Summary
Este protocolo proporciona una guía detallada para el alotrasplante generacional inicial y continuo de tumores de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos para estudiar diversos aspectos de la neoplasia. Utilizando un aparato autoinyector, los investigadores pueden lograr una mejor eficiencia y rendimientos tumorales en comparación con los logrados por los métodos manuales tradicionales.
Abstract
Este protocolo describe el alotrasplante de tumores en Drosophila melanogaster utilizando un aparato de inyección de auto-nanolitrolitros. Con el uso de un aparato autoinyector, los operadores capacitados pueden lograr resultados de trasplante más eficientes y consistentes en comparación con los obtenidos utilizando un inyector manual. Aquí, cubrimos temas de manera cronológica: desde el cruce de líneas de Drosophila , hasta la inducción y disección del tumor primario, el trasplante del tumor primario en un nuevo huésped adulto y el trasplante generacional continuo del tumor para estudios extendidos. Como demostración, aquí utilizamos los tumores de anillo imaginal inducidos por la sobreexpresión del dominio intracelular Notch (NICD) para el trasplante generacional. Estos tumores pueden primero ser inducidos de manera confiable en un microambiente de zona de transición dentro de los anillos imaginales de las glándulas salivales larvales, luego aloinjertados y cultivados in vivo para estudiar el crecimiento continuo del tumor, la evolución y la metástasis. Este método de alotrasplante puede ser útil en posibles programas de detección de fármacos, así como para estudiar las interacciones tumor-huésped.
Introduction
Este protocolo proporciona una guía paso a paso para el alotrasplante de tumores de anillo imaginal de la glándula salival larval (SG) de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos utilizando un aparato de inyección de autonanolitros (por ejemplo, Nanoject). Este protocolo también proporciona instrucciones para el posterior reasignointe de tumores en nuevas generaciones de huéspedes adultos, lo que brinda oportunidades para el estudio longitudinal continuo de las características del tumor, como la evolución del tumor y las interacciones tumor-huésped. El protocolo también se puede aplicar a los experimentos de detección de drogas.
Este método fue desarrollado para mejorar la eficacia de la realización de alotrasplantes tumorales en Drosophila utilizando inyectores manuales1, que a menudo son inconsistentes en sus fuerzas de succión e inyección, lo que lleva a resultados subóptimos para el alotrasplante tumoral. Un aparato autoinyector proporciona un mejor control y puede resultar en tasas más bajas de mortalidad por moscas después del aloinjerto. Un operador entrenado podría lograr una tasa de supervivencia del huésped de más del 90% con el autoinyector, en comparación con alrededor del 80% cuando se utilizó el inyector manual1. La tasa general de adquisición del tumor es del 60%-80% en el día 8-12 después del aloinjerto. El tiempo promedio de inyección también se ha mejorado de 30-40 s por mosca usando un inyector manual a 20-25 s por mosca usando el autoinyector.
Este protocolo es uno de los primeros protocolos para utilizar el aparato autoinyector en el alotrasplante de tumores de Drosophila . Un estudio reciente también utilizó el autoinyector para el alotrasplante de células madre neurales tumorales2. Anteriormente, el aparato autoinyector se utilizó en Drosophila para estudiar la virulencia bacteriana3, las infecciones parasitarias y la defensa del huésped4, así como la detección de la bioactividad de diferentes compuestos5. Nuestro protocolo adapta el aparato autoinyector para el uso de inyección tumoral y busca proporcionar a los investigadores de Drosophila una mayor calidad y resultados más consistentes, al tiempo que les ahorra un tiempo considerable. Este protocolo no solo se puede utilizar para el alotrasplante de tumores, sino que también se puede adaptar al alotrasplante de tejidos silvestres y mutantes de calibre6 similar.
El tumor Drosophila NICD utilizado en este protocolo fue introducido por primera vez por Yang et al.7 en la zona de transición del anillo imaginal SG, un "punto caliente tumoral" que exhibe altos niveles de actividad endógena de Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT), y c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Además, la zona de transición tiene altos niveles de metaloproteinasa-1 de la matriz (MMP1)7, lo que hace que esta región sea particularmente propicia para la tumorigénesis. La activación de la vía de muesca a través de la sobreexpresión de NICD por sí sola es suficiente para iniciar consistentemente la formación de tumores. Estos tumores se pueden alotrasplantar posteriormente para permitir la investigación de una amplia gama de temas, incluida la división de células tumorales, la invasión y las interacciones tumor-huésped.
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Protocol
1. Preparación del tumor del anillo imaginal SG
- Cruce moscas adultas con genotipos de UAS-NICD (macho: 10-15 moscas) y Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (hembra virgen: 10-15 moscas) y permítales reproducirse durante 1 día a 18 °C. Las moscas adultas seleccionadas deben tener entre 5 y 9 días de edad para garantizar una alta fertilidad.
- Permita que las moscas adultas pongan huevos en el alimento para moscas contenido en viales durante 24 h a 18 ° C, luego retire las moscas adultas.
NOTA: La comida para moscas se prepara utilizando la receta estándar de harina de maíz de Drosophila Stock Center8. Cada vial debe contener alrededor de 10 ml de alimento para moscas. - Deje que los huevos se incuben durante 6 días a 18 °C. Durante este período, las larvas eclosionarán.
- Transfiera los viales que contienen larvas a una incubadora de 29 °C e incube durante otros 7 días.
NOTA: Este paso de incubación es opcional dependiendo del diseño experimental específico.
2. Preparación de Drosophila silvestre adulta para el alotrasplante
- Anestesiar moscas adultas de tipo salvaje o mutantes apropiadas con 100% de CO2 y clasificar moscas según los sexos. Tanto las moscas macho como las hembras se pueden utilizar como huéspedes tumorales.
- Asegure un trozo de cinta de mosca de 5 cm de largo a un portaobjetos de microscopio con el lado pegajoso hacia arriba fijándolo con dos trozos más pequeños de cinta, uno en cada extremo.
- Inmoviliza las moscas adhiriendo sus alas a la cinta. Use fórceps mientras maniobra las moscas.
- Repita el paso anterior para 60-80 moscas adultas utilizadas como aceptores de aloinjertos.
NOTA: Es mejor organizar las moscas en filas ordenadas, con su eje corporal alineado paralelo entre sí para un proceso de inyección más eficiente en el tiempo más adelante. La Figura 1 muestra filas de moscas huésped pegadas con cinta adhesiva de esta manera.
- Repita el paso anterior para 60-80 moscas adultas utilizadas como aceptores de aloinjertos.
3. Montaje del aparato autoinyector
- Conecte tanto el aparato autoinyector como el cable de alimentación a la caja del controlador.
- Establezca el volumen de inyección en 59,8 nL. Esto ayudará a mantener la cantidad adecuada de fuerzas de succión e inyección durante el alotrasplante.
- Coloque la caja del controlador y el autoinyector en lados opuestos del microscopio de luz.
NOTA: Para los operadores diestros, la caja de control debe colocarse en el lado izquierdo del microscopio con el inyector en el lado derecho. Viceversa para operadores zurdos. - Prepare el capilar de vidrio de 3.5 '' para su uso recortando el extremo cerrado con fórceps.
- Procese un extremo del capilar de vidrio con un extractor de micropipeta de cuatro pasos y caliente a un extremo estrecho y cerrado utilizando las siguientes especificaciones en el instrumento: Calor = 650, Fuerza = 200 y Distancia = 8. Coloque cuidadosamente los capilares en el aparato del extractor y ejecute el programa después de ingresar los ajustes anteriores.
- Use fórceps para sujetar el capilar en un ángulo de aproximadamente 60 ° para hacer un extremo más afilado para facilitar la entrada en el abdomen de la mosca adulta1. Vea la Figura 2 para un ejemplo de un capilar bien recortado.
- Desenrosque ligeramente la tapa del inyector. Mantenga presionado el botón Vacío para avanzar la aguja del inyector hasta que se muestre entre el 70% y el 80% de su longitud total. Para acelerar el avance capilar, presione el botón Llenar una vez mientras mantiene presionado simultáneamente el botón Vacío .
- Use una jeringa para llenar el capilar de vidrio con aceite mineral. Luego, inserte cuidadosamente el capilar de vidrio en la aguja del inyector hasta que el primero esté firmemente unido al tapón de goma del inyector. Ahora atornille bien la tapa del inyector.
- Limpie el residuo de aceite mineral en la superficie externa de la cubierta capilar de vidrio para evitar contaminar el medio durante el alotrasplante.
4. Disección del tumor del anillo imaginal SG
- Seleccione una de las larvas y transfiérala a una placa de disección llena de 100 μL del medio de Schneider para prepararse para la disección del tumor del anillo imaginal SG.
NOTA: Solo los especímenes que albergan el tumor permanecerán como larvas. Esto se debe a que el crecimiento tumoral retrasa el desarrollo larvario y la progresión9. Dos tercios de los especímenes no albergarán el tumor y, por lo tanto, habrán progresado a pupas / adultos.- Para fines de disección y alotrasplante, use un estereomicroscopio con un rango de aumento de 10x-20x.
- Usando un par de fórceps para sostener la sección media del cuerpo larvario, pellizque la cabeza larvaria con otro par de fórceps y aplique una fuerza de estiramiento a lo largo.
- Localiza el SG en forma de Y de las larvas y aíslalo del resto del tejido larvario10.
- Diseccionar y aislar el tumor del anillo imaginal SG mediante la extirpación del tejido adyacente. Vea la Figura 3 para una representación de este proceso de disección.
- Repita los pasos 4.1-4.4 para 10 a 20 tumores de anillo imaginal SG adicionales según las necesidades de investigación.
5. Aloinjerto de tumor primario del anillo imaginal SG
- Sumergir el capilar en el medio de Schneider que contiene los tumores primarios del anillo imaginal SG. Mantén pulsado el botón Rellenar para rellenar el capilar de vidrio con el Medium de Schneider hasta el segmento superior de 0,5 cm. Este segmento superior debe permanecer lleno de aceite mineral.
NOTA: Acelere este proceso presionando el botón Vaciar una vez mientras mantiene presionado simultáneamente el botón Llenar . - Localice un tumor primario y presione el botón Llenar hasta que el tumor se succione en el capilar.
- Asegúrese de que el tumor se asiente en la punta del capilar o a varios milímetros de distancia de la punta del capilar. Esto ayuda a evitar que el tumor se desvíe y se pierda en la solución contenida dentro del capilar. Consulte la Figura 4A para obtener una demostración de la ubicación apropiada del tumor a medida que se encuentra en el capilar.
- Localice una mosca adulta inmovilizada en la cinta adhesiva del portaobjetos del microscopio. Usando fórceps, sostenga suavemente la parte inferior del abdomen. Luego, perfore la cutícula lateral inferior del abdomen con el capilar. Presione el botón Vacío hasta que el tumor entre en el nuevo abdomen del huésped. Consulte la Figura 4B para una demostración de esta técnica.
- Usando fórceps, pellizque suavemente las alas del host hacia arriba para sacarlo de la cinta. Coloque el anfitrión en un vial nuevo con alimentos frescos. Es mejor colocar el vial de lado durante las 24 horas iniciales después de la inyección. Cada vial solo debe contener hasta un máximo de 20 moscas.
NOTA: A algunas moscas huésped les faltarán alas y otras heridas en sus cuerpos después de la inyección y pueden adherirse a la comida para moscas si el vial se coloca en posición vertical. - Repita los pasos 5.2 a 5.4 para trasplantar los tumores primarios restantes a sus nuevoshuéspedes adultos.
- Deseche los capilares en el recipiente de objetos punzantes y limpie el residuo de aceite mineral del exterior del autoinyector antes de reemplazar el aparato de nuevo en su caja.
- Guarde el vial de los huéspedes a temperatura ambiente durante 1 día, luego transfiera el vial a una cámara de incubación a 29 °C. Transfiera los huéspedes de la mosca a nuevos viales cada 2-3 días.
- Monitoree a los huéspedes de la mosca diariamente y calcule las tasas de supervivencia. Después de una semana, los tumores deben ser visibles bajo un microscopio estereoscópico con adaptador de fluorescencia y pueden ser monitoreados continuamente por su tamaño y progresión.
6. Realoinjerto de tumores trasplantados
- Alrededor de 10-14 días después del aloinjerto, detecte los tumores que han crecido en el abdomen del huésped utilizando un microscopio de fluorescencia.
- Anestesiar un huésped con CO2 y colocarlo en una placa de disección llena de 100 μL de Schneider's Medium. Diseccionar el tumor aloinjertado crecido fuera del huésped usando dos pares de fórceps.
- Use un par de fórceps para sujetar el abdomen y el otro par para abrir la cutícula abdominal, exponiendo el tumor aloinjertado1.
- Aísle cuidadosamente el tumor de los tejidos del huésped adheridos tanto como sea posible utilizando marcadores de fluorescencia como guía.
- Repita el paso 6.2 para prepararse para dos o tres tumores aloinjertados adicionales.
- Transfiera la placa de disección que contiene los tumores recolectados a la etapa de un microscopio de luz.
- Use agujas estériles y diseccione los tumores en pedazos más pequeños que sean apropiados para el tamaño capilar.
- Repita los pasos 4.1-4.5 para preparar a la nueva generación de huéspedes adultos y repita los pasos 5.1-5.7 para completar el alotrasplante de los tumores.
NOTA: Las tasas de éxito son generalmente más altas para los tumores no primarios en comparación con las de los tumores primarios. - Repita los pasos 6.1-6.6 para cada generación posterior de moscas utilizadas en el estudio.
NOTA: Elija líneas de host de Drosophila apropiadas para las necesidades experimentales.
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Representative Results
Aquí, llevamos a cabo el alotrasplante generacional de tumores de anillo imaginal SG utilizando el aparato autoinyector de inyección de nanolitros y realizamos imágenes en vivo del tumor posteriores con un microscopio de escaneo láser confocal, lo que permitió una inmersión más profunda en temas de crecimiento tumoral, migración de células tumorales e interacciones tumor-huésped. Cuando monte moscas, péguelas a un portaobjetos de microscopio y sujete a través de un bloque11 de polidimetilsiloxano (PDMS).
La Figura 5A presenta una captura de imágenes en vivo de un tumor de anillo imaginal SG de1ª generación (G1) que crece en el abdomen de un huésped adulto el día 10 después del alotrasplante. Este nivel de imágenes se puede utilizar para rastrear el proceso de división del tumor. La Figura 5B representa un tumor de anillo imaginal SG de6ª generación (G6) que ocupa una gran parte del abdomen del huésped en el día 10 después del alotrasplante. Las imágenes en esta etapa pueden ayudar a revelar los patrones de crecimiento del tumor, así como sus comportamientos de migración e invasión. Es importante tener en cuenta que a pesar de que esta imagen se capturó utilizando un microscopio de barrido láser confocal, un estereomicroscopio con un adaptador de fluorescencia GFP también podría usarse con un aumento de 2x a 5x, dependiendo del tamaño del tumor.
Figura 1: Moscas huésped pegadas con cinta adhesiva y aseguradas para el alotrasplante. Las moscas huésped son pegadas con cinta adhesiva por sus alas y orientadas cuidadosamente para prepararse para el procedimiento de trasplante posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un capilar de inyección bien recortado. La flecha roja apunta a un borde afilado necesario para perforar eficazmente la cutícula abdominal de los huéspedes adultos de Drosophila . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Disección del tumor ImR primario de la glándula salival. El proceso de disección y aislamiento de dos tumores imR primarios de glándulas salivales se demuestra cronológicamente desde el Panel (A) hasta el Panel (B), utilizando dos incisiones separadas. El panel (A) muestra la glándula salival antes de la disección del tumor. Las puntas de flecha rojas indican los primeros puntos de incisión. Las puntas de flecha azules indican los segundos puntos de incisión. El tumor se encuentra entre las puntas de flecha rojas y azules. El panel (B) muestra el tumor ImR aislado después de que se realizan las dos incisiones para separarlo del tejido normal de las glándulas salivales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Localización apropiada del tumor dentro del capilar e inyección del tumor en el abdomen del huésped de Drosophila . El panel (A) muestra la ubicación más adecuada del tumor dentro del capilar. El tumor expresa eGFP (488 nm). El panel (B) muestra el proceso de inyección. La flecha roja indica el sitio de inyección del tumor. La flecha azul muestra la colocación de fórceps para ayudar a mantener presionada la terminal de la mosca para facilitar la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un tumor G1 y G6 ImR observado en el abdomen del huésped WT Drosophila en el día 10 después del alotrasplante. Estas son vistas ventrales del abdomen de la mosca con los tumores trasplantados en verde. El panel (A) muestra un tumor G1 en el día 10 después del alotrasplante que expresa eGFP (488 nm). El panel (A) se captura utilizando un microscopio confocal utilizando una lente de 20x con 0.8 NA y zoom de 3x. El panel (B) muestra un tumor G6 en el día 10 después del alotrasplante que expresa eGFP (488 nm). El panel (B) se captura utilizando un microscopio confocal utilizando una lente 5x con 0.25 NA y un zoom de escaneo 1x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El alotrasplante tumoral puede ayudar a los investigadores a abordar ciertos problemas que surgen durante el crecimiento y la progresión del tumor de Drosophila. Uno de esos desafíos es la elusión de las muertes prematuras de larvas o adultos portadores de tumores durante el cultivo de tumores primarios12. En este contexto, el alotrasplante tumoral continuado permite que los tumores crezcan indefinidamente, lo que facilita los estudios longitudinales del crecimiento tumoral, la metástasis y la evolución. El alotrasplante tumoral también es útil para evaluar diversos aspectos de las interacciones huésped-tumor 7,13. Los genotipos del huésped pueden manipularse antes del aloinjerto tumoral para permitir la evaluación del efecto del huésped sobre el crecimiento y la migración del tumor, y sobre la caquexia inducida por el tumor14,15. Los huéspedes de moscas con diferentes genotipos pueden exhibir manifestaciones distintas de desgaste similar a la caquexia en respuesta al mismo tumor. Después del alotrasplante, los huéspedes tumorales pueden montarse en preparación para la obtención de imágenes in vivo utilizando un protocolo adaptado de Koyama et al. y Ji et al.11,16.
La aplicación del aparato autoinyector hacia el alotrasplante del tumor de Drosophila proporciona un protocolo conveniente y sencillo que posee una mayor eficiencia. En comparación con el inyector manual1, este método permite alotrasplantes reproducibles y a gran escala, que pueden acelerar y estandarizar los estudios de comportamiento tumoral y los procedimientos de detección de drogas. Este método mejorado produce impresionantes tasas de supervivencia del huésped y de rendimiento tumoral. Un investigador capacitado puede lograr tasas de supervivencia del huésped después del aloinjerto de >90%. Las tasas de rendimiento tumoral pueden diferir dependiendo de si el tumor es primario o realoinjertado. Los investigadores pueden esperar alcanzar tasas de rendimiento tumoral de >50% para los tumores primarios y >70% para los tumores reasignados. Además, este método reduce el tiempo de inyección por mosca huésped en casi un 50% en comparación con el método del inyector manual.
Sin embargo, este procedimiento tiene sus limitaciones, principalmente debido a la inconsistencia de la incisión del tumor, la ubicación de la inyección y el tamaño de la herida. Si los tumores primarios no se cortan en fragmentos de tamaño uniforme antes del alotrasplante, ciertos huéspedes de moscas pueden recibir fragmentos más grandes que otros. Este es un factor de confusión que afecta a los estudios que tienen como objetivo rastrear la tasa de crecimiento tumoral. Esto puede mitigarse potencialmente midiendo la tasa diferencial de crecimiento tumoral a intervalos de dos días después del aloinjerto. Además, durante la inyección, el operador debe elegir un sitio consistente en la cutícula abdominal en todas las moscas huésped. Esto ayuda a mitigar otra variable de confusión que puede afectar la supervivencia del huésped de la mosca y la ubicación final de la unión del tumor.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar entre los autores.
Acknowledgments
Agradecemos a los ex miembros del laboratorio Dr. Sheng-An Yang y al Sr. Juan-Martin Portilla por su contribución en el desarrollo de este protocolo. Estamos agradecidos por el laboratorio del Dr. Yan Song en la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Pekín por compartir su protocolo sobre el alotrasplante manual. También agradecemos al Sr. Calder Ellsworth y al Sr. Everest Shapiro por la lectura crítica del manuscrito.
WMD recibió fondos (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabajo del Instituto Nacional de Salud (https://www.nih.gov/) y fondos (IOS-155790) de la Fundación Nacional de Ciencias (htps://nsf.gov/). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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