satt til 37 °C. Alternativt kan Ca2 + endringer overvåkes i enkeltceller ved fluorescensmikroskopi. I begge tilfeller fjernes celler fra vevskulturflasken, vaskes to ganger med Krebs Ringers løsning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5,5 mM glukose, pH 7,4 som inneholder 1 mM CaCl2) og telt .
- For eksperimenter i cellepopulasjoner som bruker et spektrofluorometer11,13,14
- Resuspend celler ved en endelig konsentrasjon på 1 x 107 celler / ml i Krebs Ringers løsning og inkubere ved 37 °C i 30 minutter med en endelig konsentrasjon på 5 μM Fura-2/AM.
- Sentrifuger celler på 900 x g i 10 min og resuspend dem i Krebs Ringers løsning i en konsentrasjon på 2 x 106 celler / ml.
- Mål fluorescensendringer (forhold 340/380 nm) ved hjelp av et spektrofluorometer utstyrt med et magnetisk rørersett med maksimal hastighet og satt til 37 °C.
- Like før eksperimentet spinn celler på 900 x g i 5 min i en mikrocentrifuge og raskt resuspend pellet i 1,5 ml Krebs Ringer løsning med 0,5 mM EGTA, men ingen lagt Ca2 +.
- Plasser celler i en 3 ml glassspektrofluorometer cuvette og registrer fluorescensforholdet (340 nm / 380 nm eksitasjon, 510 nm utslipp).
- Oppnå en stabil baselinje (ca. 30 sekunder), tilsett den valgte konsentrasjonen av RyR1-agonist (4-kloro-m-cresol, eller 4 cmc) og registrer kalsium forbigående.
MERK: En 300 mM lagerløsning på 4 cmc laget i DMSO brukes som startreagens. Denne løsningen kan gjøres på forhånd, alikvotert og lagret ved -20 °C i flere måneder. - Utfør eksperimenter for forskjellige 4 cmc konsentrasjoner.
MERK: Inkluder 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM til 1 mM for å generere en doseresponskurve av agonist versus endring i [Ca2+]. De forskjellige 4 cmc-konsentrasjonene oppnås ved å legge til riktig volum på 4 cmc fra lagerløsningen, direkte inn i cuvette som inneholder Fura-2-lastede celler. For eksempel, for en endelig konsentrasjon på 300 μM 4 cmc, legges 1,5 μL av lagerløsningen til cuvette som inneholder 1,5 ml celler i Krebs Ringers løsning. For lavere agonistkonsentrasjoner bør 300 mM lagerløsningen fortynnes til 75 mM med DMSO og riktig volum legges til cuvette som inneholder 1,5 ml celler i Krebs Ringers løsning. - Tilsett 400 nM thapsigargin i celler for å beregne den totale mengden Ca2+ som finnes i intracellulære butikker. Registrer toppen Ca2+.
- Plott toppen kalsium indusert av en gitt 4 cmc konsentrasjon versus toppen kalsium indusert av thapsigargin, som regnes som 100% og konstruere en 4 cmc dose respons kurve sammenligne celler fra en proband og sunn slektning
- For eksperimenter på enkeltceller13
- Fortynn poly-L-lysin 1:10 i steril H2O og forbehandle glassdekslene i 30 min. La det lufttørke under en steril vevskulturhette.
- Re-suspendere EBV-transformerte B-lymfocytter til en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml i Krebs Ringers løsning som inneholder 1 mM CaCl2 og tilsett en endelig konsentrasjon på 5 μM Fura-2 / AM.
- Plasser 1 ml celler på poly-L-lysinbehandlede deksler og inkuber ved 37 °C i en fuktet cellekulturinkubator i 30 minutter slik at EBV-cellene kan holde seg til glasslokkene under lasting.
- Plasser dekslene i perfusjonskammeret og start perfusjonen (med en hastighet på 2 ml/min) med Krebs Ringers løsning som inneholder 1 mM Ca2+.
- Bruk et invertert fluorescerende mikroskop (utstyrt med et 40x olje-nedsenkingsmål (0,17 numerisk blenderåpning), filtre (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) for å registrere online-målinger, med et programvarestyrt ladekoblet enhetskamerafeste (CCD).
- Hent bilder med 1 s intervaller ved en fast eksponeringstid (100 ms for både 340- og 380-nm eksitasjonsbølgelengder. Bruk bildeprogramvare til å analysere endringer i fluorescens. Mål den gjennomsnittlige pikselverdien for hver celle ved eksitasjonsbølgelengder på 340 og 380 nm13.
- For å oppnå cellestimulering, bruk en celleperfusjonstimulator med 12 ventiler og legg til forskjellige konsentrasjoner på 4 cmc. Spyleventilen inneholder Krebs Ringers løsning uten ekstra Ca2+ pluss 100 μM La3+ for å overvåke kalsiumutslipp bare fra intracellulære butikker.
- Konstruer en doseresponskurve på 4 cmc versus endring i [Ca2+], som beskrevet ovenfor.
3. Fremstilling av menneskelige myotuber fra muskelbiopsier10,12,15
MERK: Ulike metoder har blitt brukt av forskjellige laboratorier for å få satellittcelleavledede myoblaster og myotuber. Nedenfor er beskrivelsen av metoden som brukes i Basel.
- Skyll muskelbiopsi med steril PBS for å fjerne overflødig blod og kutt i små fragmenter på ca. 0,5-1 mm.
- Forbered 6 godt vev kultur retter med innsats. Tilsett 1,5 ml vekstmedium for mennesker i muskel til hver brønn og 0,5 ml vekstmedium for mennesker til hver innsats.
MERK: Vekstmediet består som følger: 500 ml dulbeccos modifiserte ørns medium med høy glukose, eller DMEM (4,5 mg/ml), som inneholder 10 % hesteserum, 5 ng/ml insulin, 3 mM glutamin, 600 ng/ml penicillin G og streptomycin og 7 mM HEPES, pH 7,4. Kommersielt tilgjengelig skjelett muskel vekst medium kan også brukes. - Plasser 2-3 små muskelfragmenter i hver innsats (Figur 1A) og plasser kulturretter i cellekulturinkubatoren (5% CO2, 37 °C). Etter ca. 8-10 dager kan satellittceller ses vokse ut av og rundt muskelbiopsien, festet til innsatsen (Figur 1, B og C, piler).
- Frigjør et tilstrekkelig antall celler fra biopsien (etter ca. 10-14 dager), prøv på følgende måte:
- Fjern alle kulturmedier, skyll cellene en gang med 1 ml PBS, tilsett 0,5 ml trypsin/EDTA-oppløsning (0,025% trypsin og 0,01% EDTA) og inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 1 ml vekstmedium til cellene for å nøytralisere effekten av trypsin og overføre satellittcellene til en ny T25-cellekulturflaske; tilsett 3 ml vekstmedium og plasser cellene i en cellekulturinkubator (5% CO2,37 °C).
- Endre vekstmediet neste dag for å fjerne EDTA og deretter endre mediet en gang i uken.
- Når myoblaster er ca. 75% sammenfallende, kan du prøve og overføre dem til lamininbehandlede glassdeksler.
MERK: Som andel skal celler som vokser i en T25-kolbe overføres til en lamininbehandlet glassdeksler med diameter på 43 mm. Glassdekslene skal plasseres innenfor en vevskulturplate med en diameter på 60 mm som inneholder 3 ml vekstmedium. - Voks celler på glassdekslene i vekstmedium i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 °C) som endrer mediet en gang i uken. Ved 90% samløp, bytt til differensieringsmedium som består av følgende: høy glukose DMEM (4,5 mg / ml), 0,5% bovint serumalbumin, 10 ng/ml epidermal vekstfaktor, 0,15 mg/ml kreatin, 5 ng/ml insulin, 200 mM glutamin, 600 ng/ml penicillin G og streptomycin og 7 mM HEPES, pH 7,4). Kommersielt tilgjengelig differensieringsmedium kan også brukes. Endre differensieringsmediet én gang i uken.
- Etter 7-10 dager i differensieringsmedium er multinukleerte myotuber synlige. Vurder for endringer i [Ca2+] innen en uke, som beskrevet nedenfor.
4. [Ca2+]i forholdsmålinger bestemt med Fura-2
- Lastglassdekslerlip dyrket myotubes med Fura-2/AM (sluttkonsentrasjon på 5 μM) fortynnet i DMEM i 30 min ved 37 °C. Kort sagt, fjern differensieringsmediet fra glassdekslenelip voksne celler og tilsett 2 ml frisk differensieringsmedium. Tilsett 10 μL Fura-2 AM fra en lagerløsning på 1 mM og inkuber 30 min i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 °C).
- Overfør glassdeksler til perfusjonskammeret og skyll cellene med Krebs Ringers løsning som inneholder 2 mM CaCl2.
- Utfør online [Ca2+] målinger som beskrevet ovenfor i EBV encellet seksjon med bruk en 20x vann nedsenking FLUAR objektiv (0,17 numerisk blenderåpning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i målinger i populasjoner av EBV-udødelige B-lymfocytter
Primære B-lymfocytter uttrykker RyR1-isoformen som fungerer som en Ca2+ frigjøringskanal under B-celleantigenreseptor stimulerte signalprosesser17. Udødeliggjøring av B-celler med EBV, en prosedyre som rutinemessig brukes av genetikere for å skaffe cellelinjer som inneholder genomisk informasjon om pasienter, gir fordelen av å generere cellelinjer som uttrykker mutant RyR1 Ca2 + kanaler hos pasienter som har RYR1 mutasjoner11,13. [Ca2+] i endringer forårsaket av tillegg av spesifikke RyR1 agonister som 4-chloro-m-cresol18 og koffein kan lett overvåkes for å fastslå om en gitt RYR1 mutasjon endrer følsomheten til en agonist, mengden kalsium utgitt, hvile [Ca2 +], eller andre parametere som har vist seg å bli påvirket av mutasjoner. [Ca2+] i endringer kan overvåkes enten i populasjoner av Fura-2 lastet celler i suspensjon med et spektrofluorometer eller på grupper av celler festet til glass coverlips og undersøkt av epifluorescence. Figur 2 viser et representativt eksperiment utført på cellesuspensjoner. Umiddelbart før de ble plassert i cuvette, ble cellene spunnet for å fjerne Fura-2 som kan ha lekket ut; celler ble deretter resuspendert til en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml i varm (37 ° C) Krebs Ringers løsning som ikke inneholder ytterligere Ca2 + pluss 0,5 mM EGTA og plassert i spektroflufluorometeret. Den magnetiske røreren ble slått på posisjon 4 (høyeste posisjon) for å holde cellene i suspensjon og fluorescens ble registrert. Etter at et stabilt spor ble oppnådd, ble den valgte agonisten lagt til (i figur 2A var dette 300 μM 4-kloro-m-cresol) noe som førte til en rask Ca2 + økning som deretter sakte falt tilbake til hvilenivåer. Den forbigående karakteren av endringen i fluorescens er viktig som det indikerer (i) at det ikke er en artefakt forårsaket av tilsetning av en fluorescerende eller slukkeforbindelse, (ii) at det ikke skyldes kalsiumbinding til ekstracellulær Fura-2 og (iii) at cellene er sunne og aktivt kan fjerne kalsium fra cytoplasma.
Det samme eksperimentet må gjentas flere ganger for å bli analysert statistisk. For hver cellelinje og hver dag utføres forsøkene, og den totale mengden raskt utleisbart kalsium i butikkene må bestemmes ved å legge til SERCA-hemmeren thapsigargin11,13,14. Som vist i figur 2B, forårsaker tilsetningen av 400 nM thapsigargin en stor kalsium forbigående nå en topp fluorescensverdi på 2,4 vilkårlige enheter (a.u.); Dermed tilsvarer den totale mengden kalsium som kan frigjøres fra de intracellulære butikkene til EBV-udødeliggjorte B-celler vist i figur 2B, 2,4 a.u. (thapsigargin peak) - 1,45 a.u. (hvileforhold) eller 0,95 Denne fluorescensverdien ble ansett som 100% ved konstruksjon av doseresponskurven vist i figur 2C.
Encellede [Ca2+]i målinger i EBV-udødelige B-lymfocytter
Denne andre tilnærmingen er avhengig av tilgjengeligheten av et fluorescensmikroskop og mikroperfusjon satt opp slik at stimulering av en enkelt celle eller små grupper av celler med en gitt konsentrasjon av agonist og samtidig registrering av fluorescensendringene. Sprøytene i mikroperfusjonssystemet er lastet med forskjellige konsentrasjoner av den valgte RyR1-agonisten (enten koffein eller 4-kloro-m-cresol) som vil bli brukt til å generere doseresponskurver. I eksemplet vist i figur 3ble celler stimulert med 0,5-10 mM koffein oppløst i Krebs Ringers løsning som ikke inneholder tilsatt kalsium pluss 100 μM La3+ for å overvåke Ca2 + frigjøring fra intracellulære butikker. Glassdeksler som Fura-2 lastet EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter fikk lov til å feste, plasseres i perfusjonskammeret og perfunderes med Krebs Ringers løsning som inneholder 1 mM Ca2+. De fleste cellene vil ha festet seg til poly-L-lysinbehandlet dekslerlip og små grupper av celler skal identifiseres og kontrolleres for Fura-2-lasting. Spissen av perfusjonssystemet er plassert nær cellene for å bade dem (og ikke alle cellene på dekslene) med koffein. Normalt stimuleres celler fra laveste til høyeste konsentrasjon av koffein; For hver konsentrasjon merkes en ny celle eller cellegruppe. Ratiometriske fluorescensmålinger (eksitasjon ved 340 nm og 380 nm, utslipp ved 510 nm) registreres hvert sekund i opptil 2 min. Noen få bilder oppnås før perfusjon for å oppnå en jevn grunnlinje, deretter startes celleperfusjon, først ved å skylle celler med en løsning av Krebs Ringers løsning som inneholder 100 μM La3 + i 5 sekunder. Dette bør ikke resultere i en endring i florescens og er en kontroll for å sikre at cellen (e) holder seg til dekslene gjennom hele eksperimentet; deretter skylles en løsning som inneholder den valgte agonistkonsentrasjonen over cellen(e). I eksemplet vist i figur 3Able cellene stimulert med 5 mM koffein i 20 sekunder. Pilen som vises indikerer når koffeinventilen ble åpnet, og dette resulterer i en umiddelbar økning i 340/380 nm fluorescerende forhold. Etter 20 sekunder lukkes koffeinventilen, og cellene skylles med Krebs Ringers løsning som inneholder 100 μM La3+; fluorescens registreres til grunnlinjen er nådd. For hver koffeinkonsentrasjon ΔF, det vil være koffeinindusert topp 340/380 nm fluorescens - den første hvile 340/380 nm fluorescens beregnes og brukes til å konstruere en doseresponskurve som vist i figur 3B. Gjennomsnittlig ΔF fra 5-10 celler er gjennomsnittet for hver koffeinkonsentrasjon. Mengden kalsium i intracellulære butikker kan også overvåkes. I dette tilfellet skylles celler med Krebs Ringers løsning som inneholder 0,5 mM EGTA og en løsning på 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomycin og 0,5 mM EGTA tilsettes for hånd til cellene (ikke gjennom mikroperfusjonssystemet som ionomycinpinner til slangen og kan ikke vaskes av) og fluorescensen registreres i ca. 4-5 min. For å beregne ΔF, oppnås en interesseregion (ROI) som skisserer en celle, og endringene i fluorescens i avkastningen beregnes ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare.
Oppsummert, når du bruker EBV-udødelige B-celler for å måle RyR1s følsomhet til en bestemt agonist, bør gjentatte eksperimenter utføres på celler fra ett individ, på forskjellige dager. For målinger på cellepopulasjoner må statusen til de intracellulære kalsiumlagrene vurderes, og EC50 til agonistindusert kalsiumfrigjøring plottes i forhold til den totale mengden kalsium som kan frigjøres fra butikkene. En fordel med å bruke denne tilnærmingen er at [Ca2+] responsen til millioner av celler er gjennomsnittet; I tillegg er det ikke nødvendig med mikroperfusjonssystem og fluorescerende mikroskoper. Enkeltcellemetoden tillater bruk av et mindre antall celler og online visualisering av endringer i [Ca2+] av merkede celler.
Enkeltcelle [Ca2+]i målinger i human satellittcelle avledet myotubes
Glassdekslerlip dyrket og differensiert myotubes er lastet med Fura-2, overført til perfusjonskammeret og badet i Krebs Ringers løsning som inneholder 2 mM Ca2 + som beskrevet ovenfor for EBV-celler. Sprøytene i perfusjonssystemet er fylt med den valgte agonisten og myotubene stimuleres som beskrevet ovenfor. Siden ikke alle cellene på dekslene er multinukleerte myotuber, er det viktig å velge de aktuelle cellene som skal måles. Små grupper av myotubes kan stimuleres samtidig. I eksemplet vist i figur 4ble et enkelt myotube spylt med en løsning som inneholder KCl, forskjellige konsentrasjoner av 4-kloro-m-cresol og til slutt koffein, men normalt er doseresponskurver til agonister konstruert, som angitt i forrige avsnitt, for å sammenligne den agonistiske følsomheten til celler fra forskjellige individer12,15,16 . KCl brukes som en måte å depolarisere plasmamembranen på. I skjelett, muskel plasma membran depolarisering er følt av spenningen sensing DHPR som dermed gjennomgår en konformasjonsendring som fører til aktivering og åpning av RyR1. På den annen side er 4-kloro-m-cresol og koffein direkte farmakologiske aktivatorer av RyR1.
Figur 1: Generering av primær menneskelig muskelbiopsi-avledede myoblastkulturer. (A) Små fragmenter av muskel (piler) plasseres i innsatser som inneholder 0,5 ml vekstmedium. Etter 7-14 dager satellittceller kan ses (små piler) ved siden av muskelvevet og vokser på bunnen av innsatsen. Bilde tatt gjennom en 10x målsetting (B) og 20x mål (C). De grå boksene i panel A ble brukt til å dekke pasientens identitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kalsiumfrigjøringsforsøk i EBV-udødelige B-lymfocytter. Ratiometric [Ca2+]i målinger i en populasjon av Fura-2 lastede celler i suspensjon. A) Tilsetningen av 300 μM 4-kloro-m-cresol (pil) forårsaker en umiddelbar økning i cytoplasmatisk [Ca2+], som deretter forfaller tilbake til hvilenivåer innen 500 sekunder. I dette eksemplet er ΔF indusert ved tilsetning av 300 μM 4-kloro-m-cresol 1,7 fluorescensenheter - 1,4 fluorescensenheter = 0,3 fluorescensenheter. B) Tilsetningen av SERCA-hemmeren thapsigargin (400 nM, pil) forårsaker en større økning i Fura-2 fluorescensforholdet som topper på 2,4 fluorescensenheter, og deretter forfaller til hvilenivåer ved 1,45 fluorescensenheter. Thapsigargin indusert [Ca2 +] forbigående representerer den totale mengden raskt utleprbare kalsium i de intracellulære butikkene som finnes i cellepopulasjonen. Den oppnådde topp forbigående (2,4-1,45 = 0,95 enheter) brukes til å beregne prosentandelen kalsium som frigjøres ved en gitt konsentrasjon på 4-kloro-m-cresol. C) Representative doseresponskurver korrelerer ΔF som en prosentandel av den totale mengden raskt utleid kalsium i intracellulære butikker. For 300 μM 4-kloro-m-cresol er denne verdien 0,3/0,95x100=31,6%. Hvert symbol representerer gjennomsnittet± SEM% av 5-10 verdier fra EBV-udødelige celler fra en kontroll (lukkede sirkler, prikket linje) og en MHS-person (lukkede firkanter, kontinuerlig linje) som bærer en RYR1-mutasjon. Kurvene ble generert ved hjelp av en sigmoidal doseresponskurvefunksjon. Panelene A og B er tilpasset girard et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Koffeinindusert Ca2+ frigjøring i individuelle EBV-udødelige B-lymfocytter fra en kontrollperson. A) Topppaneler, tidsforløpbilder (A) Fasekontrast; (B-E), encellede [Ca2+]Jeg målinger av fura-2-lastede EBV-udødelige lymfocytter: (B) t = 0, (C) t = 36 s, (D) t = 50 s og (E) t = 77 s etter påføring av 5 mM koffein. Celler ble individuelt stimulert ved tilsetning av koffein fortynnet i Krebs-Ringer-løsningen. Skala bar = 10 μm. Bunnpanel, representativt spor oppnådd etter stimulering av en enkelt celle med 5 mM koffein (pil). B) Doseresponskurver som viser koffeinavhengig endring i [Ca2+]i, uttrykt som endring i fluorescensforhold (toppforhold 340/380 nm-hvileforhold 340/380 nm). Hvert punkt representerer gjennomsnittlig ± SEM av endringen i fluorescens på 4-15 celler. Kurvene ble generert ved hjelp av en sigmoidal doseresponskurvefunksjon. Lukkede firkanter, prikket linje, kontrollceller; lukkede trekanter, kontinuerlig linje, MHS-individ som bærer en RYR1-mutasjon. Denne figuren er en tilpasning fra Ducreux et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kalsiumfrigjøring stimulert av KCl, 4-kloro-m-cresol og koffein i menneskelige myotuber fra en kontrollperson. Venstre paneler: A) fasekontrast (B-H), encellede intracellulære Ca2+ målinger av Fura-2-lastede menneskelige myotuber. B) hvile [Ca2+]i ; C) t= 2 s etter påføring av 150 mM KCl. D) t = 2 s etter påføring av 150 μM 4-kloro-m-cresol; E) t = 2 s etter påføring av 300 μM 4-kloro-m-cresol; F) t = 2 s etter påføring av 600 μM 4-kloro-m-cresol; G) t = 2 s etter påføring av 10 mM koffein; H) t = 20 s etter påføring av koffein. Høyre panel: Plott av tid (er) versus fluorescensforhold (340/380 nm) i den stimulerte cellen. Myotubes ble individuelt stimulert ved tilsetning av agonisten i Krebs-Ringer buffer som inneholder 100 μM La3+, og dermed representerer økningen i [Ca2+]i bare frigjøring av kalsium fra intracellulære butikker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene beskrevet i denne artikkelen har blitt brukt av flere laboratorier for å studere effekten av RYR1 mutasjoner på kalsium homeostase. De kritiske trinnene i tilnærmingene som er skissert i dette dokumentet, omhandler sterilitet, cellekulturferdigheter og teknikker og tilgjengelighet av biologisk materiale. I prinsippet er bruken av EBV-udødelige B-lymfocytter enklere og gjør det mulig å generere cellelinjer som inneholder mutante RyR1-kanaler. Cellene kan fryses og lagres i flytende nitrogen i mange år, og kulturer kan startes på nytt når som helst. I tillegg kan man velge om man skal overvåke kalsium homeostase i cellepopulasjoner eller på enkeltcellenivå. Den tidligere metoden er enklere, krever ikke et fluorescensmikroskop og lar undersøkeren teste cellelinjer generert fra forskjellige individer innen kort tid. Begrensningen er hastigheten på cellevekst og tilgjengeligheten av et fullt utstyrt (oppvarmet og med magnetisk omrører) spektrofluorometer. Som en alternativ tilnærming strømning cytometri i kombinasjon med fluorescerende kalsiumindikatorer kan brukes til å måle kalsiumflukser i EBV-udødelige B-lymfocytter; På en slik måte kan endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen bestemmes19. Hvis et fluorescerende mikroskop, perfusjonskammer og mikroperfusjonssystem er tilgjengelig, har enkeltcelleavbildning fordelen av å være mer følsom og gi mer detaljert informasjon, inkludert celle til cellevariabilitet, kinetisk analyse og identifisering av subcellulære domener involvert i kalsiumfrigjøring. Sistnevnte tilnærming er teknisk mer utfordrende og krever mer utstyr.
Det er flere fordeler med å bruke EBV-udødelige B-lymfocytter, inkludert at andre parametere til side [Ca2+]i homeostase kan måles. For eksempel har 4-kloro-m-cresol indusert forsuring av B-celler blitt brukt til å skille celler fra kontrollpersoner fra MHS-pasienter20,21. Likevel må man huske (i) at B-celler ikke uttrykker mange av proteinene som er involvert i skjelettmuskulatureksitasjonskobling som indirekte kan påvirke kalsiumfrigjøring, (ii) de er ikke-spennende celler, og kan derfor ikke aktiveres fysiologisk ved plasmamembrandepolarisering, og til slutt fant en rapport fra Monnier et al. at en mutasjon identifisert hos en pasient ikke ble uttrykt i EBV-udødelige B-celler på grunn av et kryptisk skjøtested22.
Pasientavledede primærmuskelcellekulturer har blitt brukt av flere grupper som er interessert i å studere effekten av mutasjoner i forskjellige gener som koder proteiner involvert i kalsium homeostase10,23,24. Disse cellene kan differensieres i multinukleerte myotuber, reagere på plasmamembrandepolarisering og kan vurderes med elektrofysiologiske midler. I tillegg kan de bli udødeliggjort for å oppnå cellelinjer som bærer RYR1 mutasjoner25, selv om prosedyren er langt mer kompleks enn for B-lymfocytter. Selv om det også er sant at muskelcellene vokser sakte og tiden som er nødvendig fra å ta en biopsi til å ha et tilstrekkelig antall celler kan være mer enn en måned, er det også mulig å lagre de små delene av muskelbiopsier i frysemiddel i flytende nitrogen for å oppnå myoblaster år senere. De lange dyrkingstidene har den ekstra risikoen for forurensning av bakterier, gjær eller mugg, og så snart et tilstrekkelig stort antall myoblaster er oppnådd, er det viktig å fryse og lagre dem i flytende nitrogen. Vårt laboratorium har vellykket brukt den samme teknikken som er skissert ovenfor for myotubes, for å studere kalsiumforandringer i humane hudavledede fibroblaster transdusert med myoD og differensiert i myotubes26. Dette ble gjort for å studere den funksjonelle effekten av RYR1 mutasjoner når muskelbiopsi-avledede myoblaster ikke var tilgjengelige. Når det gjelder B-lymfocytter, har 4-kloro-m-cresol indusert forsuring av myotuber fra pasienter med RYR1 mutasjoner knyttet til MHS blitt testet vellykket27.
Til slutt har bruk av biologisk materiale fra pasienter for å studere genotype-fenotype korrelasjonen mange fordeler ulempen og kan brukes med hell til å studere effekten av mutasjoner i RYR1. Når du bruker denne tilnærmingen, er det imidlertid viktig å huske på at mutasjoner som er tilstede i andre gener, kan påvirke kalsium homeostase; Derfor bør bruk av celler fra forskjellige familier som har samme mutasjon så vel som fra familiemedlemmer som ikke har RYR1-mutasjonen som kontroller, utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Verket som er beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (SNF) og Swiss Muscle Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
