Summary
Denne protokol beskriver de kirurgiske og tekniske procedurer, der muliggør realtid in vivo multiphoton fluorescens billeddannelse af gnaverehjernen under fokuseret ultralyd og mikrobubble behandlinger for at øge blod - hjerne barriere permeabilitet.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en central udfordring for en vellykket levering af lægemidler til hjernen. Ultralydseksponering i nærværelse af mikrobobler har vist sig som en effektiv metode til at forbigående og lokalt øge BBB's gennemtrængelighed, hvilket letter para- og transcellulær transport af lægemidler på tværs af BBB. Imaging vaskulatur under ultralyd-microbubble behandling vil give værdifuld og ny indsigt i mekanismer og dynamikken i ultralyd-microbubble behandlinger i hjernen.
Her præsenterer vi en eksperimentel procedure for intravital multiphoton mikroskopi ved hjælp af et kranievindue justeret med en ringtransducer og en 20x objektiv linse. Dette set-up muliggør høj rumlig og tidsmæssig opløsning billeddannelse af hjernen under ultralyd-microbubble behandlinger. Optisk adgang til hjernen opnås via et åbent kranievindue. Kort sagt fjernes et stykke kraniet med en diameter på 3-4 mm, og det udsatte område af hjernen forsegles med et glascoverlip. En 0,82 MHz ringtransducer, som er fastgjort til en anden glasdæksler, er monteret på toppen. Agarose (1% w /v) anvendes mellem transducerens omslagsdæksler og dækslet, der dækker kranievinduet for at forhindre luftbobler, som forhindrer ultralydsudbredelse. Når sterile kirurgi procedurer og anti-inflammatoriske foranstaltninger er truffet, ultralyd-microbubble behandlinger og billeddannelse sessioner kan udføres gentagne gange over flere uger. Fluorescerende dextran konjugates injiceres intravenøst for at visualisere vaskulaturen og kvantificere ultralyd-mikrobubble inducerede virkninger (f.eks lækage kinetics, vaskulære ændringer). Dette papir beskriver kranievinduet placering, ring transducer placering, billedbehandling procedure, fælles fejlfinding trin, samt fordele og begrænsninger af metoden.
Introduction
En vigtig udfordring i behandlingen af neurologiske lidelser er tilstedeværelsen af blod - hjerne barrieren (BBB). BBB begrænser hydrofile, ladede, polære og store (> 400 Da) molekyler fra at komme ind i hjernen parenkym1. En metode, der i øjeblikket anvendes til at levere terapi på tværs af BBB i hjernen parenchyma er at bruge stereotaktiske intrakranielle injektioner2. Andre mindre invasive metoder, der undersøges, hæmmes af kompleksiteten af de anvendte teknikker, såsom design af lægemidler til receptormedieret levering på tværs af BBB3, eller er begrænset i den rumlige præcision af målrettede områder, såsom intranasale injektioner4 eller administration af hyperosmotiske løsninger5.
Brugen af ultralyd i forbindelse med systemisk injicerede mikrobubbles, et ultralydkontrastmiddel, er blevet udviklet som et ikke-invasivt middel til at forbigående øge gennemtrængeligheden af BBB6. Ved at bruge en fokuseret transducer7 eller en styrbar faset vifte af transducers8,9, ultralyd kan målrettes til udvalgte områder i hjernen med millimeter niveau præcision, minimere off-target effekter. Ultralyd-microbubble behandlinger kan tilpasses til hvert emne hjerne anatomi ved hjælp af magnetisk resonans imaging vejledning7,10,11,12,13,14 eller stereotaktiske rammer15. Desuden kan omfanget af stigningen i BBB-permeabilitet kontrolleres i realtid ved at overvåge akustiske emissioner fra mikrobubbles16,17,18. Kliniske forsøg, der undersøger sikkerheden og gennemførligheden af ultralyd-mikrobubble behandlinger er i øjeblikket i gang på verdensplan (f.eks ClinicalTrials.gov identifikator NCT04118764).
Ultralyd-microbubble BBB behandlinger er typisk evalueret ved at bekræfte behandling induceret stigninger i BBB permeabilitet, visualiseret i kontrast-forbedret magnetisk resonans imaging, eller ved farvestof overvasation i in vivo imaging eller ex vivo histology. De fleste mikroskopiske analyser er imidlertid blevet udført ex vivo efter afslutningen af ultralyd-mikrobubble behandlinger11,19, hvorved de mangler de dynamiske biologiske reaktioner under og umiddelbart efter ultralydeksponering. Realtidsscanning udført under ultralydseksponering kan hjælpe med at forstå de mekanismer, der driver ultralyd-mikrobubble BBB-behandlinger samt downstream-svar, hvilket kan øge vores forståelse af dets terapeutiske anvendelser. Desuden vil brugen af kroniske kranievinduer med in vivo imaging teknikker gøre det muligt langsgående undersøgelser til at evaluere tidsmæssige aspekter af ultralyd-microbubble behandlinger.
Målet med denne protokol er at beskrive de kirurgiske og tekniske procedurer, der kræves for at udføre multifotofotosscanning i realtid af ultralyd-mikrobubblebehandlinger til akutte og kroniske undersøgelser hos gnavere (figur 1). Dette opnås i to dele: for det første at skabe et kranievindue for at muliggøre in vivo imaging, og for det andet at montere en ringtransducer på toppen for at muliggøre samtidig sonikering og billeddannelse. Kranievinduer er blevet flittigt brugt af neuroforskere til in vivo imaging af neurovaskulær kobling20, β-amyloid patogenese21, og neuroimmunology22, blandt andre. I denne protokol beskrives kirurgiske procedurer for oprettelse af akutte (ikke-genopretning) og kroniske (genopretning) kranievinduer i muse- og rottekraniet. Kranievinduesmetoder, især for kroniske eksperimenter, er veldokumenterede23,24,25. For at være i overensstemmelse med eksisterende litteratur vil udtrykkene "akut" og "kronisk" blive anvendt i hele denne protokol. Udformningen af ringtransducere til in vivo imaging er også tidligere blevet beskrevet26. På trods af tilgængeligheden af disse teknikker og den indsigt, der kan opnås ved realtidsscanning af ultralyd-mikrobubble behandlinger, er der meget få forskningslaboratorier, der med succes har offentliggjort litteratur ved hjælp af denne teknik26,27,28,29,30,31,32 . Som sådan, i denne protokol, de kirurgiske og tekniske detaljer ved at gennemføre disse real-time ultralyd-microbubble eksperimenter er beskrevet. Mens de angivne sonikerings- og billeddannelsesparametre er blevet optimeret til BBB-eksperimenter, kan andre virkninger af ultralydseksponering for hjernen, såsom neuromodulation33,34, β-amyloid plaque monitoring31 og immuncellerespons32, også undersøges ved hjælp af denne teknik.
Protocol
Alle følgende forsøgsprocedurer blev godkendt af og gennemført i overensstemmelse med den norske fødevaresikkerhedsmyndighed, Sunnybrook Research Institute's Animal Care Committee og Canadian Council on Animal Care.
1. Materialeforberedelse
- Forbered de materialer, der er nødvendige for kraniet vindue kirurgi og ultralyd-microbubble behandlinger. For kroniske kranievinduer, steriliserede værktøjer og materialer, et sterilt kirurgisk rum, og præ-og post-kirurgi lægemiddeladministration er nødvendige23,24,25.
- Fremstilling af transducer og coverslip
- Kontroller transducerens fysiske integritet: Kig efter revner og buler. Sørg for, at elektroderne på toppen og siden af transduceren er intakte.
- Sæt cyanoacrylatlim i en lille skål. Brug en applikator til at sprede et tyndt lag lim på transducerens overflade.
- Anbring transduceren på glasdækslerne. Tryk hårdt ned i 20-30 s.
BEMÆRK: En 3D-printet form kan bruges til at lette justeringen af glasdækslen med ringtransduceren, hvilket sikrer et fast og jævnt tryk på dækslerne og ringtransduceren (figur 2). - Kontroller, om der er bobler mellem transduceren og dækslerne. Hvis der er bobler, skal dækslerne af og gentages fra trin 1.2.3., da luft hindrer ultralydsudbredelse. Cure natten over ved stuetemperatur.
- Når du har klæbet til en glasovertræk, skal du matche transduceren (figur 3).
BEMÆRK: Denne protokol bruger en in-house fremstillet bly zirconat titanat ring transducer (10 mm ydre diameter, 1,4 mm tykkelse, 1,2 mm højde)35, matchet til en 50 Ω impedans og 0 ° fase belastning med en brugerdefineret matchende kredsløb. Transduceren drives ved 0,82 MHz i tykkelsestilstand, hvilket giver et cirkulært brændpunkt ca. 1 mm under dækslen. Ringtransducere af lignende egenskaber (10 mm ydre diameter, 1,5 mm tykkelse, 1,1 mm højde) er karakteriseret26 og anvendes i vid udstrækning til multifotomikroskopiforsøg27,28,29,31,32,36.
- Genbrug og udskiftning af transducer
- Udskift dækslet, hvis det er revnet eller har snavs (f.eks pels, lim) fra det foregående eksperiment. For at fjerne dæksleren opløses limen ved at nedsænke transduceren og coverlip i acetone i 20 min.
BEMÆRK: Acetone kan påvirke transducerens og/eller elektrodernes integritet. Kontakt producenten, før du fortsætter med dette trin. - Kontroller, om acetone har opløst limen ved forsigtigt at trække på dækslerne med sammentrækninger. Kontroller en gang hvert 10. minut for at undgå langvarig acetoneeksponering.
- Udskift dækslet, hvis det er revnet eller har snavs (f.eks pels, lim) fra det foregående eksperiment. For at fjerne dæksleren opløses limen ved at nedsænke transduceren og coverlip i acetone i 20 min.
2. Tilberedning af dyr
- Bedøve dyret ved hjælp af en blanding af medicinsk luft, ilt og isoflurane i et induktionskammer.
BEMÆRK: Brug af ilt som bæregas er blevet rapporteret at påvirke halveringstiden af mikrobobler37,38 og mindske omfanget af ultralyd-mikrobubble induceret stigninger i BBB permeabilitet27, men kan også reducere risikoen for hypoxi og dødelighed39. Vælg bæregasser baseret på projektmål og dyrlægerådgivning. Injicerbare bedøvelsesmidler såsom en ketamin/xylazincocktail kan også anvendes; Det er dog lettere at kontrollere anæstesi- og iltniveauet i blodet, når du bruger inhalerbare bedøvelsesmidler. - Kontroller, at dyret har opnået et tilstrækkeligt anæstesiplan ved at udføre en tåspids. Afveje dyret for at bestemme doseringen af dextran, mikrobubbles og lægemidler til at administrere. Fjern pelsen fra dyrets hoved og læg dyret på en stereotaktisk ramme.
- For akutte forsøg skal der etableres adgang til den systemiske cirkulation for dextran- og mikrobubbleinjeindsprøjtninger. For at opnå dette skal du indsætte et 27 g kateter i en haleåre.
BEMÆRK: Mens retro-orbital injektioner er også muligt, hale vener anbefales på grund af den begrænsede arbejdsplads i hovedområdet under multiphoton billeddannelse. - Overfør dyret på den stereotaktiske ramme og skift anæstesi til næsekeglen. Bevar dyrets kernetemperatur på 37 °C ved hjælp af en varmekilde, f.eks.
- Overvåg dyrs temperatur ved hjælp af en rektal sonde, og dyr fysiologi ved hjælp af en puls oximeter. Påfør oftalmisk salve. Indsprøjt passende prækirurgi smertestillende og/eller antiinflammatoriske lægemidler (se Materialetabel).
- Før du starter kranievinduet kirurgi, kontrollere flyet af anæstesi og dyrets puls, O2 mætning, åndedrætsfrekvens, og temperatur.
- For at begynde kraniet vindue kirurgi, fjerne pelsen på hovedet ved at anvende en depilatory creme og / eller ved hjælp af pels klippere. Fjern pelsen fra mellem øjnene til den forreste halvdel af halsen (Figur 4A).
BEMÆRK: Langvarig kontakt med depilatory creme vil brænde huden. For kroniske kranievindue operationer, vaske hovedbunden med vekslende klude af betadin og 70% EtOH efter pels fjernelse. Forbered det kirurgiske rum til steril kirurgi. Steriliteten skal opretholdes indtil trin 2.15. - For at fjerne hovedbunden, løfte huden mellem øjnene ved hjælp af sammenkrump holdt i den ikke-dominerende hånd, langs sagittal sutur. Brug buet saks, fjern huden for at eksponere parietalbenene (Figur 4B). Påfør fast tryk med en vatpind, hvis der er blødning fra kraniet eller hovedbunden; blødningen skal stoppes, før den går videre til næste trin.
BEMÆRK: Ved akutte operationer kan huden skubbes tilbage og klæbes til kraniet ved hjælp af flydende cyanoacrylatlim eller vævslim. - Fjern periosteum dækker den ydre overflade af kraniet ved hjælp af vatpinde.
- Ved hjælp af et fungerende mikroskop (6-25x) og en tandbor (0,5 mm borebor, medium hastighed) omrids en cirkel på parietalbenet for at markere den ønskede placering af kranievinduet på kraniet (figur 5). Undgå sagittal sutur, lambda og bregma, da disse områder er tyndere og overlejrer store blodkar.
BEMÆRK: For at lette boringen kan der tegnes en omrids af kranievinduet på kraniet ved hjælp af en markør og stencil (Figur 5A). For rotter kan det være lettere at bore et rektangulært i stedet for et cirkulært kranievindue. På grund af tykkelsen af rottekraniebenet skal du bruge et 0,7 mm bor til at skitsere kranievinduet i den kompakte knogle, før du bruger et bor på 0,5 mm til at fuldføre boreprocessen. - Tryk forsigtigt sammen med boret. for meget tryk øger risikoen for at forårsage skade på hjernevævet. For at forhindre kraniet i at blive overophedet under boringen, dryp saltvand på kraniet ved hjælp af en sprøjte, eller anvende et stykke kirurgisk svamp gennemblødt i saltvand.
- Skift mellem boring og afkøling af kraniet, indtil den resulterende knogleø adskiller sig fra resten af kraniet. Kontroller boringen ved at lægge et skånsomt tryk på knogleøen ved hjælp af sammenklik eller boret. Fortsæt med at bore, indtil knogleøen adskiller sig fra resten af kraniet.
BEMÆRK: Små revner i de tyndeste områder af kraniet er en god indikation af, at boringen er næsten færdig. Forsøg på at fjerne knogleøen for tidligt kan forårsage knoglestykker til at trænge ind i hjernevævet, beskadige dura og forårsager betændelse og blødning. - Fjern knogleøen ved hjælp af et par fine sammentak til at gribe kanterne eller det øverste kompakte knoglelag på knogleøen (figur 6A). Sørg for, at hjernen holdes fugtig ved at anvende et stykke kirurgisk svamp, der er blevet forblødt i saltvand. Hvis blødning observeres, placere den kirurgiske svamp på den region, der bløder. Fortsæt ikke til næste trin, før blødningen er ophørt.
BEMÆRK: Hvis blødningen fortsætter efter 5 min, kan dyret ikke bruges til multifotobilledforsøg. For rotter kan det være nødvendigt at fjerne duraen, hvis den er tyk. For at fjerne duraen skal du bruge høj forstørrelse på driftsmikroskopet og et par fine sammenkationer. - For at placere et kranievindue skal du hente et glascoverlip med et par sammenkædninger, placere en dråbe saltvand på den ene side og manøvrere den over hullet i kraniet. Sørg for, at der ikke er luftbobler under dæksleren.
BEMÆRK: Brug en 5 mm glascovers til mus og 8 mm til rotter. For rotter, på grund af tykkelsen af kraniet knoglen, bruge en agarose løsning i stedet for saltvand til at udfylde rummet mellem coverlip og hjernen. Transduceren og dens coverlip kan også klæbes direkte på kraniet, i stedet for at bruge en separat coverlip til kranievinduet. For denne indstilling skal du fortsætte til trin 3.1. Se figur 1 for at få flere oplysninger. - Spred et lag cyanoacrylatlim omkring omkredsen af dækslen (figur 6B) for at fastgøre den til kraniet. Sørg for, at der ikke er lim under dækslerne. Tryk på dæksleren for at sikre, at lim ikke kommer i kontakt med hjernen.
- Når limen er helt tør, udjævnes limens overflade ved hjælp af tandboret. Sørg for, at alt limaffald fjernes fra det kirurgiske område.
BEMÆRK: For kroniske kranievinduer injiceres de nødvendige post-kirurgiske lægemidler (se Materialetabel), giver salve til sårpleje og bløde fødevarer og genvinder dyret under en varmelampe.
3. Placering af ringtransduceren
- Forbered 1% (w/v) agaroseopløsningen. I et lille bæger eller Erlenmeyer kolbe tilsættes 0,1 g agarose og 10 mL PBS (1x) eller saltvand. Kog opløsningen, indtil agarose er helt opløst ved at placere bægeret på en kogeplade eller opvarme opløsningen i en mikrobølgeovn (30-45 s).
- Trin 3.2-3.5 er tidsfølsomme, da agaroseopløsningen køler hurtigt. Træk ~ 0,5 mL af agarose i en 1 ML sprøjte.
BEMÆRK: For at beskytte hjernens integritet skal du sikre dig, at agarosetemperaturen tilnærmer kropstemperaturen før brug. - Sæt agarose liberalt på coverlip af kranievinduet.
BEMÆRK: Hvis vævet blanches, temperaturen af agarose var for høj; dyret skal aflives. Hvis der ikke er nogen separat coverlip, der dækker hjernen (dvs. transduceren og dens coverlip placeres direkte på hjernen, se trin 2.14), skal agarose deponeres på hjernens overflade i dette trin. - Anbring transduceren over kranievinduet (figur 6C). Påfør et fast tryk, så der er minimal agarose mellem transduceren og kranievinduet. Sørg for, at transduceren er centreret (XY-plan) og parallel (Z-plan) til kranievinduet, og at der ikke er luftbobler i agarose.
- Når agarose er afkølet til en jello-lignende konsistens, skåret væk overskydende agarose fra omkredsen af transducer's coverlip ved hjælp af en spatel eller skalpel. Sørg for, at der ikke er luftbobler under transducerens coverlip.
- Ved hjælp af en spatel spredes et lag cyanoacrylatlim over omkredsen af transducerens coverlip, der strækker sig til kraniet, således at transduceren klæbes fast til kraniet.
- Hold fast tryk på transduceren, indtil limen er helt tørret (10-15 min).
4. Multiphoton mikroskopi billeddannelse
- Placer dyret under den objektive linse (figur 7A). Sørg for, at objektivobjektivet er centreret i ringtransduceren og parallelt med transduceren (figur 7B). Hvis der anvendes en vanddypningsmållinse, skal du fylde midten af ringtransduceren med deioniseret og afgasset vand.
BEMÆRK: Afgasset vand er vigtigt for korrekt ultralydsudbredelse. - Start med den objektive linse i sin højeste position, og sænk derefter langsomt objektivlinsen, indtil den er inden for ringtransduceren (Figur 7A, B). Sørg for, at objektiv linse ikke kolliderer med transduceren eller coverlip.
BEMÆRK: Skift mellem okularet for at kontrollere, om Z-positionen af objektivobjektivet er i plan med hjernens overflade, og med øjet for at sikre, at den objektive linse ikke kolliderer med transduceren eller coverlip. Det kan være lettere at visualisere pialbeholderne gennem okularet efter injektion af fluorescerende dextran gennem halevenen (Figur 7C). - Forbered multifotonmikroskopet til billeddannelse.
BEMÆRK: Denne protokol bruger et opretstående multifotonmikroskop og en 20-25x objektiv linse, der har en arbejdsafstand på 2 mm, hvilket er tilstrækkeligt til at fokusere ud over coverlip(erne) i hjerneparenchymaet. - Forbered dextran. Tilsæt den passende mængde PBS til hætteglasset af dextran, i henhold til producentens anvisninger. Vortex dextranopløsningen i 1-3 min for at sikre, at dextranpulveret er helt opløst. Indsprøjt dextranopløsningen i haleåren.
- Konfigurere en billedscanning
- Brug okularerne, sikre, at den objektive linse er parallel med hjernen. Vip dyret for at korrigere for XZ og YZ forskydninger.
- Vælg et visningsfelt i et mikroskop med flere billeder. Opret en XYZ-scanning før ultralydseksponering for at have et baselinebillede af vaskulaturen før ultralydseksponering.
BEMÆRK: Typiske billeddannelsesparametre er som følger: 300-800 μm i dybden, 2-5 μm trinstørrelse og 10-20 tidsstakke. Sørg for, at objektivobjektivet ikke kommer i kontakt med transduceren eller coverslip på det laveste punkt under billedsekvensen.
5. Ultralydseksponering
- Sørg for, at alle BNC-kablerne er tilsluttet korrekt (figur 3).
- Konfigurer en XYZT-billedscanning, der er tilstrækkelig lang nok til at fange billedstakke før, under og efter ultralyd-mikrobubblebehandlinger.
- Forbered mikroboblerne ved at følge producentens anvisninger. Indsprøjt mikroboblerne i haleåren og begynd at billeddannelse.
BEMÆRK: Mikrobubble injektioner kan gøres med en infusionspumpe for at sikre ensartet injektionshastighed og for at muliggøre samtidig mikrobobble injektion og billeddannelse. Hvis mikrobobler skal injiceres under billeddannelse, skal du sikre dig, at haleåren let kan tilgås uden at udsætte detektorerne for omgivende lys. - Begynd sonikering.
BEMÆRK: Typiske sonikeringsparametre er som følger: 10 ms cyklusser, mekanisk indeks på 0,2-0,4 og pulsgentagelsesfrekvenser mellem 1-4 Hz. Sonikerings- og mikrobubbleparametre, der anvendes i prækliniske ultralydmikrobubblestudier, er blevet grundigt undersøgt og er veldokumenterede i litteraturen (f.eks. se 40 til en gennemgang). - Fortsæt multiphoton billeddannelse i hele varigheden af sonikering og efter afslutningen af sonikering. Vær opmærksom på dextran ekstravasation fra blodkar, da dette er tegn på stigninger i BBB permeabilitet.
BEMÆRK: Hvis dextran opdages i det ekstravaskulære rum, men i periferien af synsfeltet, kan der blive påvirket blodkar uden for synsfeltet. Dette kan skyldes forskydning af transducer med fokus for den objektive linse. I dette scenario er det lettere at justere synsfeltet ved at flytte objektivlinsen eller ved at flytte dyret end at justere transduceren. - Når billeddannelsen er afsluttet, aflive dyret cervikal dislokation under dyb anæstesi eller CO2 kvælning. For kroniske kranievinduer, sprede et lag af dental cement på den udsatte kraniet.
BEMÆRK: For kroniske kranievinduer kan huden omkring vinduet sutureres, selv om dette ikke er nødvendigt, på grund af fjernelsen af hovedbunden i trin 2.8.
6. Billedanalyse
- Eksporter billedstakke.
- Analyser billeder med billedanalysesoftware (f.eks. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) og/eller programmeringsværktøjer (f.eks. Python, MATLAB).
Representative Results
Vellykkede ultralyd-mikrobubble behandlinger kan påvises ved ekstravasation af fluorescerende dextran fra intravaskulære til ekstravaskulære rum (Figur 8), hvilket indikerer en stigning i BBB permeabilitet. Afhængigt af trykfeltet på ringtransduceren vil pialbeholdere og/eller kapillærer blive påvirket.
For at evaluere de vaskulære ændringer forårsaget af ultralyd-mikrobubble behandlinger, diameteren af fartøjet af interesse kan måles før, under og efter ultralyd-microbubble behandling (Figur 9). Dette kan gøres manuelt i en kommercielt tilgængelig software (f.eks Olympus Fluoview software). Under billedopsamling kan bolus dextran injektioner og linje scanninger også bruges til at vurdere blodgennemstrømningen30,41. For at evaluere kinetikken af dextranlækage som en repræsentativ model for lægemiddellevering kan signalintensiteten mellem de intra- og ekstravaskulære rum evalueres ved hjælp af værktøjer som MATLAB26,27,29,41 (Figur 10).
Yderligere billedbehandling kan opnås ved hjælp af ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI er en open source-software, der er kompatibel med MATLAB og er velegnet til at foretage fælles analyser i biologisk billedanalyse, såsom måling af vaskulære ændringer eller længden af eller afstanden mellem fluorescerende objekter (f.eks. β-amyloid plaques til blodkar). Billedbehandlingspipeliner, der er oprettet i ImageJ/FIJI, kan automatiseres ved at skrive brugerdefinerede makroer.
Mere komplekse analyser, såsom 3D-segmentering af blodkar og cellesporing, kan opnås ved hjælp af mere avanceret, halvautomatisk software (Figur 11). Efter segmentering, mere specifikke analyser kan udføres, såsom klassificering blodkar som arterioler, venules, eller kapillærer, baseret på diameter, forgrening, tortuositet mønstre, og flow retning42,43. Machine learning algoritmer er også blevet udviklet til at automatisere blodkar segmentering22,44.
Figur 1: Generel arbejdsgang for intravitale multifoto ultralyd-mikrobubble hjerneforsøg. En generel arbejdsgang af intravital multiphoton ultralyd-microbubble hjerne eksperimenter beskrevet i denne protokol er vist. Der er 6 trin: (A) Animalsk forberedelse til (A1) mus og (A2) rotter, (B) Dextran injektion, (C) Microbubble injektion, (D) Forbehandling billeddannelse, (E) Behandling og billeddannelse, (F) Post-behandling billeddannelse og dataanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tværsnit og topvisning af 3D-printet form. (A) Tværsnit af formen. Et tyndt lag cyanoacrylatlim påføres på den øverste overflade af ringtransduceren, og en coverlip er placeret ovenpå. Et stempel kan anvendes til at påføre fast, selv pres på dæksler og ring transducer. (B) Top visning af formen. Et hak kan tilsættes i formen for at lette fjernelsen af den forberedte transducer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ultralydsopsætning. Typisk hardware til ultralydsforsøg er vist. Ultralydsparametre indstilles og udløses af signalgeneratoren og forstærkes af forstærkeren. En effektmåler kan bruges til at registrere fremadrettede og reflekterede kræfter, før du sender signalet til den matchende boks, som matches med transduceren. Alle forbindelser opnås ved hjælp af BNC-kabler, medmindre andet er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Område for pelsfjernelse og fjernelse af hovedbunden. (A) Pelsfjernelse skal starte mellem øjnene og strække sig, indtil den forreste halvdel af halsen. (B) Fjernelse af hovedbunden bør være tilstrækkelig til at eksponere parietalbenene. Blødningen skal stoppes, før der fortsættes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Omrids af kranievinduet. Kranievinduet er placeret på en parietal knogle. (A) En omrids af kranievinduet kan trækkes på kraniet for at hjælpe i boreprocessen. (B) Omridset af kranievinduet kan ses efter boring gennem den kompakte knogle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kranievindue og transducerjustering. (A) Kranievinduet er skabt på en parietal knogle. Knogleøen er blevet fjernet, hvilket udsætter hjernen nedenunder. B) Kranievinduet er færdigt, når et glascoverlip forsegles på kraniet ved hjælp af cyanoacrylatlim. (C) Transduceren er centreret til kranievinduet og klæbet ved hjælp af cyanoacrylatlim. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Placering af objektiv linse og transducer. (A,B) Objektivlinsen er centreret til ringtransduceren. (C) Blodkar fyldt med fluorescerende dextran er synlige gennem okularerne, under epifluorescence. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Maksimale projektion multiphoton billeder af ultralyd-microbubble induceret stigninger i BBB permeabilitet. Maksimale projektion billeder af vaskulatur (A) før og (B) efter ultralyd-microbubble behandlinger. Vellykkede ultralyd-microbubble behandlinger kan bekræftes ved at observere stigninger i BBB permeabilitet efter behandling, visualiseret som fluorescerende dextran ekstravasation (pile). Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Analyse af vasomodulation forårsaget af ultralyd-mikrobubble behandlinger. Maksimal projektion billeder af cerebral blodkar før, under, og efter ultralyd-microbubble behandlinger. Mikrobobler er til stede i alle billeder. Sammenlignet med (A) forbehandlingsbetingelser kan der observeres klar vasomodulation (B) under ultralyd-mikrobubble behandlinger (røde pile). Ultralyd-mikrobubble medieret stigninger i BBB permeabilitet er også tydeligt efter behandling fra lækage af fluorescerende dextran fra intravaskulære til ekstravaskulære rum (gule pile). (C) Når ultralyd er slukket, vaskulære diametre vende tilbage til forbehandling, baseline størrelser. (D) Vaskulære ændringer kan analyseres ved at plotte diameteren af det fartøj af interesse før, under og efter ultralyd-microbubble behandling. Skalastang: 100 μm. (Ikke-offentliggjort arbejde). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Analyse af lækage kinetika efter ultralyd-mikrobubble behandlinger. Forøgelse af BBB permeabilitet visualiseres som lækage af fluorescerende dextran fra intravaskulær til det ekstravaskulære rum. Ændringer i BBB permeabilitet er tydelige, når man sammenligner billede stakke erhvervet (A) før og (B) efter ultralyd-microbubble behandlinger. (C) Lækage kinetik kan analyseres ved at spore intensiteten, volumen, og hastigheden af dextran i ekstravaskulære rum (gul rektangel). Skalastang: 50 μm. (Ikke-offentliggjort arbejde.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Blodkarsegmentering af multifotomikroskopi XYZ-stak. (A) Dybde (XYZ) stak blodkar i en transgen EGFP-rotte. Blodkar visualiseres via intravenøs injektion af fluorescerende Texas Red 70 kDa dextran (rød). Den grønne kanal viser fluorescerende celler og væv autofluorescence. (B) 3D rekonstruktioner af blodkar er skabt, og derefter farvekodet i henhold til blodkar type for at lette typespecifikke analyser. Vene / venules er blå, arterier / arteriel er røde, og kapillærer er cyan. Skalastang: 50 μm. Rekonstruktioner skabt ved hjælp af Bitplane Imaris. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Intravital multiphoton mikroskopi overvågning af hjernen er et værdifuldt værktøj til at studere hjernens reaktioner under ultralyd eksponering. Så vidt vi ved, er den protokol, der er beskrevet her, den eneste metode til at udføre multiphoton mikroskopibilleddannelse af hjernens parenkym under ultralyd-mikrobubble behandlinger. Oprettelsen af kranievinduer og brugen af ringtransducere tillader realtidsovervågning af vaskulære, cellulære og andre downstream-reaktioner på ultralyd-mikrobubble behandlinger ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Andre grupper har udført multiphoton mikroskopi billeddannelse efter afslutningen af ultralyd-microbubble behandlinger, og dermed mangler real-time respons af hjernen parenchyma til behandlinger19. Den beskrevne procedure tilbyder forbedret tidsmæssig kontrol, så indsamling af data, der kan hjælpe med at belyse de akutte mekanismer bag ultralyd-microbubble behandlinger. Kvantitative og kvalitative data kan udtrækkes og analyseres fra de erhvervede billedstakke, såsom ekstravasation kinetics27,29,30, ændringer i β-amyloid plaque volume31 og celledynamik32.
Flere fejlfindingstrin blev fremhævet i hele protokollen. For det første blev kirurgiske trin, der er særligt modtagelige for operatørfejl, understreget, såsom brug af agarose under kranievindueskirurgi og placering af transduceren. Der blev også givet skridt til at forhindre ubehag og død hos dyr, herunder overvågning af dyrs fysiologi under operationen og grundigt hvirvlende dextran før injektion. For det andet blev der også fremhævet fysiske specifikationer for transduceren og tilpasningen af mållinsen, transduceren og kranievinduet. Specifikationerne for ringtransduceren og dens akustiske egenskaber skal fastlægges under hensyntagen til den anvendte objektive linse og dyremodellen. Specifikt skal den indre diameter af ringtransduceren være stor nok til at omgive den objektive linse, men lille nok til at blive monteret sikkert på dyrets kranium. Desuden skal transducerens brændvidde flugte med rækkevidden af den anvendte objektive linse.
En fælles udfordring er, at kranievinduet og ringtransducer er vinklet i forhold til den objektive linse. Korrekt centrering (XY) og tilpasning (Z) af den objektive linse med kranievinduet og transducer sikrer, at brændvidde af transducer, og dermed området for behandlet hjernevæv, er i overensstemmelse med billeddannelse felt-of-view, og reducerer risikoen for kollision mellem den objektive linse og transducer under billeddannelse. Justering kan opnås ved at justere dyrets hovedposition og/eller ved at rotere den stereotaktiske ramme, som den er fastgjort i.
Mikroskopkomponenter (f.eks. detektorer, strålekløvere) og parametre for billedopsamling bør udvælges på grundlag af undersøgelsens formål. Her anvendes en objektiv linse med en lang brændvidde (> 2 mm) på grund af tilstedeværelsen af coverlip(er) og ringtransducer placeret mellem den objektive linse og hjernen. Et opretstående mikroskop anbefales også, da det giver mulighed for mere plads til at manøvrere dyret, især til hjerneforsøg. For at fange kinetikken af ultralyd-mikrobubble induceret lækage af det intravaskulære farvestof er en høj tidsmæssig opløsning gunstig, hvilket kan opnås ved hjælp af et resonansscanningssystem. Ved at kombinere dette med et højfølsomt detektionssystem, såsom gallium arsenidphosphid (GaAsP) detektorer, vil også resultere i mere gunstige billeder.
Den fremlagte forsøgsprocedure har flere begrænsninger. For det første, den kirurgiske procedure er ganske invasiv, og er blevet rapporteret til at forårsage inflammation45, selv om betændelse kan minimeres46. Desuden, immunrespons induceret af kraniet vindue operationer blev observeret for at løse med 2-4 uger efter operationen23,24,25. Derudover kan boreprocessen, især når den udføres med overdreven kraft eller hastighed, forårsage skade på underliggende væv på grund af generering af varme, vibrationer og tryk. Kranievindue operationer og multiphoton imaging er også blevet observeret for at påvirke hjernens temperatur47. Disse begrænsninger kan reduceres til en vis grad gennem omhyggelig skabelse af uberørte kranievinduer, korrekt genopretning af dyr med kroniske kranievinduer og vedligeholdelse af normterm kropstemperatur ved hjælp af en varmekilde med feedbackkontrol. For det andet er billeddybden begrænset af det anvendte mikroskop og objektive linse. For eksempel kan effekten af ultralyd-mikrobubble behandling i dybere hjernestrukturer, såsom hippocampus, ikke studeres uden mere invasive foranstaltninger, såsom fjernelse af overliggende kortikalt væv48 eller brugen af mikrolinser i forbindelse med kortikal penetration49. Brug af en objektiv linse med en lang arbejdsafstand kan løse dette problem til en vis grad, men lys penetration er også begrænset på større dybder.
Mens de repræsentative billeder af denne protokol blev erhvervet fra vilde gnavere, kan den præsenterede forsøgsprocedure også anvendes på transgene dyr og sygdomsmodeller, såsom Alzheimers sygdom31. Ultralydsforsøg, der ikke er relateret til BBB-graduering, såsom ultralyd-induceret neuromodulation, kan også overvåges ved hjælp af denne protokol33,34. Andre mulige applikationer kan opnås ved hjælp af forskellige mikroskop eller detektor set-ups, såsom parring af et konfokalt mikroskop med et ultra-højhastighedskamera50. Mens fotobleaching og fototoksicitet er forholdsvis værre i konfokale mikroskoper på grund af den store excitation volumen, ultra-high-speed imaging kan muliggøre visualisering af hjernen kapillær endotelcelle-microbubble interaktioner med høj tidsmæssig opløsning, som yderligere kunne belyse de mekanismer, der driver ultralyd-microbubble BBB behandlinger. Afslutningsvis giver den beskrevne protokol en metode til at overvåge vaskulære og cellulære effekter induceret af ultralyd-mikrobubble BBB-eksperimenter i realtid, hvilket giver et værktøj til yderligere at bestemme de mekanismer, der driver disse behandlinger, samt at belyse de downstream-svar fra hjernens parenchyma til ultralyd-mikrobubble behandlinger.
Disclosures
Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman og Catharina de Lange Davies erklærer ingen finansielle eller ikke-finansielle konkurrerende interessekonflikter. Spiros Kotopoulis er en fuldtidsansat og ejer aktier i EXACT Therapeutics AS, et firma, der udvikler ultralyd og microbubble / klynge forbedret lægemiddellevering. Kullervo Hynynen er grundlægger af FUS Instruments, hvorfra han modtager ikke-forskningsrelateret støtte.
Acknowledgments
Dyrenes stald blev leveret af Comparative Medicine Core Facility (CoMed, NTNU). Figur 3 blev oprettet i BioRender.com. Videooptagelse og redigering er udført af Per Henning, webmaster ved Det Naturvidenskabelige Fakultet på NTNU. Projektet blev finansieret af Det Norske Universitet for Videnskab og Teknologi (NTNU, Trondheim, Norge), Research Council of Norway (RCN 262228), Canadian Institutes of Health Research (FDN 154272), National Institute of Health (R01 EB003268) og Temerty Chair i Focused Ultrasound Research på Sunnybrook Health Sciences Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ring transducer placement | |||
| Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
| Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
| Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
| Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
| Animal preparation and drugs | |||
| Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
| Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
| Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
| Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
| Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
| Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
| Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
| Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
| Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
| Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
| Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
| Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
| * Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
| Material and equipment for cranial window placement | |||
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
| Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
| Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
| Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
| Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
| * Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
| Multiphoton microscopy | |||
| 20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
| Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
| MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
| SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
| Ultrasound treatment | |||
| 50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
| Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
| Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
| Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
| Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), London, England. 787-796 (2016).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12 (2005).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
- Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
- Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
- Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911 (2015).
- Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
- Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
- Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13 (2014).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
- Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
- Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
- Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
- McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
- Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
- Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
- Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer's disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
- Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
- Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061 (2018).
- Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Chu, P. -C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477 (2015).
- Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , at http://eprints.gla.ac.uk/158176/ 2079-2082 (2014).
- Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
- Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
- Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
- Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
- Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
- Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 7, 46427 (2017).
- Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer's disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, Pt 10 3039-3050 (2012).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , at http://arxiv.org/abs/1606.02382 (2016).
- Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271 (2014).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499 (2019).
- Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
- Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598 (2019).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).
