Summary
Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.
Abstract
Malign hipertermi duyarlılığı, çekirdek miyopatiler ve merkezkonükleer miyopati gibi farklı nöromüsküler bozuklukları olan hastalarda RYR1 geninde 700'den fazla varyant tanımlanmıştır. RYR1 mutasyonlarına bağlı çeşitli fenotipler nedeniyle, gelecekteki terapötik müdahaleler için hastalar tarafından taşınan varyantları sınıflandırmak ve patojenik olmayan varyantları tanımlamak için fonksiyonel etkilerini karakterize etmek esastır. Birçok laboratuvar, hastaların hücrelerinde ifade edilen RYR1 mutasyonlarını işlevsel olarak karakterize etmek için yöntemler geliştirmekle ilgilenmiştir. Bu yaklaşımın çok sayıda avantajı vardır: mutasyonlar endojen olarak ifade edilir, RyR1 aşırı ifade edilir, heterolog RyR1 eksprese hücrelerinin kullanımından kaçınılır. Bununla birlikte, hastalar RYR1 dışında farklı genlerde mutasyonlar sunabileceğinden, aynı mutasyonu barındıran bireylerden elde edilen biyolojik materyalin sonuçlarını farklı genetik geçmişlerle karşılaştırmak önemlidir. Bu makale, endojen olarak ifade edilen RYR1 varyantlarının fonksiyonel etkilerini incelemek için geliştirilen yöntemleri açıklar: (a) Epstein Barr virüsü, kas biyopsilerinden elde edilen ve miyotüplere farklılaşan insan B-lenfositlerini ve (b) uydu hücrelerini ölümsüzleştirmiştir. Daha sonra farmakolojik RyR1 aktivatörlerinin eklenmesiyle tetiklenen hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler izlenir. Seçilen hücre tipi bir oranmetrik floresan kalsiyum göstergesi ile yüklenir ve hücre içi [Ca2+] değişiklikler floresan mikroskopi ile tek hücre düzeyinde veya spektrofluorometre kullanılarak hücre popülasyonlarında izlenir. Dinlenme [Ca2+], agonist doz yanıt eğrileri daha sonra sağlıklı kontrollerden gelen hücreler ile belirli bir varyantın işlevsel etkisi hakkında fikir veren RYR1 varyantlarını barındıran hastalar arasında karşılaştırılır.
Introduction
Bugüne kadar insan popülasyonunda 700'den fazla RYR1 varyantı tanımlanmış ve malign hipertermi duyarlılığı (MHS), egzersize bağlı rabdomiyoliz, merkezi çekirdek hastalığı (CCD), çoklu minicore hastalığı (MMD), merkezkronükleer miyopati (CNM)1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli nöromüsküler bozukluklarla bağlantılıdır. ; bununla birlikte, fonksiyonel etkilerini karakterize etme çalışmaları gecikmektedir ve mutasyonların sadece yaklaşık% 10'unu işlevsel olarak test edilmiştir. Belirli bir RyR1 varyantının etkisini değerlendirmek için farklı deneysel yaklaşımlar kullanılabilir, HEK293 ve COS-7 hücreleri gibi heterolog hücrelerin WT ve mutant RYR1 cDNA4,5,dispedik fare fibroblastlarının WT ve mutant RYR1 cDNA için kodlanmış plazmidler ve vektörler ile transdüksiyonu dahil olmak üzere, ardından myo-D ile transdüksiyon ve miyotubes6'ya farklılaşma , mutant taşıyan transgenik hayvan modellerinin üretimi RyR1s7,8,9, RYR1 varyantını endojen olarak ifade eden hastalardan hücrelerin karakterizasyonu10,11,12. Bu tür yöntemler, farklı mutasyonların RyR1 Ca2+ kanalını işlevsel olarak nasıl etkilediğini belirlemeye yardımcı oldu.
Burada RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için geliştirilen yöntemler açıklanmıştır. Hücre içi kalsiyum homeostazın çeşitli parametreleri, miyotüpler ve Epstein Barr Virüsü (EBV) ölümsüzleştirilmiş B-lenfositler de dahil olmak üzere RyR1 kalsiyum kanalını endojen olarak ifade eden insan hücrelerinde araştırılmaktadır. Hücreler hastalardan elde edilir, kültür olarak genişletilir ve Fura-2 veya indo-1 gibi oranmetrik floresan kalsiyum indictors ile yüklenir. Dinlenme [Ca2+] dahil olmak üzere patojenik RYR1 mutasyonları, farklı farmakolojik agonistlere duyarlılık ve hücre içi Ca2+ depolarının büyüklüğü gibi patojenik RYR1 mutasyonları nedeniyle değiştirildiği bildirilen parametreler, floresan mikroskopi kullanılarak veya florometre kullanılarak hücre popülasyonlarında tek hücre düzeyinde ölçülür. Mutasyon taşıyıcılarından hücrelerde elde edilen sonuçlar daha sonra sağlıklı kontrol aile üyelerinden elde edilenlerle karşılaştırılır. Bu yaklaşım göstermiştir ki: (i) MHS ile bağlantılı birçok mutasyon, dinlenmede bir artışa yol açar [Ca2+] ve doz yanıt eğrisinde sola kayarak KCl kaynaklı depolarizasyona veya farmakolojik RyR1 aktivasyonuna 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) CCD'ye bağlı mutasyonlar, RyR1'in farmakolojik aktivasyonu ile salınan zirvede [Ca2+] azalmaya ve hücre içi Ca2+ depolarsa boyutun azalmasına yol açar12,13,14,15; (iii) bazı varyantlar Ca2 + homeostaz13'üetkilemez. Bu deneysel yaklaşımın avantajları şunlardır: RyR1 proteini aşırı ifade değildir ve fizyolojik seviyeler mevcuttur, hücreler mutasyon içeren hücre çizgileri sağlayan ölümsüzleştirilebilir (hem kas hücreleri hem de B-lenfositler). Bazı dezavantajlar, hastaların kalsiyum homeostaz ve/veya heyecan verici kasılma kaplinlerinde (ECC) yer alan birden fazla gen kodlama proteininde mutasyon taşıyabileceği ve bunun deneysel sonuçları zorlaştırabileceği gerçeğiyle ilgilidir. Örneğin, MHS ve kontrol popülasyonunda iki JP-45 varyantı tanımlanmış ve bunların varlığının dihidrohidridin reseptörün (DHPR) aktivasyon16'yaduyarlılığını etkilediği gösterilmiştir. Hastaların mevcut olması, biyolojik materyalin yeni toplanması ve yerel etik kurullardan etik izinler alınması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan protokoller, Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ'nin etik kurallarına uygundur.
1. Epstein Barr'ın hazırlanması ölümsüzleştirilmiş B-lenfosit hücre hatları11
- Bilgilendirilmiş onaydan sonra, RYR1 mutasyonu taşıyan probandtan ve mutasyonu olmayan sağlıklı aile üyelerinden EDTA ile tedavi edilen steril tüplerde 30 mL tam kan toplayın.
NOT: Tüm çözümleri steril tutun ve bir doku kültürü başlığında çalışın. - Mononükleer hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ortamına (örneğin, Ficoll-Hypaque, .077 g/L) göre tam kandan izole edin.
- 50 mL konik steril tüpe 30 mL steril kan yerleştirin.
- Yoğunluk gradyan santrifüjleme ortamını içeren bir Pasteur pipetin ucunu tüpün altına yerleştirin ve 20 mL yoğunluk gradyan santrifüjleme ortam çözeltisinin 20 mL steril tabakası yavaşça kanın altına yerleştirin.
- 18°-20°C'de 900 x g'da 30 dakika santrifüj, kırılma olmadan.
NOT: Mononükleer hücre tabakası, yoğunluk gradyan santrifüj ortam tabakası ile trombosit zenginleştirilmiş plazma içeren üst katman arasındaki ara fazda bulutlu bir halka olarak görünür.
- Steril bir pipet ile mononükleer hücreler (yaklaşık 3-5 mL) içeren ara faz tabakasını hafifçe çıkarın ve çözeltiyi temiz bir 50 mL steril konik tüpe aktarın.
- Hücreleri durulamak için 20 mL fosfat tampon salin (PBS) ekleyin, oda sıcaklığında 600 x g'da 10 dakika santrifüj ekleyin ve peleti PBS'de yeniden depolayın. Toplam üç kez tekrarlayın; bu, tüm ortamların kaldırılmasını sağlar.
- Son yıkamadan sonra, hücreleri 1-2 mL doku kültürü ortamında yeniden biriktirin (% 10 fetal baldır serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 ünite penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş RPMI ortamı). Mononükleer hücreleri (yaklaşık 1 x 106 hücre) 20 mL doku kültürü ortamı içeren bir T125 doku kültürü şişesine yerleştirin.
- Mononükleer hücrelere Epstein-Barr virüsü bulaştırın.
- B95.8 hücre hattı kültürlerinden (-80 °C'de stoklanmış 102-10 3 dönüştürme ünitesi/mL içeren) süpernatantları EBV kaynağı olarak kullanın.
- Doku kültürü ortamının 20mL'sinde 1,5 adımdan 1 x 10 6 mononükleer hücreyi yeniden biriktirin ve enfeksiyon için siklosporin A (0,2 μg/mL son konsantrasyon) varlığında B95,8 hücre hattından 2 mL süpernatanta maruz kalın.
- Şişeyi 37 °C hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücrelerin büyümesine izin verin. Bir hafta sonra kültür ortamını değiştirin.
NOT: B hücreleri çoğalmaya başladıktan sonra tanınabilir kümeler oluştururlar ve kültürlerin genişletilebilmesi ve dondurulabilmesi için hızla büyürler. - Verilen mutasyonun varlığını veya yokluğunu doğrulamak için EBV ölümsüzleştirilmiş B-lenfosit hücre hatları11'den genomik DNA'yı çıkarın.
2. Hücre içi Ca2+ ölçümleri
NOT: EBV-dönüştürülmüş B-lenfosit hücre hatlarının hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, manyetik karıştırıcı ve cuvette tutucu ile donatılmış bir spektrofluorometre ile hücre popülasyonlarında 37 °C olarak ayarlanabilir. Alternatif olarak Ca2+ değişiklikleri floresan mikroskopi ile tek hücrede izlenebilir. Her iki durumda da hücreler doku kültürü şişesinden çıkarılır, Krebs Ringer çözeltisi (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 ,20mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5.5 mM glikoz, 1 mM CaCl2içeren pH 7.4) ile iki kez yıkanır ve sayılır.
- Spektrofluorometre11 , 13,14kullanarak hücre popülasyonlarındaki deneyler için
- Krebs Ringer çözeltisinde 1 x 107 hücre/ mL'lik son konsantrasyonda hücreleri yeniden kullanın ve 5 μM Fura-2/AM son konsantrasyonla 37°C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g'da santrifüj edin ve Krebs Ringer'ın çözeltisinde 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden kullanın.
- Maksimum hızda ayarlanmış ve 37 °C olarak ayarlanmış manyetik karıştırıcı ile donatılmış bir spektroflorometre kullanarak floresan değişikliklerini (oran 340/380 nm) ölçün.
- Deneyden hemen önce hücreleri bir mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca 900 x g'da döndürün ve peletin 0,5 mM EGTA ile Krebs Ringer'ın çözeltisinin 1,5 mL'sinde hızlı bir şekilde yeniden biriktirin, ancak Hiçbir ek Ca2 +.
- Hücreleri 3 mL cam spektrofluorometre cuvette yerleştirin ve floresan oranını kaydedin (340 nm/380 nm eksitasyon, 510 nm emisyon).
- Kararlı bir taban çizgisi elde edin (yaklaşık 30 saniye), seçilen RyR1 agonist konsantrasyonu (4-kloro-m-cresol veya 4-cmc) ekleyin ve kalsiyum geçici kaydedin.
NOT: Başlangıç reaktifi olarak DMSO'da üretilen 4 cmc'lik 300 mM stok çözeltisi kullanılır. Bu çözelti önceden yapılabilir, aliquoted ve birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. - Farklı 4 cmc konsantrasyonları için deneyler yapın.
NOT: [Ca2+] içinde değişime karşı agonist bir doz yanıt eğrisi oluşturmak için 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 750 μM ila 1 mM ekleyin. Farklı 4 cmc konsantrasyonları, stok çözeltisinden uygun 4 cmc hacminin doğrudan Fura-2 yüklü hücreleri içeren cuvette'e eklenmesiyle elde edilir. Örneğin, 300 μM 4 cmc'lik son konsantrasyon için, Krebs Ringer'ın çözeltisinde 1,5 mL hücre içeren cuvette stok çözeltisinin 1,5 μL'si eklenir. Daha düşük agonist konsantrasyonlar için, 300 mM stok çözeltisi DMSO ile 75 mM'ye seyreltilmeli ve Krebs Ringer çözeltisinde 1,5 mL hücre içeren cuvette uygun hacim eklenmelidir. - Hücre içi depolarda bulunan toplam Ca2+ miktarını hesaplamak için hücrelere 400 nM thapsigargin ekleyin. Ca2+tepesini kaydedin.
- Belirli bir 4 cmc konsantrasyonun neden olduğu tepe kalsiyumu, %100 olarak kabul edilen thapsigargin'in neden olduğu tepe kalsiyumuna karşı çizin ve bir proband ve sağlıklı bir akrabadan gelen hücreleri karşılaştıran 4 cmc'lik bir doz yanıt eğrisi oluşturun
- Tek hücre üzerindeki deneyler için13
- Poli-L-lizin 1:10'u steril H2O'da seyreltin ve cam kapakları 30 dakika boyunca önceden tedavi edin. Steril bir doku kültürü başlığı altında havayla kurumaya bırakın.
- EBV dönüştürülmüş B-lenfositleri Krebs Ringer'ın 1 mM CaCl2 içeren çözeltisinde 1 x10 6 hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden askıya alın ve 5 μM Fura-2/AM'lik son bir konsantrasyon ekleyin.
- Poli-L-lizinle işlenmiş kapak örtülerine 1 mL hücre yerleştirin ve EBV hücrelerinin yükleme sırasında cam kapakçığa yapışmasını sağlamak için 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kapak sapını perfüzyon odasına yerleştirin ve Krebs Ringer'ın 1 mM Ca 2+ içeren çözeltisi ile perfüzyona(2mL / dk oranında) başlayın.
- Yazılım kontrollü şarjlı bağlantılı cihaz (CCD) kamera eki ile çevrimiçi ölçümleri kaydetmek için ters floresan mikroskop (40x yağ daldırma hedefi (0,17 sayısal diyafram), filtreler (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) kullanın.
- Sabit pozlama süresinde 1 s aralıklarla Görüntü Alın (hem 340 hem de 380-nm heyecan dalga boyları için 100 ms. Floresandaki değişiklikleri analiz etmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Her hücre için ortalama piksel değerini 340 ve 380 nm13'lükheyecan dalga boylarında ölçün.
- Hücre stimülasyonu elde etmek için, 12 valfli bir hücre perfüzyon stimülatörü kullanın ve 4 cmc'lik farklı konsantrasyonlar ekleyin. Yıkama vanası, sadece hücre içi depolardan kalsiyum salınımını izlemek için Eklenen Ca2 + artı 100 μM La3 + içermeyen Krebs Ringer çözeltisini içerir.
- Yukarıda açıklandığı gibi [Ca2+] içinde değişime karşı 4 cmc'lik bir doz yanıt eğrisi oluşturun.
3. Kas biyopsilerinden insan miyotütlerinin hazırlanması10,12,15
NOT: Uydu hücresi türevli miyoplastlar ve miyotubelar elde etmek için farklı laboratuvarlar tarafından farklı yöntemler kullanılmıştır. Basel'de kullanılan yöntemin açıklaması aşağıdadır.
- Fazla kanı çıkarmak ve yaklaşık 0,5-1 mm'lik küçük parçalar halinde kesmek için steril PBS ile kas biyopsisini durulayın.
- Insert ile 6 kuyu doku kültürü yemekleri hazırlayın. Her kuyuya 1,5 mL insan kası büyüme ortamı ve her kesici uç için 0,5 mL insan kası büyüme ortamı ekleyin.
NOT: Büyüme ortamı aşağıdaki gibi oluşur: Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'un 500 mL'si yüksek glikozlu, veya DMEM (4.5 mg/mL), %10 at serumu, 5 ng/mL insülin, 3 mM glutamin, 600 ng/mL penisilin G ve streptomisin ve 7 mM HEPES, pH 7.4 içerir. Piyasada bulunan iskelet kası büyüme ortamı da kullanılabilir. - Her kesici ucun içine 2-3 küçük kas parçası yerleştirin (Şekil 1A) ve kültür yemeklerini hücre kültürü inkübatörüne (%5 CO2, 37 °C) yerleştirin. Yaklaşık 8-10 gün sonra uydu hücrelerinin ekine bağlı kas biyopsisinin dışında ve çevresinde büyüdüğü görülebilir(Şekil 1, B ve C, oklar).
- Biyopsiden yeterli sayıda hücre bırakın (yaklaşık 10-14 gün sonra), aşağıdaki gibi deneyin:
- Tüm kültür ortamını çıkarın, hücreleri 1 mL PBS ile bir kez durulayın, 0,5 mL tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin (% 0,025 tripsin ve% 0,01 EDTA) ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yaslayın.
- Tripsin etkisini nötralize etmek ve uydu hücrelerini yeni bir T25 hücre kültürü şişesine aktarmak için hücrelere 1 mL büyüme ortamı ekleyin; 3 mL büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin (%5 CO2, 37 °C).
- EDTA'yı kaldırmak için ertesi gün büyüme ortamını değiştirin ve daha sonra ortamı haftada bir kez değiştirin.
- Miyeoblastlar yaklaşık% 75 birleştiğinde, trypsinize ve laminin işlem görmüş cam kapak kapağına aktarın.
NOT: Oran olarak, bir T25 şişesinde büyüyen hücreler 43 mm çapında laminin işlem görmüş bir cam kapak kapağına aktarılmalıdır. Cam kapak, 3 mL büyüme ortamı içeren 60 mm çapında bir doku kültürü plakasına yerleştirilmelidir. - Cam kapaktaki hücreleri, haftada bir kez ortayı değiştiren bir hücre kültürü inkübatöründe(%5CO 2 , 37 °C) büyüme ortamında büyütün. % 90 izdiahta, aşağıdaki gibi yapılmış farklılaşma ortamına geçin: yüksek glikoz DMEM (4.5 mg / mL), % 0.5 sığır serum albümini, 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 0.15 mg/mL kreatin, 5 ng/mL insülin, 200 mM glutamin, 600 ng/mL penisilin G ve streptomisin ve 7 mM HEPES, pH 7.4). Ticari olarak kullanılabilen farklılaşma ortamı da kullanılabilir. Farklılaşma ortamını haftada bir kez değiştirin.
- Farklılaşma ortamında 7-10 gün sonra, çok yönlü miyotubelar görülebilir. Aşağıda açıklandığı gibi, bir hafta içinde [Ca2+] içindeki değişiklikleri değerlendirin.
4. [Ca2+] Fura-2 ile belirleneni oran ölçümleri
- Yük cam kapaklı yetiştirilen miyotüpler, DMEM'de 37 °C'de 30 dakika seyreltilmiş Fura-2/ (5 μM'lik son konsantrasyon) ile yetiştirildi. Kısaca, farklılaşma ortamını cam kapaklı yetişkin hücrelerden çıkarın ve 2 mL taze farklılaşma ortamı ekleyin. 1 mM'lik bir stok çözeltisinden 10 μL Fura-2 ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatörüne 30 dakika kuluçkaya yatırın (%5 CO2, 37 °C).
- Cam kapakları perfüzyon odasına aktarın ve Krebs Ringer'ın 2 mM CaCl2içeren çözeltisi ile hücreleri durulayın.
- 20xsuya daldırma FLUAR hedefi (0,17 sayısal diyafram) kullanarak EBV tek hücre bölümünde yukarıda açıklandığı gibi çevrimiçi [Ca 2+ ] ölçümleri gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+] EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfosit popülasyonlarında i ölçümleri
Primer B-lenfositler, B hücre antijen reseptörü uyarılmış sinyalizasyon işlemleri sırasında Ca2+ salınım kanalı olarak işlev gören RyR1 izoformu ifade eder17. Genetikçiler tarafından hastaların genomik bilgilerini içeren hücre hatlarını elde etmek için rutin olarak kullanılan bir prosedür olan EBV ile B hücrelerinin ölümsüzleştirilmesi, RYR1 mutasyonları 11,13barındıran hastalarda mutant RyR1 Ca2+ kanallarını ifade eden hücre hatları oluşturma avantajı sağlar. [Ca2+] i 4-kloro-m-cresol18 ve kafein gibi spesifik RyR1 agonistlerinin eklenmesiyle ortaya çıkan değişiklikler, belirli bir RYR1 mutasyonunun bir agoniste duyarlılığı değiştirip değiştirmediğini, salınan kalsiyum miktarını, dinlenme [Ca2+] veya mutasyonlardan etkilendiğini gösteren diğer parametreleri belirlemek için kolayca izlenebilir. [Ca2+] i değişiklikleri, fura-2 yüklü hücrelerin popülasyonlarında veya bir spektrofluorometre ile süspansiyonda veya cam kapaklara bağlı ve epifluoresans ile incelenen hücre gruplarında i izlenebilir. Şekil 2 hücre süspansiyonları üzerinde gerçekleştirilen temsili bir deneyi göstermektedir. Cuvette yerlere yerlenmeden hemen önce, hücreler dışarı sızmış olabilecek Fura-2'yi çıkarmak için döndürüldü; hücreler daha sonra sıcak (37 °C) Krebs Ringer çözeltisinde ilave Ca2+ artı 0,5 mM EGTA içermeyen 1 x 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona geri çekildi ve spektrofluorometreye yerleştirildi. Manyetik karıştırıcı, hücreleri süspansiyonda tutmak için 4 pozisyonuna (en yüksek konum) açıldı ve floresan kaydedildi. Kararlı bir iz elde edildikten sonra, seçilen agonist eklendi (Şekil 2A'da bu 300 μM 4-kloro-m-cresol idi) hızlı bir Ca2+ artışına yol açtı ve daha sonra yavaşça dinlenme seviyelerine geriledi. Floresandaki değişimin geçici doğası, (i) floresan veya söndürme bileşiği eklenmesinden kaynaklanan bir eser olmadığını, (ii) hücre dışı Fura-2'ye kalsiyum bağlanmasından kaynaklanmadığını ve (iii) hücrelerin sağlıklı olduğunu ve kalsiyumu sitoplazmalarından aktif olarak çıkarabileceğini gösterdiği için önemlidir.
Aynı deneyin istatistiksel olarak analiz edilmesi için birkaç kez tekrarlanması gerekir. Her hücre hattı ve her gün için deneyler yapılır ve serca inhibitörü thapsigargin11 , 13,14eklenerek mağazalardaki toplam hızlı salınabilir kalsiyum miktarının belirlenmesi gerekir. Şekil 2B'degösterildiği gibi, 400 nM thapsigargin ilavesi, 2,4 keyfi birim (a.u.); böylece Şekil 2B'de gösterilen EBV ölümsüzleştirilmiş B hücrelerinin hücre içi depolarından salınabilecek toplam kalsiyum miktarı 2,4 a.u. (thapsigargin zirvesi) - 1,45 a.u. (dinlenme oranı) veya 0,95 Şekil 2C'degösterilen doz yanıt eğrisi oluşturulurken bu floresan değeri% 100 olarak kabul edilmiştir.
EBV ile ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerinde tek hücre [Ca2+]i ölçümleri
Bu ikinci yaklaşım, belirli bir agonist konsantrasyonuna sahip tek bir hücrenin veya küçük hücre gruplarının uyarılmasına ve floresan değişikliklerinin aynı anda kaydedilmesine izin veren bir floresan mikroskobun ve mikroperfüzyon kurulumunun mevcudiyetine dayanır. Mikroperfüzyon sisteminin şırıngaları, doz yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılacak seçilen RyR1 agonistinin (kafein veya 4-kloro-m-cresol) farklı konsantrasyonlarıyla yüklenir. Şekil 3'tegösterilen örnekte, hücreler, Hücre içi mağazalardan Ca2+ salınımını izlemek için Krebs Ringer'ın çözeltisinde çözünen 0,5-10 mM kafein ile uyarılmıştır. Fura-2 yüklü EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerin takılmasına izin verilen cam kapaklar perfüzyon odasına yerleştirilir ve Krebs Ringer'ın 1 mM Ca2+içeren çözeltisi ile perfüzyonlanır. Hücrelerin çoğu poli-L-lizin ile tedavi edilen kapak kapağına yapışmış olacaktır ve küçük hücre grupları tespit edilmeli ve Fura-2 yüklemesi için kontrol edilmelidir. Perfüzyon sisteminin ucu, kafeinle yıkanması için hücrelere yakın yerleştirilir (ve kapak üzerindeki tüm hücreler değil). Normalde hücreler en düşükten başlayarak en yüksek kafein konsantrasyonuna kadar uyarılır; her konsantrasyon için yeni bir hücre veya hücre grubu seçilir. Oranmetrik floresan ölçümleri (340 nm ve 380 nm'de ekscitasyon, 510 nm emisyon) her saniye 2 dakikaya kadar kaydedilir. Sabit bir taban çizgisi elde etmek için perfüzyondan önce birkaç görüntü elde edilir, daha sonra hücre perfüzyonu başlatılır, ilk olarak hücreleri 5 saniye boyunca 100 μM La3+ içeren Krebs Ringer çözeltisi çözeltisi ile yıkama ile başlatılır. Bu, floresansta bir değişikliğe neden olmamalıdır ve hücre(ler)in deney boyunca kapak kılıflarına yapışmasını sağlamak için bir kontroldür; daha sonra seçilen agonist konsantrasyonunu içeren bir çözelti hücre(ler) üzerine yıkanır. Şekil 3A'dagösterilen örnekte, hücreler 20 saniye boyunca 5 mM kafein ile uyarıldır. Gösterilen ok kafein vanasının ne zaman açıldığını gösterir ve bu da 340/380 nm floresan oranında anında bir artışa neden olur. 20 saniye sonra kafein valfi kapanır ve hücreler Krebs Ringer'ın 100 μM La3+içeren çözeltisi ile yıkanır; floresan taban çizgisine ulaşılana kadar kaydedilir. Her kafein konsantrasyonu için ΔF, yani kafein kaynaklı tepe 340/380 nm floresan - ilk dinlenme 340/380 nm floresan hesaplanır ve Şekil 3B'degösterildiği gibi bir doz yanıt eğrisi oluşturmak için kullanılır. Her kafein konsantrasyonu için 5-10 hücreden ortalama ΔF ortalaması vardır. Hücre içi depolardaki kalsiyum miktarı da izlenebilir. Bu durumda, hücreler Krebs Ringer'ın 0,5 mM EGTA ve 1 μM thapsigargin çözeltisi içeren çözeltisi ile durulanır, Hücrelere 1 μM iyonomisin ve 0,5 mM EGTA elle eklenir (iyonomisin boruya yapıştığı ve yıkanamadığı için mikroperfüzyon sistemi aracılığıyla değil) ve floresan yaklaşık 4-5 dakika boyunca kaydedilir. ΔF'yi hesaplamak için, bir hücreyi özetleyen bir ilgi alanı (ROI) elde edilir ve yatırım getirislerindeki floresan değişiklikleri bir görüntüleme yazılımı kullanılarak hesaplanır.
Özetle, RyR1'in belirli bir agoniste duyarlılığını ölçmek için EBV ölümsüzleştirilmiş B hücreleri kullanırken, farklı günlerde, bir bireyden hücreler üzerinde tekrarlanan deneyler yapılmalıdır. Hücre popülasyonları üzerindeki ölçümler için hücre içi kalsiyum depolarının durumunun değerlendirilmesi gerekir ve EC50 ila agonist kaynaklı kalsiyum salınımı, mağazalardan salınabilecek toplam kalsiyum miktarına göre çizilir. Bu yaklaşımı kullanmanın bir avantajı, milyonlarca hücrenin [Ca2+] yanıtının ortalama olmasıdır; ayrıca mikroperfüzyon sistemi ve floresan mikroskoplara gerek yoktur. Tek hücre yöntemi, daha az sayıda hücrenin kullanılmasına ve seçili hücrelerin [Ca2+] üzerindeki değişikliklerin çevrimiçi görselleştirilmesine izin verir.
Tek hücre [Ca2+]i insan uydu hücresi türetilmiş miyotubes ölçümleri
Yetiştirilen ve farklılaştırılmış cam kapaklı miyotubelar Fura-2 ile yüklenir, perfüzyon odasına aktarılır ve EBV hücreleri için yukarıda açıklandığı gibi Krebs Ringer'ın 2 mM Ca2+ içeren çözeltisinde yıkanır. Perfüzyon sisteminin şırınnaları seçilen agonist ile doldurulur ve miyotubelar yukarıda açıklandığı gibi uyarılır. Kapaklardaki tüm hücreler çok yönlü miyotüpler olmadığından, ölçülecek uygun hücrelerin seçilmesi önemlidir. Küçük miyotüp grupları aynı anda uyarılabilir. Şekil 4'tegösterilen örnekte, tek bir miyotube KCl içeren bir çözelti ile yıkandı, farklı konsantrasyonlarda 4-kloro-m-cresol ve son olarak kafein, ancak normalde doz yanıt eğrileri agonistlere, önceki bölümde belirtildiği gibi, farklı bireylerden hücrelerin agonist duyarlılığını karşılaştırmak için inşa edilir12,15,16 . KCl, plazma membranını depolarize etmenin bir yolu olarak kullanılır. İskelette, kas plazma membran depolarizasyonu, DHPR algılayan voltaj ile algılanır ve böylece RyR1'in aktivasyonuna ve açılmasına yol açan konformasyonel bir değişikliğe uğrar. Öte yandan, 4-kloro-m-cresol ve kafein RyR1'in doğrudan farmakolojik aktivatörleridir.
Şekil 1: Primer insan kas biyopsisi türevi mioblast kültürlerinin üretimi. (A) 0,5 mL büyüme ortamı içeren kesici uçlara küçük kas parçaları (oklar) yerleştirilir. 7-14 gün sonra uydu hücreleri kas dokusuna bitişik ve kesici ucun dibinde büyüyen (küçük oklar) görülebilir. 10x amaç (B) ve 20x amaç (C) aracılığıyla çekilen görüntü. A panelinde bulunan gri kutular hastanın kimliğini örtmek için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EBV'de kalsiyum salınım deneyleri B lenfositleri ölümsüzleştirdi. Fura-2yüklü hücre popülasyonunda süspansiyonda ratiometrik [Ca 2+ ]i ölçümleri. A) 300 μM 4-kloro-m-cresol (ok) ilavesi sitoplazmikte hemen bir artışa neden olur [Ca2+], daha sonra 500 saniye içinde dinlenme seviyelerine geri döner. Bu örnekte, 300 μM 4-kloro-m-cresol ilavesi ile indüklenen ΔF 1.7 floresan ünitesi- 1.4 floresan ünitesi = 0.3 floresan ünitesidir. B) SERCA inhibitörü thapsigargin (400 nM, ok) ilavesi, 2.4 floresan biriminde zirve yapan Fura-2 floresan oranında daha büyük bir artışa neden olur ve daha sonra 1.45 floresan biriminde dinlenme seviyelerine çürür. Thapsigargin indüklenen [Ca2+] geçici hücre popülasyonunda bulunan hücre içi depolarda hızla salınan toplam kalsiyum miktarını temsil eder. Elde edilen tepe geçici (2.4-1.45= 0.95 birim), belirli bir 4 kloro-m-cresol konsantrasyonu ile salınan kalsiyum yüzdesini hesaplamak için kullanılır. C) Hücre içi depolardaki toplam hızlı salınabilir kalsiyum miktarının bir yüzdesi olarak ΔF'i ilişkilendiren temsili doz yanıt eğrileri. 300 μM 4-kloro-m-cresol için bu değer 0.3/0.95x100=%31.6'dır. Her sembol± EBV'den gelen 5-10 değerin ortalama% SEM'ini temsil eder ve bir kontrolden (kapalı daireler, noktalı çizgi) ve RYR1 mutasyonu taşıyan bir MHS bireyinden (kapalı kareler, sürekli çizgi) hücreleri ölümsüzleştirdi. Eğriler sigmoidal doz-tepki eğrisi fonksiyonu kullanılarak oluşturulmuş. Paneller A ve B Girard ve ark.11'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir kontrol bireyinden bireysel EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerinde kafein kaynaklı Ca2+ salınımı. A) Üst paneller, zaman atlamalı görüntüler(A) Faz kontrastı; (B-E), tek hücreli [Ca2+]I fura-2 yüklü EBV-ölümsüzleştirilmiş lenfositlerin ölçümleri: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s ve (E) t=77 s 5 mM kafein uygulamasından sonra. Hücreler, Krebs-Ringer çözeltisinde seyreltilmiş kafein ilavesi ile ayrı ayrı uyarıldı. Ölçek çubuğu=10 μm. Alt panel, 5 mM kafein (ok) ile tek bir hücrenin uyarılmasından sonra elde edilen temsili iz. B) [Ca2+]i'deki kafein bağımlı değişimi gösteren doz yanıt eğrileri, floresan oranındaki değişim olarak ifade edilir (pik oranı 340/380 nm−istirahat oranı 340/380 nm). Her nokta, 4-15 hücrenin floresanındaki değişimin ortalama ± SEM'ini temsil eder. Eğriler sigmoidal doz-tepki eğrisi fonksiyonu kullanılarak oluşturulmuş. Kapalı kareler, noktalı çizgi, kontrol hücreleri; kapalı üçgenler, sürekli çizgi, RYR1 mutasyonu taşıyan MHS birey. Bu rakam Ducreux ve ark.13'ten bir uyarlamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kontrol bireyinden insan miyotüplerinde KCl, 4-kloro-m-cresol ve kafein tarafından uyarılan kalsiyum salınımı. Sol paneller: A) faz kontrastı (B-H), tek hücreli hücre içi Ca2+ Fura-2 yüklü insan miyotütlerinin ölçümleri. B) dinlenme [Ca2+]i; C) t=2 s 150 mM KCl. D uygulamasından sonra t= 2 s 150 μM 4-kloro-m-cresol uygulamasından sonra; E) t=2 s 300 μM 4-kloro-m-cresol uygulamasından sonra; F) t=2 s 600 μM 4-kloro-m-cresol uygulamasından sonra; G) t=2 s 10 mM kafein uygulamasından sonra; H) t=20 s kafein uygulamasından sonra. Sağ panel: Uyarılmış hücredeki floresan oranına (340/380 nm) karşı zaman çizik. Miyotubes, 100 μM La3+içeren Krebs-Ringer tamponunda agonistin eklenmesiyle ayrı ayrı uyarıldı, böylece [Ca2+]i'deki artış sadece hücre içi mağazalardan kalsiyum salınımını temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan protokoller, RYR1 mutasyonlarının kalsiyum homeostaz üzerindeki etkisini incelemek için çeşitli laboratuvarlar tarafından başarıyla kullanılmıştır. Bu makalede özetlenen yaklaşımların kritik adımları sterilite, hücre kültleme becerileri ve teknikleri ve biyolojik materyalin mevcudiyeti ile ilgilenmiştir. Prensip olarak, EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerin kullanımı daha basittir ve mutant RyR1 kanalları içeren hücre hatları üretmesine izin verir. Hücreler uzun yıllar boyunca dondurulabilir ve sıvı nitrojende saklanabilir ve kültürler herhangi bir zamanda yeniden başlatılabilir. Ek olarak, hücre popülasyonlarında veya tek hücre düzeyinde kalsiyum homeostazın izlenmesini seçebilirsiniz. Eski yöntem daha basittir, floresan mikroskop gerektirmez ve araştırmacının kısa bir süre içinde farklı bireylerden oluşturulan hücre hatlarını test etmesine izin verir. Sınırlama, hücre büyümesinin hızı ve tam donanımlı (ısıtılmış ve manyetik karıştırıcılı) spektroflorometrenin kullanılabilirliğidir. Alternatif bir yaklaşım olarak, floresan kalsiyum göstergeleri ile birlikte sitomemetri, EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerindeki kalsiyum akılarını ölçmek için kullanılabilir; hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler bu şekilde belirlenebilir19. Floresan mikroskop, perfüzyon odası ve mikroperfüzyon sistemi mevcutsa, tek hücreli görüntüleme daha hassas olma ve hücreden hücreye değişkenlik, kinetik analiz ve kalsiyum salınımında yer alan hücre altı etki alanlarının tanımlanması dahil olmak üzere daha ayrıntılı bilgi verme avantajına sahiptir. İkinci yaklaşım teknik olarak daha zorludur ve daha fazla ekipman gerektirir.
EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositleri kullanmanın birçok avantajı vardır, diğer parametreler bir yana [Ca2+]i homeostaz ölçülebilir. Örneğin, B hücrelerinin 4-kloro-m-cresol kaynaklı asitlenmesi, hücreleri KONTROL bİrEYLerİNDEN MHS hastalarından ayırt etmek için kullanılmıştır20,21. Bununla birlikte, (i) B hücrelerinin, dolaylı olarak kalsiyum salınımını etkileyebilecek iskelet kası eksitasyon kasılması bağlantısında yer alan proteinlerin çoğunu ifade etmediğini akılda tutmak gerekir, (ii) bunlar heyecan verici olmayan hücrelerdir, bu nedenle plazma membran depolarizasyonu ile fizyolojik olarak aktive edilemezler ve son olarak Monnier ve ark. tarafından hazırlanan bir rapor, bir hastada tanımlanan bir mutasyonun EBV ölümsüzleştirilmiş B hücrelerinde kriyotik bir splice bölgesi nedeniyle ifade edilmemesini buldu22.
Hasta türevi primer kas hücresi kültürleri, kalsiyum homeostazında yer alan proteinleri kodlayan farklı genlerdeki mutasyonların etkisini incelemek isteyen birkaç grup tarafından kullanılmıştır10,23,24. Bu hücreler çok fonksiyonlu miyotüplere ayırt edilebilir, plazma membran depolarizasyonuna yanıt verebilir ve elektrofizyolojik yollarla değerlendirilebilir. Ek olarak, RYR1 mutasyonları taşıyan hücre hatlarını elde etmek için ölümsüzleştirilebilirler25Prosedür B-lenfositlerden çok daha karmaşıktır. Kas hücrelerinin yavaş büyüdüğü ve biyopsiden yeterli sayıda hücreye sahip olmaya kadar gereken sürenin bir aydan fazla olabileceği de doğru olsa da, yıllar sonra mioblast elde etmek için küçük kas biyopsi parçalarını sıvı nitrojende donma ortamında saklamak da mümkündür. Uzun kültleme süreleri bakteriler, mayalar veya küfler tarafından ek bulaşma riskine sahiptir ve yeterince fazla sayıda mioblast elde edilir edinilmez, bunların dondurulması ve sıvı nitrojende saklanması önemlidir. Laboratuvarımız, miyod ile transdüklenmiş ve miyotubes26'yafarklılaştırılmış insan derisi kaynaklı fibroblastlardaki kalsiyum değişikliklerini incelemek için miyotubes için yukarıda özetlenen tekniği başarıyla uygulamıştır. Bu, kas biyopsisi türevli mioblastlar mevcut olmadığında RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için yapıldı. B-lenfositlere gelince, MHS ile bağlantılı RYR1 mutasyonu olan hastalardan miyotütlerin 4-kloro-m-cresol kaynaklı asitlenmesi başarıyla test edilmiştir27.
Sonuç olarak, genotip-fenotip korelasyonunu incelemek için hastalardan biyolojik materyal kullanımı dezavantajı birçok avantaja sahiptir ve RYR1'deki mutasyonların etkisini incelemek için başarıyla kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımı kullanırken, diğer genlerde bulunan mutasyonların kalsiyum homeostazı etkileyebileceğini akılda tutmak önemlidir; bu nedenle, aynı mutasyonu barındıran farklı ailelerden ve RYR1 mutasyonu kontrol olarak barındırmayan aile üyelerinden hücrelerin kullanımı yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yazıda açıklanan çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF) ve İsviçre Kas Vakfı'nın hibeleriyle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
