Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62229
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tulane University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת להקצאה הדורית הראשונית והמתמשכת של גידולי דרוזופילה לתוך בטנם של מארחים בוגרים לחקר היבטים שונים של ניאופלזיה. באמצעות מנגנון autoinjector, חוקרים יכולים להשיג יעילות משופרת ותפוקת הגידול בהשוואה לאלה שהושגו על ידי שיטות מסורתיות, ידניות.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את ההקצאה של גידולים ב - Drosophila melanogaster באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי. עם השימוש במנגנון autoinjector, מפעילים מיומנים יכולים להשיג תוצאות השתלה יעילות ועקביות יותר בהשוואה לאלה המתקבלות באמצעות מזרק ידני. כאן אנו מכסים נושאים בצורה כרונולוגית: החל מחציית קווי דרוזופילה , דרך אינדוקציה ונתיחה של הגידול הראשוני, השתלת הגידול הראשוני לפונדקאי בוגר חדש והמשך השתלה דורית של הגידול למחקרים ממושכים. כהדגמה, כאן אנו משתמשים בתחום התוך-תאי של Notch (NICD) בביטוי יתר המושרה על ידי גידולי טבעת הרוק המושרים על ידי בלוטת הרוק לצורך השתלה דורית. גידולים אלה יכולים תחילה להיות מושרים באופן אמין במיקרו-סביבה של אזור מעבר בתוך טבעות דמיוניות של בלוטת הרוק הזחלית, ולאחר מכן להשתיל אותם ולתרבת אותם in vivo כדי לחקור את המשך גדילת הגידול, האבולוציה והגרורות. שיטת ההקצאה הזו יכולה להיות שימושית בתוכניות בדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם לחקר אינטראקציות בין גידול למארח.

Introduction

פרוטוקול זה מספק הנחיה שלב אחר שלב להקצאה של גידולים דמיוניים של בלוטת הרוק הזחלית של דרוזופילה (SG) לתוך הבטן של מארחים בוגרים באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי (למשל, Nanoject). פרוטוקול זה מספק גם כיוונים להשתלה מחדש של גידולים לדורות חדשים של מארחים בוגרים, מה שמספק הזדמנויות להמשך מחקר אורך של מאפייני הגידול, כגון אבולוציה של גידולים ואינטראקציות בין גידולים לפונדקאים. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על ניסויים בסינון תרופות.

שיטה זו פותחה כדי לשפר את היעילות של ביצוע allotransplantation הגידול ב Drosophila באמצעות מזרקים ידניים1, אשר לעתים קרובות אינם עקביים בכוחות היניקה וההזרקה שלהם, מה שמוביל לתוצאות לא אופטימליות עבור allotransplantation הגידול. מנגנון אוטו-איניג'קטור מספק שליטה טובה יותר ויכול לגרום לשיעורים נמוכים יותר של תמותת זבובים לאחר אלוגרפט. מפעיל מיומן יכול להשיג שיעור הישרדות של יותר מ-90% עם המזרק האוטומטי, לעומת כ-80% כאשר נעשה שימוש במזרק הידני1. שיעור רכישת הגידול הכולל הוא 60%-80% ביום 8-12 לאחר הלידה. זמן ההזרקה הממוצע השתפר גם הוא מ-30-40 שניות לטוס באמצעות מזרק ידני ל-20-25 שניות לטוס באמצעות האוטו-איניג'קטור.

פרוטוקול זה הוא בין הפרוטוקולים הראשונים שהשתמשו במנגנון האוטו-איניג'קטור באלוטרנספלנטציה של גידול דרוזופילה . מחקר שנערך לאחרונה השתמש גם ב-autoinjector עבור ההקצאה של תאי גזע עצביים סרטניים2. בעבר, מנגנון autoinjector שימש Drosophila כדי לחקור ויראליות חיידקית3, זיהומים טפיליים והגנה המארח4, כמו גם הקרנה עבור פעילות ביולוגית של תרכובות שונות5. הפרוטוקול שלנו מתאים את מנגנון ה-autoinjector לשימוש בהזרקת גידולים ומבקש לספק לחוקרי Drosophila תוצאות איכותיות ועקביות יותר תוך חיסכון בזמן רב. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק עבור allotransplantation של גידולים, אלא יכול להיות מותאם גם אלוטרנספלנטציה של wildtype ורקמות מוטנטיות של קליבר דומה6.

גידול ה-Drosophila NICD המשמש בפרוטוקול זה הוצג לראשונה על ידי Yang et al.7 באזור המעבר של הטבעת הדמיונית SG, "נקודה חמה של גידול" המציג רמות גבוהות של מתמר ג'אנוס קינאז/אותות אנדוגניים ומפעילי שעתוק (JAK-STAT), ופעילות c-Jun N-terminal Kinase (JNK). בנוסף, באזור המעבר יש רמות גבוהות של מטריצה metalloproteinase-1 (MMP1)7, מה שהופך את האזור הזה לתרום במיוחד לגידולים סרטניים. הפעלת מסלול חריץ באמצעות ביטוי יתר של NICD בלבד מספיקה כדי ליזום באופן עקבי היווצרות גידולים. לאחר מכן ניתן להקצות גידולים אלה כדי לאפשר חקירה של מגוון רחב של נושאים, כולל חלוקת תאי גידול, פלישה ואינטראקציות בין גידול לפונדקאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת גידול טבעת דמיוני SG

  1. צלב זבובים בוגרים עם גנוטיפים של UAS-NICD (זכר: 10-15 זבובים) ו - Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (נקבה בתולה: 10-15 זבובים) ומאפשר להם להתרבות במשך יום אחד ב -18 מעלות צלזיוס. הזבובים הבוגרים שנבחרו צריכים להיות בני 5-9 ימים כדי להבטיח פוריות גבוהה.
  2. אפשרו לזבובים הבוגרים להטיל ביצים במזון הזבובים הכלול בבקבוקונים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס, ואז הסירו את הזבובים הבוגרים.
    הערה: מזון זבובים מוכן באמצעות מתכון מזון קמח תירס סטנדרטי ממרכז Drosophila Stock 8. כל בקבוקון צריך להכיל כ-10 מ"ל של מזון זבובים.
  3. אפשרו לביצים לדגור במשך 6 ימים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. במהלך תקופה זו, הזחלים יבקעו.
  4. מעבירים את הבקבוקונים המכילים זחלים לחממה של 29 מעלות צלזיוס ואינקובציה למשך 7 ימים נוספים.
    הערה: שלב דגירה זה הוא אופציונלי בהתאם לתכנון הניסוי הספציפי.

2. הכנת דרוזופילה מסוג בר בוגר להקצאת אלוטרנספלנטציה

  1. מרדימים זבובים בוגרים מסוג פראי או מוטנטיים מתאימים עם 100% CO2 וממיינים זבובים על בסיס מינים. זבובים זכריים ונקביים כאחד יכולים לשמש כמארחי גידול.
  2. הצמידו פיסת סרט דבק באורך 5 ס"מ לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הדביק למעלה על ידי תיקון שלה עם שתי חתיכות קטנות יותר של סרט הדבקה, אחת בכל קצה.
  3. שתקו את הזבובים על ידי הצמדת כנפיהם לקלטת. השתמש במלקחיים תוך כדי תמרון הזבובים.
    1. חזור על השלב הנ"ל עבור 60-80 זבובים בוגרים המשמשים כמקבלי allograft.
      הערה: עדיף לארגן זבובים בשורות מסודרות, כאשר ציר הגוף שלהם מיושר במקביל זה לזה לתהליך הזרקה יעיל יותר בזמן מאוחר יותר. איור 1 מציג שורות של זבובים מארחים מודבקים כלפי מטה באופן זה.

3. הרכבת מנגנון האוטו-איניג'קטור

  1. חברו גם את מנגנון ההתקן האוטומטי וגם את כבל החשמל לתיבת הבקר.
    1. הגדר את נפח ההזרקה ל- 59.8 nL. זה יעזור לשמור על הכמות המתאימה של כוחות יניקה והזרקה במהלך allotransplantation.
  2. מקם את תיבת הבקר ואת ה- autoinjector בצדדים מנוגדים של מיקרוסקופ האור.
    הערה: עבור מפעילים ימניים, יש למקם את תיבת הבקרה בצד שמאל של המיקרוסקופ עם המזרק בצד ימין. להיפך עבור מפעילים שמאליים.
  3. הכינו את נימי הזכוכית בגודל 3.5 אינץ' לשימוש על ידי חיתוך הקצה הסגור עם מלקחיים.
    1. לעבד קצה אחד של נימי הזכוכית באמצעות מושך מיקרופיפט בן ארבעה שלבים וחום לקצה צר וסגור באמצעות המפרטים הבאים במכשיר: חום = 650, כוח = 200, ומרחק = 8. מקם בצורה מסודרת את הנימים במנגנון המושך והפעל את התוכנית לאחר הזנת ההגדרות לעיל.
    2. השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הנימים בזווית של כ-60° כדי ליצור קצה חד יותר לכניסה קלה לבטן הזבוב הבוגר1. ראו איור 2 דוגמה לנימי נכים חתוכים היטב.
  4. שחררו קלות את הכובע של המזרק. הצמידו את כפתור ה-Empty כדי לקדם את מחט המזרק עד שיראו 70%-80% מאורכו הכולל. כדי להאיץ את התקדמות הנימים, לחץ על לחצן מילוי פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על הלחצן 'ריק '.
  5. השתמש במזרק כדי למלא את נימי הזכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, הכנס בזהירות את נימי הזכוכית על מחט המזרק עד שהראשון מחובר בחוזקה לפקק הגומי של המזרק. עכשיו תברגו את מכסה המזרק חזק.
    1. נגבו את שאריות השמן המינרלי על פני השטח החיצוניים של כיסוי נימי הזכוכית כדי למנוע זיהום של המדיום במהלך ההקצאה.

4. דיסקציה של גידול הטבעת הדמיונית SG

  1. בחר אחד מהזחלים והעביר אותו לצלחת דיסקציה מלאה ב-100 מיקרול'ס מדיום של שניידר כדי להתכונן לנתיחה של גידול טבעתי דמיוני של SG.
    הערה: רק הדגימות המכילות את הגידול יישארו כזחלים. הסיבה לכך היא שצמיחת הגידול מעכבת את התפתחות הזחל ואתהתקדמותו 9. שני שלישים מהדגימות לא יאכלו את הגידול ולכן יתקדמו לגלמים/מבוגרים.
    1. למטרות כריתה והקצאה, השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם טווח הגדלה של 10x-20x.
  2. באמצעות זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את החלק האמצעי של גוף הזחל, צובטים את ראש הזחל באמצעות זוג מלקחיים נוספים ומפעילים כוח מתיחה לאורך.
  3. אתרו את ה-SG בצורת Y של הזחלים ובודדו אותו משאר רקמת הזחל10.
  4. לנתח ולבודד את הגידול הטבעתי הדמיוני SG על ידי הסרת הרקמה הסמוכה. ראו איור 3 לתיאור של תהליך הנתיחה הזה.
  5. חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור 10 עד 20 גידולי טבעת דמיוניים נוספים של SG המבוססים על צרכי מחקר.

5. Allograft של גידול טבעת דמיוני SG ראשוני

  1. טבלו את הנימים לתוך המדיום של שניידר המכיל את גידולי הטבעת הדמיוניים העיקריים של SG. הקישו לחיצה על כפתור המילוי כדי למלא את נימי הזכוכית ב-Schneider's Medium עד לקטע העליון של 0.5 ס"מ. קטע עליון זה צריך להישאר מלא בשמן מינרלי.
    הערה: האץ תהליך זה על-ידי לחיצה על לחצן 'ריק ' פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על לחצן 'מילוי '.
  2. אתרו גידול ראשוני ולחצו על כפתור המילוי עד שהגידול נשאב לתוך הנימים.
    1. ודא שהגידול יושב בקצה הנימים או במרחק של כמה מילימטרים מקצה הנימים. זה עוזר למנוע את הגידול להיסחף וללכת לאיבוד בתמיסה הכלולה בתוך הנימים. ראו איור 4A להדגמה של מיקום הגידול המתאים כשהוא יושב בנימילים.
  3. אתר זבוב מבוגר משותק לקלטת על שקופית המיקרוסקופ. באמצעות מלקחיים, החזק בעדינות את הבטן התחתונה. לאחר מכן, לנקב את הציפורן הלטרלית התחתונה של הבטן עם הנימים. לחץ על כפתור ריק עד שהגידול נכנס לבטן המארחת החדשה. ראו איור 4B להדגמה של טכניקה זו.
  4. באמצעות מלקחיים, צובטים בעדינות את כנפיו של המארח כלפי מעלה כדי להסיר אותו מהסרט. מכניסים את המארח לבקבוקון חדש עם אוכל טרי. עדיף למקם את הבקבוקון לצדדים במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההזרקה. כל בקבוקון צריך להכיל רק עד 20 זבובים לכל היותר.
    הערה: לחלק מהזבובים המארחים יהיו כנפיים חסרות ופצעים אחרים על גופם לאחר ההזרקה והם עלולים להידבק למזון הזבובים אם הבקבוקון מונח זקוף.
  5. חזור על שלבים 5.2 עד 5.4 כדי להשתיל את הגידולים הראשוניים הנותריםבמארחים הבוגרים החדשים שלהם.
  6. השליכו נימים למיכל של שארפ ונקו את שאריות השמן המינרלי מהחלק החיצוני של האוטו-איניג'קטור לפני שהחליפו את המנגנון בחזרה לתוך הקופסה שלו.
  7. אחסנו את בקבוקון המארחים בטמפרטורת החדר למשך יום אחד, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקון לתא דגירה בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס. העברת מארחי זבובים לבקבוקונים חדשים כל 2-3 ימים.
  8. עקוב אחר מארחי הזבובים מדי יום וחשב את שיעורי ההישרדות. לאחר שבוע, גידולים צריכים להיות גלויים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מתאם פלואורסצנטי וניתן לעקוב אחריהם באופן רציף אחר גודלם והתקדמותם.

6. השתלה מחדש של גידולים מושתלים

  1. בסביבות 10-14 ימים לאחר ה-allograft, יש לסנן גידולים שגדלו בבטן המארחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. הרדימו פונדקאי עם CO2 והניחו אותו בצלחת דיסקציה מלאה במדיום של שניידר של 100 μL. נתחו את הגידול הגדל מתוך הפונדקאי באמצעות שני זוגות מלקחיים.
    1. השתמשו בזוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הבטן ובזוג השני כדי לפתוח את קוטיקת הבטן, וחשפו את הגידול המושתל1.
    2. יש לבודד בזהירות את הגידול מהרקמות המארחות המחוברות ככל האפשר באמצעות סמני פלואורסצנציה כהנחיה.
  3. חזור על שלב 6.2 כדי להתכונן לשניים עד שלושה גידולים נוספים.
  4. מעבירים את לוחית הנתיחה המכילה את הגידולים שנקטפו על הבמה של מיקרוסקופ אור.
  5. השתמש במחטים סטריליות ונתח את הגידולים לחתיכות קטנות יותר המתאימות לגודל הנימים.
  6. חזור על שלבים 4.1-4.5 כדי להכין את הדור החדש של המארחים הבוגרים ולחזור על שלבים 5.1-5.7 כדי להשלים את ההקצאה של הגידולים.
    הערה: שיעורי ההצלחה בדרך כלל גבוהים יותר עבור גידולים שאינם ראשוניים בהשוואה לאלה של גידולים ראשוניים.
  7. חזור על שלבים 6.1-6.6 עבור כל דור הבא של זבובים המשמשים במחקר.
    הערה: בחר קווי מארח של Drosophila המתאימים לצרכים הניסוייים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, ביצענו הקצאה דורית של גידולי טבעת דמיוניים של SG באמצעות מנגנון ההזרקה האוטומטית של הזרקת ננוליט וביצענו הדמיה חיה של הגידול לאחר מכן עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, שאיפשר צלילה עמוקה יותר לנושאים של צמיחת גידול, נדידת תאי גידול ואינטראקציות בין גידול למארח. בעת הרכבת זבובים, הדביקו אותם למגלשת מיקרוסקופ וריסן אותם באמצעות בלוק11 של פולידימתילסילוקסן (PDMS).

איור 5A כולל לכידת הדמיה חיה של גידול טבעת דמיוני SG מהדורהראשון (G1) הגדל בבטן מארחת בוגרת ביום ה-10 שלאחר ההקצאה. ניתן להשתמש ברמה זו של הדמיה כדי לעקוב אחר תהליך חלוקת הגידול. איור 5B מתאר גידול טבעתי דמיונישל דור 6 (G6) SG התופס חלק גדול מהבטן המארחת ביום ה-10 שלאחר ההקצאה. הדמיה בשלב זה עשויה לסייע בחשיפת דפוסי גדילת הגידול, כמו גם התנהגויות הנדידה והפלישה שלו. חשוב לציין שלמרות שתמונה זו צולמה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, סטריאומיקרוסקופ עם מתאם פלואורסצנציה GFP יכול לשמש גם בהגדלה של פי 2 עד פי 5, בהתאם לגודל הגידול.

Figure 1
איור 1: זבובים מארחים מודבקים ומאובטחים להקצאה. הזבובים המארחים מודבקים על ידי כנפיהם ומכוונים בצורה מסודרת כדי להתכונן להליך ההשתלה הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: נימי הזרקה חתוכים היטב. החץ האדום מצביע על קצה חד הדרוש כדי לחדור ביעילות את קוטיקת הבטן של מארחי דרוזופילה בוגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כריתה של הגידול העיקרי בבלוטת הרוק ImR. תהליך הניתוח והבידוד של שני גידולי ImR ראשוניים של בלוטת הרוק מודגם באופן כרונולוגי מפאנל (A) לפאנל (B), תוך שימוש בשני חתכים נפרדים. פאנל (A) מציג את בלוטת הרוק לפני כריתת הגידול. ראשי החצים האדומים מציינים את נקודות החתך הראשונות. ראשי החץ הכחולים מציינים את נקודות החתך השניות. הגידול נמצא בין ראשי החץ האדומים והכחולים. פאנל (B) מראה את הגידול המבודד ImR לאחר ששני החתכים נעשים כדי להפריד אותו מרקמת בלוטת הרוק הרגילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מיקום מתאים של הגידול בתוך הנימים והזרקת הגידול לתוך הבטן המארחת של Drosophila . פאנל (A) מציג את מיקום הגידול המתאים ביותר בתוך הנימים. הגידול מבטא eGFP (488 ננומטר). לוח (B) מציג את תהליך ההזרקה. החץ האדום מציין את אתר הזרקת הגידול. החץ הכחול מראה את מיקום המלקחיים כדי לעזור להחזיק את הטרמינליה של הזבוב לזריקה קלה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: גידול G1 ו-G6 ImR שנראה בבטן המארחת של WT Drosophila ביום ה-10 שלאחר ההקצאה. אלה הם מבטים גחוניים של הבטן זבוב עם הגידולים המושתלים בירוק. פאנל (A) מראה גידול G1 ביום ה-10 שלאחר ההקצאה המבטאת eGFP (488 ננומטר). לוח (A) נלכד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עדשת 20x עם 0.8 NA וזום 3x. פאנל (B) מראה גידול G6 ביום 10 שלאחר ההקצאה המבטאת eGFP (488 ננומטר). פאנל (B) נלכד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עדשת 5x עם 0.25 NA וזום סריקה של 1x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אלוטרנסנטציה של גידולים יכולה לסייע לחוקרים לטפל בבעיות מסוימות המתעוררות במהלך גדילת הגידול בהתקדמותו של דרוזופילה. אתגר אחד כזה הוא עקיפת מקרי מוות בטרם עת של זחלים נושאי גידול או מבוגרים במהלך תרבית גידול ראשונית12. בהקשר זה, המשך ההקצאה של הגידול מאפשר לגידולים לגדול ללא הגבלת זמן, מה שמקל על מחקרי אורך של גדילת גידולים, גרורות ואבולוציה. אלוטרנספלציה של גידולים שימושית גם להערכת היבטים שונים של אינטראקציות בין פונדקאי לגידול 7,13. ניתן לתמרן את הגנוטיפים המארחים לפני אלוגרפט הגידול כדי לאפשר הערכה של השפעת המארח על גדילת הגידול ועל נדידתו, ועל cachexia14,15 המושרה על ידי הגידול. מארחי זבובים עם גנוטיפים שונים עשויים להפגין ביטויים מובהקים של בזבוז דמוי cachexia בתגובה לאותו גידול. לאחר ההקצאה, ניתן להרכיב את מארחי הגידולים כהכנה להדמיית in vivo באמצעות פרוטוקול המותאם מ- Koyama et al. ו- Ji et al.11,16.

היישום של מנגנון autoinjector לכיוון אלוטרנספלנטציה של גידול Drosophila מספק פרוטוקול נוח ופשוט בעל יעילות משופרת. בהשוואה למזרק הידני1, שיטה זו מאפשרת הקצאות הניתנות לשחזור ולקנה מידה גדול, אשר יכולות לזרז ולתקנן מחקרי התנהגות גידולים והליכי סינון תרופות. שיטה משופרת זו מייצרת שיעורי הישרדות ותפוקת גידולים מרשימים של פונדקאים. חוקר מיומן יכול להשיג שיעורי הישרדות של פונדקאים לאחר אלוגרפט של >90%. שיעורי התשואה של הגידול יכולים להשתנות בהתאם לשאלה אם הגידול הוא ראשוני או מושתל מחדש. חוקרים יכולים לצפות להשיג שיעורי תשואה של גידולים של >50% עבור גידולים ראשוניים ו->70% עבור גידולים שעברו השתלה מחדש. בנוסף, שיטה זו מפחיתה את זמן ההזרקה לכל זבוב מארח בכמעט 50% בהשוואה לשיטת המזרק הידנית.

הליך זה יש מגבלות, עם זאת, בעיקר בשל חוסר עקביות של חתך הגידול, מיקום ההזרקה וגודל הפצע. אם הגידולים הראשוניים אינם נחתכים לרסיסים בגודל אחיד לפני ההקצאה, פונדקאי זבובים מסוימים יכולים לקבל שברים גדולים יותר מאחרים. זהו גורם מבלבל המשפיע על מחקרים שמטרתם לעקוב אחר קצב גדילת הגידול. ניתן למתן זאת על ידי מדידת הקצב הדיפרנציאלי של צמיחת הגידול במרווחים של יומיים לאחר ההדבקה. בנוסף, במהלך ההזרקה, המפעיל צריך לבחור אתר עקבי בציפורן הבטן על פני כל הזבובים המארחים. זה עוזר למתן משתנה מבלבל נוסף שעשוי להשפיע על הישרדות מארח הזבוב ועל המיקום הסופי של חיבור הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי עניינים להצהיר בין המחברים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה לשעבר ד"ר שנג-אן יאנג ולמר חואן-מרטין פורטייה על תרומתם בפיתוח פרוטוקול זה. אנו אסירי תודה למעבדתו של ד"ר יאן סונג בבית הספר למדעי החיים של אוניברסיטת פקין על שיתוף הפרוטוקול שלהם בנושא הקצאה ידנית. אנו מודים גם למר קאלדר אלסוורת' ולמר אוורסט שפירו על הקריאה הביקורתית בכתב היד.

נשק להשמדה המונית קיבל מימון (GM072562, CA224381, CA227789) עבור עבודה זו מהמכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/) ומימון (IOS-155790) מהקרן הלאומית למדע (htps://nsf.gov/). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 980 Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food Bloomington Drosophila Stock Center N/A Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2) BD PrecisionGlide 305106
Dissection Plate Fisher Scientific 12-565B
Fly Tape Fisherbrand 159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope Electron Microscopy Sciences SFA-UV Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope Zeiss 495015-0001-000 Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps Fine Science Tools 11251-10 Also known as "Dumont #5 Forceps" 
Glass Capillary (3.5'') Drummond 3-000-203-G/X
Glue Elmer E305 Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope Zeiss 435063-9010-100 Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller World Precision Instruments PUL-1000 Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus Drummond 3-000-204 Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium ThermoFisher 21720001
Syringe (27G x1/2) BD PrecisionGlide 305109
Vial Fisherbrand AS507

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
  2. Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
  3. Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
  4. Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
  5. Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
  6. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
  7. Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
  8. Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
  9. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
  10. Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
  11. Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  12. Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
  13. Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
  14. Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
  15. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  16. Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).

Tags

חקר הסרטן גיליון 168 דרוזופילה בלוטת הרוק NICD אלוגרפט הגידול השתלה הקצאה אלוטרנספלנטציה אוטו-איניג'קטור הדמיה חיה
אלוטרנספלנטציה של גידול <em>בדרוזופילה מלנוגסטר</em> עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, S., Zhang, Y., Bao, H., Wang,… More

Gong, S., Zhang, Y., Bao, H., Wang, X., Chang, C. H., Huang, Y. C., Deng, W. M. Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector. J. Vis. Exp. (168), e62229, doi:10.3791/62229 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter