Summary
यह प्रोटोकॉल नियोप्लासिया के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए वयस्क मेजबानों के पेट में ड्रोसोफिला ट्यूमर के प्रारंभिक और निरंतर पीढ़ीगत एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करता है। एक ऑटोइंजेक्टर तंत्र का उपयोग करके, शोधकर्ता पारंपरिक, मैनुअल तरीकों से प्राप्त लोगों की तुलना में बेहतर दक्षता और ट्यूमर की पैदावार प्राप्त कर सकते हैं।
Abstract
यह प्रोटोकॉल एक ऑटो-नैनोलीटर इंजेक्शन उपकरण का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में ट्यूमर के एलोट्रांसप्लांटेशन का वर्णन करता है। एक ऑटोइंजेक्टर उपकरण के उपयोग के साथ, प्रशिक्षित ऑपरेटर मैनुअल इंजेक्टर का उपयोग करके प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में अधिक कुशल और सुसंगत प्रत्यारोपण परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। यहां, हम एक कालानुक्रमिक फैशन में विषयों को कवर करते हैं: ड्रोसोफिला लाइनों को पार करने से, प्राथमिक ट्यूमर के प्रेरण और विच्छेदन के लिए, एक नए वयस्क मेजबान में प्राथमिक ट्यूमर का प्रत्यारोपण और विस्तारित अध्ययन के लिए ट्यूमर के निरंतर पीढ़ीगत प्रत्यारोपण। एक प्रदर्शन के रूप में, यहां हम पीढ़ीगत प्रत्यारोपण के लिए नॉच इंट्रासेल्युलर डोमेन (एनआईसीडी) ओवरएक्सप्रेशन प्रेरित लार ग्रंथि काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर का उपयोग करते हैं। इन ट्यूमर को पहले लार्वा लार ग्रंथि काल्पनिक छल्ले के भीतर एक संक्रमण-क्षेत्र माइक्रोएन्वायरमेंट में मज़बूती से प्रेरित किया जा सकता है, फिर निरंतर ट्यूमर के विकास, विकास और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए विवो में एलोग्राफ्टेड और सुसंस्कृत किया जा सकता है। यह एलोट्रांसप्लांटेशन विधि संभावित दवा स्क्रीनिंग कार्यक्रमों के साथ-साथ ट्यूमर-होस्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है।
Introduction
यह प्रोटोकॉल ऑटो-नैनोलीटर इंजेक्शन उपकरण (जैसे, नैनोजेक्ट) का उपयोग करके वयस्क मेजबानों के पेट में ड्रोसोफिला लार्वा लार ग्रंथि (एसजी) काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर के एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शन प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल वयस्क मेजबानों की नई पीढ़ियों में ट्यूमर के बाद के पुन: एलोग्राफ्टिंग के लिए दिशा-निर्देश भी प्रदान करता है, जो ट्यूमर विशेषताओं के निरंतर अनुदैर्ध्य अध्ययन के अवसर प्रदान करता है, जैसे ट्यूमर विकास और ट्यूमर-होस्ट इंटरैक्शन। प्रोटोकॉल को दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों की ओर भी लागू किया जा सकता है।
इस पद्धति को मैनुअल इंजेक्टर1 का उपयोग करके ड्रोसोफिला में ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन करने की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया था, जो अक्सर उनके चूषण और इंजेक्शन बलों में असंगत होते हैं, जिससे ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए उप-इष्टतम परिणाम होते हैं। एक ऑटोइंजेक्टर उपकरण बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है और इसके परिणामस्वरूप एलोग्राफ्ट के बाद मक्खी मृत्यु दर की कम दर हो सकती है। एक प्रशिक्षित ऑपरेटर ऑटोइंजेक्टर के साथ 90% से अधिक की मेजबान-उत्तरजीविता दर प्राप्त कर सकता है, जबकि मैनुअल इंजेक्टर का उपयोग लगभग 80% की तुलना में1. समग्र ट्यूमर अधिग्रहण दर दिन 8-12 पोस्ट-एलोग्राफ्ट में 60% -80% है। मैनुअल इंजेक्टर का उपयोग करके औसत इंजेक्शन समय भी 30-40 एस प्रति फ्लाई से ऑटोइंजेक्टर का उपयोग करके 20-25 एस प्रति फ्लाई तक सुधार किया गया है।
यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन में ऑटोइंजेक्टर तंत्र का उपयोग करने वाले पहले कुछ प्रोटोकॉल में से एक है। हाल के एक अध्ययन में ट्यूमरस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए ऑटोइंजेक्टर का भी उपयोग कियागया था 2. इससे पहले, ऑटोइंजेक्टर तंत्र का उपयोग ड्रोसोफिला मेंजीवाणु विषाणु 3, परजीवी संक्रमण और मेजबान रक्षा4 का अध्ययन करने के साथ-साथ विभिन्न यौगिकों की जैव सक्रियता के लिए स्क्रीनिंग के लिए किया गया था5. हमारा प्रोटोकॉल ट्यूमर इंजेक्शन उपयोग के लिए ऑटोइंजेक्टर तंत्र को अनुकूलित करता है और ड्रोसोफिला शोधकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता और अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करना चाहता है जबकि उन्हें काफी समय बचाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल ट्यूमर के एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए किया जा सकता है, बल्कि इसी तरह के कैलिबर6 के वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती ऊतकों के एलोट्रांसप्लांटेशन के अनुरूप भी किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ड्रोसोफिला एनआईसीडी ट्यूमर को पहली बार एसजी काल्पनिक रिंग संक्रमणकालीन क्षेत्र में यांग एट अल .7 द्वारा पेश किया गया था, एक "ट्यूमर हॉटस्पॉट" जो अंतर्जात जानूस किनेज / सिग्नल ट्रांसड्यूसर और एक्टिवेटर्स ऑफ ट्रांसक्रिप्शन (जेएके-एसटीएटी), और सी-जून एन-टर्मिनल किनेज (जेएनके) गतिविधि के उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, संक्रमण क्षेत्र में मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज -1 (एमएमपी 1) 7 के उच्च स्तर हैं, जो इस क्षेत्र को ट्यूमरजेनेसिस के लिए विशेष रूप से अनुकूल बनाता है। अकेले एनआईसीडी ओवरएक्सप्रेशन के माध्यम से पायदान मार्ग सक्रियण लगातार ट्यूमर गठन शुरू करने के लिए पर्याप्त है। इन ट्यूमर को बाद में ट्यूमर कोशिका विभाजन, आक्रमण और ट्यूमर-होस्ट इंटरैक्शन सहित विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच की अनुमति देने के लिए एलोट्रांसप्लांट किया जा सकता है।
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Protocol
1. एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर की तैयारी
- यूएएस-एनआईसीडी (नर: 10-15 मक्खियों) और एक्ट-गैल 4, यूएएस-जीएफपी / साइओ; टब-गैल 80 टीएस (वर्जिन मादा: 10-15मक्खियों) के जीनोटाइप के साथ क्रॉस वयस्क मक्खियां और उन्हें 18 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए प्रजनन करने की अनुमति दें। उच्च प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए चयनित वयस्क मक्खियों को 5-9 दिन पुराना होना चाहिए।
- वयस्क मक्खियों को 18 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए शीशियों में निहित मक्खी भोजन में अंडे देने की अनुमति दें, फिर वयस्क मक्खियों को हटा दें।
नोट: फ्लाई फूड ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर8 से मानक कॉर्नमील फूड रेसिपी का उपयोग करके तैयार किया जाता है। प्रत्येक शीशी में लगभग 10 एमएल फ्लाई फूड होना चाहिए। - अंडे को 18 डिग्री सेल्सियस पर 6 दिनों के लिए सेते हैं। इस अवधि के दौरान, लार्वा हैच करेगा।
- लार्वा युक्त शीशियों को 29 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और एक और 7 दिनों के लिए सेते हैं।
नोट: यह इनक्यूबेशन कदम विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर वैकल्पिक है।
2. एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए वयस्क जंगली प्रकार ड्रोसोफिला की तैयारी
- जंगली प्रकार या उपयुक्त उत्परिवर्ती वयस्क मक्खियों को 100% सीओ2 के साथ संवेदनाहारी करें और लिंगों के आधार पर मक्खियों को क्रमबद्ध करें। नर और मादा दोनों मक्खियों को ट्यूमर होस्ट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
- टेप के दो छोटे टुकड़ों के साथ इसे ठीक करके चिपचिपा पक्ष के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए फ्लाई टेप का 5 सेमी लंबा टुकड़ा सुरक्षित करें, प्रत्येक छोर पर एक।
- टेप के लिए अपने पंखों का पालन करके मक्खियों को स्थिर करें। मक्खियों पैंतरेबाज़ी करते समय संदंश का प्रयोग करें।
- एलोग्राफ्ट स्वीकर्ता के रूप में उपयोग किए जाने वाले 60-80 वयस्क मक्खियों के लिए उपरोक्त चरण दोहराएं।
नोट: मक्खियों को साफ पंक्तियों में व्यवस्थित करना सबसे अच्छा है, बाद में अधिक समय-कुशल इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए उनके शरीर की धुरी एक दूसरे के समानांतर संरेखित होती है। चित्रा 1 इस तरह से टेप किए गए मेजबान मक्खियों की पंक्तियों को दर्शाता है।
- एलोग्राफ्ट स्वीकर्ता के रूप में उपयोग किए जाने वाले 60-80 वयस्क मक्खियों के लिए उपरोक्त चरण दोहराएं।
3. ऑटोइंजेक्टर तंत्र की असेंबली
- ऑटोइंजेक्टर उपकरण और पावर कॉर्ड दोनों को नियंत्रक बॉक्स से कनेक्ट करें।
- इंजेक्शन वॉल्यूम को 59.8 एनएल पर सेट करें। यह एलोट्रांसप्लांटेशन के दौरान उचित मात्रा में चूषण और इंजेक्शन बलों को बनाए रखने में मदद करेगा।
- नियंत्रक बॉक्स और ऑटोइंजेक्टर को प्रकाश माइक्रोस्कोप के विपरीत किनारों पर रखें।
नोट: दाएं हाथ के ऑपरेटरों के लिए, नियंत्रण बॉक्स को दाईं ओर इंजेक्टर के साथ माइक्रोस्कोप के बाईं ओर रखा जाना चाहिए। बाएं हाथ के ऑपरेटरों के लिए इसके विपरीत। - संदंश के साथ बंद अंत से कतरन द्वारा उपयोग के लिए 3.5 " ग्लास केशिका तैयार करें।
- उपकरण में निम्नलिखित विनिर्देशों का उपयोग करके एक संकीर्ण, बंद छोर पर चार-चरण माइक्रोपिपेट खींचने और गर्मी का उपयोग करके ग्लास केशिका के एक छोर को संसाधित करें: हीट = 650, फोर्स = 200, और दूरी = 8। बड़े करीने से केशिकाओं को खींचने वाले उपकरण में रखें और उपरोक्त सेटिंग्स को इनपुट करने के बाद प्रोग्राम चलाएं।
- वयस्क मक्खी पेट में आसान प्रवेश के लिए एक तेज अंत बनाने के लिए लगभग 60 ° कोण पर केशिका क्लिप करने के लिए संदंश का प्रयोग करें1. एक अच्छी तरह से क्लिप केशिका के एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें।
- इंजेक्टर की टोपी को हल्के ढंग से खोल दें। इंजेक्टर सुई को आगे बढ़ाने के लिए खाली बटन को तब तक दबाए रखें जब तक कि इसकी कुल लंबाई का 70% -80% दिखाई न दे। केशिका उन्नति में तेजी लाने के लिए, एक साथ खाली बटन दबाए रखते हुए एक बार भरण बटन दबाएं।
- खनिज तेल के साथ ग्लास केशिका को भरने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। फिर, इंजेक्टर सुई पर ग्लास केशिका को सावधानीपूर्वक डालें जब तक कि पूर्व इंजेक्टर के रबर स्टॉपर से दृढ़ता से जुड़ा न हो। अब इंजेक्टर कैप को कसकर पेंच करें।
- एलोट्रांसप्लांटेशन के दौरान माध्यम को दूषित करने से बचने के लिए ग्लास केशिका कवर की बाहरी सतह पर खनिज तेल अवशेषों को मिटा दें।
4. एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर का विच्छेदन
- लार्वा में से एक का चयन करें और एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए श्नाइडर के माध्यम के 100 μL से भरा एक विच्छेदन प्लेट के लिए हस्तांतरण।
नोट: केवल ट्यूमर को शरण देने वाले नमूने लार्वा के रूप में रहेंगे। ऐसा इसलिए है क्योंकि ट्यूमर वृद्धि लार्वा के विकास और प्रगति में देरी करतीहै 9. नमूनों के दो तिहाई ट्यूमर बंदरगाह नहीं होगा और इस प्रकार प्यूपा / वयस्कों के लिए प्रगति की होगी।- विच्छेदन और एलोट्रांसप्लांटेशन उद्देश्यों के लिए, 10x-20x आवर्धन सीमा के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- लार्वा शरीर के मध्य खंड को पकड़ने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करके लार्वा सिर चुटकी और लंबाई में एक खींच बल लागू करें।
- लार्वा के वाई-आकार के एसजी का पता लगाएं और इसे लार्वा ऊतक10 के बाकी हिस्सों से अलग करें।
- आसन्न ऊतक को हटाकर एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर को विच्छेदित और अलग करें। इस विच्छेदन प्रक्रिया के चित्रण के लिए चित्रा 3 देखें।
- अनुसंधान आवश्यकताओं के आधार पर अतिरिक्त 10 से 20 एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर के लिए चरण 4.1-4.4 दोहराएं।
5. प्राथमिक एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर के एलोग्राफ्ट
- प्राथमिक एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर युक्त श्नाइडर के माध्यम में केशिका को डुबोएं। श्नाइडर के माध्यम के साथ ग्लास केशिका को शीर्ष 0.5 सेमी सेगमेंट में भरने के लिए भरण बटन दबाए रखें। यह शीर्ष खंड खनिज तेल से भरा रहना चाहिए।
नोट: एक साथ भरण बटन दबाए रखते हुए एक बार खाली बटन दबाकर इस प्रक्रिया में तेजी लाएं। - एक प्राथमिक ट्यूमर का पता लगाएं और भरण बटन दबाएं जब तक कि ट्यूमर को केशिका में चूषण न किया जाए।
- सुनिश्चित करें कि ट्यूमर केशिका की नोक पर या केशिका की नोक से कई मिलीमीटर दूर बैठता है। यह ट्यूमर बहती और केशिका के भीतर निहित समाधान में खो जाने से बचने में मदद करता है। उपयुक्त ट्यूमर स्थान के प्रदर्शन के लिए चित्रा 4 ए देखें क्योंकि यह केशिका में बैठता है।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड पर टेप के लिए स्थिर एक वयस्क मक्खी का पता लगाएं। संदंश का उपयोग करके, धीरे पेट के निचले हिस्से को पकड़ें। फिर, केशिका के साथ पेट के निचले पार्श्व छल्ली को छेदें। खाली बटन दबाएं जब तक कि ट्यूमर नए मेजबान पेट में प्रवेश न करे। इस तकनीक के प्रदर्शन के लिए चित्रा 4 बी देखें।
- संदंश का उपयोग करके, धीरे से टेप से इसे हटाने के लिए मेजबान के पंखों को चुटकी लें। ताजे भोजन के साथ मेजबान को एक नई शीशी में रखें। इंजेक्शन के बाद शुरुआती 24 घंटे के लिए शीशी को बग़ल में रखना सबसे अच्छा है। प्रत्येक शीशी में अधिकतम 20 मक्खियां होनी चाहिए।
नोट: कुछ मेजबान मक्खियों इंजेक्शन के बाद उनके शरीर पर लापता पंख और अन्य घाव होंगे और अगर शीशी को सीधा रखा जाता है तो फ्लाई फूड से चिपक सकते हैं। - अपने नए वयस्कमेजबानों में शेष प्राथमिक ट्यूमर प्रत्यारोपण करने के लिए चरण 5.2 से 5.4 दोहराएं।
- शार्प्स कंटेनर में केशिकाओं का निपटान करें और उपकरण को अपने बॉक्स में वापस बदलने से पहले ऑटोइंजेक्टर के बाहरी हिस्से से खनिज तेल अवशेषों को साफ करें।
- 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर मेजबान की शीशी स्टोर करें, फिर शीशी को 29 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें। हर 2-3 दिनों में नई शीशियों के लिए फ्लाई होस्ट स्थानांतरित करें।
- दैनिक मक्खी मेजबानों की निगरानी करें और जीवित रहने की दर की गणना करें। एक सप्ताह के बाद, ट्यूमर प्रतिदीप्ति एडाप्टर के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देना चाहिए और उनके आकार और प्रगति के लिए लगातार निगरानी की जा सकती है।
6. प्रत्यारोपित ट्यूमर के पुन: एलोग्राफ्ट
- लगभग 10-14 दिनों के बाद एलोग्राफ्ट, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मेजबान पेट में उगने वाले ट्यूमर के लिए स्क्रीन।
- सीओ2 के साथ एक मेजबान को संवेदनाहारी करें और इसे 100 μL श्नाइडर के माध्यम से भरे विच्छेदन प्लेट में रखें। संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर मेजबान से बाहर उगाए गए एलोग्राफ्टेड ट्यूमर विच्छेदन।
- पेट को पकड़ने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें और पेट छल्ली को खोलने के लिए दूसरी जोड़ी का उपयोग करें, एलोग्राफ्टेड ट्यूमर को उजागर करें1.
- सावधानी से मार्गदर्शन के रूप में प्रतिदीप्ति मार्करों का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में संलग्न मेजबान ऊतकों से ट्यूमर को अलग करें।
- दो से तीन अतिरिक्त एलोग्राफ्टेड ट्यूमर के लिए तैयार करने के लिए चरण 6.2 दोहराएं।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के चरण पर कटाई ट्यूमर युक्त विच्छेदन प्लेट स्थानांतरण।
- बाँझ सुइयों का प्रयोग करें और केशिका आकार के लिए उपयुक्त हैं कि छोटे टुकड़ों में ट्यूमर विच्छेदन।
- वयस्क मेजबानों की नई पीढ़ी को तैयार करने के लिए चरण 4.1-4.5 दोहराएं और ट्यूमर के एलोट्रांसप्लांटेशन को पूरा करने के लिए चरण 5.1-5.7 दोहराएं।
नोट: प्राथमिक ट्यूमर की तुलना में गैर-प्राथमिक ट्यूमर के लिए सफलता दर आम तौर पर अधिक होती है। - अध्ययन में उपयोग की जाने वाली मक्खियों की हर बाद की पीढ़ी के लिए चरण 6.1-6.6 दोहराएं।
नोट: प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए उपयुक्त ड्रोसोफिला मेजबान लाइनों का चयन करें।
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Representative Results
यहां, हमने नैनोलीटर इंजेक्शन ऑटोइंजेक्टर तंत्र का उपयोग करके एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर के पीढ़ीगत एलोट्रांसप्लांटेशन को अंजाम दिया और बाद में एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ ट्यूमर लाइव-इमेजिंग का आयोजन किया, जिसने ट्यूमर के विकास, ट्यूमर सेल माइग्रेशन और ट्यूमर-होस्ट इंटरैक्शन के विषयों में गहरी गोता लगाने की अनुमति दी। मक्खियों को बढ़ते समय, उन्हें एक माइक्रोस्कोप स्लाइड में गोंद करें और उन्हें पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) ब्लॉक 11 के माध्यम सेरोकें।
चित्रा 5 ए में 1पीढ़ी (जी 1) एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर का लाइव इमेजिंग कैप्चर है जो 10 दिन के बाद एलोट्रांसप्लांटेशन पर एक वयस्क मेजबान पेट में बढ़ रहा है। इमेजिंग के इस स्तर का उपयोग ट्यूमर विभाजन की प्रक्रिया को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 5 बी एक 6पीढ़ी (जी 6) एसजी काल्पनिक अंगूठी ट्यूमर को दर्शाता है जो 10 दिन के बाद एलोट्रांसप्लांटेशन पर मेजबान पेट के एक बड़े हिस्से पर कब्जा कर लेता है। इस स्तर पर इमेजिंग ट्यूमर के विकास पैटर्न, साथ ही इसके प्रवास और आक्रमण व्यवहार को प्रकट करने में मदद कर सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि भले ही इस छवि को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था, जीएफपी प्रतिदीप्ति एडाप्टर के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग ट्यूमर के आकार के आधार पर 2x से 5x आवर्धन पर भी किया जा सकता है।
चित्रा 1: मेजबान मक्खियों को एलोट्रांसप्लांटेशन के लिए टेप और सुरक्षित किया जाता है। मेजबान मक्खियों को उनके पंखों द्वारा टेप किया जाता है और बाद में प्रत्यारोपण प्रक्रिया की तैयारी के लिए बड़े करीने से उन्मुख किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक अच्छी तरह से क्लिप इंजेक्शन केशिका। लाल तीर वयस्क ड्रोसोफिला मेजबानों के पेट छल्ली को प्रभावी ढंग से छेदने के लिए आवश्यक एक तेज किनारे की ओर इशारा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्राथमिक लार ग्रंथि आईएमआर ट्यूमर का विच्छेदन। दो प्राथमिक लार ग्रंथि आईएमआर ट्यूमर को विच्छेदन और अलग करने की प्रक्रिया को दो अलग-अलग चीरों का उपयोग करके पैनल (ए) से पैनल (बी) तक कालानुक्रमिक रूप से प्रदर्शित किया जाता है। पैनल (ए) ट्यूमर विच्छेदन से पहले लार ग्रंथि से पता चलता है। लाल तीरहेड्स पहले चीरा बिंदुओं को इंगित करते हैं। नीले तीर दूसरे चीरा बिंदुओं को इंगित करते हैं। ट्यूमर लाल और नीले तीर के बीच स्थित है। पैनल (बी) दो चीरों के बाद पृथक आईएमआर ट्यूमर को सामान्य लार ग्रंथि ऊतक से अलग करने के लिए दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: केशिका के भीतर उपयुक्त ट्यूमर स्थान और ड्रोसोफिला मेजबान पेट में ट्यूमर का इंजेक्शन। पैनल (ए) केशिका के भीतर सबसे उपयुक्त ट्यूमर स्थान दिखाता है। ट्यूमर ईजीएफपी (488 एनएम) व्यक्त करता है। पैनल (बी) इंजेक्शन प्रक्रिया को दर्शाता है। लाल तीर ट्यूमर इंजेक्शन साइट को इंगित करता है। नीला तीर आसान इंजेक्शन के लिए मक्खी के टर्मिनलिया को पकड़ने में मदद करने के लिए संदंश की नियुक्ति से पता चलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: डब्ल्यूटी ड्रोसोफिला मेजबान पेट में देखा गया एक जी 1 और जी 6 आईएमआर ट्यूमर 10 दिन पोस्ट-एलोट्रांसप्लांटेशन पर देखा गया। ये हरे रंग में प्रत्यारोपित ट्यूमर के साथ मक्खी पेट के उदर दृश्य हैं। पैनल (ए) ईजीएफपी (488 एनएम) को व्यक्त करने वाले दिन 10 पोस्ट-एलोट्रांसप्लांटेशन पर एक जी 1 ट्यूमर दिखाता है। पैनल (ए) को 0.8 एनए, और 3 एक्स ज़ूम के साथ 20 एक्स लेंस का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया है। पैनल (बी) ईजीएफपी (488 एनएम) को व्यक्त करने वाले दिन 10 पोस्ट-एलोट्रांसप्लांटेशन पर एक जी 6 ट्यूमर दिखाता है। पैनल (बी) 0.25 एनए, और 1 एक्स स्कैन ज़ूम के साथ 5 एक्स लेंस का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कब्जा कर लिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन शोधकर्ताओं को ड्रोसोफिला ट्यूमर के विकास और प्रगति के दौरान उत्पन्न होने वाली कुछ समस्याओं को हल करने में मदद कर सकता है। ऐसी ही एक चुनौती प्राथमिक ट्यूमर संस्कृति12 के दौरान ट्यूमर-असर लार्वा या वयस्कों की समय पूर्व मृत्यु का दरकिनार है। इस संदर्भ में, निरंतर ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन ट्यूमर को अनिश्चित काल तक बढ़ने की अनुमति देता है, जो ट्यूमर के विकास, मेटास्टेसिस और विकास के अनुदैर्ध्य अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन मेजबान-ट्यूमर इंटरैक्शन 7,13 के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए भी उपयोगी है। ट्यूमर के विकास और प्रवास पर मेजबान प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए ट्यूमर एलोग्राफ्ट से पहले मेजबान जीनोटाइप में हेरफेर किया जा सकता है, और ट्यूमर-प्रेरित कैशेक्सिया14,15 पर। विभिन्न जीनोटाइप के साथ फ्लाई होस्ट एक ही ट्यूमर के जवाब में कैशेक्सिया जैसी बर्बादी की अलग-अलग अभिव्यक्तियों का प्रदर्शन कर सकते हैं। एलोट्रांसप्लांटेशन के बाद, ट्यूमर मेजबानों को कोयामा एट अल से अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके विवो इमेजिंग में तैयारी में रखा जा सकता है।
ड्रोसोफिला ट्यूमर एलोट्रांसप्लांटेशन की ओर ऑटोइंजेक्टर तंत्र का आवेदन एक सुविधाजनक और सीधा प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसमें बढ़ी हुई दक्षता होती है। मैनुअल इंजेक्टर1 की तुलना में, यह विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और बड़े पैमाने पर एलोट्रांसप्लांटेशन की अनुमति देती है, जो ट्यूमर व्यवहार अध्ययन और दवा स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं को तेज और मानकीकृत कर सकती है। यह बेहतर विधि प्रभावशाली मेजबान अस्तित्व और ट्यूमर उपज दर पैदा करती है। एक प्रशिक्षित शोधकर्ता >90% की पोस्ट-एलोग्राफ्ट मेजबान जीवित रहने की दर प्राप्त कर सकता है। ट्यूमर उपज दर इस बात पर निर्भर करती है कि ट्यूमर प्राथमिक है या फिर से एलोग्राफ्टेड है। शोधकर्ता प्राथमिक ट्यूमर के लिए >50% और फिर से एलोग्राफ्टेड ट्यूमर के लिए >70% की ट्यूमर उपज दर प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं। इसके अलावा, यह विधि मैनुअल इंजेक्टर विधि की तुलना में प्रति मेजबान मक्खी इंजेक्शन समय को लगभग 50% तक कम कर देती है।
इस प्रक्रिया की अपनी सीमाएं हैं, हालांकि, मुख्य रूप से ट्यूमर चीरा, इंजेक्शन स्थान और घाव के आकार की असंगति के कारण। यदि प्राथमिक ट्यूमर को एलोट्रांसप्लांटेशन से पहले समान आकार के टुकड़ों में नहीं काटा जाता है, तो कुछ फ्लाई होस्ट दूसरों की तुलना में बड़े टुकड़े प्राप्त कर सकते हैं। यह अध्ययनों को प्रभावित करने वाला एक भ्रमित कारक है जिसका उद्देश्य ट्यूमर के विकास की दर को ट्रैक करना है। एलोग्राफ्ट के बाद दो दिन के अंतराल पर ट्यूमर के विकास की अंतर दर को मापकर इसे संभावित रूप से कम किया जा सकता है। इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान, ऑपरेटर को सभी मेजबान मक्खियों में पेट छल्ली में एक सुसंगत साइट चुननी चाहिए। यह एक और भ्रमित चर को कम करने में मदद करता है जो फ्लाई होस्ट अस्तित्व और ट्यूमर लगाव के अंतिम स्थान को प्रभावित कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों के बीच घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में उनके योगदान के लिए पूर्व प्रयोगशाला सदस्यों डॉ शेंग-एन यांग और श्री जुआन-मार्टिन पोर्टिला को धन्यवाद देते हैं। हम मैन्युअल एलोट्रांसप्लांटेशन पर अपने प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए पेकिंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज में डॉ यान सॉन्ग की प्रयोगशाला के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए श्री काल्डर एल्सवर्थ और श्री एवरेस्ट शापिरो को भी धन्यवाद देते हैं।
डब्ल्यूएमडी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (https://www.nih.gov/) से इस काम के लिए धन (जीएम 072562, सीए 224381, सीए 227789) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (htps://nsf.gov/) से वित्त पोषण (आईओएस -155790) प्राप्त हुआ। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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