Summary
Este protocolo fornece orientação detalhada para a ação de aotransplante geracional inicial e contínua de tumores de Drosophila no abdômen de hospedeiros adultos para estudar vários aspectos da neoplasia. Usando um aparelho autoinjetor, os pesquisadores podem obter melhor eficiência e rendimentos tumorais em comparação com os alcançados pelos métodos tradicionais e manuais.
Abstract
Este protocolo descreve a aotransplantação de tumores em Drosophila melanogaster usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera. Com o uso de um aparelho autoinjetor, operadores treinados podem obter resultados de transplante mais eficientes e consistentes em comparação com aqueles obtidos usando um injetor manual. Aqui, abordamos temas de forma cronológica: desde o cruzamento das linhas de Drosophila , até a indução e dissecação do tumor primário, o transplante do tumor primário em um novo hospedeiro adulto e o transplante geracional contínuo do tumor para estudos prolongados. Como demonstração, aqui usamos o domínio intracelular notch (NICD) sobreexpressão induzida tumores de anel de glândula salivar imaginária para transplante geracional. Esses tumores podem primeiro ser induzidos de forma confiável em um microambiente de zona de transição dentro de anéis imaginários da glândula salivar larval, depois alusorados e cultivados in vivo para estudar o crescimento contínuo do tumor, evolução e metástase. Este método de aotransplante pode ser útil em programas potenciais de triagem de medicamentos, bem como para estudar interações tumorais-hospedeiros.
Introduction
Este protocolo fornece uma orientação passo-a-passo para a ação da glândula salivar larval Drosophila (SG) tumores imagináveis de anel em abdômens de hospedeiros adultos usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera (por exemplo, Nanoject). Este protocolo também fornece instruções para o subsequente re-alusão de tumores em novas gerações de hospedeiros adultos, o que oferece oportunidades para o estudo longitudinal contínuo das características tumorais, como evolução tumoral e interações tumorais-hospedeiros. O protocolo também pode ser aplicado para experimentos de triagem de drogas.
Este método foi desenvolvido para melhorar a eficácia da realização da alotransplante tumoral em Drosophila utilizando injetores manuais1, que muitas vezes são inconsistentes em suas forças de sucção e injeção, levando a resultados subótimos para alotransplante tumoral. Um aparelho autoinjetor fornece melhor controle e pode resultar em taxas mais baixas de mortalidade por moscas pós-aoenxerto. Um operador treinado poderia alcançar uma taxa de sobrevivência de host de mais de 90% com o autoinjetor, em comparação com cerca de 80% quando o injetor manual foi usado1. A taxa global de aquisição de tumores é de 60%-80% no dia 8-12 pós-aoenxerto. O tempo médio de injeção também foi melhorado de 30-40 s por mosca usando um injetor manual para 20-25 s por mosca usando o autoinjetor.
Este protocolo está entre os primeiros protocolos para usar o aparelho autoinjetor na aotransplantação do tumor Drosophila . Um estudo recente também usou o autoinjetor para aotransplantação de células-tronco neurais tumorais2. Anteriormente, o aparelho autoinjetor foi utilizado em Drosophila para estudar virulência bacteriana3, infecções parasitárias e defesahospedeira 4, bem como triagem para bioatividade de diferentes compostos5. Nosso protocolo adapta o aparelho autoinjetor para uso de injeção de tumor e busca fornecer aos pesquisadores de Drosophila resultados de maior qualidade e mais consistentes, economizando-lhes tempo considerável. Este protocolo não só pode ser usado para a aotransplantação de tumores, mas também pode ser adaptado para a aotransplantação de tecidos selvagens e mutantes de calibresemelhante 6.
O tumor de Drosophila NICD usado neste protocolo foi introduzido pela primeira vez por Yang et al.7 na zona de transição do anel imaginário SG, um "hotspot tumoral" que exibe altos níveis de atividade endógena de Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT) e atividade c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Além disso, a zona de transição possui altos níveis de matriz metaloproteinase-1 (MMP1)7, o que torna essa região particularmente propícia à tumorigênese. A ativação da via de entalhe através da superexpressão nicd é suficiente para iniciar consistentemente a formação de tumores. Esses tumores podem ser posteriormente aotransplantados para permitir a investigação de uma ampla gama de tópicos, incluindo divisão de células tumorais, invasão e interações tumorais-hospedeiros.
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Protocol
1. Preparação do tumor do anel imaginário de SG
- Moscas adultas cruzadas com genótipos de UAS-NICD (Masculino: 10-15 moscas) e Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (Fêmea Virgem: 10-15 moscas) e permitem que elas se reproduzam por 1 dia a 18 °C. As moscas adultas selecionadas devem ter de 5 a 9 dias para garantir alta fertilidade.
- Permita que as moscas adultas coloquem ovos nos alimentos de mosca contidos em frascos por 24 h a 18 °C e, em seguida, remova as moscas adultas.
NOTA: A comida fly é preparada usando a receita padrão de alimentos de fubá do Drosophila Stock Center8. Cada frasco deve conter cerca de 10mL de alimentos para moscas. - Deixe os ovos incubarem por 6 dias a 18 °C. Durante este período, as larvas chocarão.
- Transfira os frascos que contenham larvas para uma incubadora de 29 °C e incubar por mais 7 dias.
NOTA: Esta etapa de incubação é opcional dependendo do design experimental específico.
2. Preparação de Drosophila adulto selvagem para aotransplantação
- Anestesiar o tipo selvagem ou moscas adultas mutantes apropriadas com 100% de CO2 e classificar moscas baseadas em sexos. Tanto moscas masculinas quanto femininas podem ser usadas como hospedeiros tumorais.
- Fixar um pedaço de fita de 5 cm de comprimento em um slide de microscópio com o lado pegajoso para cima, fixando-o com dois pedaços menores de fita, um em cada extremidade.
- Imobilize as moscas aderindo suas asas à fita. Use fórceps enquanto manobra as moscas.
- Repita o passo acima para 60-80 moscas adultas usadas como aceitadores de alusão.
NOTA: É melhor organizar moscas em linhas limpas, com seu eixo corporal alinhado paralelo um ao outro para um processo de injeção mais eficiente mais eficiente mais tarde. A Figura 1 mostra fileiras de moscas hospedeiras coladas desta maneira.
- Repita o passo acima para 60-80 moscas adultas usadas como aceitadores de alusão.
3. Montagem do aparelho autoinjetor
- Conecte o aparelho autoinjetor e o cabo de alimentação à caixa do controlador.
- Ajuste o volume de injeção para 59,8 nL. Isso ajudará a manter a quantidade adequada de forças de sucção e injeção durante a adução.
- Coloque a caixa do controlador e o autoinjetor em lados opostos do microscópio de luz.
NOTA: Para operadores destros, a caixa de controle deve ser colocada no lado esquerdo do microscópio com o injetor do lado direito. Vice-versa para operadores canhotos. - Prepare o capilar de vidro de 3,5'' para uso, cortando a extremidade fechada com fórceps.
- Processe uma extremidade do capilar de vidro usando um puxador de micropipette de quatro etapas e aqueça a uma extremidade estreita e fechada usando as seguintes especificações do instrumento: Calor = 650, Força = 200 e Distância = 8. Coloque os capilares perfeitamente no aparelho do puxador e execute o programa depois de inserir as configurações acima.
- Use fórceps para cortar o capilar em um ângulo de aproximadamente 60° para fazer uma extremidade mais nítida para fácil entrada no abdômende mosca adulto 1. Veja a Figura 2 como um exemplo de um capilar bem cortado.
- Levemente desaparafusar a tampa do injetor. Segure o botão Vazio para avançar a agulha do injetor até que 70%-80% de seu comprimento total esteja aparecendo. Para acelerar o avanço capilar, pressione o botão Encher uma vez enquanto segura simultaneamente o botão Vazio .
- Use uma seringa para encher o capilar de vidro com óleo mineral. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro na agulha do injetor até que o primeiro esteja firmemente preso à rolha de borracha do injetor. Agora aparar a tampa do injetor.
- Limpe o resíduo de óleo mineral na superfície externa da tampa capilar de vidro para evitar contaminar o meio durante a ação.
4. Dissecção do tumor do anel imaginário SG
- Selecione uma das larvas e transfira-a para uma placa de dissecção preenchida com 100 μL do Médio de Schneider para preparar a dissecção do tumor do anel imaginário SG.
NOTA: Apenas os espécimes que abrigam o tumor permanecerão como larvas. Isso porque o crescimento do tumor atrasa o desenvolvimento larval e a progressão9. Dois terços dos espécimes não abrigarão o tumor e, portanto, terão progredido para pupas/adultos.- Para fins de dissecção e adução, use um estereótipo com uma faixa de ampliação de 10x-20x.
- Usando um par de fórceps para segurar a parte central do corpo larval, belisque a cabeça larval usando outro par de fórceps e aplique uma força de alongamento longitudinalmente.
- Localize o SG em forma de Y das larvas e isole-o do resto do tecido larval10.
- Disseca e isole o tumor do anel imaginário SG removendo o tecido adjacente. Consulte a Figura 3 para uma representação deste processo de dissecção.
- Repita os passos 4.1-4.4 para um adicional de 10 a 20 tumores de anel imaginário SG com base nas necessidades da pesquisa.
5. Aoenxerto do tumor do anel imaginário primário de SG
- Submergir o capilar no Meio schneider contendo os tumores de anel imaginário sg primário. Segure o botão Encher para encher o capilar de vidro com o Médio de Schneider até o segmento superior de 0,5 cm. Este segmento superior deve permanecer cheio de óleo mineral.
NOTA: Acelere esse processo pressionando o botão Vazio uma vez enquanto segura simultaneamente o botão Fill . - Localize um tumor primário e pressione o botão Fill até que o tumor seja aspirado no capilar.
- Certifique-se de que o tumor está na ponta do capilar ou vários milímetros de distância da ponta do capilar. Isso ajuda a evitar que o tumor fique à deriva e se perca na solução contida no capilar. Consulte a Figura 4A para uma demonstração do local do tumor apropriado, pois ele está no capilar.
- Localize uma mosca adulta imobilizada para a fita no slide do microscópio. Usando fórceps, segure suavemente o abdômen inferior. Em seguida, fure a cutícula lateral inferior do abdômen com o capilar. Pressione o botão Esvaziar até que o tumor entre no novo abdômen hospedeiro. Consulte a Figura 4B para uma demonstração desta técnica.
- Usando fórceps, aperte suavemente as asas do host para removê-la da fita. Coloque o anfitrião em um novo frasco com comida fresca. É melhor colocar o frasco de lado para as 24 horas iniciais após a injeção. Cada frasco deve conter apenas até um máximo de 20 moscas.
NOTA: Algumas moscas hospedeiras terão asas faltando e outras feridas em seus corpos após a injeção e podem ficar com a comida de mosca se o frasco for colocado na vertical. - Repita os passos 5.2 a 5.4 para transplantar os tumores primários restantes em seus novoshospedeiros adultos.
- Descarte os capilares no recipiente de sharps e limpe o resíduo de óleo mineral do exterior do autoinjetor antes de substituir o aparelho de volta em sua caixa.
- Armazene o frasco de hosts em temperatura ambiente por 1 dia e transfira o frasco para uma câmara de incubação a 29 °C. Transfira os hosts para novos frascos a cada 2-3 dias.
- Monitore os hosts de mosca diariamente e calcule as taxas de sobrevivência. Após uma semana, os tumores devem ser visíveis sob um microscópio estéreo com adaptador de fluorescência e podem ser continuamente monitorados para seu tamanho e progressão.
6. Re-aoento de tumores transplantados
- Em torno de 10-14 dias após o aoenxerto, tela para tumores que cresceram no abdômen hospedeiro usando um microscópio de fluorescência.
- Anestesiar um host com CO2 e colocá-lo em uma placa de dissecção preenchida com 100 μL Schneider's Medium. Disseca o tumor amberxado cultivado fora do hospedeiro usando dois pares de fórceps.
- Use um par de fórceps para segurar o abdômen e o outro par para inspirar a cutícula abdominal, expondo o tumor a todo-enxerto1.
- Isole cuidadosamente o tumor dos tecidos do hospedeiro preso tanto quanto possível usando marcadores de fluorescência como orientação.
- Repita o passo 6.2 para preparar dois a três tumores alusões adicionais.
- Transfira a placa de dissecção contendo os tumores colhidos para o estágio de um microscópio leve.
- Use agulhas estéreis e disseque os tumores em pedaços menores que sejam apropriados para o tamanho capilar.
- Repita os passos 4.1-4.5 para preparar a nova geração de hospedeiros adultos e repetir etapas 5.1-5.7 para completar a aotransplantação dos tumores.
NOTA: As taxas de sucesso são geralmente mais altas para tumores não primários em comparação com os tumores primários. - Repetir as etapas 6.1-6.6 para cada geração subsequente de moscas utilizadas no estudo.
NOTA: Escolha linhas de host Drosophila adequadas às necessidades experimentais.
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Representative Results
Aqui, realizamos a alocagem de gerações de tumores de anel imaginável SG usando o aparelho autoinjetor de injeção de nanoliter e conduzimos imagens subsequentes de tumores com um microscópio de varredura a laser confocal, o que permitiu um mergulho mais profundo em tópicos de crescimento tumoral, migração de células tumorais e interações tumorais-hospedeiros. Ao montar moscas, cole-as a um slide de microscópio e contê-as através de um bloco de polidimtilatilasiloxano (PDMS)bloco 11.
A Figura 5A apresenta uma captura de imagem ao vivo de um tumor de anel imaginário de1ª geração (G1) SG crescendo em um abdômen hospedeiro adulto no dia 10 pós-aotransplante. Este nível de imagem pode ser usado para rastrear o processo de divisão de tumores. A Figura 5B retrata um tumor de anel imaginário de6ª geração (G6) SG ocupando grande parte do abdômen hospedeiro no dia 10 pós-aotransplante. Imagens nesta fase podem ajudar a revelar padrões de crescimento tumoral, bem como seus comportamentos de migração e invasão. É importante notar que, embora esta imagem tenha sido capturada usando um microscópio de varredura a laser confocal, um estereómico com um adaptador de fluorescência GFP também poderia ser usado em 2x a 5x de ampliação, dependendo do tamanho do tumor.
Figura 1: O host voa colado e protegido para aotransplantação. As moscas hospedeiras são coladas por suas asas e orientadas ordenadamente para se preparar para o procedimento de transplante subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um capilar de injeção bem cortado. A seta vermelha aponta para uma borda afiada necessária para perfurar efetivamente a cutícula abdominal dos hospedeiros adultos de Drosophila . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dissecção do tumor de ImR da glândula salivar primária. O processo de dissecação e isolamento de dois tumores primários de ImR da glândula salivar é demonstrado cronologicamente do Painel (A) ao Painel (B), utilizando duas incisões separadas. O painel (A) mostra a glândula salivar antes da dissecção do tumor. As pontas das flechas vermelhas indicam os primeiros pontos de incisão. As pontas das flechas azuis indicam os segundos pontos de incisão. O tumor está entre as pontas das flechas vermelhas e azuis. O painel (B) mostra o tumor isolado de ImR após as duas incisões serem feitas para separá-lo do tecido da glândula salivar normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Localização do tumor apropriada dentro da capilaridade e injeção de tumor no abdômen hospedeiro de Drosophila . O painel (A) mostra a localização do tumor mais adequada dentro do capilar. O tumor expressa eGFP (488 nm). O painel (B) mostra o processo de injeção. A seta vermelha indica o local da injeção do tumor. A seta azul mostra a colocação de fórceps para ajudar a segurar as terminais da mosca para facilitar a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Um tumor G1 e G6 ImR visto no abdômen hospedeiro WT Drosophila no dia 10 pós-aotransplante. Estas são vistas ventral do abdômen da mosca com os tumores transplantados em verde. Painel (A) mostra um tumor G1 no dia 10 pós-aotransplante expressando eGFP (488 nm). O painel (A) é capturado usando um microscópio confocal usando uma lente de 20x com 0,8 NA e zoom de 3x. Painel (B) mostra um tumor G6 no dia 10 pós-aotransplante expressando eGFP (488 nm). O painel (B) é capturado usando um microscópio confocal usando uma lente de 5x com 0,25 NA e zoom de 1x de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A aotransplantação tumoral pode ajudar os pesquisadores a resolver certos problemas que surgem durante o crescimento e progressão do tumor de Drosophila. Um desses desafios é a evasão de mortes prematuras de larvas tumorais ou adultos durante a cultura do tumor primário12. Nesse contexto, a aotransplante tumoral contínua permite que os tumores cresçam indefinidamente, o que facilita estudos longitudinais de crescimento tumoral, metástase e evolução. A aotransplante tumoral também é útil para avaliar vários aspectos das interações hospedeiro-tumor 7,13. Genótipos host podem ser manipulados antes do aoenxerto tumoral para permitir a avaliação do efeito hospedeiro sobre o crescimento e migração do tumor, e sobre a caquexia induzida pelo tumor14,15. Os hospedeiros voadores com diferentes genótipos podem exibir manifestações distintas de desperdiçando caquexia em resposta ao mesmo tumor. Após a aotransplante, os hospedeiros tumorais podem ser montados em preparação para imagens in vivo usando um protocolo adaptado de Koyama et al. e Ji et al.11,16.
A aplicação do aparelho autoinjetor em direção à aotransplantação do tumor Drosophila fornece um protocolo conveniente e direto que possui maior eficiência. Em comparação com o injetor manual1, este método permite alotransplantações reprodutíveis e em larga escala, que podem agilizar e padronizar estudos de comportamento tumoral e procedimentos de triagem de medicamentos. Este método melhorado produz impressionantes taxas de sobrevivência do hospedeiro e rendimento do tumor. Um pesquisador treinado pode alcançar taxas de sobrevivência pós-aoenxerto de hospedagem de >90%. As taxas de rendimento do tumor podem diferir dependendo se o tumor é primário ou re-aoentografado. Os pesquisadores podem esperar alcançar taxas de produção de tumores de >50% para tumores primários e >70% para tumores re-aoentografados. Além disso, este método reduz o tempo de injeção por voo hospedeiro em quase 50% em comparação com o método injetor manual.
Este procedimento tem suas limitações, no entanto, principalmente devido à inconsistência da incisão tumoral, localização da injeção e tamanho da ferida. Se os tumores primários não forem cortados em fragmentos de tamanho uniforme antes da aotransplantação, certos hospedeiros de moscas podem receber fragmentos maiores do que outros. Trata-se de um fator confuso que afeta estudos que visam acompanhar a taxa de crescimento do tumor. Isso pode ser potencialmente mitigado medindo a taxa diferencial de crescimento do tumor em intervalos de dois dias após o aoenxerto. Além disso, durante a injeção, o operador deve escolher um local consistente na cutícula abdominal em todas as moscas hospedeiras. Isso ajuda a mitigar outra variável de confusão que pode afetar a sobrevivência do hospedeiro de moscas e a localização final do apego ao tumor.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse para declarar entre os autores.
Acknowledgments
Agradecemos aos ex-membros do laboratório Dr. Sheng-An Yang e Sr. Juan-Martin Portilla por sua contribuição no desenvolvimento deste protocolo. Somos gratos pelo laboratório do Dr. Yan Song na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Pequim por compartilhar seu protocolo sobre a locotraplantação manual. Agradecemos também ao Sr. Calder Ellsworth e ao Sr. Everest Shapiro pela leitura crítica do manuscrito.
A ADM recebeu financiamento (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabalho do Instituto Nacional de Saúde (https://www.nih.gov/) e financiamento (IOS-155790) da Fundação Nacional de Ciência (htps://nsf.gov/). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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