Summary
Bu protokol, neoplazinin çeşitli yönlerini incelemek için Drosophila tümörlerinin yetişkin konakçıların karnına ilk ve devam eden kuşak allotransplantasyonu için ayrıntılı rehberlik sağlar. Bir otoenjektör aparatı kullanarak, araştırmacılar geleneksel, manuel yöntemlerle elde edilenlere kıyasla daha iyi verimlilik ve tümör verimi elde edebilirler.
Abstract
Bu protokol, Drosophila melanogaster'deki tümörlerin oto-nanolitre enjeksiyon cihazı kullanılarak allotransplantasyonunu tanımlar. Bir otoenjektör aparatının kullanılmasıyla, eğitimli operatörler manuel enjektör kullanılarak elde edilenlere kıyasla daha verimli ve tutarlı transplantasyon sonuçları elde edebilirler. Burada, konuları kronolojik bir şekilde ele alıyoruz: Drosophila çizgilerinin geçmesinden, primer tümörün indüksiyonuna ve diseksiyonuna, primer tümörün yeni bir yetişkin konağa transplantasyonuna ve genişletilmiş çalışmalar için tümörün nesiller boyu transplantasyonuna devam edilmesine. Bir gösterim olarak, burada kuşak transplantasyonu için Notch hücre içi alan (NICD) aşırı ekspresyonuna bağlı tükürük bezi hayali halka tümörleri kullanılmaktadır. Bu tümörler ilk önce larva tükürük bezi hayali halkaları içindeki bir geçiş bölgesi mikro ortamında güvenilir bir şekilde indüklenebilir, daha sonra devam eden tümör büyümesini, evrimini ve metastazını incelemek için in vivo olarak tahsis edilebilir ve kültürlenebilir. Bu allotransplantasyon yöntemi, potansiyel ilaç tarama programlarında ve tümör-konakçı etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir.
Introduction
Bu protokol, Drosophila larva tükürük bezi (SG) hayali halka tümörlerinin bir oto-nanolitre enjeksiyon aparatı (örneğin, Nanoject) kullanılarak yetişkin konakçıların karınlarına allotransplantasyonu için adım adım rehberlik sağlar. Bu protokol aynı zamanda tümörlerin yeni nesil yetişkin konakçılara daha sonra yeniden tahsis edilmesi için talimatlar sağlar, bu da tümör evrimi ve tümör-konakçı etkileşimleri gibi tümör özelliklerinin uzunlamasına incelenmesi için fırsatlar sağlar. Protokol, ilaç tarama deneylerine de uygulanabilir.
Bu yöntem, Drosophila'da tümör allotransplantasyonunun manuel enjektörler1 kullanılarak gerçekleştirilmesinin etkinliğini artırmak için geliştirilmiştir, bu da emme ve enjeksiyon kuvvetlerinde genellikle tutarsızdır ve tümör allotransplantasyonu için optimal olmayan sonuçlara yol açmaktadır. Bir otoenjektör aparatı daha iyi kontrol sağlar ve allogreft sonrası daha düşük sinek mortalitesi oranlarına neden olabilir. Eğitimli bir operatör, manuel enjektörkullanıldığında yaklaşık% 80'e kıyasla, otomatik enjektör ile% 90'ın üzerinde bir konakçı hayatta kalma oranı elde edebilir1. Allogreft sonrası 8-12. günlerde genel tümör edinme oranı %60-80'dir. Ortalama enjeksiyon süresi ayrıca manuel bir enjektör kullanılarak sinek başına 30-40 sn'den otomatik enjektör kullanılarak sinek başına 20-25 sn'ye yükseltilmiştir.
Bu protokol, Drosophila tümör allotransplantasyonunda otoenjektör aparatını kullanan ilk birkaç protokol arasındadır. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, tümörlü nöral kök hücrelerin allotransplantasyonu için otoenjektör de kullanılmıştır2. Daha önce, otoenjektör aparatı Drosophila'da bakteriyel virülans3, paraziter enfeksiyonlar ve konakçı savunması4'ü incelemek ve farklı bileşiklerin biyoaktivitesini taramak için kullanıldı5. Protokolümüz, otoenjektör aparatını tümör enjeksiyonu kullanımı için uyarlar ve Drosophila araştırmacılarına daha yüksek kaliteli ve daha tutarlı sonuçlar sunarken onlara önemli ölçüde zaman kazandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol sadece tümörlerin allotransplantasyonu için kullanılamaz, aynı zamanda benzer kalibre6'daki wildtype ve mutant dokuların allotransplantasyonuna da uyarlanabilir.
Bu protokolde kullanılan Drosophila NICD tümörü ilk olarak Yang ve ark.7 tarafından SG hayali halka geçiş bölgesinde, yüksek seviyelerde endojen Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörleri (JAK-STAT) ve c-Jun N-terminal Kinaz (JNK) aktivitesi sergileyen bir "tümör sıcak noktası" nda tanıtıldı. Ek olarak, geçiş bölgesi yüksek seviyelerde matriks metalloproteinaz-1 (MMP1)7'ye sahiptir, bu da bu bölgeyi özellikle tümörigeneze elverişli kılar. NICD aşırı ekspresyonu yoluyla çentik yolu aktivasyonu tek başına tümör oluşumunu sürekli olarak başlatmak için yeterlidir. Bu tümörler daha sonra tümör hücresi bölünmesi, invazyonu ve tümör-konakçı etkileşimleri dahil olmak üzere çok çeşitli konuların araştırılmasına izin vermek için tahsis edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SG hayali halka tümörünün hazırlanması
- UAS-NICD (Erkek: 10-15 sinek) ve Act-Gal4, UAS-GFP / CyO genotipleri ile yetişkin sinekleri çaprazlayın; küvet-Gal80ts (Bakire dişi: 10-15 sinek) ve 18 ° C'de 1 gün boyunca üremelerine izin verin. Seçilen yetişkin sinekler yüksek doğurganlık sağlamak için 5-9 günlük olmalıdır.
- Yetişkin sineklerin, şişelerde bulunan sinek yiyeceklerine 18 ° C'de 24 saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin, ardından yetişkin sinekleri çıkarın.
NOT: Sinek yiyecekleri, Drosophila Stok Merkezi8'in standart mısır unu yemek tarifi kullanılarak hazırlanır. Her şişe yaklaşık 10mL sinek yemi içermelidir. - Yumurtaların 18 ° C'de 6 gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin. Bu dönemde larvalar yumurtadan çıkacaktır.
- Larva içeren şişeleri 29 ° C'lik bir inkübatöre aktarın ve 7 gün daha inkübe edin.
NOT: Bu inkübasyon adımı, spesifik deneysel tasarıma bağlı olarak isteğe bağlıdır.
2. Allotransplantasyon için yetişkin vahşi tip Drosophila'nın hazırlanması
- Yabani tip veya uygun mutant yetişkin sinekleri% 100 CO2 ile uyuşturun ve sinekleri cinsiyetlere göre sıralayın. Hem erkek hem de dişi sinekler tümör konakçıları olarak kullanılabilir.
- 5 cm uzunluğunda bir sinek bandı parçasını, yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde mikroskop slaytına, her iki ucunda birer tane olmak üzere iki küçük bant parçasıyla sabitleyin.
- Kanatlarını banda yapıştırarak sinekleri hareketsiz hale getirin. Sinekleri manevra yaparken forseps kullanın.
- Allogreft alıcıları olarak kullanılan 60-80 yetişkin sinek için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
NOT: Sinekleri, daha sonra daha verimli bir enjeksiyon işlemi için vücut eksenleri birbirine paralel olarak hizalanmış düzgün sıralar halinde düzenlemek en iyisidir. Şekil 1 , bu şekilde bantlanmış konakçı sinek sıralarını göstermektedir.
- Allogreft alıcıları olarak kullanılan 60-80 yetişkin sinek için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
3. Otomatik enjektör aparatının montajı
- Hem otomatik enjektör aparatını hem de güç kablosunu kontrol ünitesi kutusuna bağlayın.
- Enjeksiyon hacmini 59,8 nL'ye ayarlayın. Bu, allotransplantasyon sırasında uygun miktarda emme ve enjeksiyon kuvvetinin korunmasına yardımcı olacaktır.
- Kontrol kutusunu ve otomatik enjektörü, ışık mikroskobunun karşı taraflarına yerleştirin.
NOT: Sağ elini kullanan operatörler için, kontrol kutusu mikroskopun sol tarafına, enjektör sağ tarafa yerleştirilmelidir. Solak operatörler için bunun tersi de geçerlidir. - 3,5'' cam kılcal damarı, kapalı ucu forseps ile kırparak kullanıma hazırlayın.
- Cam kılcal damarın bir ucunu dört adımlı bir mikropipet çektirici kullanarak işleyin ve cihazda aşağıdaki özellikleri kullanarak dar, kapalı bir uca ısıtın: Isı = 650, Kuvvet = 200 ve Mesafe = 8. Kılcal damarları çektirme aparatına düzgün bir şekilde yerleştirin ve yukarıdaki ayarları girdikten sonra programı çalıştırın.
- Yetişkin sinek karnına kolay giriş için daha keskin bir son oluşturmak üzere kılcal damarı yaklaşık 60° açıyla kesmek için forseps kullanın1. İyi kırpılmış kılcal damar örneği için Şekil 2'ye bakın.
- Enjektörün kapağını hafifçe sökün. Enjektör iğnesini toplam uzunluğunun% 70-80'i görünene kadar ilerletmek için Boş düğmesini basılı tutun. Kılcal damar ilerlemesini hızlandırmak için Doldur düğmesine bir kez basın ve aynı anda Boş düğmesini basılı tutun.
- Cam kılcal damarı mineral yağ ile doldurmak için bir şırınga kullanın. Ardından, cam kılcal damarı, enjektörün kauçuk tıpasına sıkıca tutturulana kadar enjektör iğnesine dikkatlice yerleştirin. Şimdi enjektör kapağını sıkıca vidalayın.
- Allotransplantasyon sırasında ortamın kirlenmesini önlemek için cam kılcal kapağın dış yüzeyindeki mineral yağ kalıntılarını silin.
4. SG hayali halka tümörünün diseksiyonu
- Larvalardan birini seçin ve SG hayali halka tümör diseksiyonuna hazırlanmak için 100 μL Schneider's Medium ile doldurulmuş bir diseksiyon plakasına aktarın.
NOT: Sadece tümörü barındıran örnekler larva olarak kalacaktır. Bunun nedeni, tümör büyümesinin larva gelişimini ve ilerlemesini geciktirmesidir9. Örneklerin üçte ikisi tümörü barındırmayacak ve böylece pupa / yetişkinlere ilerlemiş olacaktır.- Diseksiyon ve allotransplantasyon amacıyla, 10x-20x büyütme aralığına sahip bir stereomikroskop kullanın.
- Larva gövdesinin orta bölümünü tutmak için bir çift forseps kullanarak, başka bir çift forseps kullanarak larva kafasını sıkıştırın ve uzunlamasına bir germe kuvveti uygulayın.
- Larvaların Y şeklindeki SG'sini bulun ve larva dokusunun geri kalanından izole edin10.
- SG hayali halka tümörünü, bitişik dokuyu çıkararak diseke edin ve izole edin. Bu diseksiyon işleminin bir tasviri için Şekil 3'e bakınız.
- Araştırma ihtiyaçlarına göre ilave 10 ila 20 SG hayali halka tümörleri için 4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın.
5. Primer SG hayali halka tümörünün allogrefti
- Kılcal damarı, primer SG hayali halka tümörlerini içeren Schneider's Medium'a batırın. Cam kılcal damarı Schneider's Medium ile en üstteki 0,5 cm'lik segmente kadar doldurmak için Doldur düğmesini basılı tutun. Bu üst segment mineral yağ ile dolu kalmalıdır.
NOT: Boş düğmesine bir kez basarken aynı anda Doldur düğmesini basılı tutarak bu işlemi hızlandırın. - Birincil bir tümörü bulun ve tümör kılcal damara emilene kadar Doldur düğmesine basın.
- Tümörün kılcal damarın ucunda veya kılcal damarın ucundan birkaç milimetre uzakta oturduğundan emin olun. Bu, tümörün sürüklenmesini ve kılcal damarda bulunan çözeltide kaybolmasını önlemeye yardımcı olur. Kılcal damarda otururken uygun tümör lokalizasyonunun gösterilmesi için Şekil 4A'ya bakınız.
- Mikroskop slaytındaki banda hareketsiz hale getirilmiş yetişkin bir sinek bulun. Forseps kullanarak, alt karın bölgesini yavaşça tutun. Daha sonra, karın alt lateral kütikülünü kılcal damar ile delin. Tümör yeni konakçı karnına girene kadar Boş düğmesine basın. Bu tekniğin gösterimi için Şekil 4B'ye bakınız.
- Forseps kullanarak, konağın kanatlarını banttan çıkarmak için yavaşça sıkıştırın. Ev sahibini taze yiyeceklerle yeni bir şişeye yerleştirin. Şişeyi enjeksiyondan sonraki ilk 24 saat boyunca yana doğru yerleştirmek en iyisidir. Her şişe sadece en fazla 20 sinek içermelidir.
NOT: Bazı konakçı sineklerin enjeksiyondan sonra vücutlarında eksik kanatlar ve diğer yaralar olacaktır ve şişe dik yerleştirilirse sinek yemine yapışabilir. - Kalan primer tümörleri yeni yetişkin konakçılarına nakletmek için 5.2 ile 5.4 arasındaki adımlarıtekrarlayın.
- Kılcal damarları keskinlerin kabına atın ve aparatı tekrar kutusuna koymadan önce mineral yağ kalıntılarını otomatik enjektörün dışından temizleyin.
- Ana bilgisayar şişesini 1 gün boyunca oda sıcaklığında saklayın, ardından şişeyi 29 ° C'de bir inkübasyon odasına aktarın. Sinek konakçılarını her 2-3 günde bir yeni şişelere aktarın.
- Sinek konakçılarını günlük olarak izleyin ve hayatta kalma oranlarını hesaplayın. Bir hafta sonra, tümörler floresan adaptörlü bir stereo mikroskop altında görünür olmalı ve boyutları ve ilerlemeleri için sürekli olarak izlenebilir.
6. Nakledilen tümörlerin yeniden allogreftlenmesi
- Allogreftten yaklaşık 10-14 gün sonra, floresan mikroskobu kullanarak konakçı karınlarda büyüyen tümörleri tarayın.
- Bir konağı CO2 ile anestezi altına alın ve 100 μL Schneider Medium ile doldurulmuş bir diseksiyon plakasına yerleştirin. Büyümüş allogreftlenmiş tümörü iki çift forseps kullanarak konakçıdan diseke edin.
- Karnı tutmak için bir çift forseps kullanın ve diğer çift karın kütikülü kesmek için tahsis edilmiş tümörü açığa çıkarın1.
- Tümörü, bağlı konakçı dokulardan, floresan belirteçlerini kılavuz olarak kullanarak mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde izole edin.
- İki ila üç ek tahsis edilmiş tümöre hazırlanmak için adım 6.2'yi tekrarlayın.
- Hasat edilen tümörleri içeren diseksiyon plakasını bir ışık mikroskobu sahnesine aktarın.
- Steril iğneler kullanın ve tümörleri kılcal boyuta uygun daha küçük parçalara ayırın.
- Yeni nesil yetişkin konakçıları hazırlamak için 4.1-4.5 adımlarını tekrarlayın ve tümörlerin allotransplantasyonunu tamamlamak için 5.1-5.7 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Primer olmayan tümörlerde başarı oranları genellikle primer tümörlere göre daha yüksektir. - Çalışmada kullanılan sonraki her nesil sinek için 6.1-6.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Deneysel ihtiyaçlara uygun Drosophila konak çizgilerini seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, nanolitre enjeksiyon otoenjektör aparatını kullanarak SG hayali halka tümörlerinin nesiller arası allotransplantasyonunu gerçekleştirdik ve tümör büyümesi, tümör hücresi göçü ve tümör-konakçı etkileşimleri konularına daha derin bir dalış sağlayan konfokal lazer tarama mikroskobu ile daha sonra tümör canlı görüntüleme gerçekleştirdik. Sinekleri monte ederken, onları bir mikroskop slaytına yapıştırın ve bir polidimetilsiloksan (PDMS) blok11 ile sınırlandırın.
Şekil 5A , allotransplantasyon sonrası 10. günde erişkin bir konakçı karnında büyüyen 1. nesil (G1) SG hayali halka tümörünün canlı görüntüleme görüntüsünü içermektedir. Bu görüntüleme seviyesi, tümör bölünmesi sürecini izlemek için kullanılabilir. Şekil 5B , allotransplantasyon sonrası 10. günde konakçı karnın büyük bir bölümünü kaplayan 6. nesil (G6) SG hayali halka tümörünü göstermektedir. Bu aşamada görüntüleme, tümör büyüme paternlerinin yanı sıra göç ve invazyon davranışlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu görüntü bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak yakalanmış olsa da, GFP floresan adaptörlü bir stereomikroskopun tümör boyutuna bağlı olarak 2x ila 5x büyütmede de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir.
Şekil 1: Konakçı sinekler allotransplantasyon için bantlanmış ve emniyete alınmıştır. Konakçı sinekler kanatları tarafından bantlanır ve sonraki nakil prosedürüne hazırlanmak için düzgün bir şekilde yönlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: İyi kırpılmış bir enjeksiyon kılcal damarı. Kırmızı ok, yetişkin Drosophila konakçılarının karın kütikülünü etkili bir şekilde delmek için gereken keskin bir kenara işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Primer tükürük bezi ImR tümörünün diseksiyonu. İki primer tükürük bezi ImR tümörünün diseksiyonu ve izole edilmesi işlemi, iki ayrı insizyon kullanılarak Panel (A)'dan Panel'e (B)'ye kronolojik olarak gösterilmiştir. Panel (A) tümör diseksiyonundan önce tükürük bezini gösterir. Kırmızı ok uçları ilk kesi noktalarını gösterir. Mavi ok uçları ikinci kesi noktalarını gösterir. Tümör kırmızı ve mavi ok uçları arasında yer alır. Panel (B), normal tükürük bezi dokusundan ayırmak için iki insizyon yapıldıktan sonra izole edilen ImR tümörünü gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kılcal damar içinde uygun tümör lokalizasyonu ve tümörün Drosophila konakçı karnına enjeksiyonu. Panel (A) kılcal damar içindeki en uygun tümör lokalizasyonunu gösterir. Tümör eGFP'yi (488 nm) eksprese eder. Panel (B) enjeksiyon işlemini gösterir. Kırmızı ok, tümör enjeksiyon bölgesini gösterir. Mavi ok, daha kolay enjeksiyon için sineğin terminalini tutmaya yardımcı olmak için forsepslerin yerleşimini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Allotransplantasyon sonrası 10. günde WT Drosophila konakçı karnında görülen G1 ve G6 ImR tümörü. Bunlar, yeşil renkte nakledilen tümörlerle sinek karnının ventral görünümleridir. Panel (A), allotransplantasyon sonrası 10. günde eGFP (488 nm) eksprese eden bir G1 tümörü göstermektedir. Panel (A), 0,8 NA'lı 20x lens ve 3x yakınlaştırma kullanılarak bir konfokal mikroskop kullanılarak yakalanır. Panel (B), allotransplantasyon sonrası 10. günde eGFP (488 nm) eksprese eden bir G6 tümörü göstermektedir. Panel (B), 0,25 NA'lı 5x lens ve 1x tarama yakınlaştırması kullanılarak konfokal mikroskop kullanılarak yakalanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör allotransplantasyonu, araştırmacıların Drosophila tümörünün büyümesi ve ilerlemesi sırasında ortaya çıkan bazı sorunları ele almalarına yardımcı olabilir. Böyle bir zorluk, primer tümör kültürü 12 sırasında tümör taşıyan larvaların veya yetişkinlerin erken ölümlerininatlatılmasıdır. Bu bağlamda, devam eden tümör allotransplantasyonu, tümörlerin süresiz olarak büyümesine izin verir, bu da tümör büyümesi, metastazı ve evriminin uzunlamasına incelenmesini kolaylaştırır. Tümör allotransplantasyonu, konakçı-tümör etkileşimlerinin çeşitli yönlerinin değerlendirilmesinde de yararlıdır 7,13. Konakçı genotipleri, tümör büyümesi ve göçü ve tümöre bağlı kaşeksi14,15 üzerindeki konak etkisinin değerlendirilmesine izin vermek için tümör allogreftinden önce manipüle edilebilir. Farklı genotiplere sahip sinek konakçıları, aynı tümöre yanıt olarak kaşeksi benzeri israfın farklı belirtilerini sergileyebilir. Allotransplantasyon sonrası, tümör konakçıları, Koyama ve ark. ve Ji ve ark.11,16'dan uyarlanmış bir protokol kullanılarak in vivo görüntüleme için hazırlık olarak monte edilebilir.
Otoenjektör aparatının Drosophila tümör allotransplantasyonuna doğru uygulanması, gelişmiş verimliliğe sahip uygun ve basit bir protokol sağlar. Manuel enjektör1 ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, tümör davranış çalışmalarını ve ilaç tarama prosedürlerini hızlandırabilen ve standartlaştırabilen tekrarlanabilir ve büyük ölçekli allotransplantasyonlara izin verir. Bu geliştirilmiş yöntem, etkileyici konakçı sağkalımı ve tümör verim oranları üretir. Eğitimli bir araştırmacı allogreft sonrası konakçı sağkalım oranlarını% >90 elde edebilir. Tümör verim oranları, tümörün primer veya yeniden tahsis edilmiş olmasına bağlı olarak değişebilir. Araştırmacılar, primer tümörler için% >50 ve yeniden tahsis edilmiş tümörler için% >70 tümör verim oranlarına ulaşmayı bekleyebilirler. Ek olarak, bu yöntem konakçı sineği başına enjeksiyon süresini manuel enjektör yöntemine kıyasla yaklaşık% 50 oranında azaltır.
Bununla birlikte, bu prosedürün sınırlamaları vardır, ancak esas olarak tümör insizyonu, enjeksiyon yeri ve yara boyutunun tutarsızlığı nedeniyle. Primer tümörler allotransplantasyondan önce eşit büyüklükte parçalar halinde kesilmezse, bazı sinek konakçıları diğerlerinden daha büyük parçalar alabilir. Bu, tümör büyüme hızını izlemeyi amaçlayan çalışmaları etkileyen kafa karıştırıcı bir faktördür. Bu, allogreft sonrası iki günlük aralıklarla tümör büyümesinin diferansiyel hızını ölçerek potansiyel olarak hafifletilebilir. Ek olarak, enjeksiyon sırasında, operatör tüm konakçı sineklerde abdominal kütikülde tutarlı bir yer seçmelidir. Bu, sinek konakçısının sağkalımını ve tümör bağlanmasının nihai yerini etkileyebilecek başka bir kafa karıştırıcı değişkeni hafifletmeye yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar arasında beyan edilecek çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Eski laboratuvar üyeleri Dr. Sheng-An Yang ve Bay Juan-Martin Portilla'ya bu protokolün geliştirilmesindeki katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Dr. Yan Song'un Pekin Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi'ndeki laboratuvarına, manuel allotransplantasyon konusundaki protokollerini paylaştıkları için minnettarız. Ayrıca Bay Calder Ellsworth ve Bay Everest Shapiro'ya el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz.
KİS'ler bu çalışma için Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (https://www.nih.gov/) fon (GM072562, CA224381, CA227789) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (htps://nsf.gov/) finansman (IOS-155790) aldı. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
