Method Article

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

DOI:

10.3791/62229

⸱

February 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת להקצאה הדורית הראשונית והמתמשכת של גידולי דרוזופילה לתוך בטנם של מארחים בוגרים לחקר היבטים שונים של ניאופלזיה. באמצעות מנגנון autoinjector, חוקרים יכולים להשיג יעילות משופרת ותפוקת הגידול בהשוואה לאלה שהושגו על ידי שיטות מסורתיות, ידניות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההקצאה של גידולים ב - Drosophila melanogaster באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי. עם השימוש במנגנון autoinjector, מפעילים מיומנים יכולים להשיג תוצאות השתלה יעילות ועקביות יותר בהשוואה לאלה המתקבלות באמצעות מזרק ידני. כאן אנו מכסים נושאים בצורה כרונולוגית: החל מחציית קווי דרוזופילה , דרך אינדוקציה ונתיחה של הגידול הראשוני, השתלת הגידול הראשוני לפונדקאי בוגר חדש והמשך השתלה דורית של הגידול למחקרים ממושכים. כהדגמה, כאן אנו משתמשים בתחום התוך-תאי של Notch (NICD) בביטוי יתר המושרה על ידי גידולי טבעת הרוק המושרים על ידי בלוטת הרוק לצורך השתלה דורית. גידולים אלה יכולים תחילה להיות מושרים באופן אמין במיקרו-סביבה של אזור מעבר בתוך טבעות דמיוניות של בלוטת הרוק הזחלית, ולאחר מכן להשתיל אותם ולתרבת אותם in vivo כדי לחקור את המשך גדילת הגידול, האבולוציה והגרורות. שיטת ההקצאה הזו יכולה להיות שימושית בתוכניות בדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם לחקר אינטראקציות בין גידול למארח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הנחיה שלב אחר שלב להקצאה של גידולים דמיוניים של בלוטת הרוק הזחלית של דרוזופילה (SG) לתוך הבטן של מארחים בוגרים באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי (למשל, Nanoject). פרוטוקול זה מספק גם כיוונים להשתלה מחדש של גידולים לדורות חדשים של מארחים בוגרים, מה שמספק הזדמנויות להמשך מחקר אורך של מאפייני הגידול, כגון אבולוציה של גידולים ואינטראקציות בין גידולים לפונדקאים. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על ניסויים בסינון תרופות.

שיטה זו פותחה כדי לשפר את היעילות של ביצוע allotransplantation הגידול ב Drosophila באמצעות מזרקים ידניים1, אשר לעתים קרובות אינם עקביים בכוחות היניקה וההזרקה שלהם, מה שמוביל לת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת גידול טבעת דמיוני SG

  1. צלב זבובים בוגרים עם גנוטיפים של UAS-NICD (זכר: 10-15 זבובים) ו - Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (נקבה בתולה: 10-15 זבובים) ומאפשר להם להתרבות במשך יום אחד ב -18 מעלות צלזיוס. הזבובים הבוגרים שנבחרו צריכים להיות בני 5-9 ימים כדי להבטיח פוריות גבוהה.
  2. אפשרו לזבובים הבוגרים להטיל ביצים במזון הזבובים הכלול בבקבוקונים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס, ואז הסירו את הזבובים הבוגרים.
    הערה: מזון זבובים מוכן באמצעות מתכון מזון קמח תירס סטנדרטי ממרכז Drosophila Stock 8. כל בקבוקון צריך להכיל כ-10 מ"ל של מזון זבובים.
  3. אפשרו לביצים לדגור במשך 6 י....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, ביצענו הקצאה דורית של גידולי טבעת דמיוניים של SG באמצעות מנגנון ההזרקה האוטומטית של הזרקת ננוליט וביצענו הדמיה חיה של הגידול לאחר מכן עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, שאיפשר צלילה עמוקה יותר לנושאים של צמיחת גידול, נדידת תאי גידול ואינטראקציות בין גידול למארח. בעת הרכבת זבובים, הדביקו אותם למגלשת מיקרוסקופ וריסן אותם באמצעות בלוק11 של פולידימתילסילוקסן (PDMS).

איור 5A כולל לכידת הדמיה חיה של גידול טבעת דמיוני SG מהדורהראשון

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלוטרנסנטציה של גידולים יכולה לסייע לחוקרים לטפל בבעיות מסוימות המתעוררות במהלך גדילת הגידול בהתקדמותו של דרוזופילה. אתגר אחד כזה הוא עקיפת מקרי מוות בטרם עת של זחלים נושאי גידול או מבוגרים במהלך תרבית גידול ראשונית12. בהקשר זה, המשך ההקצאה של הגידול מאפשר לגידולים לגדול ללא הגבלת זמן, מה שמקל על מחקרי אורך של גדילת גידולים, גרורות ואבולוציה. אלוטרנספלציה של גידולים שימושית גם להערכת היבטים שונים של אינטראקציות בין פונדקאי לגידול 7,13

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי עניינים להצהיר בין המחברים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי המעבדה לשעבר ד"ר שנג-אן יאנג ולמר חואן-מרטין פורטייה על תרומתם בפיתוח פרוטוקול זה. אנו אסירי תודה למעבדתו של ד"ר יאן סונג בבית הספר למדעי החיים של אוניברסיטת פקין על שיתוף הפרוטוקול שלהם בנושא הקצאה ידנית. אנו מודים גם למר קאלדר אלסוורת' ולמר אוורסט שפירו על הקריאה הביקורתית בכתב היד.

נשק להשמדה המונית קיבל מימון (GM072562, CA224381, CA227789) עבור עבודה זו מהמכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/) ומימון (IOS-155790) מהקרן הלאומית למדע (htps://nsf.gov/). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissLSM 980ידוע גם בשם "Zeiss LSM 980"
זבוב קמח תירסבלומינגטון דרוזופילה Stock CenterN/Aידוע גם בשם "מזון קמח תירס סטנדרטי BDSC"
מחט דיסקציה (30Gx1/2)BD PrecisionGlide305106
צלחת דיסקציהפישר סיינטיפיק12-565B
קלטת זבובפישרברנד159015A
מתאם פלואורסנטי למיקרוסקופ סטרומדעי מיקרוסקופ אלקטרוניםSFA-UVהידוע גם בשם "מתאם פלואורסצנטי של ים לילה"
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeiss495015-0001-000הידוע גם בשם "Zeiss Stereo Discovery.V8"
מדע עדיניםשל מלקחיים11251-10ידוע גם בשם "דומונט #5 מלקחיים" 
נימי זכוכית (3.5 '')Drummond3-000-203-G/X
דבקElmerE305ידוע גם בשם "Elmer Washabale Clear Glue"
, מיקרוסקופ אורZeiss435063-9010-100ידוע גם בשם "Zeiss Stemi 305"
, Micropipette PullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000ידוע גם בשם "חולץ מיקרופיפטה ארבעה שלבים""
Nanoject ApparatusDrummond3-000-204ידוע גם בשם "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
ThermoFisher21720001 בינונישל שניידר
(27G x1/2)BD PrecisionGlide305109
בקבוקוןFisherbrandAS507
מזון כלי מזרק

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
  2. Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor AllotransplantationDrosophila MelanogasterAuto Nanoliter InjectorTumor TransplantationSalivary Gland TumorImaginal Ring TumorTumor Host InteractionLive ImagingCancer Drug ScreeningTumor Progression

Related Articles