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Medicine

Multisystem-Monitoring zur Identifizierung von Anfällen, Arrhythmien und Apnoe bei bewusst zurückhaltenden Kaninchen

Published: March 27, 2021 doi: 10.3791/62256
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Pharmacology, Upstate Medical University, 2Department of Neurology, Upstate Medical University, 3Strong Epilepsy Center, Departments of Neurology, Anesthesiology / Perioperative Medicine, & Pediatrics, University of Rochester Medical Center

Summary

Mit simultaner Video-EEG-Oximetrie-Kapnographie entwickelten wir eine Methodik zur Bewertung der Anfälligkeit von Kaninchenmodellen für die Entwicklung provozierter Arrhythmien und Krampfanfälle. Dieses neuartige Aufzeichnungssystem schafft eine Plattform, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Therapeutika zu testen und kann die komplexe Kaskade von Multisystemereignissen erfassen, die in einem plötzlichen Tod gipfeln.

Abstract

Patienten mit Ionenkanalopathien haben ein hohes Risiko, Anfälle und tödliche Herzrhythmusstörungen zu entwickeln. Es gibt eine höhere Prävalenz von Herzerkrankungen und Arrhythmien bei Menschen mit Epilepsie (dh epileptischem Herz). Darüber hinaus wurden Herz- und autonome Störungen im Zusammenhang mit Anfällen berichtet. 1:1.000 Epilepsiepatienten/Jahr sterben an plötzlichem unerwartetem Tod bei Epilepsie (SUDEP). Die Mechanismen für SUDEP bleiben unvollständig verstanden. Elektroenzephalogramme (EEG) und Elektrokardiogramme (EKG) sind zwei Techniken, die routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt werden, um die Substrate / Auslöser für Anfälle und Arrhythmien zu erkennen und zu untersuchen. Während viele Studien und Beschreibungen dieser Methodik bei Nagetieren sind, unterscheidet sich ihre elektrische Herzaktivität signifikant von der des Menschen. Dieser Artikel besteht eine nicht-invasive Methode zur Aufzeichnung der simultanen Video-EEG-EKG-Oximetrie-Kapnographie bei bewussten Kaninchen. Da die elektrische Herzfunktion bei Kaninchen und Menschen ähnlich ist, bieten Kaninchen ein hervorragendes Modell für translationale diagnostische und therapeutische Studien. Neben der Methodik zur Datenerfassung diskutieren wir die analytischen Ansätze zur Untersuchung der neuroherzialen elektrischen Funktion und Pathologie bei Kaninchen. Dazu gehören die Arrhythmieerkennung, die Spektralanalyse des EEG und eine Anfallsskala, die für zurückhaltende Kaninchen entwickelt wurde.

Introduction

Die Elektrokardiographie (EKG) wird routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt, um die Dynamik der elektrischen Herzleitung und den elektrischen Aktivierungs- und Genesungsprozess zu beurteilen. EKG ist wichtig für die Erkennung, Lokalisierung und Bewertung des Risikos von Arrhythmien, Ischämie und Infarkten. Typischerweise werden Elektroden an Brust, Armen und Beinen des Patienten befestigt, um eine dreidimensionale Sicht auf das Herz zu ermöglichen. Eine positive Ablenkung wird erzeugt, wenn die Richtung der Myokarddepolarisation in Richtung der Elektrode gerichtet ist, und eine negative Ablenkung wird erzeugt, wenn die Richtung der Myokarddepolarisation von der Elektrode entfernt ist. Zu den elektriographischen Komponenten des Herzzyklus gehören die vorhofliche Depolarisation (P-Welle), die vorhofventrikuläre Leitung (P-R-Intervall), die ventrikuläre Erregung (QRS-Komplex) und die ventrikuläre Repolarisation (T-Welle). Es gibt große Ähnlichkeiten in EKG- und Aktionspotenzialmessungen bei vielen Säugetieren, einschließlich Menschen, Kaninchen, Hunden, Meerschweinchen, Schweinen, Ziegen und Pferden1,2,3.

Kaninchen sind ein ideales Modell für die kardiale translationale Forschung. Das Kaninchenherz ähnelt dem menschlichen Herzen in Bezug auf die Ionenkanalzusammensetzung und die Aktionspotentialeigenschaften2,4,5. Kaninchen wurden für die Erzeugung von genetischen, erworbenen und medikamenteninduzierten Modellen von Herzerkrankungen verwendet2,4,6,7,8. Es gibt große Ähnlichkeiten im Herz-EKG und Aktionspotential-Reaktion auf Medikamente bei Menschen und Kaninchen7,10,11.

Die Herzfrequenz und der kardiale elektrische Aktivierungs- und Erholungsprozess unterscheiden sich bei Nagetieren sehr von Kaninchen, Menschen und anderen größeren Säugetieren12,13,14. Das Nagetierherz schlägt ~10 mal so schnell wie der Mensch. Im Gegensatz zum isoelektrischen ST-Segment in Menschen- und Kaninchen-EKGs gibt es bei Nagetieren14 , 15,16kein ST-Segment . Außerdem haben Nagetiere eine QRS-r' Wellenform mit einer invertierten T-Welle14,15,16. Die Messungen des QT-Intervalls sind bei Nagetieren sehr unterschiedlich im Vergleich zu Menschen und Kaninchen14,15,16. Darüber hinaus sind normale EKG-Werte beim Menschen sehr unterschiedlich gegenüber Nagetieren12,15,16. Diese Unterschiede in den EKG-Wellenformen können auf Unterschiede in der Morphologie des Aktionspotentials und den Ionenkanälen zurückgeführt werden, die die kardiale Repolarisationantreiben 9,14. Während der transiente nach außen gerichtete Kaliumstrom bei Nagetieren der wichtigste repolarisierende Strom in der kurzen (nicht dome) kardialen Wirkungspotentialmorphologie ist, gibt es bei Menschen und Kaninchen eine große Phase-2-Kuppel auf dem Aktionspotential, und die verzögerten Gleichrichter-Kaliumströme (IKr und IKs)sind die wichtigsten repolarisierenden Ströme bei Menschen und Kaninchen4,9,13,17. Wichtig ist, dass die Expression von IKr und IKs bei Nagetieren fehlt / minimal ist und aufgrund der zeitlichen Aktivierungskinetik von IKr und I Ks keine Rolle in der Morphologie des Herzaktionspotentialsspielt 9, 13. Somit bieten Kaninchen ein translationaleres Modell zur Beurteilung der Mechanismen für medikamenteninduzierte, erworbene und vererbte EKG-Anomalien und Arrhythmien4,7,13. Da zahlreiche Studien das Vorhandensein von neuronalen und kardialen elektrischen Anomalien bei primären kardialen (Long QT-Syndrom18,19,20) oder neuronalen Erkrankungen (Epilepsie21,22,23,24) gezeigt haben, ist eswichtig,die zugrunde liegenden Mechanismen in einem Tiermodell zu untersuchen, das die menschliche Physiologie genau reproduziert. Während Nagetiere ausreichen können, um das menschliche Gehirn zu modellieren, sind Nagetiere kein ideales Modell der menschlichen Herzphysiologie7.

Die Elektroenzephalographie (EEG) verwendet Elektroden, die normalerweise auf der Kopfhaut oder intrakraniell platziert werden, um die kortikale elektrische Funktion aufzuzeichnen. Diese Elektroden können Veränderungen der Feuerrate und Synchronizität von Gruppen nahegelegener pyramidaler Neuronen in der Großhirnrindeerkennen 25. Diese Informationen können verwendet werden, um die Gehirnfunktion und den Wach- / Schlafzustand zu beurteilen. EEGs sind auch nützlich, um die epileptiforme Aktivität zu lokalisieren und epileptische Anfälle von nicht-epileptischen Ereignissen (z. B. psychogene nicht-epileptiforme Aktivität und kardiogene Ereignisse) zu unterscheiden. Um den Epilepsietyp, provozierende Faktoren und den Ursprung des Anfalls zu diagnostizieren, werden Epilepsiepatienten verschiedenen Manövern unterzogen, die zu einem Anfall führen können. Verschiedene Methoden umfassen Hyperventilation, photische Stimulation und Schlafentzug. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von photischer Stimulation zur Induktion von EEG-Aberrationen und Anfällen bei Kaninchen26,27,28,29.

Simultane Video-EEG-EKG-Aufzeichnungen wurden bei Menschen und Nagetieren ausgiebig verwendet, um die Verhaltens-, neuronale und kardiale Aktivität während der prä-italen, iktalen und post-italen Zustände zu beurteilen30. Während mehrere Studien EEG- und EKG-Aufzeichnungen getrennt bei Kaninchen4,31,32,33durchgeführthaben,ist ein System zur Erfassung und Analyse simultaner Video-EEG-EKG beim bewussten zurückgehaltenen Kaninchen nicht gut etabliert34. Dieser Artikel beschreibt das Design und die Implementierung eines Protokolls, das simultane Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetriedaten bei bewussten Kaninchen aufzeichnen kann, um die neuro-kardiale elektrische und respiratorische Funktion zu beurteilen. Die ergebnisse dieser Methode können die Anfälligkeit, Auslöser, Dynamik und Konkordanz zwischen Arrhythmien, Krampfanfällen, Atemstörungen und körperlichen Manifestationen anzeigen. Ein Vorteil unseres experimentellen Systems ist, dass wir bewusste Aufnahmen ohne Beruhigungsmittel erwerben. Die Kaninchen bleiben ≥5 h in den Rückhaltemitteln, mit minimaler Bewegung. Da Anästhetika die neuronale, kardiale, respiratorische und autonome Funktion stört, liefern Aufzeichnungen während des Bewusstseinszustands die physiologischsten Daten.

Dieses Aufzeichnungssystem kann letztendlich detaillierte Einblicke liefern, um das Verständnis der neurologischen, kardialen und respiratorischen Mechanismen für den plötzlichen unerwarteten Tod bei Epilepsie (SUDEP) zu verbessern. Zusätzlich zur neurologischen und kardialen Überwachung haben jüngste Erkenntnisse auch die Rolle von Atemversagen als potenziellen Beitrag zum plötzlichen Tod nach einem Anfall unterstützt35,36. Um den Atemstatus der Kaninchen zu überwachen, wurden Oximetrie und Kapnographie implementiert, um den Status des Atmungssystems vor, während und nach einem Anfall zu bewerten. Das hier vorgestellte Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, die Schwelle für pharmakologisch und photisch-stimulierende Kaninchenanfälle zu bewerten. Dieses Protokoll kann subtile EEG- und EKG-Anomalien erkennen, die möglicherweise nicht zu körperlichen Manifestationen führen. Darüber hinaus kann diese Methode für die kardiale Sicherheit und die antiarrhythmische Wirksamkeitsprüfung neuartiger Medikamente und Geräte eingesetzt werden.

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Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Upstate Medical University durchgeführt. Darüber hinaus finden Sie in Abbildung 1eine Übersicht über dieses Protokoll.

1. Vorbereitung des Kontrollgeräts

  1. Schließen Sie den Computer an einen Verstärker mit einem 64-poligen Kopfkasten an.
    HINWEIS: Jedes Tier hat vier gerade subdermale Kopfhautstiftelektroden (7 oder 13 mm) für EEGs aus den 4 Quadranten des Kopfes, 3 gebogene subdermale Bruststiftelektroden (13 mm, 35° Winkel) für EKG (Einthovens Dreieck), 1 gebogene subdermale Stifter-Bodenelektrode am rechten Bein und 1 gerade subdermale Kopfhautstiftelektrode in der Mitte des Kopfes dient als Referenz.
  2. Um jeden8. Pin am Ausgang zu einer Referenz zu machen, aktualisieren Sie die Einstellungen der Erfassungssoftware, Registerkarte Erfassung, so dass die Referenzelektrode "Unabhängig" ist (dh Forschungsmodus).
    HINWEIS: Dies ermöglicht Aufnahmen von bis zu 7 Tieren gleichzeitig, jeweils mit 7 Elektroden plus einer dedizierten Referenzelektrode und einer Masseelektrode, alles über einen Verstärker, Digitizer und Computer. Alle Elektroden werden als unipolare Kanäle erfasst und mit der Referenz (Kopfzentrum) verglichen. Zusätzliche bipolare und erweiterte Lead-Konfigurationen/Montagen können während oder nach der Aufnahme eingerichtet werden. Da das Setup in der Lage ist, von mehreren Tieren gleichzeitig aufzunehmen, wird eine Masseelektrode von jedem Tier parallel zum Masseeingang des Verstärkers angeschlossen (Abbildung 2).
  3. Entfernen Sie Kaninchen aus ihrem Käfig und wiegen Sie sie, um die geeignete Medikamentendosis für jedes Tier zu berechnen. Legen Sie die Kaninchen in einen Transportträger und bringen Sie sie in einen separaten Raum, um den Stress für Nichtversuchstiere zu minimieren. In dieser Studie wurden männliche und weibliche neuseeländische weiße Kaninchen und ihre nachfolgenden Nachkommen verwendet. Experimente wurden an Kaninchen durchgeführt, die > 1 Monat alt waren. Zum Zeitpunkt des Experiments wogen diese Kaninchen zwischen 0,47 und 5,00 kg.
    HINWEIS: Da sich die Kaninchen im selben Raum und im Blick auf die Kamera befinden müssen, isolieren Sie die Kaninchen nicht vollständig. Es besteht das Potenzial für visuelle und auditive Manifestationen von einem Kaninchen, das ein anderes Kaninchen stresst. Daher ist es ideal, ein Kaninchen gleichzeitig im Raum zu haben, was für die photischen Stimulationsexperimente getan wird. Bei allen anderen Experimenten werden die Kaninchen so weit wie möglich verteilt, während sie alle in Sichtweite der Videokamera bleiben. Idealerweise werden Barrieren verwendet oder nur ein Tier gleichzeitig untersucht. Dies war kein großer Störfaktoren, da dieHerzfrequenz der Kaninchen während der Experimente ziemlich stabil blieb und häufig Schlafspindeln vorhanden waren. Aufzeichnungen von mehreren Tieren gleichzeitig stellen sicher, dass sowohl Kontroll- als auch Versuchsdaten unter den gleichen Umgebungsbedingungen erfasst werden.

2. Implantation von EEG-EKG-Elektroden und Anbringung von Atemschutzmasken

  1. Entfernen Sie ein Kaninchen aus dem Transportträger und legen Sie es in den Schoß eines sitzend sitzenden Ermittlers.
  2. Halten Sie das Kaninchen vertikal und halten Sie es nahe am KörperdesErmittlers.
  3. Senken Sie das Kaninchen in Rückenlage, wobei der KopfdesKaninchens auf den KniendesErmittlers und der KopfdesKaninchens niedriger ist als der Rest seines Körpers.
    HINWEIS: Dieses Manöver entspannt das Tier und minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass es versucht, sich zu bewegen oder zu entkommen, während es die Elektroden platziert.
  4. Jetzt, da das Kaninchen in Rückenlage gesichert ist, bitten Sie einen zweiten Ermittler, das Fell zu verteilen, bis die Haut identifiziert und aus dem darunter liegenden Gewebe isoliert werden kann.
  5. Setzen Sie35° gebogene Elektroden subdermal in jede Achselhöhle ein (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Die Elektroden sollten so durchgedrückt werden, dass sie sicher in die Haut eingehakt sind, aber nicht in tiefere Strukturen eindringen. Wenn die Elektrode in die Haut ein- und ausgeht (durch und durch), verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Leitungen beim Einlegen des Kaninchens in den Rückhaltearm oder wenn es sich während des Experiments bewegt (Abbildung 3B). Alle Elektroden werden vor der Platzierung mit 70% Ethanol sterilizaiert.
  6. Legen Sie die Leitungen auf der Brust nach vorne zu den rechten und linken Vordergliedmaßen und auf dem Bauch vor der linken Hintergliedmaße. Legen Sie eine massereiche Stiftelektrode anterior an der rechten Hintergliedmaße auf den Bauch (Abbildung 4A).
  7. Sobald alle EKG-Leitungen richtig platziert sind, bringen Sie das Kaninchen in eine Bauchlage zurück, wobei die Leitungen eine Seite des Kaninchenbauchs hinauflaufen, und übertragen Sie das Kaninchen in einen entsprechend großen Rückhaltebereich (z. B. 6 "x 18" x 6").  Wenn Sie das Kaninchen in den Rückhalteer legen, ziehen Sie den losen Draht nach oben, um zu minimieren, dass das Kaninchen die Elektroden mit seinen Beinen herauszieht. Kleben Sie die Drähte an die Seite des Rückhaltebandes, damit sie sich während des Experiments nicht unter dem Kaninchen verfangen (Abbildung 4B).
  8. Befestigen Sie das Kaninchen im Rückhaltesystem, indem Sie die Rückhalteeinrichtung um den Hals senken und an Ort und Stelle verriegeln. Bewegen Sie zusätzlich die Hinterbeine unter dem Tier nach oben und sichern Sie die hintere Zurückhaltung.
    HINWEIS: Man sollte in der Lage sein, 1-2 Finger in den Raum unter dem Hals zu passen, um sicherzustellen, dass es nicht zu eng ist. Insbesondere bei Experimenten, bei denen es zu motorischen Bewegungen kommt, ist es wichtig, die Rückhalteeinrichtung zu straffen, um Bewegungen, mögliche Wirbelsäulenverletzungen, Gliedmaßenluxationen und die Fähigkeit, die hintere Zurückhaltung herauszutreten, zu minimieren (Abbildung 4B). Kaninchen wurden für ~ 5 h im Rückhalteer gehalten, ohne Probleme im Zusammenhang mit erhöhter Bewegung oder Anzeichen von Dehydrierung.
    1. Bei kleinen Kaninchen (z. B. weniger als 2 Monate) legen Sie ein Gummi-Booster-Pad unter das Tier, um das Kaninchen aufzuziehen, wodurch verhindert wird, dass das Kaninchen seinen Hals auf der Unterseite der Kopfstütze absticht (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Ein plötzlicher Abfall der Atem- und Herzfrequenz kann sekundär zum Nackenimperement sein. Wenn dies auftritt, lösen Sie den Nackenfessel und heben Sie den KopfdesKaninchens an, um eine Nackenkompression zu lindern.
    2. Wenn die hintere Rückhalteeinrichtung den Rücken / die Wirbelsäule des Kaninchens nicht genau verfolgt, legen Sie einen PVC-Abstandhalter an, um jede Bewegung zu verhindern, die Wirbelsäulenverletzungen verursachen könnte.
      HINWEIS: Zum Beispiel kann ~ 14 cm langes x 4 "Innendurchmesser PVC-Rohr, mit dem unteren 25-33% entfernt, mit Schaum über das Kaninchen gelegt werden, um eine angemessene Zurückhaltung zu bieten (Abbildung 4C).
  9. Nachdem das Kaninchen nun sicher in den Rückhalteer eingesetzt ist, führen Sie die 7-13 mm subdermalen geraden Stiftelektroden in die Kopfhaut ein (Abbildung 3A). Führen Sie die Drähte mit einem Eintrittswinkel von 45° zwischen den Ohren nach oben und binden Sie die Drähte lose an den Rückhaltegurt hinter dem Kopf, um die Bleiplatzierung aufrechtzuerhalten. Platz 5 EEG führt in folgenden Positionen: rechts anterior, links anterior, rechts occipital, links occipital und eine zentrale Referenz (Cz) führen an der Stelle zwischen den anderen 4 Leitungen (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Elektroden werden richtig platziert, wenn sie im Unterhautgewebe gegen den Schädel positioniert werden. Diese Platzierung minimiert Artefakte aus Nase, Ohren und anderen umgebenden Muskeln. Einige Artefakte aus rhythmischen Nasenbewegungen sind unvermeidlich. Die vorderen EEG-Leitungen sollten medial zu den AugendesKaninchens platziert werden und nach vorne zeigen. Die Okzipitalleitungen sollten vor den Ohren platziert werden und zeigen in die mediale Richtung. Cz wird in der Mitte der Oberseite des Kopfes an einem Punkt platziert, der sich zwischen allen 4 Elektroden befindet (auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma, entlang der Nahtlinie). Der Stift der Cz-Elektrode zeigt nach vorne.
    1. Führen Sie die EEG-Drähte zwischen den Ohren nach oben, um zu vermeiden, dass das Kaninchen versucht, die Drähte zu beißen.
  10. Befestigen Sie den Pulsoximeter-Plethysmographen über der Randohrvene des Kaninchens am Ohr.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, überschüssiges Haar vom Ohr zu rasieren, um das Signal zu verbessern, oder etwas Gaze zu verwenden, um den Sensor an Ort und Stelle zu halten.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz auf der Plethysmographie mit der Herzfrequenz aus dem EKG korreliert und dass die Sauerstoffsättigung angezeigt wird (Abbildung 5C).
  11. Legen Sie die Gesichtsmaske vorsichtig mit Kapnographieschlauch über Mund und Nase des Kaninchens (Abbildung 4H). Befestigen Sie die Gesichtsmaske mit einer Schnur, die um die Maske gewickelt ist, und befestigen Sie beide Enden der Schnur am Rückhaltericht. Befestigen Sie das andere Ende des Kapnographieschlauchs am Vitalparametermonitor.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu verhindern, dass die Schnur während des Experiments über die Augen des Kaninchens legt. Kleben Sie dazu die Schnur in die Mitte des Rückhaltemittels zwischen den Ohren des Kaninchens. Um das Kapnographiesignal zu verbessern, erstellen Sie ein Einwegventil mit Klebeband und einem dünnen Stück Nitril, das Sauerstoff in das T-Stück eindringen lässt und ausgeatmetes CO2 in den Kapnographieschlauch leitet (Abbildung 4I).

3. Aufzeichnung des Video-EEG-EKGs

  1. Führen Sie Video-EEG-EKG-Aufzeichnungen mit einer handelsüblichen EEG-Software durch.
    HINWEIS: Die biopotentialen Leitungen und das Video sind zeitlich gesperrt, um später die elektrischen und Videosignale zu korrelieren (z. B. EEG-Spitze mit einem myoklonischen Ruck).
  2. Bestätigen Sie die optimale Konnektivität ohne Baseline-Drift, ohne elektrisches Rauschen von 60 Hz und mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Stellen Sie insbesondere sicher, dass jede Phase der Herzwellenform im EKG visualisiert werden kann und dass die Delta-, Theta- und Alphawellen nicht visuell durch hochfrequentes Rauschen am EEG verdeckt werden.
    1. Wenn alle Elektroden übermäßige Rauschmengen erzeugen, stellen Sie die zentrale Referenzleitung ein. Wenn nur eine Elektrode übermäßig laut ist, drücken Sie diese Elektrode tiefer in die Haut oder positionieren Sie sie neu, bis kein Metall mehr freiliegt.
  3. Passen Sie das Video so an, dass alle Kaninchen gleichzeitig gesehen werden können, was die Korrelation der motorischen Aktivität mit EEG-Befunden ermöglicht (Abbildung 5A).
    HINWEIS: Das System unterstützt gleichzeitige EEG/EKG/Oximetrie-/Kapnographieaufnahmen von bis zu 7 Kaninchen.
  4. Starten Sie die Baseline-Aufnahme von jedem Tier für mindestens 10-20 minuten oder bis sich die Herzfrequenz in einen ruhigen, entspannten Zustand (200-250 bpm) stabilisiert und die Kaninchen mindestens 5 min lang keine großen Bewegungen zeigen. Erfassen Sie elektrographische Daten mit voller Bandbreite ohne Filter. Um Die Daten besser sichtbar zu machen, setzen Sie den Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) bei 1 Hz und den Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) bei 59 Hz ein.
    HINWEIS: Ein weiteres Zeichen dafür, dass das Kaninchen entspannt ist, ist das Einsetzen von EEG-Schlafspindeln (später besprochen).
  5. Fügen Sie während des Experiments in Echtzeit zeitgebundene Notizen hinzu, um den Zeitpunkt von Interventionen (z. B. Medikamentenabgabe) und neuroherzialen Ereignissen (z. B. EEG-Spitze, motorische Anfälle, ektopischer Beat und Arrhythmien) sowie motorische / Forscherartefakte anzuzeigen.
    HINWEIS: Aufgrund der Häufigkeit, mit der der Prüfer eine Intervention durchführen muss (z. B. photische Stimulation, Medikamentenabgabe), um den Stress eines Prüfers zu minimieren, der den Raum betritt und verlässt und die Tür öffnet / schließt, bleibt der Prüfer während des gesamten Experiments auf der gegenüberliegenden Seite des Raumes. Der Ermittler sitzt so weit wie möglich vom Tier entfernt und bleibt still und ruhig, um eine mögliche Störung der Tiere zu minimieren.

4. Experimentelle Protokolle

HINWEIS: Jedes der folgenden Experimente wird an verschiedenen Tagen durchgeführt, wenn sie an demselben Tier durchgeführt werden. Es gibt eine 2-wöchige Verzögerung zwischen den oralen Tests compound Drug Studien und der akuten terminalen Pro-Convulsant-Medikamentenstudie. Bei Bedarf wird das photische Stimulationsexperiment durchgeführt, gefolgt von einer 30-minütigen Wartezeit und dann der PTZ-Medikamentenstudie.

  1. Damit sich die Kaninchen in den Rückhaltemitteln akklimatisieren können und der Prüfer die Stabilisierung der kardiorespiratorischen Raten objektiv bestätigen kann, instrumentieren Sie alle Kaninchen mit den kardiorespiratorischen und neuronalen Sensoren und führen Sie eine kontinuierliche Videoüberwachung für > 1 Stunde, 1 - 3 Mal pro Tier durch.
  2. Photisches Stimulationsexperiment
    1. Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Verfahren eine Lichtquelle mit einem kreisförmigen Reflektor 30 cm vor dem Kaninchen auf Augenhöhe platzieren, wobei die Blitzintensität auf das Maximum (16 Candela)29eingestellt ist. Die Lichtquelle wird in Abbildung 4Edurch einen weißen Punkt angezeigt.
      HINWEIS: Ein schwach beleuchteter Raum sollte verwendet werden, um die lichtempfindliche Reaktionhervorzurufen 37.
    2. Da sich die AugendesKaninchens auf der Seite des Kopfes und nicht auf der Vorderseite seines Kopfes befinden (wie beim Menschen), platzieren Sie 2 Spiegel auf beiden Seiten des Kaninchens und 1 hinter dem Kaninchen, damit das Licht in die AugendesKaninchens eindringt.
      HINWEIS: Ein flacher Spiegel, der ≥ 20 cm hoch ist, von ≥ 120 cm lang, bildet ein dreieckiges Gehege um das Kaninchen, um sicherzustellen, dass das blinkende Licht in die AugendesKaninchens eindringt, wie in Abbildung 4Ezu sehen.
    3. Schließen Sie die Lichtquelle an einen Controller an, der über eine einstellbare Rate, Intensität und Dauer verfügt.
    4. Nehmen Sie Videos mit einer Kamera mit Rotlicht- und Infrarotaufzeichnungsfunktionen auf.
    5. Setzen Sie die Kaninchen 30 s lang mit offenen Augen jeder Frequenz aus und dann weitere 30 s mit einer chirurgischen Maske, die ihr Gesicht bedeckt, um bei jeder Frequenz einen Augenverschluss zu simulieren oder zu verursachen.
      HINWEIS: Frühere Studien haben gezeigt, dass der Augenverschluss das provokativste Manöver ist, um Lichtempfindlichkeit gegen Anfälle hervorzulocken29. Darüber hinaus zeigen 10% der lichtempfindlichen Patienten nur elektroenzephalographische Anzeichen, während ihre Augen geschlossen sind29. Ein Anfall kann klinisch identifiziert werden, indem das Vorhandensein von myoklonischen Kopf- und Ganzkörperruckeln, Klonus oder einem tonischen Zustand beobachtet wird. Die EEG-Aufzeichnung wird gründlicher auf elektroenzephalographische Korrelation (z. B. Spikes, Poly-Spikes und rhythmische Entladungen) mit motorischen Manifestationen analysiert, um eine definitive Diagnose der Anfallsaktivität zu erhalten. Bewegungen, bei denen das EEG durch Muskelartefakte oder Wellen unbestimmter Epileptogenität verdeckt wird, sollten von einem Epileptologen zur Bestätigung überprüft werden.
    6. Erhöhen Sie die photische Stimulatorfrequenz von 1 Hz auf 25 Hz in 2 Hz-Schritten. Führen Sie dann das gleiche Photostimulationsprotokoll durch, aber dieses Mal verringern Sie die Frequenz von 60 Hz auf 25 Hz in 5-Hz-Schritten.
      HINWEIS: Wenn ein Kaninchen einen Anfall hat, sollte das Experiment abgebrochen werden. Überwachen Sie das Kaninchen weiterhin für 30 Minuten. Dann bringen Sie das Kaninchen in das Haltungszimmer zurück und überwachen Sie alle 1 h für 3 h für die vollständige Genesung. Wenn die photische Stimulation jedoch eine photoparoxysmale Reaktion induziert, werden die restlichen aufsteigenden Frequenzen übersprungen und die Serie wird erneut gestartet, indem von 60 Hz abgestiegen wird, bis eine andere photoparoxysmale Reaktion auftritt. Dies ermöglicht die Bestimmung der oberen und unteren photischen Stimulationsschwellen. Es ist keine Verzögerung erforderlich, da die photoparoxysmale Reaktion nach Absetzen der photischen Stimulation aufhört. Wenn unklar ist, ob eine photoparoxysmale Reaktion aufgetreten ist, wird die Frequenz nach einer Verzögerung von 10 s wiederholt38.
    7. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie EEG- und EKG-Leitungen vom Kaninchen und bringen Sie es zur routinemäßigen Pflege durch das Haltungspersonal in seinen Heimkäfig zurück.
  3. Orale Verabreichung von Medikamenten
    1. Da viele Medikamente oral eingenommen werden, bereiten Sie orale Verbindungen vor, indem Sie mit apfelmus in Lebensmittelqualität mischen. Mischen Sie 0,3 mg/kg E-4031 in 3 ml Apfelmus und laden Sie sie ohne Nadel in eine 3 ml Mund-/Bewässerungsspritze.
      HINWEIS: Mehrere Medikamente können auf diese Weise verabreicht werden, darunter Testverbindungen, Medikamente, von denen bekannt ist, dass sie die QT-Dauer verändern (Moxifloxacin oder E-4031) und eine Negativkontrolle oder ein Negativvehikel. Einige Medikamente sind nicht in einer intravenösen Formulierung erhältlich. Darüber hinaus werden viele Medikamente in einer oralen Formulierung verschrieben und daher kann eine intravenöse Verabreichung eine geringere klinische Relevanz haben.
    2. Heben Sie die Oberlippen an und schieben Sie dieSpitze der Spritze zum Einnehmen in die Seite des Kaninchenmauls, die von denZähnendes Kaninchens ungehindert wird, und injizieren Sie alle Medikamente und Apfelmus in den MunddesKaninchens.
    3. Setzen Sie die Video-EEG-EKG-Aufzeichnung für 2 h fort und bringen Sie das Tier dann zur routinen Pflege in seinen Heimkäfig zurück.
    4. Verbinden Sie das Kaninchen am experimentellen Tag 2 und 3 mit dem Video-EEG-EKG, zeichnen Sie 10-20 Minuten des Ausgangswerts auf, injizieren Sie dann das gleiche Medikament und zeichnen Sie für 2 h auf.
    5. Führen Sie nach 1 Woche Auswaschung 10-20 Minuten des Ausgangswerts durch und geben Sie dann jedem Kaninchen eine Einzeldosis Placebo für 3 aufeinanderfolgende Tage und zeichnen Sie für 2 Stunden auf.
      HINWEIS: Die Verabreichung von oralen Medikamenten kann als Crossover-Studie konzipiert werden, in der das Placebo in Woche 1 und das Medikament in Woche 2 verabreicht wird.
  4. Intravenöses Medikationsexperiment (Pentylenetetrazol, PTZ)
    1. Um die marginale Ohrvene zu visualisieren, rasieren Sie die hintere Oberfläche desKaninchenohrs. Verwenden Sie ein 70% ige Ethanoltuch, um die Stelle zu desinfizieren und die marginale Ohrvene zu erweitern. Dies wird durch das schwarz gestrichelte Oval in Abbildung 4Fangezeigt.
    2. Lassen Sie an dieser Stelle einen Experimentator das GesichtdesKaninchens mit der Hand bedecken, um den Stress des Verfahrens für das Kaninchen zu verringern. Ein zweiter Experimentator kanuliert vorsichtig die marginale Ohrvene mit einem sterilen 25-G-Angiokatheter.
    3. Sobald sich der Katheter in der Vene befindet, legen Sie einen sterilen Injektionsstopfen an das Ende des Katheters, damit eine Nadel Medikamente intravenös einführen kann. Die Position des Injektionssteckers wird durch einen blauen Kreis in Abbildung 4Gangezeigt.
    4. Machen Sie eine Schiene, indem Sie 4 x 4 Zoll Gaze mit Klebeband umwickeln, so dass sie eine Röhrenform bildet und sie in das OhrdesKaninchens legt. Dann kleben Sie die Schiene an das Ohr, so dass der Katheter an Ort und Stelle gesichert ist und aufrecht bleibt, ähnlich wie beim nicht katheterisierten Ohr.
    5. Injizieren Sie 1 ml 10 USP-Einheiten pro ml heparinisierte Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Der Katheter und das Gefäß sollten sichtbar von Luft befreit werden und patentiert bleiben. Wenn sich der Katheter nicht im Gefäß befindet, drückt die Spritze nicht leicht und es kommt zu einer Ansammlung von Kochsalzlösung im Unterhautgewebe.
    6. Geben Sie Kaninchen inkrementelle Dosen von PTZ intravenös von 1 mg/kg bis 10 mg/kg in Schritten von 1 mg/kg alle 10 Minuten. Notieren Sie sich zu Beginn jeder Dosis, um anzugeben, welches Tier injiziert wird und die Konzentration des Medikaments.
      HINWEIS: Dies ermöglicht die Beurteilung der akuten und additiven Wirkungen der PTZ-Verabreichung. Alternativ, um die chronischen Wirkungen von niedrig dosierter PTZ weiter zu beurteilen, erhält das Kaninchen wiederholte Dosen bei jeder niedrigen Dosiskonzentration, 7 Dosen bei 2 mg/ kg, 3 Dosen bei 5 mg / kg, dann 3 Dosen bei 10 mg / kg, jede Dosis wird durch 10 min getrennt.
    7. Überwachen Sie nach jeder Dosis sorgfältig die Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetrie auf neuroherziale elektrische und respiratorische Anomalien und visuelle Hinweise auf epileptiforme Aktivität. Notieren Sie sich diese Änderungen in Echtzeit und während der Nachanalyse.
      HINWEIS: Die Anfallsaktivität beginnt oft innerhalb von 60 Jahren nach der Verabreichung von PTZ.

5. Abschluss von Nicht-Überlebensexperimenten.

  1. Wenn das Kaninchen im Laufe des PTZ-Experiments keinen plötzlichen Tod hatte, verabreichen Sie 1 ml 390 mg / ml Natriumpentobarbital pro 4,54 kg Körpergewicht (oder 1,5 ml für alle Kaninchen), gefolgt von einer 1 ml Spülung normaler Kochsalzlösung. Überwachen Sie das EKG, um sicherzustellen, dass das Kaninchen einen Herzstillstand erfährt.
  2. Sobald das Kaninchen einen Herzstillstand erfährt, führen Sie schnell eine Nekropsie durch, um verschiedene Organe frisch zu isolieren, einschließlich Herz, Lunge, Leber, Gehirn, Skelettmuskulatur und anderes Gewebe, das für nachfolgende molekulare / biochemische Analysen erforderlich ist.
  3. Entsorgen Sie das Kaninchen gemäß den institutionellen Richtlinien.

6. Analyse des EKG

  1. Verwenden Sie handelsübliche EKG-Analysesoftware, um das EKG visuell zu untersuchen und Perioden von Tachykardie, Bradykardie, ektopischen Schlägen und anderen Arrhythmien zu identifizieren (Abbildung 6). Um die zu überprüfende Datenmenge zu reduzieren, erstellen Sie ein Tachogramm, das die Leichtigkeit erhöht, mit der Perioden von Tachykardie, Bradykardie oder Unregelmäßigkeiten des RR-Intervalls identifiziert werden können.
    HINWEIS: EKG-Anomalien (z. B.QT-c-Verlängerung) und Arrhythmien werden manuell identifiziert, indem das EKG auf Anomalien in der Rate (z. B. Brady-/Tachy-Arrhythmien), Rhythmus (z. B. vorzeitige vorgezogene / ventrikuläre Komplexe), Leitung (z. B. atrio-ventrikulärer Block) und Wellenform (z. B. nicht-sinus-atrielle / ventrikuläre Tachykardie und Fibrillation) überprüft wird. Arrhythmien können erkannt werden, indem das Tachogramm auf Unregelmäßigkeiten im RR-Intervall überprüft wird. Tachykardie kann durch Abschnitte des Tachogramms identifiziert werden, in denen die Herzfrequenz über 300 Schlägen pro Minute liegt. Bradykardie wird identifiziert, wenn die Herzfrequenz weniger als 120 Schläge pro Minute auf dem Tachogramm beträgt.
  2. Führen Sie mit handelsüblich erhältlicher EKG-Analysesoftware Standard-EKG-Messungen (Herzfrequenz, Herzzyklusintervalle) zu Studienbeginn und bei Provokation durch (z. B. Manipulation des Tieres durch den Prüfer, Verabreichung von Testmitteln und anfallsinduzierte EKG-Veränderungen).

7. Analyse des Video-EEG

  1. Visueller Bildlauf durch das Video und die EEG-Ablaufverfolgung mit handelsüblich erhältlicher Software, um das Basissignal (Abbildung 7) und das Vorhandensein erwarteter EEG-Entladungen wie Schlafspindeln (Abbildung 8) und Scheitelpunktwellen (Abbildung 9) zu identifizieren.
    HINWEIS: Obwohl elektrographische Daten mit voller Bandbreite ohne Filter erfasst werden, sollten die Daten mit dem Niederfrequenzfilter (d. h. Hochpassfilter) auf 1 Hz eingestellt werden, und basierend auf dem SatzvonNyquist wird der Hochfrequenzfilter (dh Tiefpassfilter) auf 120 Hz eingestellt, um zu vermeiden, dass ein Signal fehlt. Die Filter können angepasst werden, um eine bessere Visualisierung und Rauschunterdrückung (z. B. 1-59 Hz) bei der Überprüfung der EEG-Aktivität mit niedrigerer Frequenz (<25 Hz) zu ermöglichen.
  2. Zusätzlich zu Kapnographie-Wellenformen, verwenden Sie Nasenbewegungsartefakt auf dem EEG, um das Vorhandensein und Fehlen von Atmung zu bestimmen. Dies kann auch mit Nasenbewegungen korreliert werden, die auf der Videoaufnahme zu sehen sind.
  3. Visuelles Scrollen Sie mit handelsüblicher Software durch das Video und die EEG-Verfolgung, um epileptische und nicht-epileptische (z. B. bewusste) Bewegungen für mindestens 1 Minute nach jeder PTZ-Dosis zu unterscheiden (Abbildung 10). Scannen Sie nach interiktalen epileptischen Entladungen und nach EEG-Veränderungen vor, während und nach Anfällen. Ein Anfall kann klinisch identifiziert werden, indem das Vorhandensein von myoklonischen Reflexen des Kopfes und des ganzen Körpers, Clonus oder einem tonischen Zustand mit einem EEG beobachtet wird. Die EEG-Änderungen können EEG-Spikes, Poly-Spikes und rhythmische Entladungen umfassen.
    HINWEIS: Bewegungen, bei denen das EEG durch Muskelartefakte oder Wellen unbestimmter Epileptogenität verdeckt wird, sollten von einem Neurologen zur Bestätigung überprüft werden. Es kann vorteilhaft sein, das Video auf ein Kaninchen zu fokussieren, um sein Verhalten sowie seine EEG- und EKG-Aufzeichnungen genauer zu betrachten (Abbildung 5B).
  4. Bewerten Sie das Video-EEG für Anfälle basierend auf der Art und Schwere der motorischen Manifestationen, die typischerweise innerhalb von 1 Minute nach der PTZ-Injektion auftreten (Tabelle 1).
  5. Analysieren Sie nach einem photischen Stimulationsexperiment die okzipitalen Leitungen des EEG auf das Vorhandensein und Fehlen des okzipitalen Antriebsrhythmus, indem Sie ein Spektralanalysediagramm in kommerziell erhältlicher EEG-Analysesoftware erstellen. Der okzipitale Fahrrhythmus erzeugt einen Peak in der Spektralanalyse, der der Frequenz des photischen Stimulators entspricht (Abbildung 11).
    HINWEIS: Die photische Stimulation kann zusätzlich zum Höhepunkt der Grundfrequenz harmonische Frequenzspitzen erzeugen.

7. Analyse der Atmungsfunktion

  1. Überprüfen Sie die Ausgabe des Vitalparametermonitors (Abbildung 4I) und exportieren Sie das Signal zur weiteren Analyse.
  2. Beachten Sie die Veränderung des Atemmusters während eines Anfalls und nach einem Anfall, insbesondere den Zeitpunkt, zu dem die Apnoe beginnt.

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Representative Results

Die oben beschriebene Methode ist in der Lage, Anomalien im elektrischen Leitungssystem des Gehirns und des Herzens sowie Atemstörungen zu erkennen. Eine Datenerfassungssoftware wird verwendet, um die EKG-Morphologie zu beurteilen und abnormale Herzfrequenzen, Leitungsstörungen oder EKG-Rhythmen (vorhofe / ventrikuläre ektopische Schläge und Brady- / Tachy-Arrhythmien) zu erkennen (Abbildung 6). Zusätzlich zur Visualisierung der EKG-Morphologie werden die Spuren analysiert, um das RR-Intervall, die Herzfrequenz, das PR-Intervall, die P-Dauer, das QRS-Intervall, das QT-Intervall, das QTc-, das JT-Intervall und dasT-Peak-to-T-End-Intervall zu quantifizieren. Die Analyse dieser Daten zeigt, dass Tachy-/Brady-Arrhythmien leicht erkannt werden können.

Neben der Analyse von EKG-Daten werden auch EEG-Daten analysiert. Das Basis-EEG wurde gesammelt und mittels Spektralanalyse analysiert (Abbildung 7). Diese Daten zeigen, dass die okzipitalen Leitungen eine höhere Amplitude haben als die frontalen Leitungen und dass die dominante Frequenz in allen Leitungen im Deltabereich liegt. Die Möglichkeit, EEGs von Kaninchen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis aufzuzeichnen, ist wichtig, um epileptiforme Entladungen zu erkennen und weitere Analysen an der Aufzeichnung durchzuführen. Wellen, die eine ähnliche Morphologie und Frequenz wie menschliche Schlafspindeln aufweisen, sind in Abbildung 8 dargestellt. Scheitelpunktwellen, die von der Mitte des Kopfes stammen, sind in Abbildung 9 dargestellt. Neben normalen EEG-Veränderungen werden auch verschiedene bewusste nicht-epileptische Kaninchenbewegungen während der Baseline-Aufnahmen notiert, um sie von epileptiformen Entladungen zu unterscheiden (Abbildung 10). Video-EEG-Aufzeichnungen der gezeigten Bewegungen sowie anderer sind in Supplemental Movie 1-11 verfügbar.

Mehrere Methoden wurden implementiert, um Anfälle zu induzieren. Die erste Methode verwendete photische Stimulation bei 1-60 Hz mit offenen und geschlossenen Augen (Abbildung 4E). Da die Position der Augen auf dem Kaninchen eher seitlich als anterior wie beim Menschen ist, werden Spiegel verwendet, um Das Licht mit einer einzigen Lichtquelle in die Augen des Kaninchens zu leiten. Die Analyse des EEG aus dem photischen Stimulationsexperiment bei 3 Hz zeigt eine starke okzipitale Antriebsreaktion bei der erwarteten 3 Hz-Frequenz (Abbildung 11). Zusätzlich zur photischen Stimulation wird Kaninchen Pentylenetetrazol (PTZ, GABA A-Blocker) über einen Katheter in der linken Randohrvene injiziert (Abbildung 4G). Die Injektion von PTZ verursacht innerhalb von 1 Minute einen unterschiedlichen Grad an Anfallsaktivität und ist mit unterschiedlichen EEG-Wellenformen verbunden. Einige repräsentative Wellenformen, zu denen Theta-Bursts, Theta-Bursts mit großer Amplitude, Polyspike-Wellen, Niederspannungs-Polyspike-Wellen, rhythmische Gamma-Bursts und elektrozerebrale Stille (ECS)gehören, sind in Abbildung 12, Abbildung 13, Abbildung 14, Abbildung 15, Abbildung 16, Abbildung 17dargestellt.

Um einen Anfall zu identifizieren, werden mehrere Kriterien verwendet. Das Video wird überprüft, um mögliche anfallsmotorische Manifestationen zu identifizieren. Um dann zu bestätigen, dass die motorische Aktivität das Ergebnis epileptischer Aktivität war, wird das EEG-Signal auf eine zeitlich korrelierte EEG-Spitze, Polyspike, scharfe Welle oder rhythmische Entladung untersucht. Im Zweifelsfall wird das Video-EEG von einem zweiten Prüfarzt und/oder einem Epileptologen zur Verifizierung überprüft. Anfallsbeginn ist definiert als die erste Instanz von rhythmischen EEG-Entladungen (EEG-Anfallsstart) und motorischer Aktivität (klinischer Anfallsstart). EEG und klinischer Anfall enden, wenn die Beendigung der rhythmischen EEG-Spitzen bzw. der motorischen Aktivität beobachtet wird. Neben verschiedenen EEG-Wellenmorphologien durchliefen Kaninchen zunehmend generalisierte und zunehmend verlängerte motorische Anfälle. Eine Anfallsskala wurde geschaffen, weil weder die Racine-Anfallsskala noch ihre modifizierten Versionen auf zurückgehaltene Kaninchen anwendbar waren (Tabelle 1). Videos von repräsentativer motorischer Anfallsaktivität werden in Supplemental Movie 17, Supplemental Movie 18, Supplemental Movie 19, Supplemental Movie 20, Supplemental Movie 21, Supplemental Movie 22gezeigt.

Die hier vorgestellte Methode ist auch in der Lage, die Multisystemkaskade von Ereignissen zu bestimmen, die einem anfallsvermittelten plötzlichen Tod vorausgehen (Abbildung 18). Verschiedene Pathologien umfassen: Elektrozerebrale Stille (ECS), Atemstillstand (Apnoe), Brady-/Tachy-Arrhythmien und Herzstillstand (Asystole). Während der Experimente erlebte ein Kaninchen einen plötzlichen Tod nach einem pharmakologisch induzierten Anfall. Bei diesem Kaninchen gab es eine Sequenz, die mit Atemstillstand, dann ECS, atrioventrikulärem Block, mehreren nicht anhaltenden Tachyarrhythmien, Bradykardie und schließlich Asystole begann.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über das experimentelle Protokoll. Um einen Überblick über die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll zu geben, wurde eine Abbildung erstellt. Diese Abbildung zeigt, dass das Kontrollgerät vorbereitet werden muss, gefolgt von der Verbindung des Geräts mit dem Kaninchen und der Sicherstellung, dass ein qualitativ hochwertiges Signal eingehalten wird. Nach diesem Schritt kann das vorgesehene Experiment durchgeführt, Organe beschafft und die Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetrie-Daten analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Versuchsausrüstung. Diagramm des Versuchsaufbaus, der einen Computer, Infrarotlicht, Mikrofon, Videokamera, Vitalparametermonitor, 64-poligen Kopfkasten, Verstärker, Digitizer, 8 Elektroden (5 EEG, 3 EKG) + Masse für jedes Tier umfasst, die an den Kopfkasten angeschlossen sind. Die Leitungen sind farblich gekennzeichnet nach: 4 blaues EEG, 1 schwarze EEG-Referenz, 3 rotes EKG, 1 grüner Grund. Die Rückhaltebox, die die Kaninchen hält, wird nicht angezeigt. Mit diesem Setup können bis zu 7 Kaninchen gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die gelbe Linie stellt den Kapnographieschlauch dar und verbindet die Gesichtsmaske mit dem Vitalparametermonitor. Die blaue Linie stellt den Oximetriedraht dar, der mit dem Vitalparametermonitor verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bild von EEG- und EKG-Elektroden. (A) Gebogene EKG-Elektroden und gerade EEG-Elektroden. (B) Wie hakt die EKG-Elektrode in das Unterhautgewebe des Kaninchens ein, so dass es durch und durch ist. Abkürzungen (LL: Linkes Glied, RA: Rechter Arm, RL: Rechtes Glied, LA: Linker Arm, RF: Rechts frontal, LF: Links frontal, Cz: Mitte, RO: Rechtes Okzipital, LO: Linkes Okzipital). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Kaninchen, das an das Gerät angeschlossen ist. (A) Die Position der EKG-Elektroden, der linke Arm ist durch einen gelben Punkt gekennzeichnet. Der rechte Arm ist durch einen weißen Punkt gekennzeichnet. Das linke Bein ist durch einen roten Punkt gekennzeichnet. Der Boden vor dem rechten Bein ist durch einen grünen Punkt gekennzeichnet. (B) Kaninchen in Rückhaltekessel mit EKG- und EEG-Elektroden angebracht. (C) Jungkaninchen in einem Rückhaltesystem mit geeigneten Modifikationen, um ein kleineres Kaninchen unterzubringen, einschließlich eines Boosters unter dem Kaninchen, Halsschaum und geschnittenem PVC-Rohr. (D) Kaninchen im Rückhaltekessel mit Lage der EEG-Elektroden. Rechts Frontal ist durch einen orangefarbenen Punkt gekennzeichnet. Links Frontal ist durch einen roten Punkt gekennzeichnet. Das rechte Okzipital ist durch einen gelben Punkt gekennzeichnet. Das linke Okzipital ist durch einen blauen Punkt gekennzeichnet. Die Referenz wird durch einen schwarzen Punkt angezeigt. (E) Kaninchen in Rückhalteeinrichtung mit photischem Stimulator und Spiegelkabinenaufbau. Die Lichtquelle wird durch einen weißen Punkt angezeigt. (F) Marginale Ohrvene, nachdem das Kaninchenohr rasiert und mit Alkohol abgewischt wurde. (G) Kaninchen mit Angiokatheter sicher in der linken Randohrvene geklebt. Die Stelle des Injektionssteckers ist mit einem blauen Punkt gekennzeichnet. (H) Kaninchen mit Gesichtsmaske, die durch ein T-Stück, das ein Einwegventil enthält, am Kapnographieschlauch befestigt ist. (I) Diagramm der Gesichtsmaske und des T-Stücks, die mit dem Kapnographieschlauch verbunden sind. Während der Inspiration kann Raumluft durch ein Einwegventil (grüner Pfeil) in das T-Stück gelangen. Während des Ablaufs verlässt CO2 das T-Stück, indem es in den Kapnographieschlauch (gelber Pfeil) eintritt. Aufgrund des geringen Totraums wird sehr wenig CO2 im T-Stück zurückgehalten und beträgt in der Regel weniger als 5 mmHg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Simultane Kaninchen-Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetrie. (A) Gleichzeitige Video-EEG-EKG-Aufzeichnung von 3 Kaninchen. (B) Gezoomt im Hinblick auf die gleichzeitige Video-EEG-EKG-Aufzeichnung von Rabbit #2. (LL: Linkes Glied, RA: Rechter Arm, LA: Linker Arm) (C) Gleichzeitige Aufzeichnung von Kapnographie (gelb) und Plethysmographie (blau). Messungen mit inspiriertem CO2, Endgezeiten-CO2, Atemfrequenz, Pulsfrequenz und Pulsoximetrie sind in der Abbildung enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kaninchen-EKG. (A) Ausgangs-EKG. Die Leitungen werden in der standardmäßigen bipolaren Frontalebenengliedmaßenleitungskonfiguration und in der unipolaren Konfiguration (RA: Rechter Arm, LL: Linkes Glied, LA: Linker Arm) mit der Cz-Leitung auf dem Kopf als Referenz angezeigt. (B) Vorzeitige ventrikuläre Komplexe. (C) Sinusbradykardie. (D) Sinustachykardie. (E) Baseline Kaninchen EKG Tracing mit P Wellenstart, P Wellenpeak, P Wellende, QRS Wellenstart, QRS Wellenpeak, QRS Wellende, ST Segmenthöhe, T Wellenpeak, T Wellenende beschriftet. (F) EKG-Messungen. Alle Messungen sind in Millisekunden mit Ausnahme der Herzfrequenz, die in Schlägen pro Minute ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Basis-EEG und Spektralanalyse. (A) EEG-Tracing während der Baseline-Aufzeichnung. (B) Die Spektralanalyse des EEG zeigt, dass die Deltawellenaktivität die dominierende Frequenz in allen Leitungen ist. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 120 Hz angezeigt. Video-EEG-EKG-Aufnahmen werden in den Zusatzfilmen 1 und 2 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: EEG-Rückverfolgung und Spektralanalyseder Schlafspindel . (A) EEG-Rückverfolgung während der Schlafspindeln. (B) Die Spektralanalyse des EEG zeigt das Vorhandensein einer zusätzlichen Welle bei 12-15 Hz, die der Frequenz ähnelt, die mit Schlafspindeln beim Menschen verbunden ist. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). (C) Mehrere EEG-Montagen einer Schlafspindel zeigen, dass sie aus der Mitte des Kopfes (Cz) entstehen, was mit menschlichen Befunden übereinstimmt. Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) mit 59 Hzangezeigt.

Figure 9
Abbildung 9: Vertexwellenverfolgung und Spektralanalyse. (A) EEG-Verfolgung mehrerer Vertexwellen. (B) Die Spektralanalyse der Scheitelpunktwellen zeigt keinen nennenswerten Unterschied in der Frequenz der Scheitelpunktwellen. Obwohl dies erwartet wird, weil visuell die Frequenz weniger als 1 Hz beträgt. (C) Mehrere EEG-Montagen von Scheitelpunktwellen zeigen, dass sie aus dem Zentrum des Kopfes entstehen, was mit menschlichen Befunden übereinstimmt. Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: EEG-Artefakte, die durch Kaninchenbewegungen verursacht werden. (A) EEG während der Sakkade des rechten Auges. (B) EEG während eines linken Augenblinzelns. (C) EEG während der rhythmischen Bewegung der Nase, die mit dem Vorhandensein von Atmung verbunden ist. (D) EEG während der Leckbewegung. (E) EEG während einer Episode des Kaninchens, das seinen Kopf nach unten streckt. (F) EEG bei komplexen bewussten Bewegungen des gesamten Körpers. Video-EEG dieser Bewegungen sind in Supplemental Movies 3-11verfügbar. Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) mit 59 Hzangezeigt.

Figure 11
Abbildung 11: EEG während der photischen Stimulation. (A) EEG-Verfolgung während der 3 Hz photischen Stimulation mit geöffneten Augen des Kaninchens. (B) Spektralanalyse der 3 Hz photischen Stimulation mit Peaks bei 3 Hz, die in den Okzipitalleitungen, aber nicht in den frontalen Leitungen beobachtet werden. Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 12
Abbildung 12: EEG-Tracing und Spektralanalyse von Theta-Bursts. Theta-Bursts sind intermittierend in allen EEG-Leitungen zu sehen. Die Frequenz dieser Wellen liegt bei etwa 4-6 Hz. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gamma (γ: ≥ 32 Hz) Wellen. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 13
Abbildung 13:EEG-Tracing und Spektralanalyse von Theta-Bursts mit großer Amplitude. Theta-Bursts mit großer Amplitude ähneln in Aussehen und Frequenz Theta-Wellen, jedoch mit einer größeren Amplitude. Die schnelle Änderung der Amplitude lässt einige dieser Wellen schärfer aussehen. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die Video-EEG-EKG-Aufzeichnung wird in Supplemental Movie 12 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 14
Abbildung 14:EEG-Tracing und Spektralanalyse von Polyspike-Wellen. Polyspike-Wellen werden intermittierend und gleichzeitig in allen Leads gesehen. Bei der Spektralanalyse gibt es mehrere harmonische Peaks mit einer Grundfrequenz um 6 Hz. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gamma (γ: ≥ 32 Hz) Wellen. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die Video-EEG-EKG-Aufzeichnung wird in Supplemental Movie 13 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 15
Abbildung 15: EEG-Rückverfolgung und Spektralanalyse von Niederspannungs-Polyspike-Wellen. Niederspannungs-Polyspikewellen ähneln Polyspike-Wellen, haben aber eine geringere Amplitude. Die Spektralanalyse ähnelt der von Polyspikes. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 16
Abbildung 16: EEG-Tracing und Spektralanalyse rhythmischer Gamma-Bursts. Rhythmische Gamma-Ausbrüche in einem berstenden Muster sind am deutlichsten in den vorderen Leitungen zu sehen. Bei der Frequenzanalyse ist ein zusätzlicher Peak um 50-55 Hz in den vorderen Leitungen zu sehen. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 120 Hz angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 17
Abbildung 17: EEG-Tracing und Spektralanalyse der postizitalen generalisierten EEG-Unterdrückung. Postiktale generalisierte EEG-Unterdrückung mit dem entsprechenden Frequenz histogramm. Delta (δ: bis zu 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) Wellen Alpha (α: 8 -15 Hz) Wellen Beta (β: 15-32 Hz) Wellen Gammawellen (γ: ≥ 32 Hz). Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die elektrographischen Daten mit voller Bandbreite wurden ohne Filter erfasst, aber die Daten wurden mit einem Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und einem Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz angezeigt. Die Y-Achse ist Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Die Video-EEG-EKG-Aufzeichnung wird in Supplemental Movie 15 gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 18
Abbildung 18: Abfolge des plötzlichen Todes nach einem Anfall. Ein Kaninchen erlebte während des PTZ-Protokolls einen plötzlichen Tod und die Todesfolge ist detailliert. Die elektroenzephalographischen Manifestationen sind grün dargestellt. Zeit Null ist das klinische Ende des Anfalls. Es folgt die postiktale elektrozerebrale Stille (ECS). Die Atemdaten sind rot dargestellt und vermerken den Beginn der Apnoe. Elektrokardiographische Informationen werden in Blautönen angezeigt. Dieses Kaninchen erlebte Herzblockade, multiple Tachyarrhythmien, Bradykardie und schließlich Asystole, die durch den schwarzen Stern angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Anfallsskala für zurückgehaltene Kaninchen. Eine zunehmende Schwere der Anfälle ist mit einer zunehmend anhaltenden und generalisierten epileptischen motorischen Aktivität verbunden. Videobeispiele finden Sie in Supplemental Movies 17-22. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzender Film 1: Baseline Kaninchen-Video-EEG-EKG-Aufnahme mit eingeschaltetem Licht. Nachdem das Kaninchen in den Rückhalteer gelegt wurde, wird das Kaninchen entspannter und es können Basislinienaufnahmen gemacht werden. Das Video zeigt, dass sich das Kaninchen während dieser Aufnahme nicht bewegt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: Baseline Kaninchen-Video-EEG-EKG-Aufnahme mit ausgeschaltetem Licht. Damit ein photisches Stimulationsexperiment durchgeführt werden kann, müssen die Lichter im Raum ausgeschaltet werden. Das Ausschalten des Lichts im Raum hat keinen wesentlichen Einfluss auf die EEG- oder EKG-Aufzeichnung. Wichtig ist, dass die Videokamera über ein Infrarotlicht verfügt, so dass das Kaninchen im Dunkeln gesehen werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 3: Muskelartefakt aus bewegung des linken Auges. Die in diesem Artikel beschriebene Methode ist in der Lage, zwischen Muskelartefakten und epileptiformen Entladungen zu unterscheiden. Obwohl diese periodische große Amplitudenwelle mit einem Anfall verwechselt werden könnte, tritt sie gleichzeitig mit der Bewegung des linken Auges auf und wird daher eher durch Muskelaktivität verursacht. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 4: Muskelartefakt aus einem linken Augenblinzeln. Die Video-EEG-Aufzeichnung ist in der Lage, ein Augenblinzeln am EEG zu erkennen und auch festzustellen, dass es gleichzeitig mit dem Augenblinzeln auf dem Video auftritt. Das Augenblinzeln ist seitlich zu den linksseitigen EEG-Leitungen lateralisiert. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 5: Muskelartefakt aus Kiefermuskel. Das Video-EEG ist in der Lage, Bewegungen kleiner Muskeln des Kopfes und Halses zu erkennen. Video ist von unschätzbarem Wert, um festzustellen, dass diese Bewegung auf Muskeln und nicht auf epileptische Entladungen aus dem Gehirn zurückzuführen ist. Wie erwartet, entsteht das mit dieser Bewegung verbundene Signal aus den okzipitalen Leitungen. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 6: Muskelartefakt vom Lecken. Die EEG-Verfolgung zeigt große rhythmische scharfe Wellen, die mit der Anfallsaktivität übereinstimmen könnten. Das Video zeigt, dass diese Wellen durch Zungenbewegungen verursacht werden und keine epileptischen Entladungen sind. Wie erwartet, entsteht das mit dieser Bewegung verbundene Signal aus den okzipitalen Leitungen. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 7: Muskelartefakt aus Mundbewegung. Neue Wellen, die im Deltabereich beobachtet werden, sind mit der Bewegung des Mundes verbunden. Wichtig ist, dass dies von einer intermittierenden Verlangsamung der Sekundär- zur Enzephalopathie durch Visualisierung der Mundbewegung unterschieden werden kann, wenn die Thetawellen auftreten. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 8: Muskelartefakt aus Kopfdrehung. Eine große, langsame und vorübergehende Abnahme der Amplitude, die in den frontalen Leitungen beobachtet wird, ist mit dem Drehen des Kaninchenkopfes verbunden. Es ist wichtig zu beachten, dass der Bewegung keine epileptischen Entladungen vorausgehen. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 9: Muskelartefakt aus der Kopfverlängerung. Ein großer, langsamer und vorübergehender Anstieg der Amplitude ist in allen Leitungen zu sehen, wenn das Kaninchen seinen Kopf hebt. Es gibt keine epileptischen Entladungen vor der Bewegung. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 10: Muskelartefakt aus Kopfbeugung. Eine sehr starke Abnahme der Amplitude in allen Leitungen ist zu sehen, wenn das Kaninchen seinen Kopf nach unten streckt. Es gibt keine epileptischen Entladungen vor der Bewegung. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 11: Muskelartefakt aus komplexer Bewegung. Während des Rückhaltekörpers macht das Kaninchen eine komplexe Bewegung, die seinen Kopf und seinen ganzen Körper betrifft. Dies geschah während der Baseline-Aufzeichnung, bevor anfallsinduzierende Medikamente verabreicht wurden. Diese schnell auftretende Bewegung wurde als hochamplituden- und hochfrequenter Burst am EEG aufgezeichnet. Darüber hinaus sind die rhythmischen scharfen Wellen, die in den frontalen Leitungen zu sehen sind, auf die Bewegung der Nase zurückzuführen, die synchron mit den Wellen auf dem Video zu sehen ist. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 12: Video-EEG von Theta-Bursts mit großer Amplitude. Nach der PTZ-Injektion zeigten einige Kaninchen eine intermittierende Verlangsamung des EEG in allen Leitungen. Diese abnormalen Wellen waren normalerweise nicht mit Bewegung verbunden. Obwohl diese Wellenausbrüche im Theta-Bereich nicht typisch für Anfallsaktivität sind, sind sie mit Enzephalopathie beim Menschen verbunden. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 13: Video-EEG von Polyspikes. Scharfe Wellen können unmittelbar nach der Injektion, während eines Anfalls oder während der postizitalen Phase beobachtet werden. Diese Befunde ähneln denen, die beim Menschen gefunden wurden, und sind mit Anfallsaktivität verbunden. Während der Polyspikes wird auch bemerkt, dass das rechte Ohr zuckt, eine körperliche Manifestation des Anfalls. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 14: Video-EEG des rhythmischen Gamma-Bursts. Hochfrequente Bursts, wie die im Video gezeigten, treten oft in der postizitalen Phase und gelegentlich nach subthreshold Dosen von PTZ auf. Die physiologische Ursache dieser hochfrequenten Gammaausbrüche ist unbekannt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 15: Video-EEG der postizitalen generalisierten EEG-Unterdrückung. In der postiktalen Phase, insbesondere nach einem generalisierten tonisch-klonischen Anfall, kommt es häufig zu einer Unterdrückung des EEG in allen Leitungen. Es wird gezeigt, dass große Amplitudenablenkungen während der postizitalen Periode durch Muskelartefakte von myoklonischen Rucklern verursacht werden. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 16: Video-EEG der elektrozerebralen Stille. Dieses Video zeigt das hohe Signal-Rausch-Verhältnis dieser Methode. Bei minimaler EEG-Aktivität gibt es kein wertschätzendes Signal vom EEG. Diese Spezifität ist wichtig, um den Zeitpunkt des Hirntodes zu bestimmen. Darüber hinaus ist zu beachten, dass nach dem Hirntod häufig eine Restfunktion des Herzens besteht. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 17: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 0. Die Anfallsskala wurde entwickelt, um die Schwere der motorischen Anfälle zu bewerten, indem sie die Ausbreitung und Dauer des Anfalls bestimmt. Im Stadium 0 gibt es keine sichtbare Anfallsaktivität, obwohl es epileptische Entladungen beim EEG geben kann. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 18: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 1. Stadium 1 der Anfallsskala wird durch das Vorhandensein eines kurzen partiellen Anfalls identifiziert. Im Allgemeinen sind partielle Anfälle auf den Kopf und nicht auf jeden anderen Körperteil beschränkt. Dies kann sich als einzelne Kopfstöße, ein ohriges Zucken oder andere kurze, nicht rhythmische motorische Aktivität im Zusammenhang mit epileptischen Entladungen beim EEG manifestieren. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 19: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 2. Stadium 2 der Anfallsskala wird durch einen nicht anhaltenden generalisierten Anfall identifiziert. Häufig erfährt der ganze Körper einen myoklonischen Ruck. Dies unterscheidet sich von späteren Stadien durch einen Mangel an Rhythmizität. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 20: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 3. Stadium 3 der Anfallsskala wird durch einen anhaltenden, rhythmischen Anfall identifiziert, der in Bezug auf motorische Manifestationen auf den Kopf beschränkt ist. Das gezeigte Kaninchen hat rhythmisches Zucken der Ohren und Augenlider. Das Kaninchen erlebt einen kurzen myoklonischen Ganzkörperruck, entwickelt sich aber nicht zum rhythmischen Ganzkörperruckeln. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 21: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 4. Stadium 4 der Anfallsskala wird durch einen anhaltenden, rhythmischen Anfall identifiziert, der den gesamten Körper bezischt. Wie im Video zu sehen ist, ist der Körper des Kaninchens am Myoklonus beteiligt, während es relativ wenig Bewegung der Ohren, Augen und des Kopfes gibt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 22: Video-EEG der Anfallsskala Stufe 5. Das letzte Stadium der Anfallsskala, wenn es durch das Vorhandensein sowohl der tonischen als auch der klonischen Phase des Anfalls identifiziert wird. Anfangs gibt es eine unorganisierte Bewegung des gesamten Körpers. Es folgt das tonische Stadium, dann das klonische Stadium des Anfalls, bis der Anfall abklungen ist. Gelegentlich erleben Kaninchen nach diesem Stadium einen plötzlichen Tod, aber selten sterben sie nach einem Anfall von geringerer Schwere. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

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Discussion

Dieser Versuchsaufbau ermöglicht detaillierte simultane Video-EEG-EKG-Oximetrie-Kapnographie-Aufzeichnungen und Analysen bei Kaninchen, insbesondere in Modellen von Herz- und/oder neuronalen Erkrankungen. Die Ergebnisse dieses Artikels zeigen, dass diese Methode in der Lage ist, Anfälle und Arrhythmien zu erkennen und sie von elekrographischen Artefakten zu unterscheiden. Erwartete Ergebnisse wurden erzielt, wenn Kaninchen ein Prokonvulsivum gegeben wurde, das Anfälle induzierte. Die aus den Video-EEG-Aufzeichnungen gewonnenen Daten konnten weiter analysiert werden, um willkürliche Bewegungen von der zunehmenden Schwere von motorischen Anfällen und elektroenzephalographischen Anomalien, einschließlich photischer Fahrreaktion, Enzephalopathie und epileptiformer Entladungen, zu unterscheiden. Verschiedene Arten von epileptiformen Entladungen wurden weiter charakterisiert und mit der motorischen Aktivität korreliert. Die Analyse des EKG zeigte eine Methode, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erzeugte und die Identifizierung und Quantifizierung jedes elektrischen Korrelats des Herzzyklus ermöglichte. Diese Methode war auch in der Lage, das Vorhandensein von Herzanomalien zu erkennen, einschließlich vorzeitiger ventrikulärer Komplexe, Bradykardie, Herzblock, Tachykardie, Tachy-Arrhythmien und Asystole. Die Entwicklung einer robusten Methode zur weiteren Untersuchung neuro-kardialer Wechselwirkungen von Multisystemerkrankungen stellt einen wichtigen technologischen Fortschritt voraus, der notwendig ist, um diese Krankheiten besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Überwachung der Atmungsfunktion im Laufe der Zeit ein besseres Verständnis des Atemversagens nach Anfällen und seines Beitrags zum plötzlichen Tod.

Dieses Setup bietet auch ein robustes System für Arzneimittelstudien, wie z. B. kardiale Sicherheitstests. Forschungsprojekte, die diese Techniken anwenden, sind in der Lage, die Wechselwirkung zwischen den neuronalen, kardialen und respiratorischen Manifestationen in Echtzeit zu untersuchen. Obwohl viele Studien an Nagetierherzen durchgeführt wurden, sind die Ergebnisse im Kaninchenherz für translationale Studien besser, da die Ionenkanalexpression, die Aktionspotentialeigenschaften und die EKG-Messungen dem Menschen ähneln. Da es sich um ein klinisch eingesetztes Video-EEG-EKG-Setup handelt, kann das gleiche Design in Zukunft auf große Säugetiere wie Schweine, Hunde oder Schafe angewendet werden. Darüber hinaus kann dieses Aufzeichnungssetup für die intrakranielle EEG-Überwachung im frei beweglichen Kaninchen verwendet werden, was umfangreichere Aufzeichnungen bei verschiedenen physiologischen Zuständen, umgeben von spontanen neuroherzigen Ereignissen und vor dem plötzlichen Tod ermöglicht. Diese Methoden werden von unschätzbarem Wert sein, um den Mechanismus von SUDEP aufklärt und neuartige Therapien zur Behandlung von Erkrankungen des Gehirns und des Herzens zu finden.

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll enthält viele kritische Schritte, die befolgt werden müssen, um Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. Wichtig ist, dass das Kaninchen vor Beginn des Experiments im Rückhaltegriff gesichert werden muss, um große Körperbewegungen zu begrenzen, die zu Wirbelsäulenverletzungen führen könnten. Alle Elektroden werden auf Signalqualität geprüft. Wenn alle Elektroden laut sind, kann die Referenzelektrode ausgetauscht werden, um das Signal zu verbessern. Wenn einzelne Elektroden laut sind, sollte diese eine Elektrode tiefer in die Haut gedrückt oder entfernt und erneut implantiert werden. Während des Experiments kann die Bewegung der Kaninchen dazu führen, dass Elektroden verschoben werden. Versuchen Sie so schnell wie möglich, die Elektroden zu ersetzen, ohne die Sicht auf die Kamera zu behindern, damit noch Daten aus dem Experiment gesammelt werden können.

Ein Vorteil der in dieser Studie beschriebenen Methodik besteht darin, dass sie es dem Prüfer erleichtert, eine große Anzahl von Tieren zu screenen, und kostengünstig ist. Es gibt Einschränkungen dieses Protokolls. Obwohl nur wenige Studien durchgeführt wurden, um die physiologischen Auswirkungen der Zurückhaltung auf Kaninchen spezifisch zu untersuchen, fanden wir heraus, dass Kaninchen Zurückhaltung extrem gut vertragen. Viele Studien des Hörsystems wurden an wachen Kaninchen in leichten Fesseln durchgeführt. Unter diesen Bedingungen sitzen Kaninchen stundenlang ruhig ohne Anzeichen von Stress oder Unbehagen39. Nachdem kaninchen in den Rückhalteer gelegt wurden, versuchen sie selten, dem Rückhaltekessel zu entkommen. Sie zeigen eine Herzfrequenz, die nahe am Ausgangswert liegt und schlafen oft ein, wie das Vorhandensein von Schlafspindeln im EEG zeigt. Kaninchen zeigen keine visuellen, Herzfrequenz- oder andere Manifestationen, die darauf hindeuten, dass sie gestresst sind.

Eine zukünftige Richtung ist die Entwicklung eines Systems zur telemetrischen EEG- und EKG-Aufzeichnung. Dies würde eine detailliertere Analyse während verschiedener physiologischer Zustände, die Erkennung spontaner Anfälle und die Kaskade neuroherzialer Veränderungen ermöglichen, die dem plötzlichen unerwarteten Tod bei Epilepsie (SUDEP) vorausgehen. Aufgrund technologischer Einschränkungen und eines relativen Mangels an Literatur zum EEG bei Kaninchen wurde die vorgestellte Methode zunächst entwickelt. Um diese Methode an frei bewegliche Kaninchen anzupassen, wären eine kontinuierliche Videoüberwachung, intrakranielle EEG-Implantate und subkutane EKG-Elektroden erforderlich. Eine chronische Atemkapnographie wäre jedoch nicht durchführbar. Aufgrund institutioneller Vorschriften (IACUC) ist die Methodik für ≤5-Stunden-Aufnahmen im Restrainer. Bei Nagetieren ist es üblich, die Schwelle, Dynamik und Arten von Anfällen mit provokativen Maßnahmen wie Fieber, Auditiv, maximalem Elektroschock, Hyperventilation, Schlafentzug und drogeninduzierten Anfällen zu beurteilen16,40,41,42,43. Dieses Protokoll würde es ermöglichen, jede der zuvor genannten provokativen Maßnahmen zu testen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren bestätigen, dass diese Studie durch Zuschüsse der American Heart Association, der American Epilepsy Society und der SUNY Upstate Department of Pharmacology unterstützt wurde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container PFIZER (HOSPIRA) 7983-09 Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle Sur-Vet SS-10L2025 Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges Fisher Scientific 22-415-469 Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce Kirkland 897971 Vehicle for oral medications
Computer Dell Optiplex 5040 Acquisition computer
E-4031 Tocris 1808 Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode RhythmLink RLSND116-2.5 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode RhythmLink RLSP513 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020) Swartz Center for Computational Neuroscience Open Access Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter Linksys USB3G16 Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution Med-Pharmex ANADA 200-280 Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding Generic N/A Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush Medline EMZ50051240 To maintain patency of angiocatheter
IR Light Bosch EX12LED-3BD-8W Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) ADInstruments N/A ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge Smiths Medical 3060 Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5) MathWorks N/A Required to run EEGLAB
Microphone Sony Stereo ECM-D570P Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White 3M 1530-1 Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks Natus LC101-8 Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume) Sigma-Aldrich 88580 Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator Grass PS22 Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler 12Vwire.com LM-12-100-BLK Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator Grass Instruments BZA641035 Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe Generic N/A Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier Natus 13926 Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier Natus 22134 64-pin breakout box
Rabbit Restrainer Plas-Labs 501-TC Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster) Generic N/A Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip NONIN 61000 PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter NONIN 13931 XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output Sony SRG-X120 Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer Sur-Vet 13882 Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock Sur-Vet SRIP2V Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply Covidien 5110 To prepare ear vein before catheterization

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Bosinski, C., Wagner, K., Zhou, X.,… More

Bosinski, C., Wagner, K., Zhou, X., Liu, L., Auerbach, D. S. Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits. J. Vis. Exp. (169), e62256, doi:10.3791/62256 (2021).

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