Summary
Denne protokollen beskriver de kirurgiske og tekniske prosedyrene som muliggjør sanntids in vivo multifoton fluorescensavbildning av gnagerhjernen under fokusert ultralyd og mikrobobblebehandlinger for å øke blod-hjernebarrierens permeabilitet.
Abstract
Blod-hjernebarrieren (BBB) er en viktig utfordring for vellykket levering av legemidler til hjernen. Ultralydeksponering i nærvær av mikrobobler har dukket opp som en effektiv metode for forbigående og lokalt å øke permeabiliteten til BBB, noe som letter para- og transcellulær transport av legemidler over BBB. Avbildning av vaskulaturen under ultralydmikrobubble behandling vil gi verdifull og ny innsikt i mekanismene og dynamikken i ultralyd-mikroboble behandlinger i hjernen.
Her presenterer vi en eksperimentell prosedyre for intravital multifotonmikroskopi ved hjelp av et kranialvindu på linje med en ringtransduser og en 20x objektiv linse. Dette oppsettet muliggjør høy romlig og tidsmessig oppløsningsavbildning av hjernen under ultralydmikrobobble behandlinger. Optisk tilgang til hjernen oppnås via et åpen hodeskallekranialvindu. Kort sagt fjernes et 3-4 mm diameter stykke av skallen, og det eksponerte området av hjernen er forseglet med en glassdekslelip. En ringtransduser på 0,82 MHz, som er festet til en ekstra glassdekslerlip, er montert på toppen. Agarose (1% m/ v) brukes mellom dekslene på svingeren og dekslene som dekker kranialvinduet for å forhindre luftbobler, noe som hindrer ultralydutbredelse. Når sterile kirurgi prosedyrer og antiinflammatoriske tiltak er tatt, ultralyd-mikrobubble behandlinger og avbildning økter kan utføres gjentatte ganger over flere uker. Fluorescerende dekstrankonjugater injiseres intravenøst for å visualisere vaskulaturen og kvantifisere ultralydmikrobobble induserte effekter (f.eks. lekkkinetikk, vaskulære endringer). Dette dokumentet beskriver plasseringen av kranialvinduet, plassering av ringtransduser, bildebehandlingsprosedyre, vanlige feilsøkingstrinn, samt fordeler og begrensninger ved metoden.
Introduction
En viktig utfordring for behandling av nevrologiske lidelser er tilstedeværelsen av blod-hjernebarrieren (BBB). BBB begrenser hydrofile, ladede, polare og store (> 400 Da) molekyler fra å komme inn i hjernen parenchyma1. En metode som for tiden brukes til å levere terapeutiske stoffer over BBB i hjernen parenchyma er å bruke stereotaktiske intrakranielle injeksjoner2. Andre mindre invasive metoder som undersøkes hindres av kompleksiteten i teknikkene som brukes, for eksempel å designe legemidler for reseptormediert levering over BBB3, eller er begrenset i romlig presisjon av målrettede områder, for eksempel intranasale injeksjoner4 eller administrering av hyperosmotiske løsninger5.
Bruken av ultralyd i forbindelse med systemisk injiserte mikrobobler, et ultralydkontrastmiddel, er utviklet som et ikke-invasivt middel for å midlertidig øke permeabiliteten til BBB6. Ved å bruke en fokusert svinger7 eller et styrbart faset utvalg av transdusere8,9, kan ultralyd målrettes mot utvalgte områder i hjernen med millimeternivåpresisjon, og minimere off-target effekter. Ultralydmikrobobble behandlinger kan tilpasses hvert hjerneanatomi ved å bruke magnetisk resonansavbildningsveiledning7,10,11,12,13,14 eller stereotaktiske rammer15. Videre kan omfanget av økning i BBB permeabilitet kontrolleres i sanntid ved å overvåke akustiske utslipp fra mikrobobler16,17,18. Kliniske studier som undersøker sikkerheten og gjennomførbarheten av ultralydmikrobubble-behandlinger pågår for tiden over hele verden (f.eks. ClinicalTrials.gov identifikator NCT04118764).
Ultralydmikrobubble BBB-behandlinger evalueres vanligvis ved å bekrefte behandlingsinduserte økninger i BBB-permeabilitet, visualisert i kontrastforbedret magnetisk resonansavbildning, eller ved fargestoff ekstravasasjon i in vivo-avbildning eller ex vivo histologi. Imidlertid har de fleste mikroskopiske analyser blitt utført ex vivo, etter ferdigstillelse av ultralyd-mikrobubble behandlinger11,19, og dermed mangler de dynamiske biologiske responsene under, og umiddelbart etter, ultralydeksponering. Sanntidsavbildning utført under ultralydeksponering kan bidra til å forstå mekanismene som driver ultralydmikrobubble BBB-behandlinger samt nedstrømsresponser, noe som kan øke vår forståelse av terapeutiske applikasjoner. Videre vil bruk av kroniske kranialvinduer med in vivo-avbildningsteknikker gjøre det mulig for langsgående studier å evaluere temporale aspekter ved ultralydmikrobobble behandlinger.
Målet med denne protokollen er å beskrive de kirurgiske og tekniske prosedyrene som kreves for å gjennomføre sanntids multifotonavbildning av ultralydmikroboblebehandlinger for akutte og kroniske studier hos gnagere (figur 1). Dette oppnås i to deler: først å lage et kranialvindu for å aktivere in vivo-avbildning, og for det andre å montere en ringtransduser på toppen for å muliggjøre samtidig sonikering og avbildning. Kranialvinduer har blitt mye brukt av nevrologer for in vivo-avbildning av blant annet nevrovaskulær kobling20, β-amyloidpatogenese21 og nevroimmunologi22. I denne protokollen beskrives kirurgiske prosedyrer for å skape akutte (ikke-gjenoppretting) og kroniske (utvinning) kranialvinduer i musen og rotteskallen. Kraniale vindusmetodikker, spesielt for kroniske eksperimenter, har vært godt dokumentert23,24,25. For å være i samsvar med eksisterende litteratur, vil begrepene 'akutt' og 'kronisk' bli brukt gjennom hele denne protokollen. Utformingen av ringtransdusere for in vivo-avbildning har også tidligere blitt beskrevet26. Til tross for tilgjengeligheten av disse teknikkene og innsikten som kan oppnås ved sanntidsavbildning av ultralydmikrobubble behandlinger, er det svært få forskningslaboratorier som har publisert litteratur ved hjelp av denne teknikken26,27,28,29,30,31,32 . Som sådan, i denne protokollen, beskrives de kirurgiske og tekniske detaljene for å utføre disse sanntids ultralydmikrobubble-eksperimentene. Mens de angitte sonikerings- og bildeparameterne er optimalisert for BBB-eksperimenter, kan andre effekter av ultralydeksponering for hjernen, for eksempel nevromodulering33,34, β-amyloid plakkovervåking31 og immuncelleresponser32, også undersøkes ved hjelp av denne teknikken.
Protocol
Alle de følgende eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av og gjennomført i henhold til Mattilsynet, Sunnybrook Research Institute's Animal Care Committee og Canadian Council on Animal Care.
1. Materialforberedelse
- Forbered materialene som trengs for kranialvinduskirurgi og ultralydmikrobobble behandlinger. For kroniske kranialvinduer, steriliserte verktøy og materialer, er det nødvendig med et sterilt kirurgisk rom, og administrering av før- og etterkirurgimedisinering er nødvendig23,24,25.
- Transduser og coverlip forberedelse
- Kontroller transduserens fysiske integritet: se etter sprekker og bulker. Kontroller at elektrodene på toppen og siden av svingeren er intakte.
- Deponer cyanoacrylat lim i en liten tallerken. Bruk en applikator til å spre et tynt lag lim på overflaten av svingeren.
- Plasser svingeren på glassdekslene. Trykk godt ned i 20-30 s.
MERK: En 3D-trykt form kan brukes til å lette justeringen av glassdekslene med ringtransduseren, noe som sikrer fast og jevnt trykk på dekslene og ringtransduseren (figur 2). - Se etter bobler mellom svingeren og dekslene. Hvis det er bobler, ta av dekslene og gjenta fra trinn 1.2.3., da luft hindrer ultralydutbredelse. Herd over natten ved romtemperatur.
- Når transduseren er festet til et glassdeksler( figur 3).
MERK: Denne protokollen bruker en egenprodusert blyzirkonat-titanatringstransduser (10 mm ytre diameter, 1,4 mm tykkelse, 1,2 mm høyde)35, tilpasset en 50 Ω impedans og 0° fasebelastning med en tilpasset matchende krets. Svingeren drives ved 0,82 MHz i tykkelsesmodus, og produserer et sirkulært brennpunkt ca. 1 mm under dekslene. Ringtransdusere av lignende egenskaper (10 mm ytre diameter, 1,5 mm tykkelse, 1,1 mm høyde) har blitt karakterisert26 og brukt mye til multifotonmikroskopieksperimenter27,28,29,31,32,36.
- Transduser gjenbruk og coverlip erstatning
- Skift ut dekslene hvis det er sprukket eller har rusk (f.eks. pels, lim) fra forrige eksperiment. For å fjerne dekslene, oppløs limet ved å senke transduseren og dekslene i aceton i 20 minutter.
MERK: Aceton kan påvirke transduserens og/eller elektrodenes integritet. Kontakt produsenten før du fortsetter med dette trinnet. - Kontroller om acetonen har oppløst limet ved å trekke forsiktig i dekslene med tang. Kontroller én gang hvert tiende minutt for å unngå langvarig acetoneksponering.
- Skift ut dekslene hvis det er sprukket eller har rusk (f.eks. pels, lim) fra forrige eksperiment. For å fjerne dekslene, oppløs limet ved å senke transduseren og dekslene i aceton i 20 minutter.
2. Dyreforberedelse
- Bedøv dyret ved å bruke en blanding av medisinsk luft, oksygen og isofluran i et induksjonskammer.
MERK: Bruk av oksygen som bærergass er rapportert å påvirke halveringstiden til mikrobobler37,38 og redusere omfanget av ultralydmikrobobleinduserte økninger i BBB permeabilitet27, men kan også redusere risikoen for hypoksi og dødelighet39. Velg bærergasser basert på prosjektmål og veterinærråd. Injiserbare bedøvelsesmidler som ketamin/xylazincocktail kan også brukes; Det er imidlertid lettere å kontrollere planet av anestesi og oksygennivåer i blodet når du bruker inhalerbare bedøvelsesmidler. - Kontroller at dyret har oppnådd et tilstrekkelig plan av anestesi ved å utføre en tåklemme. Vei dyret for å bestemme doseringen av dextran, mikrobobler og legemidler som skal administreres. Fjern pelsen fra dyrets hode og plasser dyret på en stereotaktisk ramme.
- For akutte eksperimenter må tilgang til den systemiske sirkulasjonen etableres for dekstran- og mikrobobbleinjeksjoner. For å oppnå dette, sett inn et 27 g kateter i en haleåre.
MERK: Mens retro-orbital injeksjoner er også mulig, hale årer anbefales på grunn av begrenset arbeidsområde i hodet området under multiphoton avbildning. - Overfør dyret til den stereotaktiske rammen og bytt anestesi til nesekjeglen. Oppretthold dyrets kjernetemperatur på 37 °C ved hjelp av en varmekilde, for eksempel en varmepute eller en hanske fylt med varmt vann.
- Overvåk dyretemperaturen ved hjelp av en rektal sonde, og dyrefysiologi ved hjelp av et pulsoksymeter. Påfør oftalmisk salve. Injiser passende smertestillende og/eller antiinflammatoriske legemidler før operasjonen (se materialfortegnende).
- Før du starter kranialvindusoperasjonen, må du kontrollere anestesiplanet og dyrets hjertefrekvens, O2-metning , åndedrettsfrekvens og temperatur.
- For å starte kranialvindusoperasjonen, fjern pelsen på hodet ved å bruke en depilatorisk krem og / eller bruke pelsklippere. Fjern pelsen fra mellom øynene til den fremre halvdelen av nakken (figur 4A).
MERK: Langvarig kontakt med depilatorisk krem vil brenne huden. For kroniske kranialvinduoperasjoner, vask hodebunnen med vekslende kluter av betadine og 70% EtOH etter pelsfjerning. Forbered det kirurgiske rommet for steril kirurgi. Steriliteten må opprettholdes til trinn 2.15. - For å fjerne hodebunnen, løft huden mellom øynene ved hjelp av tang holdt i den ikke-dominerende hånden, langs sagittal sutur. Bruk buet saks, fjern huden for å eksponere parietalbenene (figur 4B). Påfør fast trykk med en bomullspinne hvis det er blødning fra skallen eller hodebunnen; blødning må stoppes før du går videre til neste trinn.
MERK: For akutte operasjoner kan huden skyves tilbake og festes til skallen ved hjelp av flytende cyanoacrylatlim eller vevslim. - Fjern periosteumet som dekker den ytre overflaten av skallen ved hjelp av bomullspinne.
- Bruk et mikroskop (6-25x) og en tannbor (0,5 mm borerulle, middels hastighet), skisser en sirkel på parietalbenet for å markere ønsket plassering av kranialvinduet på skallen (figur 5). Unngå sagittal sutur, lambda og bregma, da disse områdene er tynnere og overlegg store blodkar.
MERK: For å lette boringen kan et omriss av kranialvinduet trekkes på skallen ved hjelp av en markør og sjablong (figur 5A). For rotter kan det være lettere å bore en rektangulær, i stedet for et sirkulært kranialvindu. På grunn av tykkelsen på rotteskallbenet, bruk en 0,7 mm bor for å skissere kranialvinduet i det kompakte beinet før du bruker en 0,5 mm bor for å fullføre boreprosessen. - Påfør skånsomt trykk med boret; for høyt trykk øker risikoen for å forårsake skade på hjernevevet. For å forhindre at skallen overopphetes under boring, drypp saltvann på skallen ved hjelp av en sprøyte, eller påfør et stykke kirurgisk svamp gjennomvåt i saltvann.
- Veksle mellom boring og kjøling av skallen til den resulterende beinøya skiller seg fra resten av skallen. Kontroller borefremdriften ved å legge forsiktig trykk på beinøya ved hjelp av tang eller borbits. Fortsett boringen til beinøya skiller seg fra resten av skallen.
MERK: Små sprekker i de tynneste områdene av skallen er en god indikasjon på at boringen nesten er fullført. Forsøk på å fjerne beinøya for tidlig kan føre til at biter av bein trenger inn i hjernevevet, skader dura og forårsaker betennelse og blødning. - Fjern benøya ved å bruke et par fine tang for å gripe kantene, eller det øvre kompakte benlaget, på beinøya (figur 6A). Forsikre deg om at hjernen holdes fuktig ved å bruke et stykke kirurgisk svamp som er forbløtet i saltvann. Hvis blødning observeres, plasser den kirurgiske svampen på regionen som blør. Ikke gå videre til neste trinn før blødningen er avsluttet.
MERK: Hvis blødningen vedvarer etter 5 min, kan ikke dyret brukes til multifotonavbildningsforsøk. For rotter kan det være nødvendig å fjerne dura hvis den er tykk. For å fjerne dura, bruk høy forstørrelse på operasjonsmikroskopet og et par fine tang. - For å plassere et kranialvindu, plukk opp en glassdekslelip med et par tang, legg en dråpe saltvann på den ene siden og manøvrer den over hullet i skallen. Pass på at det ikke er luftbobler under dekslene.
MERK: Bruk en 5 mm glassdekslerlip for mus og 8 mm for rotter. For rotter, på grunn av tykkelsen på skallebenet, bruk en agaroseløsning i stedet for saltvann for å fylle ut rommet mellom dekslene og hjernen. Svingeren og dens deksler kan også festes direkte på skallen, i stedet for å bruke en separat dekslelip for kranialvinduet. For dette alternativet går du videre til trinn 3.1. Se figur 1 hvis du vil ha mer informasjon. - Spred et lag cyanoakrylatlim rundt omkretsen av dekslene (figur 6B) for å feste det til skallen. Pass på at det ikke er lim under dekslene. Påfør trykk på dekslene for å sikre at lim ikke kommer i kontakt med hjernen.
- Når limet er helt tørt, jevn ut overflaten av limet ved hjelp av tannboret. Sørg for at alt limrester fjernes fra det kirurgiske området.
MERK: For kroniske kranialvinduer, injiser de nødvendige postkirurgiske legemidlene (se Materialfortegnelse), gi salve for sårpleie og myke matvarer, og gjenopprett dyret under en varmelampe.
3. Plassering av ringtransduseren
- Forbered 1% (w / v) agarose-løsningen. I en liten beger- eller Erlenmeyer-kolbe tilsetter du 0,1 g agarose og 10 ml PBS (1x) eller saltvann. Kok oppløsningen til agarose er fullstendig oppløst ved å plassere begeret på en kokeplate eller varme opp oppløsningen i en mikrobølgeovn (30-45 s).
- Trinn 3.2-3.5 er tidssensitive etter hvert som agaroseløsningen avkjøles raskt. Trekk ut ~ 0,5 ml agarose i en 1 ml sprøyte.
MERK: For å beskytte hjernens integritet må du sørge for at temperaturen på agaroseen tilnærmer kroppstemperaturen før bruk. - Deponer agarose liberalt på dekslene på kranialvinduet.
MERK: Hvis vevet blanches, temperaturen på agarose var for høy; dyret må avlives. Hvis det ikke er noen separate deksler som dekker hjernen (dvs. transduseren og dens deksler er plassert direkte på hjernen, se trinn 2.14), bør agarose deponeres på overflaten av hjernen i dette trinnet. - Plasser svingeren over kranialvinduet (figur 6C). Påfør fast trykk slik at det er minimal agarose mellom svingeren og kranialvinduet. Kontroller at svingeren er sentrert (XY-plan) og parallell (Z-plan) til kranialvinduet, og at det ikke er noen luftbobler i agarose.
- Når agarose har avkjølt til en jello-lignende konsistens, kutt bort overflødig agarose fra omkretsen av transduserens dekslerlip ved hjelp av en spatel eller skalpell. Påse at det ikke er luftbobler under transduserens deksler.
- Bruk en spatel, spred et lag cyanoacrylat lim over omkretsen av svingerens dekslerlip, som strekker seg til skallen, slik at svingeren er fast festet til skallen.
- Hold godt trykk på transduseren til limet er helt tørket (10-15 min).
4. Multifotonmikroskopiavbildning
- Plasser dyret under objektivlinsen (figur 7A). Kontroller at objektivet er sentrert i ringtransduseren, og parallelt med svingeren (figur 7B). Hvis det brukes en objektiv linse for vanninnlevelse, fyller du midten av ringtransduseren med avionisert og avgasset vann.
MERK: Avgasset vann er viktig for riktig ultralydutbredelse. - Start med objektivet i høyeste posisjon, og senk deretter objektivet langsomt til det er innenfor ringetransduseren (figur 7A, B). Pass på at objektivlinsen ikke kolliderer med svingeren eller dekslene.
MERK: Bytt mellom okularet for å kontrollere om Z-posisjonen til objektivlinsen er i plan med overflaten av hjernen, og for øyet for å sikre at objektivlinsen ikke kolliderer med svingeren eller dekslene. Det kan være lettere å visualisere pialkarene gjennom okularet etter injeksjon av fluorescerende dextran gjennom halevenen (figur 7C). - Klargjør multifotonmikroskopet for avbildning.
MERK: Denne protokollen bruker et oppreist multifotonmikroskop og en 20-25x objektiv linse som har en arbeidsavstand på 2 mm, som er tilstrekkelig til å fokusere utover dekslene, inn i hjernens parenchyma. - Forbered dextran. Tilsett riktig mengde PBS i hetteglasset med dextran, i henhold til produsentens instruksjoner. Virvel dekstranoppløsningen i 1-3 min for å sikre at dekstranpulveret er fullstendig oppløst. Injiser dextranoppløsningen i halevenen.
- Sette opp en bildeskanning
- Bruk okularene til å sikre at objektivlinsen er parallell med hjernen. Vipp dyret for å korrigere for XZ og YZ feiljusteringer.
- Velg et synsfelt i et multifotonmikroskop. Sett opp en XYZ-skanning før ultralydeksponering for å få et basisbilde av vaskulaturen før ultralydeksponering.
MERK: Typiske bildeparametere er som følger: 300-800 μm i dybden, 2-5 μm trinnstørrelse og 10-20 tidsstakker. Påse at objektivlinsen ikke kommer i kontakt med svingeren eller dekslene på det laveste punktet under bildesekvensen.
5. Ultralydeksponering
- Kontroller at alle BNC-kablene er riktig tilkoblet (figur 3).
- Sett opp en XYZT-bildeskanning som er tilstrekkelig lang nok til å fange bildestakker før, under og etter ultralydmikrobobble-behandlinger.
- Forbered mikroboblene ved å følge produsentens instruksjoner. Injiser mikroboblene i halevenen og begynn å forestille deg.
MERK: Mikrobobleinjeksjoner kan gjøres med en infusjonspumpe for å sikre konsistent injeksjonshastighet og for å muliggjøre samtidig mikrobobleinjeksjon og avbildning. Hvis mikrobobler skal injiseres under avbildning, må du sørge for at halevenen er lett tilgjengelig uten å utsette detektorene for omgivelseslys. - Begynn sonikering.
MERK: Typiske sonikeringsparametere er som følger: 10 ms sykluser, mekanisk indeks på 0,2-0,4, og pulsrepetisjon frekvenser mellom 1-4 Hz. Sonikering og mikrobubble parametere som brukes i prekliniske ultralyd-mikrobubble studier har blitt grundig studert og er godt dokumentert i litteraturen (f.eks. se 40 for en gjennomgang). - Fortsett multifotonavbildning gjennom hele sonikeringsvarigheten og etter slutten av sonikeringen. Vær oppmerksom på dekstran ekstravasasjon fra blodårene, da dette indikerer økning i BBB-permeabilitet.
MERK: Hvis dextran oppdages i det ekstravaskulære rommet, men i periferien av synsfeltet, kan det være berørte blodkar utenfor synsfeltet. Dette kan skyldes feiljustering av svingeren med fokus på objektivet. I dette scenariet er det lettere å justere synsfeltet ved å flytte objektivet eller ved å omplassere dyret, enn å omjustere svingeren. - Når avbildningen er fullført, euthanize dyret cervical dislokasjon under dyp anestesi eller CO2 kvelning. For kroniske kranialvinduer, spred et lag med tannsement på den eksponerte skallen.
MERK: For kroniske kranialvinduer kan huden rundt vinduet sutureres, selv om dette ikke er nødvendig, på grunn av fjerning av hodebunnen i trinn 2.8.
6. Bildeanalyse
- Eksporter bildestakker.
- Analyser bilder med bildeanalyseprogramvare (f.eks. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) og/eller programmeringsverktøy (f.eks.
Representative Results
Vellykkede ultralydmikrobubble behandlinger kan oppdages ved ekstravasasjon av fluorescerende dextran fra intravaskulær til ekstravaskulær plass (figur 8), noe som indikerer en økning i BBB permeabilitet. Avhengig av trykkfeltet til ringtransduseren, vil pialfartøy og / eller kapillærer bli påvirket.
For å evaluere de vaskulære endringene som induseres ved ultralydmikrobobblebehandlinger, kan diameteren på det aktuelle karet måles før, under og etter ultralydmikrobobblebehandling (figur 9). Dette kan gjøres manuelt i en kommersielt tilgjengelig programvare (f.eks. Under bildeoppkjøp kan bolus dextran injeksjoner og linje skanninger også brukes til å vurdere blodstrømmen30,41. For å evaluere kinetikken til dekstranlekkasje som en representativ modell for legemiddellevering, kan signalintensiteten mellom intra- og ekstravaskulære rom evalueres ved hjelp av verktøy som MATLAB26,27,29,41 (figur 10).
Videre bildebehandling kan oppnås ved hjelp av ImageJ / FIJI. ImageJ/FIJI er en programvare med åpen kildekode som er kompatibel med MATLAB og er velegnet til å utføre felles analyser i biologisk bildeanalyse, for eksempel måling av vaskulære endringer, eller lengden på eller avstanden mellom fluorescerende objekter (f.eks. β-amyloidplakk til blodkar). Datasamlebånd for bildebehandling som er opprettet i ImageJ/FIJI, kan automatiseres ved å skrive egendefinerte makroer.
Mer komplekse analyser, som 3D-segmentering av blodårer og cellesporing, kan oppnås ved hjelp av mer avansert, halvautomatisert programvare (figur 11). Etter segmentering kan det gjennomføres mer spesifikke analyser, for eksempel klassifisering av blodkar som arterioler, venuler eller kapillærer, basert på diameter, forgrening, tortuositetsmønstre og strømningsretning42,43. Maskinlæringsalgoritmer er også utviklet for å automatisere blodkarsegmentering22,44.
Figur 1: Generell arbeidsflyt av intravitale multifoton ultralydmikrobobble hjerneeksperimenter. En generell arbeidsflyt av de intravitale multifoton ultralyd-mikrobubble hjerneeksperimentene beskrevet i denne protokollen vises. Det er 6 trinn: (A) Dyrepreparat for (A1) mus og (A2) rotter, (B) Dextran injeksjon, (C) Mikrobobleinjeksjon, (D) Pre-treatment imaging, (E) Behandling og avbildning, (F) Etterbehandling bildebehandling og dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tverrsnitt og toppvisning av 3D-trykt form. (A) Tverrsnitt av formen. Et tynt lag cyanoacrylatlim påføres på den øverste overflaten av ringtransduseren, og en dekslelip er plassert på toppen. Et stempel kan brukes til å påføre fast, jevnt trykk på dekslene og ringtransduseren. (B) Sett ovenfra på formen. Et hakk kan legges i formen for å lette fjerningen av den forberedte svingeren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ultralydoppsett. Typisk maskinvare for ultralydeksperimenter vises. Ultralydparametere stilles inn og utløses av signalgeneratoren og forsterkes av forsterkeren. En kraftmåler kan brukes til å registrere fremover og reflekterte krefter før signalet sendes til den matchende boksen, som samsvarer med svingeren. Alle tilkoblinger oppnås ved hjelp av BNC-kabler med mindre annet er oppgitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Arealet av pelsfjerning og fjerning av hodebunnen. (A) Pelsfjerning bør starte fra mellom øynene og strekke seg til den fremre halvdelen av nakken. (B) Fjerning av hodebunnen bør være tilstrekkelig til å eksponere parietalbenene. Blødning må stoppes før du fortsetter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Omrisset av kranialvinduet. Kranialvinduet ligger på et parietalben. (A) Et omriss av kranialvinduet kan trekkes på skallen for å hjelpe til med boringsprosessen. (B) Omrisset av kranialvinduet kan ses etter boring gjennom det kompakte beinet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kranialvindu og svingerjustering. (A) Kranialvinduet er laget på et parietalben. Benøya er fjernet, og eksponerer hjernen under. (B) Kranialvinduet er komplett når et glassdeksler er forseglet på skallen ved hjelp av cyanoakrylatlim. (C) Svingeren er sentrert til kranialvinduet og festet ved hjelp av cyanoakrylatlim. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Plassering av objektiv og svinger. (A,B) Objektivlinsen er sentrert rundt ringtransduseren. (C) Blodkar fylt med fluorescerende dekstran er synlige gjennom okularene, under epifluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Maksimal projeksjon multifoton bilder av ultralyd-mikrobubble induserte økninger i BBB permeabilitet. Maksimalt antall projeksjonsbilder av vaskulatur (A) før og (B) etter ultralydmikrobubble behandlinger. Vellykkede ultralydmikrobubble behandlinger kan bekreftes ved å observere økning i BBB permeabilitet etter behandling, visualisert som fluorescerende dextran ekstravasasjon (piler). Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Analyse av vasomodulering indusert ved ultralydmikroboblebehandlinger. Maksimalt antall projeksjonsbilder av cerebral blodårer før, under og etter ultralyd-mikrobubble behandlinger. Mikrobobler er til stede i alle bilder. Sammenlignet med (A) forbehandlingstilstander, kan klar vasomodulering observeres (B) under ultralydmikrobubble behandlinger (røde piler). Ultralydmikrobubble medierte økninger i BBB-permeabilitet er også tydelig etter behandling fra lekkasjen av fluorescerende dextran fra det intravaskulære til det ekstravaskulære rommet (gule piler). (C) Når ultralyd er slått av, går vaskulære diametre tilbake til forbehandling, baseline størrelser. (D) Vaskulære endringer kan analyseres ved å plotte diameteren på det adekkende karet før, under og etter ultralydmikrobubble behandling. Skalastang: 100 μm. (Upublisert arbeid). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Analyse av lekkasjekinetikk etter ultralydmikroboblebehandlinger. Økning i BBB-permeabilitet visualiseres som lekkasje av fluorescerende dextran fra det intravaskulære til det ekstravaskulære rommet. Endringer i BBB-permeabilitet er tydelige når man sammenligner bildestakker som er anskaffet (A) før og (B) etter ultralydmikroboblebehandlinger. (C) Lekkasjekinetikk kan analyseres ved å spore intensiteten, volumet og hastigheten til dekstran i ekstravaskulære rom (gult rektangel). Skalalinje: 50 μm. (Upublisert arbeid.) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Segmentering av blodkar av multifotonmikroskopi XYZ-stakk. (A) Dybde (XYZ) stabel med blodkar i en transgen EGFP-rotte. Blodårene visualiseres via intravenøs injeksjon av fluorescerende Texas Red 70 kDa dextran (rød). Den grønne kanalen viser fluorescerende celler og vevs autofluorescens. (B) 3D-rekonstruksjoner av blodkar opprettes, og deretter fargekodes i henhold til blodkartype for å lette typespesifikke analyser. Venn/venuler er blå, arterier/arterioler er røde og kapillærene er cyan. Skala bar: 50 μm. Rekonstruksjoner opprettet ved hjelp av Bitplane Imaris. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Intravital multifotonmikroskopiovervåking av hjernen er et verdifullt verktøy for å studere hjerneresponser under ultralydeksponering. Så vidt vi vet, er protokollen som er beskrevet her den eneste metoden for å utføre multifotonmikroskopiavbildning av hjernens parenchyma under ultralydmikrobobble behandlinger. Opprettelsen av kranialvinduer og bruk av ringtransdusere tillater sanntidsovervåking av vaskulære, cellulære og andre nedstrømsresponser på ultralydmikrobobblebehandlinger ved høy romlig og tidsmessig oppløsning. Andre grupper har utført multifotonmikroskopiavbildning etter ferdigstillelse av ultralydmikrobubble behandlinger, og dermed mangler sanntidsresponsen til hjernen parenchyma til behandlinger19. Den beskrevne prosedyren gir forbedret temporal kontroll, slik at innsamling av data som kan bidra til å belyse de akutte mekanismene bak ultralydmikroboblebehandlinger. Kvantitative og kvalitative data kan trekkes ut og analyseres fra de oppkjøpte bildestakkene, for eksempel ekstravasasjonskinetikk27,29,30, endringer i β-amyloid plakkvolum31 og celledynamikk32.
Flere feilsøkingstrinn ble uthevet i hele protokollen. For det første ble det lagt vekt på kirurgiske trinn som er spesielt utsatt for operatørfeil, for eksempel bruk av agarose under kranial vinduskirurgi og plassering av svingeren. Tiltak for å forhindre ubehag og død av dyr ble også gitt, inkludert overvåking av dyrefysiologi under operasjonen, og grundig virveling av dextran før injeksjon. For det andre ble også fysiske spesifikasjoner av svingeren og justeringen av objektivlinsen, svingeren og kranialvinduet uthevet. Spesifikasjonene til ringtransduseren og dens akustiske egenskaper må bestemmes i betraktning av objektivet som brukes, så vel som dyremodellen. Spesielt må den indre diameteren på ringtransduseren være stor nok til å omgi den objektive linsen, men liten nok til å monteres sikkert på dyrets skalle. I tillegg må fokusområdet til svingeren justeres etter rekkevidden til objektivet som brukes.
En vanlig utfordring er at kranialvinduet og ringtransduseren er vinklet i forhold til objektivet. Riktig sentrering (XY) og justering (Z) av objektivlinsen med kranialvinduet og svingeren sikrer at fokusområdet til transduseren, og dermed området med behandlet hjernevev, samsvarer med synsfeltet, og reduserer risikoen for kollisjon mellom objektivet og transduseren under avbildning. Justering kan oppnås ved å justere dyrets hodeposisjon og/eller ved å rotere den stereotaktiske rammen den er festet i.
Mikroskopkomponenter (f.eks. detektorer, bjelkesplittere) og bildeanskaffelsesparametere bør velges basert på målet med studien. Her brukes en objektiv linse med lang brennvidde (> 2 mm) på grunn av tilstedeværelsen av dekslene og ringtransduseren som ligger mellom objektivlinsen og hjernen. Et oppreist mikroskop anbefales også, da det gir mer plass til å manøvrere dyret, spesielt for hjerneeksperimenter. For å fange kinetikken til ultralydmikrobobble indusert lekkasje av det intravaskulære fargestoffet, er en høy temporal oppløsning gunstig, noe som kan oppnås ved å bruke et resonansskanningssystem. Kombinere dette med et høysensitivt deteksjonssystem, for eksempel gallium arsenid fosfid (GaAsP) detektorer, vil også resultere i gunstigere bilder.
Den eksperimentelle prosedyren som presenteres har flere begrensninger. For det første er den kirurgiske prosedyren ganske invasiv, og har blitt rapportert å forårsake betennelse45, selv om betennelse kan minimeres46. Videre ble immunresponser indusert av kranialvinduoperasjoner observert for å løse med 2-4 uker etter operasjonen23,24,25. I tillegg kan boreprosessen, spesielt når den utføres med overdreven kraft eller hastighet, forårsake skade på underliggende vev på grunn av generering av varme, vibrasjon og trykk. Kraniale vindusoperasjoner og multifotonavbildning har også blitt observert for å påvirke hjernetemperaturen47. Disse begrensningene kan reduseres til en viss grad gjennom forsiktig opprettelse av uberørte kranialvinduer, riktig gjenoppretting av dyr med kroniske kranialvinduer og vedlikehold av normotermisk kroppstemperatur ved hjelp av en varmekilde med tilbakemeldingskontroll. For det andre er bildedybden begrenset av mikroskopet og objektivet som brukes. For eksempel kan effekten av ultralydmikrobobble behandling i dypere hjernestrukturer, som hippocampus, ikke studeres uten mer invasive tiltak, for eksempel fjerning av overlying av kortikale vev48, eller bruk av mikrolenser i forbindelse med kortikale penetrasjon49. Bruk av en objektiv linse med lang arbeidsavstand kan løse dette problemet til en viss grad, men lett penetrasjon er også begrenset på større dybder.
Mens de representative bildene av denne protokollen ble anskaffet fra villtype gnagere, kan den presenterte eksperimentelle prosedyren også brukes på transgene dyr og sykdomsmodeller, for eksempel Alzheimers sykdom31. Ultralydeksperimenter som ikke er relatert til BBB-modulering, for eksempel ultralydindusert nevromodulering, kan også overvåkes ved hjelp av denne protokollen33,34. Andre mulige bruksområder kan oppnås ved å bruke forskjellige mikroskop- eller detektoroppsett, for eksempel paring av et konfokalt mikroskop med et ultra-høyhastighetskamera50. Mens fotobleking og fototoksisitet er relativt verre i konfektmikroskoper på grunn av det store eksitasjonsvolumet, kan ultra-høyhastighets avbildning muliggjøre visualisering av hjernekapillær endotelcelle-mikrobubble interaksjoner med høy temporal oppløsning, noe som ytterligere kan belyse mekanismene som driver ultralydmikrobobble BBB-behandlinger. For å konkludere, protokollen beskrevet gir en metode for å overvåke vaskulære og cellulære effekter indusert av ultralyd-mikrobubble BBB eksperimenter i sanntid, gi et verktøy for å ytterligere bestemme mekanismene som driver disse behandlingene, samt belyse nedstrøms respons av hjernen parenchyma til ultralyd-mikrobubble behandlinger.
Disclosures
Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman og Catharina de Lange Davies erklærer ingen økonomiske eller ikke-finansielle konkurrerende interessekonflikter. Spiros Kotopoulis er heltidsansatt og eier aksjer i EXACT Therapeutics AS, et selskap som utvikler ultralyd og mikroboble/klyngeforbedret legemiddellevering. Kullervo Hynynen er grunnleggeren av FUS Instruments, hvorfra han mottar ikke-forskningsrelatert støtte.
Acknowledgments
Dyrenes boliger ble levert av Comparative Medicine Core Facility (CoMed, NTNU). Figur 3 ble opprettet i BioRender.com. Videoopptak og redigering ble gjort av Per Henning, nettredaktør ved Fakultet for naturvitenskap ved NTNU. Prosjektet ble finansiert av NTNU, Trondheim, Norge, Norges forskningsråd (NFR 262228), Canadian Institutes of Health Research (FDN 154272), National Institute of Health (R01 EB003268) og Temerty Chair in Focused Ultrasound Research ved Sunnybrook Health Sciences Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ring transducer placement | |||
| Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
| Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
| Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
| Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
| Animal preparation and drugs | |||
| Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
| Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
| Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
| Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
| Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
| Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
| Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
| Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
| Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
| Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
| Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
| Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
| * Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
| Material and equipment for cranial window placement | |||
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
| Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
| Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
| Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
| Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
| * Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
| Multiphoton microscopy | |||
| 20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
| Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
| MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
| SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
| Ultrasound treatment | |||
| 50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
| Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
| Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
| Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
| Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), London, England. 787-796 (2016).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12 (2005).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
- Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
- Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
- Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911 (2015).
- Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
- Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
- Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13 (2014).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
- Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
- Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
- Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
- McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
- Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
- Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
- Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer's disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
- Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
- Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061 (2018).
- Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Chu, P. -C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477 (2015).
- Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , at http://eprints.gla.ac.uk/158176/ 2079-2082 (2014).
- Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
- Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
- Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
- Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
- Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
- Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 7, 46427 (2017).
- Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer's disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, Pt 10 3039-3050 (2012).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , at http://arxiv.org/abs/1606.02382 (2016).
- Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271 (2014).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499 (2019).
- Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
- Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598 (2019).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).
