Summary
यह प्रोटोकॉल सर्जिकल और तकनीकी प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जो रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता को बढ़ाने के लिए केंद्रित अल्ट्रासाउंड और माइक्रोबबल उपचार के दौरान कृंतक मस्तिष्क के विवो मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति इमेजिंग में वास्तविक समय को सक्षम करते हैं।
Abstract
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) मस्तिष्क को दवाओं के सफल वितरण के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती है। माइक्रोबबल्स की उपस्थिति में अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर बीबीबी की पारगम्यता को क्षणिक और स्थानीय रूप से बढ़ाने के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में उभरा है, जिससे बीबीबी में दवाओं के पैरा- और ट्रांससेलुलर परिवहन की सुविधा मिलती है। अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के दौरान वास्कुलचर की इमेजिंग मस्तिष्क में अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के तंत्र और गतिशीलता पर मूल्यवान और उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।
यहां, हम एक रिंग ट्रांसड्यूसर और 20x उद्देश्य लेंस के साथ संरेखित एक कपाल खिड़की का उपयोग करके इंट्राविटल मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। यह सेट-अप अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के दौरान मस्तिष्क के उच्च स्थानिक और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है। मस्तिष्क तक ऑप्टिकल पहुंच एक खुली खोपड़ी कपाल खिड़की के माध्यम से प्राप्त की जाती है। संक्षेप में, खोपड़ी के एक 3-4 मिमी व्यास के टुकड़े को हटा दिया जाता है, और मस्तिष्क के उजागर क्षेत्र को एक ग्लास कवरस्लिप के साथ सील कर दिया जाता है। एक 0.82 मेगाहर्ट्ज रिंग ट्रांसड्यूसर, जो एक दूसरे ग्लास कवरस्लिप से जुड़ा हुआ है, शीर्ष पर लगाया गया है। Agarose (1% w / v) का उपयोग ट्रांसड्यूसर के कवरस्लिप और हवा के बुलबुले को रोकने के लिए कपाल खिड़की को कवर करने वाले कवरस्लिप के बीच किया जाता है, जो अल्ट्रासाउंड प्रसार को बाधित करता है। जब बाँझ सर्जरी प्रक्रियाओं और विरोधी भड़काऊ उपाय किए जाते हैं, तो अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार और इमेजिंग सत्र कई हफ्तों में बार-बार किए जा सकते हैं। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान संयुग्मों को वास्कुलचर की कल्पना करने और अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल प्रेरित प्रभावों (जैसे, रिसाव कैनेटीक्स, संवहनी परिवर्तन) को मापने के लिए अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया जाता है। यह पेपर कपाल विंडो प्लेसमेंट, रिंग ट्रांसड्यूसर प्लेसमेंट, इमेजिंग प्रक्रिया, सामान्य समस्या निवारण चरणों के साथ-साथ विधि के फायदे और सीमाओं का वर्णन करता है।
Introduction
न्यूरोलॉजिकल विकारों के इलाज के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की उपस्थिति है। बीबीबी हाइड्रोफिलिक, चार्ज, ध्रुवीय और बड़े (> 400 डीए) अणुओं को मस्तिष्क पैरेन्काइमा 1 में प्रवेश करने से सीमित करता है। वर्तमान में मस्तिष्क पैरेन्काइमा में बीबीबी में चिकित्सीय प्रदान करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक विधि स्टीरियोटैक्टिक इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन 2 का उपयोग करना है। जांच के तहत अन्य कम आक्रामक तरीकों का उपयोग की जाने वाली तकनीकों की जटिलता से बाधित होता है, जैसे कि बीबीबी 3 में रिसेप्टर-मध्यस्थता वितरण के लिए दवाओं को डिजाइन करना, या लक्षित क्षेत्रों की स्थानिक सटीकता में सीमित है, जैसे कि इंट्रानेसल इंजेक्शन 4 या हाइपरओस्मोटिक समाधान 5 का प्रशासन।
व्यवस्थित रूप से इंजेक्ट किए गए माइक्रोबबल्स, एक अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के साथ संयोजन के रूप में अल्ट्रासाउंड का उपयोग, बीबीबी 6 की पारगम्यता को क्षणिक रूप से बढ़ाने के लिए एक noninvasive साधन के रूप में विकसित किया गया है। एक केंद्रित ट्रांसड्यूसर 7 या ट्रांसड्यूसर 8,9 की एक स्टीयरेबल चरणबद्ध सरणी का उपयोग करके, अल्ट्रासाउंड को मिलीमीटर स्तर की सटीकता के साथ मस्तिष्क में चयनित क्षेत्रों में लक्षित किया जा सकता है, जिससे ऑफ-टारगेट प्रभाव कम हो जाता है। अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार को चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग मार्गदर्शन 7,10,11,12,13,14 या स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम 15 का उपयोग करके प्रत्येक विषय के मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान में अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, बीबीबी पारगम्यता में वृद्धि की सीमा को वास्तविक समय में माइक्रोबबल्स 16,17,18 से ध्वनिक उत्सर्जन की निगरानी करके नियंत्रित किया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार की सुरक्षा और व्यवहार्यता की जांच करने वाले नैदानिक परीक्षण वर्तमान में दुनिया भर में प्रगति पर हैं (उदाहरण के लिए, ClinicalTrials.gov पहचानकर्ता NCT04118764)।
अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल बीबीबी उपचारों का मूल्यांकन आमतौर पर बीबीबी पारगम्यता में उपचार प्रेरित वृद्धि की पुष्टि करके किया जाता है, जो इसके विपरीत-संवर्धित चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में कल्पना की जाती है, या विवो इमेजिंग या पूर्व विवो हिस्टोलॉजी में डाई एक्सट्रावेशन द्वारा। हालांकि, अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार 11,19 के पूरा होने के बाद अधिकांश माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण पूर्व विवो किए गए हैं, जिससे अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान और तुरंत बाद गतिशील जैविक प्रतिक्रियाओं को याद किया जाता है। अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान आयोजित रियल-टाइम इमेजिंग अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल बीबीबी उपचार के साथ-साथ डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं को चलाने वाले तंत्र को समझने में सहायता कर सकती है, जो इसके चिकित्सीय अनुप्रयोगों की हमारी समझ को बढ़ा सकती है। इसके अलावा, विवो इमेजिंग तकनीकों के साथ क्रोनिक कपाल खिड़कियों का उपयोग अनुदैर्ध्य अध्ययनों को अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के अस्थायी पहलुओं का मूल्यांकन करने में सक्षम करेगा।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कृन्तकों में तीव्र और पुरानी अध्ययनों के लिए अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के वास्तविक समय मल्टीफोटॉन इमेजिंग का संचालन करने के लिए आवश्यक सर्जिकल और तकनीकी प्रक्रियाओं का वर्णन करना है (चित्रा 1)। यह दो भागों में प्राप्त किया जाता है: पहला, विवो इमेजिंग में सक्षम करने के लिए एक कपाल विंडो बनाने के लिए, और दूसरा, समवर्ती sonication और इमेजिंग को सक्षम करने के लिए शीर्ष पर एक रिंग ट्रांसड्यूसर माउंट करने के लिए। कपाल खिड़कियों को न्यूरोवैस्कुलर युग्मन 20, β-अमाइलॉइड रोगजनन 21, और न्यूरोइम्यूनोलॉजी 22 के विवो इमेजिंग में न्यूरोसाइंटिस्टों द्वारा बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, माउस और चूहे की खोपड़ी में तीव्र (गैर-वसूली) और पुरानी (वसूली) कपाल खिड़कियों को बनाने के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। कपाल खिड़की के तरीके, विशेष रूप से पुराने प्रयोगों के लिए, अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है23,24,25। मौजूदा साहित्य के अनुरूप होने के लिए, इस प्रोटोकॉल के दौरान 'तीव्र' और 'क्रोनिक' शब्दों का उपयोग किया जाएगा। इन विवो इमेजिंग के लिए रिंग ट्रांसड्यूसर के डिजाइन को पहले भी वर्णित किया गया है26। इन तकनीकों की उपलब्धता और अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के वास्तविक समय इमेजिंग से प्राप्त की जा सकने वाली अंतर्दृष्टि के बावजूद, बहुत कम शोध प्रयोगशालाएं हैं जिन्होंने इस तकनीक का उपयोग करके सफलतापूर्वक साहित्य प्रकाशित किया है26,27,28,29,30,31,32 . इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, इन वास्तविक समय अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल प्रयोगों के संचालन के सर्जिकल और तकनीकी विवरणों का वर्णन किया गया है। जबकि निर्दिष्ट sonication और इमेजिंग मापदंडों को BBB प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है, मस्तिष्क के लिए अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के अन्य प्रभाव, जैसे कि न्यूरोमॉड्यूलेशन 33,34, β-अमाइलॉइड पट्टिका निगरानी 31, और प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रियाएं 32, इस तकनीक का उपयोग करके भी जांच की जा सकती है।
Protocol
सभी निम्नलिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं द्वारा अनुमोदित किया गया था और नॉर्वेजियन खाद्य और सुरक्षा प्राधिकरण, सनीब्रुक रिसर्च इंस्टीट्यूट की पशु देखभाल समिति, और पशु देखभाल पर कनाडाई परिषद के अनुसार आयोजित किया गया था।
1. सामग्री की तैयारी
- कपाल खिड़की सर्जरी और अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें। क्रोनिक कपाल खिड़कियों, निष्फल उपकरण और सामग्रियों के लिए, एक बाँझ सर्जिकल स्पेस, और सर्जरी से पहले और बाद के दवा प्रशासन आवश्यक हैं23,24,25।
- ट्रांसड्यूसर और कवरस्लिप तैयारी
- ट्रांसड्यूसर की भौतिक अखंडता की जांच करें: दरारें और डेंट की तलाश करें। सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूसर के शीर्ष और पक्ष पर इलेक्ट्रोड बरकरार हैं।
- एक छोटे से पकवान में साइनोएक्रिलेट गोंद जमा करें। ट्रांसड्यूसर की सतह पर गोंद की एक पतली परत फैलाने के लिए एक applicator का उपयोग करें।
- ट्रांसड्यूसर को ग्लास कवरस्लिप पर रखें। 20-30 सेकंड के लिए मजबूती से दबाएं।
नोट: एक 3 डी मुद्रित मोल्ड का उपयोग रिंग ट्रांसड्यूसर के साथ ग्लास कवरस्लिप के संरेखण को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है, जो कवरस्लिप और रिंग ट्रांसड्यूसर (चित्रा 2) पर फर्म और यहां तक कि दबाव सुनिश्चित करता है। - ट्रांसड्यूसर और coverslip के बीच बुलबुले के लिए जाँच करें. यदि बुलबुले हैं, तो कवरस्लिप को बंद करें और चरण 1.2.3 से दोहराएं, क्योंकि हवा अल्ट्रासाउंड प्रसार में बाधा डालती है। कमरे के तापमान पर रात भर इलाज करें।
- एक बार एक ग्लास कवरस्लिप का पालन करने के बाद, ट्रांसड्यूसर (चित्रा 3) से मेल खाता है।
नोट: यह प्रोटोकॉल एक इन-हाउस निर्मित लीड जिरकोनेट टाइटनेट रिंग ट्रांसड्यूसर (10 मिमी बाहरी व्यास, 1.4 मिमी मोटाई, 1.2 मिमी ऊंचाई) 35 का उपयोग करता है, जो एक कस्टम मिलान सर्किट के साथ 50 Ω प्रतिबाधा और 0 ° चरण लोड से मेल खाता है। ट्रांसड्यूसर मोटाई मोड में 0.82 मेगाहर्ट्ज पर संचालित होता है, जो कवरस्लिप के नीचे लगभग 1 मिमी एक परिपत्र फोकल स्पॉट का उत्पादन करता है। इसी तरह के गुणों (10 मिमी बाहरी व्यास, 1.5 मिमी मोटाई, 1.1 मिमी ऊंचाई) के रिंग ट्रांसड्यूसर को 26 की विशेषता दी गई है और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है27,28,29,31,32,36।
- ट्रांसड्यूसर पुन: उपयोग और coverslip प्रतिस्थापन
- कवरस्लिप को बदलें यदि यह टूटा हुआ है या पिछले प्रयोग से मलबे (जैसे, फर, गोंद) है। coverslip को हटाने के लिए, ट्रांसड्यूसर को डुबोकर गोंद को भंग करें और 20 मिनट के लिए एसीटोन में कवरस्लिप को कवरस्लिप करें।
नोट: एसीटोन ट्रांसड्यूसर और / या इलेक्ट्रोड की अखंडता को प्रभावित कर सकता है। इस चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले निर्माता के साथ जाँच करें। - जांचें कि एसीटोन ने संदंश के साथ कवरस्लिप पर धीरे से खींचकर गोंद को भंग कर दिया है या नहीं। लंबे समय तक एसीटोन एक्सपोजर से बचने के लिए हर 10 मिनट में एक बार जांचें।
- कवरस्लिप को बदलें यदि यह टूटा हुआ है या पिछले प्रयोग से मलबे (जैसे, फर, गोंद) है। coverslip को हटाने के लिए, ट्रांसड्यूसर को डुबोकर गोंद को भंग करें और 20 मिनट के लिए एसीटोन में कवरस्लिप को कवरस्लिप करें।
2. पशु तैयारी
- एक प्रेरण कक्ष में चिकित्सा हवा, ऑक्सीजन, और isoflurane के मिश्रण का उपयोग करके जानवर को एनेस्थेटिक करें।
नोट: एक वाहक गैस के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग microbubbles37,38 के आधे जीवन को प्रभावित करने और BBB पारगम्यता 27 में अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल प्रेरित वृद्धि के परिमाण को कम करने के लिए सूचित किया गया है, लेकिन हाइपोक्सिया और मृत्यु दर के जोखिम को भी कम कर सकता है39। परियोजना के उद्देश्यों और पशु चिकित्सा सलाह के आधार पर वाहक गैसों का चयन करें। इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स जैसे कि केटामाइन / xylazine कॉकटेल का भी उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, इनहेलेबल एनेस्थेटिक्स का उपयोग करते समय संज्ञाहरण और रक्त ऑक्सीजन के स्तर के विमान को नियंत्रित करना आसान है। - जांचें कि जानवर ने पैर की अंगुली की चुटकी करके संज्ञाहरण का पर्याप्त विमान हासिल किया है। dextran, microbubbles, और दवाओं के प्रशासन की खुराक निर्धारित करने के लिए जानवर का वजन। जानवर के सिर से फर को हटा दें और जानवर को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर रखें।
- तीव्र प्रयोगों के लिए, प्रणालीगत परिसंचरण तक पहुंच dextran और microbubble इंजेक्शन के लिए स्थापित किया जाना चाहिए। इसे प्राप्त करने के लिए, एक पूंछ की नस में एक 27 ग्राम कैथेटर डालें।
नोट: जबकि रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन भी संभव हैं, मल्टीफोटॉन इमेजिंग के दौरान सिर क्षेत्र में सीमित कार्य स्थान के कारण पूंछ नसों की सिफारिश की जाती है। - स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर जानवर को स्थानांतरित करें और संज्ञाहरण को नाक शंकु पर स्विच करें। गर्मी स्रोत का उपयोग करके जानवर के 37 डिग्री सेल्सियस के मुख्य तापमान को बनाए रखें, जैसे कि हीटिंग पैड या गर्म पानी से भरा एक दस्ताना।
- एक गुदा जांच का उपयोग करके जानवरों के तापमान की निगरानी करें, और पल्स ऑक्सीमीटर का उपयोग करके पशु शरीर विज्ञान। नेत्र मरहम लगाएं। उपयुक्त पूर्व-सर्जरी एनाल्जेसिक और / या विरोधी भड़काऊ दवाओं को इंजेक्ट करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- कपाल खिड़की सर्जरी शुरू करने से पहले, संज्ञाहरण के विमान और जानवर की हृदय गति, O2 संतृप्ति, श्वसन दर और तापमान की जांच करें।
- कपाल खिड़की की सर्जरी शुरू करने के लिए, एक depilatory क्रीम लागू करके और / या फर clippers का उपयोग करके सिर पर फर को हटा दें। आंखों के बीच से गर्दन के पूर्वकाल के आधे हिस्से तक फर को हटा दें (चित्रा 4 ए)।
नोट: depilatory क्रीम के साथ लंबे समय तक संपर्क त्वचा को जला देगा। क्रोनिक कपाल खिड़की सर्जरी के लिए, बीटाडीन के वैकल्पिक पोंछे और फर हटाने के बाद 70% EtOH के साथ खोपड़ी को धोएं। बाँझ सर्जरी के लिए सर्जिकल स्पेस तैयार करें। चरण 2.15 तक बाँझपन बनाए रखा जाना चाहिए। - खोपड़ी को हटाने के लिए, गैर-प्रमुख हाथ में आयोजित संदंश का उपयोग करके आंखों के बीच की त्वचा को उठाएं, सैगिटल सीवन के साथ। घुमावदार कैंची का उपयोग करके, पार्श्विका हड्डियों को उजागर करने के लिए त्वचा को हटा दें (चित्रा 4 बी)। एक कपास झाड़ू के साथ फर्म दबाव लागू करें यदि खोपड़ी या खोपड़ी से खून बह रहा है; अगले चरण में प्रगति करने से पहले रक्तस्राव को रोका जाना चाहिए।
नोट: तीव्र सर्जरी के लिए, त्वचा को वापस धकेल दिया जा सकता है और तरल साइनोएक्रिलेट गोंद या ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करके खोपड़ी का पालन किया जा सकता है। - कपास swabs का उपयोग कर खोपड़ी की बाहरी सतह को कवर periosteum निकालें.
- एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप (6-25x) और एक दंत ड्रिल (0.5 मिमी ड्रिल, मध्यम गति) का उपयोग करके, खोपड़ी पर कपाल खिड़की के वांछित स्थान को चिह्नित करने के लिए पार्श्विका हड्डी पर एक सर्कल की रूपरेखा तैयार करें (चित्रा 5)। सैजिटल सीवन, लैम्ब्डा और ब्रेग्मा से बचें, क्योंकि ये क्षेत्र पतले होते हैं और बड़ी रक्त वाहिकाओं को ओवरले करते हैं।
नोट: ड्रिलिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए, कपाल खिड़की की एक रूपरेखा को एक मार्कर और स्टेंसिल (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके खोपड़ी पर खींचा जा सकता है। चूहों के लिए, एक परिपत्र, कपाल खिड़की के बजाय एक आयताकार ड्रिल करना आसान हो सकता है। चूहे की खोपड़ी की हड्डी की मोटाई के कारण, ड्रिलिंग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 0.5 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग करने से पहले कॉम्पैक्ट हड्डी में कपाल खिड़की को रेखांकित करने के लिए 0.7 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग करें। - ड्रिल बिट के साथ कोमल दबाव लागू करें; अत्यधिक दबाव मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को बढ़ाता है। ड्रिलिंग के दौरान खोपड़ी को ओवरहीटिंग से रोकने के लिए, एक सिरिंज का उपयोग करके खोपड़ी पर खारा ड्रिप करें, या खारा में भिगोए गए सर्जिकल स्पंज का एक टुकड़ा लागू करें।
- ड्रिलिंग और खोपड़ी को ठंडा करने के बीच वैकल्पिक जब तक कि परिणामी हड्डी द्वीप खोपड़ी के बाकी हिस्सों से अलग न हो जाए। संदंश या ड्रिल बिट का उपयोग करके हड्डी के द्वीप पर कोमल दबाव लागू करके ड्रिलिंग प्रगति की जांच करें। ड्रिलिंग जारी रखें जब तक कि हड्डी द्वीप खोपड़ी के बाकी हिस्सों से अलग न हो जाए।
नोट: खोपड़ी के सबसे पतले क्षेत्रों में छोटी दरारें एक अच्छा संकेत है कि ड्रिलिंग लगभग पूरी हो गई है। हड्डी द्वीप को समय से पहले हटाने का प्रयास करने से हड्डी के टुकड़े मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश कर सकते हैं, ड्यूरा को नुकसान पहुंचा सकते हैं और सूजन और रक्तस्राव का कारण बन सकते हैं। - हड्डी द्वीप के किनारों, या ऊपरी कॉम्पैक्ट हड्डी परत को समझने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके हड्डी द्वीप को हटा दें (चित्रा 6 ए)। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क को सर्जिकल स्पंज का एक टुकड़ा लागू करके नम रखा जाता है जिसे खारा में पहले से भिगोया गया है। यदि रक्तस्राव देखा जाता है, तो सर्जिकल स्पंज को उस क्षेत्र पर रखें जो रक्तस्राव कर रहा है। अगले चरण के लिए आगे मत बढ़ो जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए।
नोट: यदि 5 मिनट के बाद रक्तस्राव जारी रहता है, तो जानवर का उपयोग मल्टीफोटॉन इमेजिंग प्रयोगों के लिए नहीं किया जा सकता है। चूहों के लिए, यदि यह गाढ़ा है तो ड्यूरा को हटाना आवश्यक हो सकता है। ड्यूरा को हटाने के लिए, ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप पर उच्च आवर्धन और ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। - एक कपाल खिड़की रखने के लिए, संदंश की एक जोड़ी के साथ एक ग्लास कवरस्लिप उठाएं, एक तरफ खारा की एक बूंद रखें, और इसे खोपड़ी में छेद पर पैंतरेबाज़ी करें। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप के नीचे कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
नोट: चूहों के लिए एक 5 मिमी ग्लास कवरस्लिप का उपयोग करें, और चूहों के लिए 8 मिमी। चूहों के लिए, खोपड़ी की हड्डी की मोटाई के कारण, कवरस्लिप और मस्तिष्क के बीच की जगह को भरने के लिए खारा के बजाय एक एगारोज़ समाधान का उपयोग करें। ट्रांसड्यूसर और इसके कवरस्लिप को कपाल खिड़की के लिए एक अलग कवरस्लिप का उपयोग करने के बजाय सीधे खोपड़ी पर भी पालन किया जा सकता है। इस विकल्प के लिए, चरण 3.1 पर आगे बढ़ें। विवरण के लिए चित्र 1 देखें। - इसे खोपड़ी से जोड़ने के लिए कवरस्लिप (चित्रा 6 बी) की परिधि के चारों ओर सायनोएक्रिलेट गोंद की एक परत फैलाएं। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप के नीचे कोई गोंद नहीं है। यह सुनिश्चित करने के लिए कवरस्लिप पर दबाव लागू करें कि गोंद मस्तिष्क के संपर्क में नहीं आता है।
- एक बार गोंद पूरी तरह से सूख जाता है, यहां तक कि दंत ड्रिल का उपयोग करके गोंद की सतह को भी बाहर निकालता है। सुनिश्चित करें कि सभी गोंद मलबे को सर्जिकल क्षेत्र से हटा दिया गया है।
नोट: पुरानी कपाल खिड़कियों के लिए, आवश्यक पोस्ट-सर्जिकल दवाओं को इंजेक्ट करें (सामग्री की तालिका देखें), घाव की देखभाल और नरम खाद्य पदार्थों के लिए मरहम प्रदान करें, और गर्मी के दीपक के तहत जानवर को ठीक करें।
3. अंगूठी ट्रांसड्यूसर की नियुक्ति
- 1% (w / v) agarose समाधान तैयार करें। एक छोटे से बीकर या एर्लेनमेयर फ्लास्क में, 0.1 ग्राम एगारोज़ और 10 मिलीलीटर पीबीएस (1x) या खारा जोड़ें। समाधान को तब तक उबालें जब तक कि बीकर को एक हॉटप्लेट पर रखकर या माइक्रोवेव ओवन (30-45 सेकंड) में समाधान को गर्म करके पूरी तरह से भंग न हो जाए।
- चरण 3.2-3.5 समय के प्रति संवेदनशील हैं क्योंकि एगरोज समाधान जल्दी से ठंडा हो जाता है। एक 1 mL सिरिंज में agarose के ~ 0.5 mL वापस लें।
नोट: मस्तिष्क की अखंडता की रक्षा करने के लिए, सुनिश्चित करें कि agarose का तापमान उपयोग करने से पहले शरीर के तापमान का अनुमान लगाता है। - कपाल खिड़की के coverslip पर उदारतापूर्वक agarose जमा.
नोट: यदि ऊतक blanches, agarose का तापमान बहुत अधिक था; जानवर euthanized किया जाना चाहिए। यदि मस्तिष्क को कवर करने वाला कोई अलग कवरस्लिप नहीं है (यानी, ट्रांसड्यूसर और इसके कवरस्लिप को सीधे मस्तिष्क पर रखा जाता है, तो चरण 2.14 देखें), तो इस चरण में मस्तिष्क की सतह पर एगारोज़ जमा किया जाना चाहिए। - कपाल खिड़की (चित्रा 6 C) पर ट्रांसड्यूसर रखें। फर्म दबाव लागू करें जैसे कि ट्रांसड्यूसर और कपाल खिड़की के बीच कम से कम एगारोज़ हो। सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूसर कपाल खिड़की के लिए केंद्रित (XY-प्लेन) और समानांतर (Z-plane) है, और यह कि agarose में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
- जब agarose एक जेलो जैसी स्थिरता के लिए ठंडा हो जाता है, तो एक स्पैटुला या स्केलपेल का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर के कवरस्लिप की परिधि से अतिरिक्त एगारोज़ को काट दें। सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूसर के कवरस्लिप के नीचे कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
- एक स्पैटुला का उपयोग करते हुए, ट्रांसड्यूसर के कवरस्लिप की परिधि पर सायनोएक्रिलेट गोंद की एक परत फैलाएं, खोपड़ी तक फैली हुई हैं, जैसे कि ट्रांसड्यूसर दृढ़ता से खोपड़ी का पालन करता है।
- ट्रांसड्यूसर पर दृढ़ दबाव बनाए रखें जब तक कि गोंद पूरी तरह से सूख न जाए (10-15 मिनट)।
4. मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
- उद्देश्य लेंस के नीचे जानवर की स्थिति (चित्रा 7A)। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस रिंग ट्रांसड्यूसर में केंद्रित है, और ट्रांसड्यूसर (चित्रा 7 बी) के साथ समानांतर है। यदि एक जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग किया जाता है, तो रिंग ट्रांसड्यूसर के केंद्र को विआयनीकृत और degassed पानी से भरें।
नोट: Degassed पानी उचित अल्ट्रासाउंड प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है। - अपनी उच्चतम स्थिति में उद्देश्य लेंस के साथ शुरू करें, और फिर धीरे-धीरे उद्देश्य लेंस को कम करें जब तक कि यह रिंग ट्रांसड्यूसर (चित्रा 7 ए, बी) के भीतर न हो। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस ट्रांसड्यूसर या कवरस्लिप के साथ नहीं टकराता है।
नोट: आईपीस के बीच वैकल्पिक यह जांचने के लिए कि उद्देश्य लेंस की जेड-स्थिति मस्तिष्क की सतह के साथ इन-प्लेन है या नहीं, और यह सुनिश्चित करने के लिए आंखों से कि उद्देश्य लेंस ट्रांसड्यूसर या कवरस्लिप से टकराता नहीं है। पूंछ शिरा (चित्रा 7 सी) के माध्यम से फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के इंजेक्शन के बाद आईपीस के माध्यम से पियाल वाहिकाओं की कल्पना करना आसान हो सकता है। - इमेजिंग के लिए मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप तैयार करें।
नोट: यह प्रोटोकॉल एक ईमानदार मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप और एक 20-25x उद्देश्य लेंस का उपयोग करता है जिसमें 2 मिमी की काम करने की दूरी होती है, जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा में कवरस्लिप (ओं) से परे ध्यान केंद्रित करने के लिए पर्याप्त है। - Dextran तैयार करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, डेक्सट्रान की शीशी में पीबीएस की उचित मात्रा जोड़ें। भंवर 1-3 मिनट के लिए dextran समाधान यह सुनिश्चित करने के लिए कि dextran पाउडर पूरी तरह से भंग हो गया है. पूंछ नस में dextran समाधान इंजेक्ट करें।
- कोई छवि स्कैन सेट करना
- आईपीस का उपयोग करके, सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस मस्तिष्क के समानांतर है। XZ और YZ misalignments के लिए सही करने के लिए जानवर झुकाव।
- एक मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप में फ़ील्ड-ऑफ-व्यू का चयन करें। अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर से पहले एक XYZ स्कैन सेट अप करने के लिए अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर से पहले वास्कुलचर की एक बेसलाइन छवि है।
नोट:: विशिष्ट इमेजिंग पैरामीटर निम्नानुसार हैं: गहराई में 300-800 μm, 2-5 μm चरण-आकार, और 10-20 समय स्टैक। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस इमेजिंग अनुक्रम के दौरान अपने सबसे निचले बिंदु पर ट्रांसड्यूसर या कवरस्लिप के संपर्क में नहीं आता है।
5. अल्ट्रासाउंड जोखिम
- सुनिश्चित करें कि सभी BNC केबल सही ढंग से जुड़े हुए हैं (चित्र3)।
- एक XYZT छवि स्कैन सेट करें जो अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार से पहले, दौरान और बाद में छवि स्टैक को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त रूप से पर्याप्त है।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करके माइक्रोबबल्स तैयार करें। पूंछ नस में microbubbles इंजेक्ट करें और इमेजिंग शुरू करते हैं।
नोट: माइक्रोबबल इंजेक्शन लगातार इंजेक्शन दर सुनिश्चित करने के लिए और समवर्ती microbubble इंजेक्शन और इमेजिंग को सक्षम करने के लिए एक जलसेक पंप के साथ किया जा सकता है। यदि इमेजिंग के दौरान माइक्रोबबल्स को इंजेक्ट किया जाना है, तो सुनिश्चित करें कि पूंछ की नस को डिटेक्टरों को परिवेश प्रकाश में उजागर किए बिना आसानी से एक्सेस किया जा सकता है। - sonication शुरू करें।
नोट: ठेठ sonication पैरामीटर निम्नानुसार हैं: 10 एमएस चक्र, 0.2-0.4 के यांत्रिक सूचकांक, और 1-4 हर्ट्ज के बीच नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्तियों. Preclinical अल्ट्रासाउंड-microbubble अध्ययन में इस्तेमाल Sonication और microbubble पैरामीटर बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और साहित्य में अच्छी तरह से प्रलेखित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए एक समीक्षा के लिए 40 देखें). - sonication की अवधि के दौरान और sonication के अंत के बाद multiphoton इमेजिंग जारी रखें। रक्त वाहिकाओं से डेक्सट्रान एक्सट्रावेशन के लिए चौकस रहें, क्योंकि यह बीबीबी पारगम्यता में वृद्धि का संकेत है।
नोट: यदि dextran extravascular स्थान में पाया जाता है, लेकिन फ़ील्ड-ऑफ-व्यू की परिधि में, तो फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के बाहर प्रभावित रक्त वाहिकाएं हो सकती हैं। यह उद्देश्य लेंस के फोकस के साथ ट्रांसड्यूसर के misalignment के परिणामस्वरूप हो सकता है। इस परिदृश्य में, ट्रांसड्यूसर को फिर से संरेखित करने की तुलना में उद्देश्य लेंस को स्थानांतरित करके या जानवर को पुनर्स्थापित करके फ़ील्ड-ऑफ-व्यू को समायोजित करना आसान है। - एक बार इमेजिंग पूरा हो जाने के बाद, गहरी संज्ञाहरण या सीओ 2 श्वासावरोध के तहत पशु ग्रीवा अव्यवस्था को euthanize करें। पुरानी कपाल खिड़कियों के लिए, उजागर खोपड़ी पर दंत सीमेंट की एक परत फैलाएं।
नोट: क्रोनिक कपाल खिड़कियों के लिए, खिड़की के आसपास की त्वचा को टांका जा सकता है, हालांकि चरण 2.8 में खोपड़ी को हटाने के कारण यह आवश्यक नहीं है।
6. छवि विश्लेषण
- छवि स्टैक निर्यात करें.
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ओलंपस Fluoview, ImageJ / FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) और / या प्रोग्रामिंग टूल (जैसे, पायथन, MATLAB) के साथ छवियों का विश्लेषण करें।
Representative Results
सफल अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार इंट्रावैस्कुलर से एक्स्ट्रावैस्कुलर स्पेस (चित्रा 8) तक फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के एक्सट्रावेशन द्वारा पता लगाया जा सकता है, जो बीबीबी पारगम्यता में वृद्धि का संकेत देता है। रिंग ट्रांसड्यूसर के दबाव क्षेत्र के आधार पर, पियाल वाहिकाओं और / या केशिकाओं को प्रभावित किया जाएगा।
अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार द्वारा प्रेरित संवहनी परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, ब्याज के पोत के व्यास को अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार (चित्रा 9) से पहले, दौरान और बाद में मापा जा सकता है। यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर (उदाहरण के लिए, Olympus Fluoview सॉफ़्टवेयर) में मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। छवि अधिग्रहण के दौरान, बोलस डेक्सट्रान इंजेक्शन और लाइन स्कैन का उपयोग रक्त प्रवाह 30,41 का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। दवा वितरण के लिए एक प्रतिनिधि मॉडल के रूप में डेक्सट्रान रिसाव के कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए, इंट्रा- और एक्स्ट्रावैस्कुलर रिक्त स्थान के बीच सिग्नल तीव्रता का मूल्यांकन MATLAB26,27,29,41 (चित्रा 10) जैसे उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है।
आगे की छवि प्रसंस्करण ImageJ / FIJI का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। इमेजजे / फिजी एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर है जो MATLAB के साथ संगत है और जैविक छवि विश्लेषण में सामान्य विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जैसे कि संवहनी परिवर्तनों को मापना, या फ्लोरोसेंट वस्तुओं की लंबाई या उनके बीच की दूरी (उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं के लिए β-अमाइलॉइड सजीले टुकड़े)। ImageJ/FIJI में बनाई गई छवि प्रसंस्करण पाइपलाइनों को कस्टम मैक्रोज़ लिखकर स्वचालित किया जा सकता है.
अधिक जटिल विश्लेषण, जैसे रक्त वाहिकाओं के 3 डी विभाजन और सेल ट्रैकिंग, अधिक उन्नत, अर्ध-स्वचालित सॉफ़्टवेयर (चित्रा 11) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। विभाजन के बाद, अधिक विशिष्ट विश्लेषण किए जा सकते हैं, जैसे कि रक्त वाहिकाओं को धमनियों, वेन्यूल्स या केशिकाओं के रूप में वर्गीकृत करना, व्यास, ब्रांचिंग, टॉर्टुओसिटी पैटर्न और प्रवाह दिशा 42,43 के आधार पर। मशीन लर्निंग एल्गोरिदम को रक्त वाहिका विभाजन 22,44 को स्वचालित करने के लिए भी विकसित किया गया है।
चित्रा 1: intravital multiphoton अल्ट्रासाउंड-microbubble मस्तिष्क प्रयोगों के सामान्य वर्कफ़्लो. इस प्रोटोकॉल में वर्णित इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल मस्तिष्क प्रयोगों का एक सामान्य वर्कफ़्लो दिखाया गया है। 6 चरण हैं: (ए) (ए) (ए 1) चूहों और (ए 2) चूहों के लिए पशु तैयारी, (बी) डेक्सट्रान इंजेक्शन, (सी) माइक्रोबबल इंजेक्शन, (डी) प्री-ट्रीटमेंट इमेजिंग, (ई) उपचार और इमेजिंग, (एफ) पोस्ट-ट्रीटमेंट इमेजिंग और डेटा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: क्रॉस-सेक्शन और 3 डी-मुद्रित मोल्ड का शीर्ष दृश्य। (ए) मोल्ड का क्रॉस-सेक्शन। साइनोएक्रिलेट गोंद की एक पतली परत को रिंग ट्रांसड्यूसर की शीर्ष सतह पर लागू किया जाता है, और शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखा जाता है। एक स्टांप का उपयोग फर्म को लागू करने के लिए किया जा सकता है, यहां तक कि कवरस्लिप और रिंग ट्रांसड्यूसर पर भी दबाव। (बी) मोल्ड का शीर्ष दृश्य। तैयार ट्रांसड्यूसर को हटाने की सुविधा के लिए मोल्ड में एक पायदान जोड़ा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: अल्ट्रासाउंड सेट-अप। अल्ट्रासाउंड प्रयोगों के लिए विशिष्ट हार्डवेयर दिखाए गए हैं। अल्ट्रासाउंड पैरामीटर सेट और सिग्नल जनरेटर द्वारा ट्रिगर किए जाते हैं और एम्पलीफायर द्वारा प्रवर्धित होते हैं। एक पावर मीटर का उपयोग मिलान बॉक्स में सिग्नल भेजने से पहले आगे और परावर्तित शक्तियों को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है, जिसे ट्रांसड्यूसर से मिलान किया जाता है। सभी कनेक्शन बीएनसी केबलों का उपयोग करके प्राप्त किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: फर हटाने और खोपड़ी को हटाने का क्षेत्र( ए) फर हटाने को आंखों के बीच से शुरू होना चाहिए और गर्दन के पूर्वकाल के आधे हिस्से तक विस्तारित होना चाहिए। (बी) खोपड़ी हटाने पार्श्विका हड्डियों को उजागर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। आगे बढ़ने से पहले रक्तस्राव को रोकना होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: कपाल खिड़की की रूपरेखा। कपाल की खिड़की एक पार्श्विका हड्डी पर स्थित है। (ए) ड्रिलिंग प्रक्रिया में सहायता के लिए कपाल खिड़की की एक रूपरेखा खोपड़ी पर खींची जा सकती है। (बी) कपाल खिड़की की रूपरेखा कॉम्पैक्ट हड्डी के माध्यम से ड्रिलिंग के बाद देखी जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: कपाल खिड़की और ट्रांसड्यूसर संरेखण। (ए) कपाल खिड़की एक पार्श्विका हड्डी पर बनाई गई है। हड्डी द्वीप को हटा दिया गया है, नीचे मस्तिष्क को उजागर करता है। (बी) कपाल खिड़की पूरी हो जाती है जब एक ग्लास कवरस्लिप को साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करके खोपड़ी पर सील कर दिया जाता है। (सी) ट्रांसड्यूसर कपाल खिड़की पर केंद्रित होता है और साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करके पालन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: उद्देश्य लेंस और ट्रांसड्यूसर की स्थिति(ए, बी) उद्देश्य लेंस रिंग ट्रांसड्यूसर पर केंद्रित है। (सी) फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान से भरी रक्त वाहिकाएं एपिफ्लोरेसेंस के तहत, आईपीस के माध्यम से दिखाई देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल प्रेरित BBB पारगम्यता में वृद्धि की अधिकतम प्रक्षेपण multiphoton छवियों. अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के बाद वास्कुलचर (ए) की अधिकतम प्रक्षेपण छवियां पहले और (बी)। सफल अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार की पुष्टि उपचार के बाद बीबीबी पारगम्यता में वृद्धि को देखकर की जा सकती है, जिसे फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान एक्सट्रावेशन (तीर) के रूप में देखा जाता है। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 9: अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार द्वारा प्रेरित वासोमोड्यूलेशन का विश्लेषण। अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार से पहले, दौरान और बाद में सेरेब्रल रक्त वाहिकाओं की अधिकतम प्रक्षेपण छवियां। Microbubbles सभी छवियों में मौजूद हैं। (ए) पूर्व-उपचार स्थितियों की तुलना में, अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार (लाल तीर) के दौरान स्पष्ट वासोमोड्यूलेशन (बी) देखा जा सकता है। BBB पारगम्यता में अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल मध्यस्थता वृद्धि भी intravascular अंतरिक्ष (पीले तीर) के लिए intravascular से फ्लोरोसेंट dextran के रिसाव से उपचार के बाद स्पष्ट कर रहे हैं। (सी) जब अल्ट्रासाउंड बंद हो जाता है, तो संवहनी व्यास पूर्व-उपचार, बेसलाइन आकारों में वापस आ जाते हैं। (डी) अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार से पहले, दौरान और बाद में ब्याज के पोत के व्यास की साजिश रचकर संवहनी परिवर्तनों का विश्लेषण किया जा सकता है। स्केल बार: 100 μm. (अप्रकाशित कार्य). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 10: अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के बाद रिसाव कैनेटीक्स का विश्लेषण। BBB पारगम्यता में वृद्धि intravascular से extravascular अंतरिक्ष के लिए फ्लोरोसेंट dextran के रिसाव के रूप में कल्पना की है. BBB पारगम्यता में परिवर्तन स्पष्ट हैं जब अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के बाद अधिग्रहित छवि स्टैक (ए) से पहले (ए) और (बी) की तुलना की जाती है। (सी) एक्सट्रावैस्कुलर डिब्बों (पीले आयत) में डेक्सट्रान की तीव्रता, मात्रा और गति को ट्रैक करके रिसाव कैनेटीक्स का विश्लेषण किया जा सकता है। स्केल बार: 50 μm. (अप्रकाशित कार्य.) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 11: मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी XYZ स्टैक का रक्त वाहिका विभाजन(A) एक ट्रांसजेनिक EGFP चूहे में रक्त वाहिकाओं की गहराई (XYZ) स्टैक। रक्त वाहिकाओं को फ्लोरोसेंट टेक्सास रेड 70 केडीए डेक्सट्रान (लाल) के अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से कल्पना की जाती है। ग्रीन चैनल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और ऊतक autofluorescence से पता चलता है. (बी) रक्त वाहिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण बनाए जाते हैं, और फिर प्रकार-विशिष्ट विश्लेषणों को सुविधाजनक बनाने के लिए रक्त वाहिका प्रकार के अनुसार रंग-कोडित होते हैं। शिरा /वेन्यूल्स नीले रंग के होते हैं, धमनियां / धमनियां लाल होती हैं, और केशिकाएं सियान होती हैं। स्केल बार: 50 μm. Bitplane Imaris का उपयोग करके बनाए गए पुनर्निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
मस्तिष्क की इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी निगरानी अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर के दौरान मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। हमारे ज्ञान के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के दौरान मस्तिष्क पैरेन्काइमा के मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का संचालन करने का एकमात्र तरीका है। कपाल खिड़कियों का निर्माण और रिंग ट्रांसड्यूसर का उपयोग संवहनी, सेलुलर और उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प पर अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के लिए अन्य डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। अन्य समूहों ने अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के पूरा होने के बाद मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का प्रदर्शन किया है, जिससे उपचार के लिए मस्तिष्क पैरेन्काइमा की वास्तविक समय की प्रतिक्रिया गायब हो गई है। वर्णित प्रक्रिया बेहतर अस्थायी नियंत्रण प्रदान करती है, जिससे डेटा का संग्रह होता है जो अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के पीछे तीव्र तंत्र को रोशन करने में मदद कर सकता है। मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा को अधिग्रहित छवि स्टैक से निकाला और विश्लेषण किया जा सकता है, जैसे कि एक्सट्रावेशन कैनेटीक्स 27,29,30, β-अमाइलॉइड पट्टिका वॉल्यूम 31 में परिवर्तन, और सेल गतिशीलता 32।
पूरे प्रोटोकॉल में कई समस्या निवारण चरण हाइलाइट किए गए थे। सबसे पहले, सर्जिकल कदम जो विशेष रूप से ऑपरेटर त्रुटि के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, पर जोर दिया गया था, जैसे कि कपाल खिड़की सर्जरी के दौरान एगारोज़ का उपयोग और ट्रांसड्यूसर का प्लेसमेंट। जानवरों की असुविधा और मृत्यु को रोकने के लिए कदम भी प्रदान किए गए थे, जिसमें सर्जरी के दौरान पशु शरीर विज्ञान की निगरानी करना शामिल था, और इंजेक्शन से पहले डेक्सट्रान को पूरी तरह से भंवर करना शामिल था। दूसरा, ट्रांसड्यूसर के भौतिक विनिर्देशों, और उद्देश्य लेंस, ट्रांसड्यूसर और कपाल खिड़की के संरेखण को भी हाइलाइट किया गया था। रिंग ट्रांसड्यूसर के विनिर्देशों और इसके ध्वनिक गुणों को उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य लेंस के साथ-साथ पशु मॉडल को ध्यान में रखते हुए निर्धारित किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, रिंग ट्रांसड्यूसर का आंतरिक व्यास उद्देश्य लेंस को घेरने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए, लेकिन जानवर की खोपड़ी पर सुरक्षित रूप से माउंट करने के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए। इसके अलावा, ट्रांसड्यूसर के फोकल क्षेत्र को उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य लेंस की सीमा के साथ संरेखित करना चाहिए।
एक आम चुनौती यह है कि कपाल खिड़की और अंगूठी ट्रांसड्यूसर उद्देश्य लेंस के सापेक्ष कोण हैं। कपाल खिड़की और ट्रांसड्यूसर के साथ उद्देश्य लेंस के उचित केंद्रीकरण (XY) और संरेखण (जेड) यह सुनिश्चित करता है कि ट्रांसड्यूसर का फोकल क्षेत्र, और इस प्रकार उपचारित मस्तिष्क ऊतक का क्षेत्र, इमेजिंग फील्ड-ऑफ-व्यू के साथ संरेखित होता है, और इमेजिंग के दौरान उद्देश्य लेंस और ट्रांसड्यूसर के बीच टकराव के जोखिम को कम करता है। संरेखण को जानवर के सिर की स्थिति को समायोजित करके और / या स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम को घुमाकर प्राप्त किया जा सकता है जिसमें यह तय किया गया है।
माइक्रोस्कोप घटकों (जैसे, डिटेक्टरों, बीम स्प्लिटर्स) और छवि अधिग्रहण मापदंडों को अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर चुना जाना चाहिए। यहां, एक लंबी फोकल लंबाई (> 2 मिमी) के साथ एक उद्देश्य लेंस का उपयोग उद्देश्य लेंस और मस्तिष्क के बीच स्थित कवरस्लिप (एस) और रिंग ट्रांसड्यूसर की उपस्थिति के कारण किया जाता है। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की भी सिफारिश की जाती है क्योंकि यह जानवर को पैंतरेबाज़ी करने के लिए अधिक स्थान की अनुमति देता है, विशेष रूप से मस्तिष्क प्रयोगों के लिए। अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल प्रेरित इंट्रावैस्कुलर डाई के रिसाव के कैनेटीक्स पर कब्जा करने के लिए, एक उच्च अस्थायी संकल्प अनुकूल है, जिसे अनुनाद स्कैनिंग सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। एक उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने की प्रणाली के साथ इसका संयोजन, जैसे गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड (GAAsP) डिटेक्टरों, भी अधिक अनुकूल छवियों में परिणाम होगा।
प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रक्रिया की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, सर्जिकल प्रक्रिया काफी आक्रामक है, और सूजन 45 का कारण बनने की सूचना दी गई है, हालांकि सूजन को कम से कम किया जा सकता है46। इसके अलावा, कपाल खिड़की सर्जरी से प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सर्जरी के बाद 2-4 सप्ताह तक हल करने के लिए देखा गया था23,24,25। इसके अलावा, ड्रिलिंग प्रक्रिया, विशेष रूप से जब अत्यधिक बल या गति के साथ आयोजित की जाती है, तो गर्मी, कंपन और दबाव की पीढ़ी के कारण अंतर्निहित ऊतक को नुकसान पहुंचा सकती है। कपाल खिड़की सर्जरी और मल्टीफोटॉन इमेजिंग को भी मस्तिष्क के तापमान को प्रभावित करने के लिए देखा गया है47। इन सीमाओं को प्राचीन कपाल खिड़कियों के सावधानीपूर्वक निर्माण, पुरानी कपाल खिड़कियों के साथ जानवरों की उचित वसूली, और प्रतिक्रिया नियंत्रण के साथ एक हीटिंग स्रोत का उपयोग करके नॉर्मोथर्मिक शरीर के तापमान के रखरखाव के माध्यम से एक हद तक कम किया जा सकता है। दूसरा, इमेजिंग गहराई माइक्रोस्कोप और उद्देश्य लेंस द्वारा उपयोग की जाती है। उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क संरचनाओं में अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के प्रभाव का अध्ययन अधिक आक्रामक उपायों के बिना नहीं किया जा सकता है, जैसे कि अतिरंजित कॉर्टिकल ऊतक48 को हटाना, या कॉर्टिकल पेनिट्रेशन 49 के साथ संयोजन के रूप में माइक्रोलेंस का उपयोग। एक लंबी काम की दूरी के साथ एक उद्देश्य लेंस का उपयोग करना इस मुद्दे को एक हद तक हल कर सकता है, लेकिन प्रकाश प्रवेश भी अधिक गहराई पर सीमित है।
जबकि इस प्रोटोकॉल की प्रतिनिधि छवियों को जंगली-प्रकार के कृन्तकों से प्राप्त किया गया था, प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रक्रिया को ट्रांसजेनिक जानवरों और रोग मॉडल, जैसे अल्जाइमर रोग 31 पर भी लागू किया जा सकता है। BBB मॉडुलन से असंबंधित अल्ट्रासाउंड प्रयोग, जैसे अल्ट्रासाउंड-प्रेरित न्यूरोमॉड्यूलेशन, इस प्रोटोकॉल 33,34 का उपयोग करके भी निगरानी की जा सकती है। अन्य संभावित अनुप्रयोगों को विभिन्न माइक्रोस्कोप या डिटेक्टर सेट-अप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि अल्ट्रा-हाई-स्पीड कैमरा 50 के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप को जोड़ना। जबकि बड़ी उत्तेजना की मात्रा के कारण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी तुलनात्मक रूप से बदतर हैं, अल्ट्रा-हाई-स्पीड इमेजिंग उच्च अस्थायी संकल्प के साथ मस्तिष्क केशिका एंडोथेलियल सेल-माइक्रोबबल इंटरैक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम कर सकती है, जो अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल बीबीबी उपचार चलाने वाले तंत्र को और रोशन कर सकती है। निष्कर्ष निकालने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल वास्तविक समय में अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल बीबीबी प्रयोगों द्वारा प्रेरित संवहनी और सेलुलर प्रभावों की निगरानी करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, इन उपचारों को चलाने वाले तंत्र को आगे निर्धारित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है, साथ ही अल्ट्रासाउंड-माइक्रोबबल उपचार के लिए मस्तिष्क पैरेन्काइमा की डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं को रोशन करता है।
Disclosures
Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman, और Catharina de Lange Davies कोई वित्तीय या गैर-वित्तीय प्रतिस्पर्धी हितों के संघर्ष की घोषणा नहीं करते हैं। Spiros Kotopoulis एक पूर्णकालिक कर्मचारी है और सटीक चिकित्सीय एएस में शेयरों का मालिक है, जो अल्ट्रासाउंड और माइक्रोबबल / क्लस्टर एन्हांस्ड ड्रग डिलीवरी विकसित करने वाली एक कंपनी है। Kullervo Hynynen FUS इंस्ट्रूमेंट्स के संस्थापक हैं, जहां से उन्हें गैर-शोध संबंधी समर्थन प्राप्त होता है।
Acknowledgments
जानवरों का आवास तुलनात्मक चिकित्सा कोर सुविधा (CoMed, NTNU) द्वारा प्रदान किया गया था। चित्र 3 BioRender.com में बनाया गया था। वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन NTNU में प्राकृतिक विज्ञान के लिए संकाय में प्रति हेनिंग, वेबमास्टर द्वारा किया गया था। परियोजना को नॉर्वेजियन यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (NTNU, Trondheim, नॉर्वे), नॉर्वे की अनुसंधान परिषद (RCN 262228), कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (FDN 154272), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 EB003268), और सनीब्रुक स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र में केंद्रित अल्ट्रासाउंड अनुसंधान में टेमर्टी चेयर द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ring transducer placement | |||
| Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
| Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
| Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
| Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
| Animal preparation and drugs | |||
| Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
| Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
| Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
| Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
| Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
| Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
| Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
| Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
| Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
| Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
| Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
| Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
| * Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
| Material and equipment for cranial window placement | |||
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
| Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
| Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
| Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
| Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
| * Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
| Multiphoton microscopy | |||
| 20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
| Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
| MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
| SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
| Ultrasound treatment | |||
| 50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
| Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
| Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
| Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
| Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |
References
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