Summary
同時ビデオ-EEG-ECG-オキシメトリー-カプノグラフィーを用いて、ウサギモデルの感受性を評価し、引き起こされた不整脈および発作を発症する方法論を開発した。この新しい記録システムは、治療薬の有効性と安全性をテストするプラットフォームを確立し、突然死に至るマルチシステムイベントの複雑なカスケードをキャプチャすることができます。
Abstract
イオンチャネル症の患者は、発作および致命的な心臓不整脈を発症する危険性が高い。てんかん患者(すなわちてんかんの心臓)には心臓病や不整脈の有病率が高い。さらに、発作を取り巻く心臓および自律神経障害が報告されている。1:1,000てんかん患者/年はてんかん(SUDEP)で突然の予期せぬ死で死亡する。SUDEP のメカニズムは、完全には理解されていません。脳波(EEG)と心電図(ECG)は、発作や不整脈の基質/トリガーを検出して研究するために臨床現場で日常的に使用される2つの技術です。この方法論の多くの研究と記述はげっ歯類にありますが、心臓の電気的活動は人間とは大きく異なります。この記事では、意識的なウサギの同時ビデオ-脳脳-EEG-ECG-オキシメトリーカポノグラフィーを記録するための非侵襲的な方法の説明を提供します。心臓の電気機能はウサギとヒトで類似しているので、ウサギは翻訳診断および治療研究の優れたモデルを提供する。データ収集の方法論を概説するほか、ウサギの神経心の電気機能や病理を調べる分析手法についても議論する。これには、不整脈検出、EEGのスペクトル分析、および抑制されたウサギのために開発された発作スケールが含まれます。
Introduction
心電図(ECG)は、心臓電気伝導のダイナミクスと電気活性化回復プロセスを評価するために臨床現場で日常的に使用されています。ECGは、不整脈、虚血、梗塞のリスクを検出、局所化、評価するために重要です。典型的には、電極は、心臓の立体的なビューを提供するために、患者の胸部、腕および脚に付設される。心筋脱分極の方向が電極に向かう場合に正の偏向が生じ、心筋脱分極の方向が電極から離れているときに負の偏向が生じる。心周期の電解成分には、心房脱分極(P波)、心房心室伝導(P-R間隔)、心室興奮(QRS複合体)、心室リポーラリゼーション(T波)が含まれる。ECGには、人間、ウサギ、イヌ、モルモット、ブタ、ヤギ、馬1、2、3など、多くの哺乳類に対して、行動の可能性のある対策が大きく類似しています。
ウサギは心臓翻訳研究に理想的なモデルです。ウサギの心臓は、イオンチャネル組成の点で人間の心臓に似ており、作用電位特性2、4、5。ウサギは、心臓病2、4、6、7、8の遺伝的、獲得、および薬物誘発モデルの生成に使用されてきた。心臓心電図と行動の薬物に対する反応の可能性は、人間7、10、11に大きな類似点があります。
心拍数と心臓電気活性化回復プロセスは、ウサギ、ヒト、および他の大きな哺乳類12、13、14と比較して、げっ歯類では非常に異なっています。げっ歯類の心臓は人間の10倍の速さで鼓動する。これに対し、ヒトおよびウサギのECGにおける等電動STセグメントに対して、げっ歯類14、15、16にはSTセグメントはない。また、げっ歯類は、逆T波14、15、16を持つQRS-r波形を有する。QT間隔の測定値は、げっ歯類と人間とウサギの14、15、16で非常に異なっています。さらに、正常なECG値は、げっ歯類12、15、16との人間で大きく異なる。心電図波形のこれらの違いは、心臓再分極9,14を駆動する作用電位形態とイオンチャネルの違いに起因する可能性がある。一過性外向きカリウム電流はげっ歯類における短い(非ドーム)心行動電位形態の主要な再分極電流であるが、ヒトおよびウサギでは、作用電位に大きな相2ドームがあり、遅滞性整流カリウム電流(IKrおよびIKs)はヒトおよびウサギ4,17の主要な再分極電流である。重要なことに、IKrおよびIKsの発現はげっ歯類において存在しない/最小限であり、そしてIKrおよびI Ksの時間的活性化運動学のために、それは心行動電位形態9、13において役割を持たない。このように、ウサギは、薬物誘発、取得、および遺伝したECG異常および不整脈4、7、13のメカニズムを評価するためのより翻訳的なモデルを提供する。次に、多くの研究が、初発心臓(長いQT症候群18、19、20)または神経疾患(てんかん21、22、23、24)における神経および心臓の両方の電気異常の存在を示しているように、ヒト生理学を密接に再現する動物モデルの基礎的メカニズムを研究することが重要である。げっ歯類は人間の脳をモデル化するのに十分かもしれませんが、げっ歯類はヒト心臓生理学7の理想的なモデルではありません。
脳波(EEG)は、通常頭皮または内部に置かれた電極を使用して、皮質の電気機能を記録します。これらの電極は、大脳皮質25における近傍錐型ニューロン群の焼成速度およびシンクロニシティの変化を検出できる。この情報は、脳機能と覚醒/睡眠状態を評価するために使用することができます。また、EEGはてんかんの活性を局所化し、てんかん発作を非てんかん事象(例えば、心因性非てんかん活動および心原性事象)と区別するのに有用である。てんかんの種類、誘発因子、および発作の起源を診断するために、てんかん患者は発作をもたらす可能性のある様々な操縦を受ける。様々な方法は、過換気、photic刺激、および睡眠不足を含む。このプロトコルは、ウサギ26、27、28、29におけるEEG収差および発作を誘発する感知刺激の使用を示す。
同時ビデオ-EEG-ECG記録は、ヒトおよびげっ歯類において、イクタル前、イクタル状態、およびイクタル状態30の間の行動、神経、および心臓活動を評価するために広く使用されている。いくつかの研究がウサギ4、31、32、33で個別にEEGとECG記録を行っているが、意識的に拘束されたウサギの同時ビデオ-EEG-ECGを取得および分析するためのシステムは34を確立していない。本論文では、神経心の電気機能と呼吸機能を評価するために、意識的なウサギに同時にビデオ-EEG-ECG-カプノグラフィーオキシメトリーデータを記録できるプロトコルの設計と実装について述べる。この方法から収集された結果は、不整脈、発作、呼吸障害、および身体的症状の間の感受性、引き金、ダイナミクスおよび一体性を示すことができる。実験システムの利点は、鎮静剤を必要とせずに意識的な録音を取得することです。ウサギは、最小限の動きで≥5時間の拘束剤に残ります。麻酔薬は神経細胞、心臓、呼吸、自律神経機能を摂動するので、意識状態の間の記録は最も生理学的なデータを提供する。
この記録システムは、最終的には、てんかんにおける突然の予期せぬ死(SUDEP)に対する神経学的、心臓および呼吸機構の理解を進めるための詳細な洞察を提供するかもしれない。上記の神経学的および心臓モニタリングに加えて、最近の証拠は、発作35、36後の突然死への潜在的な貢献として呼吸不全の役割を支持している。ウサギの呼吸状態を監視するために、発作の前後の呼吸器系の状態を評価するためにオキシメトリーおよびカプノグラフィーを実施した。ここで提示されるプロトコルは、薬理学的および感電誘発性ウサギの発作の閾値を評価することを目的として設計された。このプロトコルは、物理的な症状を引き起こす可能性のある微妙なEEGおよびECG異常を検出することができる。さらに、この方法は、心臓の安全性と新しい薬剤やデバイスの抗不整脈効果検査に使用することができます。
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Protocol
すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)ガイドラインおよびアップステート医科大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)に従って行われました。また、このプロトコルの概要を 図 1に示します。
1. 録音機器の準備
- コンピュータを64ピンヘッドボックスでアンプに接続します。
注:各動物は、頭部の4象限からのEEG用の4つのまっすぐな皮下頭皮ピン電極(7または13mm)、ECG(アイントーヴェンの三角形)のための3つの曲がった皮下胸部ピン電極(13mm、35°の角度)、右脚の1曲りの皮下ピン接地電極、および1つのストレート皮下頭皮ピン電極を備えています。 - ヘッドボックスの 8番目 のピンを参照するには、取得ソフトウェア設定、取得タブを更新して、参照電極が "独立" (リサーチ モード) になるようにします。
注:これは7つの電極と専用の参照電極および地面の電極をそれぞれ1つのアンプ、デジタイザーおよびコンピュータを通して同時に7動物からの記録を可能にする。すべての電極は、単極チャネルとして取得され、参照(頭の中心)と比較されます。追加のバイポーラおよび拡張リード構成/モンタージュは、記録中または記録後に設定することができます。セットアップは複数の動物から同時に記録する能力を有するので、各動物からの接地電極は、アンプ上のグランド入力に並列に接続される(図2)。 - 飼いのうちからウサギを取り除き、体重を量って動物ごとに適切な薬物用量を計算します。ウサギを輸送キャリアに入れ、非実験動物へのストレスを最小限に抑えるために別の部屋に持って行きます。本研究では、雄と雌のニュージーランド白ウサギとその後の子孫を使用した。実験は生後1ヶ月>ウサギに対して行った。実験の時点で、これらのウサギの重量は0.47-5.00キロの間でした。
注意:ウサギは同じ部屋に、カメラの視界にある必要があるので、ウサギを完全に隔離しないでください。あるウサギが別のウサギにストレスを与える視覚および聴覚症状の可能性があります。したがって、一度に1匹のウサギを部屋に入れ、これは、感性刺激実験のために行われるのが理想的です。他のすべての実験では、ウサギはビデオカメラの視界内にそれらのすべてを保持しながら、可能な限り間隔を空けています。理想的には、障壁が使用されるか、または一度に1匹の動物だけが研究される。これは、ウサギの心拍数が 実験中にかなり安定しており、睡眠スピンドルが頻繁に存在していたため、大きなコンファウンダーではありませんでした。複数の動物からの記録は同時に制御およびテスト動物のデータが同じ環境条件の下で獲得されることを保証する。
2. EEG-ECG電極の埋め込みと呼吸モニターの取り付け
- 輸送キャリアから1匹のウサギを取り除き、座った調査官の膝の上に置きます。
- ウサギを縦に持ち、捜査官の遺体の近くに置いてください。
- ウサギを、見本の膝に、ウサギの頭を身体の他の部分よりも低くして、うさぎの位置に下げます。
注:この操縦は動物を弛緩させ、電極を置いている間動かしたり逃げようとする可能性を最小にする。 - ウサギが腹の位置に固定されている今、皮膚が特定され、根底の組織から隔離されるまで毛皮を広げるように2人目の調査官に依頼する。
- 各腋窩に35°曲げ電極を下皮に挿入する(図3A)。
注:電極は、皮膚にしっかりと引っ掛けられるように押し通す必要がありますが、より深い構造に浸透しないでください。電極を皮膚に入れてから出て(スルースルー)すると、ウサギを拘束剤に入れたり、実験中に動いたりするとリードが外れる可能性が低くなります(図3B)。すべての電極は、配置前に70%エタノールで殺菌される。 - 胸部の後部を右および左前肢に置き、腹部の前部を左後肢に置く。右後肢の腹部に接地ピン電極前部を置く(図4A)。
- すべてのECGリードが適切に配置されたら、ウサギの腹部の片側を駆け上がった状態でウサギを起こしやすい位置に戻し、ウサギを適切なサイズの拘束剤(例えば、6" x 18"x 6")に移します。 ウサギを拘束剤に入れる場合は、緩いワイヤーを上に引っ張り、ウサギが足で電極を引き出すことを最小限に抑えます。実験中にウサギの下に巻き込まれないように、ワイヤーをサビサの側面にテープで留めます(図4B)。
- 首の周りの拘束を下げ、所定の位置にロックすることによって、拘束剤にウサギを固定します。さらに、後肢を動物の下に上に移動させ、後部拘束を固定します。
注:首の下のスペースに1-2本の指を収め、きつすぎないようにする必要があります。特に運動が起こる可能性のある実験では、動き、潜在的な脊髄損傷、四肢脱臼、および後部拘束を蹴り出す能力を最小限に抑えるために拘束を引き締めることが重要である(図4B)。ウサギは、動きの増加や脱水症状の兆候に関連する問題なしに〜5時間の拘束剤に維持されています。- 小さいウサギ(例えば、2ヶ月未満)の場合は、動物の下にゴムブースターパッドを置いてウサギを上げ、ウサギが頭の下に首を置くことを防ぎます(図4C)。
注:呼吸と心拍数の急激な低下は、首の衝突に二次的である可能性があります。この場合は、首の拘束を緩め、ウサギの頭を持ち上げて首の圧迫を緩和します。 - 後部拘束がウサギの背中/背骨を密接に追跡しない場合は、脊髄損傷を引き起こす可能性のある動きを防ぐためにPVCスペーサーを配置します。
注:例えば、〜14センチ長x 4"内径PVCパイプ、下25〜33%を取り除いた適切な拘束を提供するために泡でウサギの上に置くことができます(図4C)。
- 小さいウサギ(例えば、2ヶ月未満)の場合は、動物の下にゴムブースターパッドを置いてウサギを上げ、ウサギが頭の下に首を置くことを防ぎます(図4C)。
- これでウサギがしっかりと拘束剤に入れられたので、7~13mmの皮下ストレートピン電極を頭皮に挿入します(図3A)。45°の角度アプローチを使用して、耳の間にワイヤーを上げ、導線の配置を維持するために、ワイヤーを頭部の後ろの拘束者にゆるやかにつなぐ。5 EEGリードを次の位置に配置します:右前、左前頭、右後頭、左後頭部および中央参照(Cz)リードを他の4つのリードとの間のポイントに配置します(図4D)。
注:電極は頭蓋骨に対して皮下組織に配置されたときに適切に配置されます。この配置により、鼻、耳、およびその他の周囲の筋肉からのアーチファクトを最小限に抑えます。リズミカルな鼻の動きからいくつかのアーティファクトは避けられません。前のEEGリードはウサギの目に内側に置かれ、前向きにする必要があります。後頭部リードは耳の前に置かれ、内側方向を指し示す。Czは、4つの電極(縫合線に沿ってラムダとブレグマの中間方向)の間にある点で、頭頂部の中央に配置されます。Cz電極のピンは前向きに向いています。- ウサギがワイヤーを噛もうとしないように、耳の間にEEGワイヤーを渡します。
- パルスオキシメータプレチスモグラフを、うさぎの耳に、限界の耳静脈の上に取り付けます。
メモ:信号を改善するために耳から余分な髪を剃るか、センサーを所定の位置に保つためにいくつかのガーゼを使用する必要があります。- 胸膜造影の心拍数が心電図からの心拍数と相関し、酸素飽和度が表示されていることを確認します(図5C)。
- ウサギの口と鼻の上にカプノグラフィーチューブを入れ、フェイスマスクをそっと置きます(図4H)。マスクに巻き付けられた文字列でフェイスマスクを固定し、文字列の両端を拘束者に取り付けます。カプノグラフィーチューブのもう一方の端をバイタルサインモニターに取り付けます。
注:実験中に、ひもがウサギの目の上に置かないようにすることが重要です。これを行うには、ウサギの耳の間の拘束剤の真ん中に文字列をテープします。カポノグラフィー信号を改善するために、テープとTピースに酸素を入れ込む薄いニトリルを使用して一方通行バルブを作成し、吐出したCO2をカポノグラフィーチューブに導きます(図4I)。
3. ビデオ-EEG-ECGの記録
- 市販のEEGソフトウェアを使用してビデオ-EEG-ECG記録を行う。
注:バイオポテンシャルリードとビデオは、後で電気信号とビデオ信号を相関させるために時間ロックされています(例えば、EEGスパイクとミオクロニックジャーク)。 - ベースラインドリフト、60 Hzの電気ノイズ、高い信号対雑音比を備えた最適な接続性を確認します。具体的には、心波形の各相をECG上で可視化し、デルタ波、シータ波、アルファ波がEEG上の高周波ノイズによって視覚的に隠されていないことを確認します。
- すべての電極が過度のノイズを発生させる場合は、中央基準リードを調整します。1つの電極だけが過度に騒がしい場合は、その電極を皮膚の奥深くに押し込むか、金属が露出しなくなるまで位置を変更します。
- すべてのウサギが同時に見ることができるようにビデオを調整し、運動活動とEEGの所見の相関を可能にします(図5A)。
注:システムは最大7匹のウサギからの同時EEG/ECG/オキシメトリー/カプノグラフィー録音を収容する。 - 最低10〜20分間、または心拍数が穏やかなリラックス状態(200〜250 bpm)に安定するまで、各動物からベースライン記録を開始し、ウサギは少なくとも5分間大きな動きを示さない。フィルターなしで完全な帯域幅の電気的なデータを得る。データをより良く視覚化するために、低周波数フィルタ(=ハイパスフィルタ)を1 Hzに設定し、高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)を59 Hzに設定します。
注:ウサギがリラックスしているもう一つの兆候は、EEG睡眠スピンドルの発症です(後述します)。 - リアルタイムでの実験中に時間ロックされたメモを追加して、介入(例えば、薬物送達)および神経心事象(例えば、脳電スパイク、運動発作、異所性拍動、不整脈)、および運動/研究者の人工物のタイミングを示す。
注:調査官が介入(例えば、恐怖刺激、薬物送達)を適用する必要がある頻度のために、調査官が部屋に出入りし、ドアを開閉するストレスを最小限に抑えるために、調査官は実験を通して部屋の反対側にとどまります。研究者は可能な限り動物から遠くに座り、動物を邪魔する可能性を最小限に抑えるために静かに静かにしています。
4. 実験プロトコル
注:次の実験は、同じ動物に対して実行された場合、別々の日に実行されます。経口検査化合物薬物研究と急性末端痙攣薬研究の間には2週間の遅延がある。必要に応じて、感知刺激実験を行い、続いて30分待機し、次にPTZ薬物研究を行う。
- ウサギが拘束剤に順応し、研究者が心呼吸率の安定化を客観的に確認できるようにするために、すべてのウサギを心呼吸センサーおよび神経センサーで計器化し、動物1匹あたり1〜3回>連続的なビデオモニタリングを行います。
- 感知刺激実験
- 上記の方法に加えて、眼の高さでウサギの前部に円形反射器30cmの光源を配置し、フラッシュ強度を最大(16カンデラ)29に設定した。光源は 図4Eの白い点で示されています。
注:薄暗い部屋は、感光応答37を引き出すために使用されるべきです。 - ウサギの目は頭の前ではなく頭の側にあるので(人間のように)、ウサギの両側に2つの鏡を置き、ウサギの目に光が入るようにウサギの後ろに1を置きます。
注: 縦≥20cmの平らな鏡は、長さ120cm≥、ウサギの周りに三角形の囲いを作成し、点滅する光がウサギの目に入るようにします( 図4E参照)。 - 調整可能なレート、強度、および持続時間を持つコントローラーに光源を接続します。
- 赤色光と赤外線記録機能を備えたカメラを使用してビデオを録画します。
- 目を開けて30sの各周波数にウサギをさらし、顔を覆う外科マスクを持つ別の30 sを各周波数でシミュレートまたは引き起こします。
注:以前の研究では、目の閉鎖は発作に対する光感受性を引き出す最も挑発的な操縦であることを示しています29.また、感光患者の10%は、目を閉じている間に脳波の徴候を示すだけです。発作は、頭部および全身筋孔性ジャーク、クローヌス、または強壮状態の存在を観察することによって臨床的に同定することができる。脳波記録は、発作活動の確定診断のための運動症状を伴う脳波相関(例えば、スパイク、ポリスパイク、リズミカル放電)についてより徹底的に分析される。筋肉の人工物や不確定なてんかんの波によってEEGが隠されている動きは、確認のためにてんかん学者によって見直されるべきである。 - 2 Hz 単位で 1 Hz から 25 Hz までのフォティック刺激周波数を増加します。次に同じ光刺激プロトコルを実行しますが、今回は周波数を60Hzから25Hzに5 Hzずつ減らします。
注意:ウサギが発作を起こした場合は、実験を中止する必要があります。ウサギを30分間監視し続けます。その後、ハウジングルームにウサギを返し、完全な回復のために3時間のために1時間ごとに監視します。しかし、この感光刺激が光パルスの応答を誘導する場合、上昇周波数の残りの部分はスキップされ、別の光パルスの応答が起こるまで60Hzから降下して再び系列が開始される。これにより、上下のフォティック刺激閾値の決定が可能になります。フォティック刺激が中止された後に光パルスマル応答が停止するため、遅延は必要ありません。光パルスマル応答が発生したかどうかが不明である場合、周波数は10s遅延38の後に繰り返される。 - 実験が完了したら、ウサギからEEGと心電図のリードを取り除き、夫のスタッフによる日常的なケアのために自宅のケージに戻します。
- 上記の方法に加えて、眼の高さでウサギの前部に円形反射器30cmの光源を配置し、フラッシュ強度を最大(16カンデラ)29に設定した。光源は 図4Eの白い点で示されています。
- 薬の経口投与
- 多くの薬が経口で服用されているように, 食品グレードのリンゴソースと混合して経口化合物を準備します。.0.3 mg/kgのE-4031を3mLのリンゴソースで混ぜ、針なしで3mL経口/灌漑注射器にロードします。
注:いくつかの薬は、この方法で投与することができます, テスト化合物, QTの持続時間を変更することが知られている薬 (モキシフロキサシンまたはE-4031), 陰性制御または車両.いくつかの薬物は、静脈内製剤では利用できません.さらに、多くの薬は経口製剤で処方されるため、静脈内投与は臨床的関連性が低い可能性があります。 - 上唇を持ち上げ、ウサギの歯に塞がらないウサギの口の側面に口腔注射器の先端をスライドさせ、すべての薬とリンゴソースをウサギの口に注入します。
- ビデオ-EEG-ECGの記録を2時間続け、定期的なケアのために動物を自宅のケージに戻します。
- 実験2日目と3日目に、ウサギをビデオEEG-ECGに接続し、ベースラインの10〜20分を記録し、同じ薬を注入し、2時間記録します。
- 1週間のウォッシュアウトの後、ベースラインの10〜20分を行い、各ウサギに3日間連続してプラセボの単回投与を与え、2時間記録する。
注:経口薬の投与は、プラセボが第1週と第2週の薬の間に与えられるクロスオーバー研究として設計され得る。
- 多くの薬が経口で服用されているように, 食品グレードのリンゴソースと混合して経口化合物を準備します。.0.3 mg/kgのE-4031を3mLのリンゴソースで混ぜ、針なしで3mL経口/灌漑注射器にロードします。
- 静脈内投薬実験(ペンチレンテトラゾール、PTZ)
- 外耳静脈を可視化するために、ウサギの耳の後部表面を剃る。70%エタノールワイプを使用してサイトを消毒し、限界耳静脈を拡張します。これは、 図 4Fの黒い破線の楕円で示されています。
- この時点で、1人の実験者がウサギに対する手順のストレスを軽減するために、ウサギの顔を手で覆います。第2の実験者は、滅菌25-G血管カテーテルで限界耳静脈を慎重にカニューレ化する。
- カテーテルが静脈に入ったら、針が静脈内に薬を導入できるように、カテーテルの端に無菌注射プラグを置きます。射出プラグの位置は 、図4Gの青い円で示されています。
- 4 x 4 インチガーゼをテープで包み、チューブ状にしてウサギの耳の中に置いて副木を作ります。その後、カテーテルが所定の位置に固定され、非カテーテル化された耳と同様に直立したままになるように、副木を耳にテープで留めます。
- 1mLの10 USP単位を1mLのヘパリニ化生理的な生理液を注入する。
注意:カテーテルと容器は目に見えて空気を取り除き、特許を残す必要があります。カテーテルが血管内に存在しない場合、注射器は容易に押されず、皮下組織に生理食音が蓄積する。 - 1 mg/kg から 1mg/kg の 1 mg/kg 単位で 10 mg/kg 単位の PTZ の増分用量を 10 分ごとにウサギに与えます。各用量の開始時にメモを取り、どの動物が注射されているか、そして薬の濃度を示します。
注: これにより、PTZ 管理の急性および加法的効果の評価が可能になります。あるいは、低用量PTZの慢性的な影響をさらに評価するために、ウサギは各低用量濃度で反復投与を行い、2mg/kgで7回投与し、5mg/kgで3回投与し、次いで10mg/kgで3回投与し、各用量は10分で分離される。 - 各用量の後、任意の神経心の電気および呼吸異常およびてんかん活動の視覚的証拠に対するビデオ-EEG-ECG-カプノグラフィー-オキシメトリーを注意深く監視する。リアルタイムおよび後分析中にこれらの変更に注意してください。
注:発作活動は、PTZ管理の60s以内に開始することがよくあります。
5.非生存実験の結論
- もし、ウサギがPTZ実験の過程で突然死しなかった場合、体重4.54kg(または全てのウサギに対して1.5mL)に対してペントバルビタールナトリウムの1mLを投与し、続いて正常な生理塩水の1mLフラッシュを行う。心電図を監視して、ウサギが心停止を受けることを確認します。
- ウサギが心停止を経験したら、心臓、肺、肝臓、脳、骨格筋、その後の分子/生化学的分析に必要なその他の組織を含む様々な器官を新たに分離するために壊死を迅速に行う。
- 機関の方針に従ってウサギを処分する。
6. ECGの分析
- 市販の心電図解析ソフトウェアを使用して、心電図を目視で検査し、頻脈、徐脈、異所性拍、その他の不整脈の期間を特定する(図6)。レビューするデータの量を減らすために、タコグラムを作成し、頻脈、徐脈、またはRR間隔の不規則性の期間を容易にする。
注:ECG異常(例えば、QTの延長 )および不整脈は、速度の異常(例えば、ECGを見直すことによって手動で識別される、 ブレイディ/タキ性不整脈、リズム(例えば、早期心房/心室複合体)、伝導(例えば、房室ブロック)、波形(例えば、非正気心房/心室頻脈および線維化)不整脈は、RR間隔の不規則性のタコグラムを見直すことによって検出することができる。頻脈は、心拍数が毎分300拍を超えるタコグラムのセクションによって識別することができる。徐脈は、心拍数がタコグラムで毎分120拍未満である場合に識別される。 - 市販の心電図分析ソフトウェアを用いて、ベースラインおよび挑発時に標準心電図測定(心拍数、心拍間隔)を行う(例えば、動物を操作する研究者、試験剤の投与、発作誘発心電図変化)。
7. ビデオ-EEGの分析
- 市販のソフトウェアを使用してビデオおよびEEGトレースを視覚的にスクロールして、ベースライン信号(図7)、睡眠スピンドル(図8)や頂点波などの期待されるEEG放電の存在を特定する(図9)。
注:全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されますが、低周波数フィルタ(ハイパスフィルタ)を1Hzに設定して表示し、ナイキストの定理に基づいて、高周波フィルタ(つまり、ローパスフィルタ)を120Hzに設定して信号を逃さないようにします。フィルターは、低周波(<25 Hz)のEEGアクティビティをレビューする際に、より良い視覚化とノイズリダクション(例えば、1〜59 Hz)を可能にするために調整することができます。 - カポノグラフィー波形に加えて、脳波で鼻の動きアーティファクトを使用して、呼吸の有無を判断します。これは、ビデオ録画で見られる鼻の動きとも相関することができます。
- PTZの各投与後少なくとも1分間のてんかんと非てんかん(例えば、意識的)の動きを区別するために市販のソフトウェアを使用してビデオおよびEEGトレースを視覚的にスクロールする(図10)。発作の前後に、頭間てんかんの排出とEEGの変化をスキャンします。発作は、頭部および全身筋孔性ジャーク、クローヌス、またはEEG相関を有する強壮状態の存在を観察することによって臨床的に同定することができる。EEGの変化には、EEGスパイク、ポリスパイク、リズミカル放電が含まれる場合があります。
注:脳波が筋肉の人工物または不確定性てんかんの波によって隠されている動きは、確認のために神経科医によって見直されるべきです。ビデオを1つのウサギに焦点を当てて、その動作だけでなく、そのEEGとECGの録音をより密接に見る方が有利かもしれません(図5B)。 - PTZ注入後1分以内に発生する運動症状の種類と重症度に基づいて発作のビデオ-EEGをスコア付けする(表1)。
- 感光刺激実験の後、市販のEEG解析ソフトウェアでスペクトル解析プロットを作成することにより、後頭部駆動リズムの有無についてEEGの後頭部を解析する。後頭部駆動リズムは、感知刺激器の周波数に対応するスペクトル解析でピークを作り出す(図11)。
注:感音刺激は、基本周波数のピークに加えて、高調波周波数ピークを生成することがあります。
7. 呼吸機能の解析
- バイタルサインモニタからの出力を確認し(図4I)、信号をエクスポートしてさらなる分析を行います。
- 発作時および発作後の呼吸パターンの変化、特に無呼吸が始まる時点に注意してください。
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Representative Results
上記の方法は、呼吸障害だけでなく、脳や心臓の電気伝導系の異常を検出することができる。データ取得ソフトウェアは、ECG形態を評価し、異常な心拍数、伝導障害、または心電図リズム(心房/心室異所性拍、および徐脈性不整脈)を検出するために使用される(図6)。ECGの形態を視覚化することに加えて、トレースは、RR間隔、心拍数、PR間隔、P持続時間、QRS間隔、QT間隔、QTc、JT間隔、およびTピークからT終了間隔を定量化するために分析される。このデータの分析は、タキ/ブレイディ-不整脈が容易に検出されることを示す。
ECGデータの分析に加えて、EEGデータも分析されます。ベースラインEEGを収集し、スペクトル分析を使用して分析した(図7)。このデータは、後頭部リードが正面リードよりも高い振幅を有し、すべてのリードの主な周波数がデルタ範囲であることを示しています。高い信号対雑音比でウサギのEEGを記録できることは、てんかんの放電を検出し、記録に関するさらなる分析を行うために重要です。人間の睡眠スピンドルと同様の形態と頻度を持つ波を図8に示す。図 9に、ヘッドの中心から発生する頂点波を示します。通常のEEG変化に加えて、ベースライン記録中の様々な意識的な非てんかんウサギの動きも、てんかんの排出物と区別するために注目されている(図10)。ビデオ-EEGのビデオ-EEGの映像は、他の動きだけでなく、補足ムービー1-11で利用可能です。
発作を誘発しようとするいくつかの方法が実施された。最初の方法では、目を開けて閉じた状態で1〜60 Hzの場合に感電刺激を採用しました(図4E)。ウサギの目の位置は人間のように前部ではなく横方向であるため、鏡は単一の光源を使用してウサギの目に光を向けるために採用されています。3Hzでの感知刺激実験からのEEGの分析は、予想される3Hz周波数での強い後頭駆動応答を示す(図11)。感動刺激に加えて、ウサギは、左の外耳静脈のカテーテルを介してペンチレンテトラゾール(PTZ、GABAAブロッカー)を注入する(図4G)。PTZの注入は、1分内の発作活動の様々な程度を引き起こし、異なるEEG波形に関連している。シータバースト、大振幅シータバースト、ポリスパイク波、低電圧ポリスパイク波、リズムガンバースト、電気脳沈黙(ECS)を含むいくつかの代表的な波形を、図12、図13、図14、図15、図16、図17に示す。
発作を特定するためにいくつかの基準が使用される。ビデオは、可能な発作の運動症状を特定するために見直されます。次に、運動活動がてんかん活動の結果であることを確認するために、EEG信号は、時間的に相関するEEGスパイク、ポリスパイク、鋭波、またはリズミカル放電について評価される。疑わしい場合は、ビデオ-EEGは、検証のために第二の調査官および/またはてんかん学者によってレビューされます。発作開始は、リズミカルなEEG排出(EEG発作開始)および運動活動(臨床発作開始)の最初のインスタンスとして定義される。EEGおよび臨床発作は、リズミカルなEEGスパイクおよび運動活動の停止がそれぞれ観察される場合に終了する。様々なEEG波形態に加えて、ウサギはますます一般化し、ますます長引く運動発作を経て進行した。ラシーン発作スケールも、その修正版も、拘束されたウサギには適用できないため、発作スケールが作成されました(表1)。代表的な運動発作活動のビデオは、補足ムービー17、補足ムービー18、補足ムービー19、補足ムービー20、補足ムービー21、補足ムービー 22に示されています。
ここで示す方法は、発作媒介性突然死に先立つ事象の多系統連鎖を決定することもできる(図18)。様々な病理には、電気脳沈黙(ECS)、呼吸停止(無呼吸)、ブレイディ/タキ性不整脈、心停止(収縮期)が含まれる。実験中、1匹のウサギは薬理学的に誘発された発作を起こした後に突然死を経験した。このウサギでは、呼吸停止、次にECS、房室ブロック、いくつかの非持続性頻脈、徐脈、そして最終的には収縮期から始まる配列があった。
図1: 実験プロトコルの概要 このプロトコルの主要な手順の概要を提供するために、図が作成されました。この図は、記録装置を準備し、その後に装置をウサギに接続し、高品質の信号が観察されることを確認する必要があることを概説しています。このステップの後、意図した実験を行うことができる、臓器を調達し、ビデオ-脳電図-ECG-カプノグラフィーオキシメトリーデータを分析することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 実験装置 実験用セットアップの図は、コンピュータ、赤外線、マイク、ビデオカメラ、バイタルサインモニター、64ピンヘッドボックス、アンプ、デジタイザ、8電極(5 EEG、3 ECG)+ヘッドボックスに接続されている動物ごとに地面を含む。リードは、次に従って色分けされています: 4 青 EEG, 1 黒 EEG 参照, 3 赤 ECG, 1 緑地.ウサギを保持する抑制ボックスは表示されません。この設定により、最大7匹のウサギを同時に記録できます。黄色の線は、キャップノグラフィチューブを表し、バイタルサインモニターにフェイスマスクを接続します。青い線は、バイタルサインモニタに接続されているオキシメトリー線を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:EEG電極とECG電極の画像(A)ベントECG電極とストレートEEG電極(B)ウサギの皮下組織にECG電極を引っ掛ける方法を通り抜ける。略語(LL:左肢、RA:右腕、RL:右肢、LA:左腕、RF:右前頭、LF:左前頭、Cz:中央、RO:右後頭部、LO:左後頭部)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:機器に接続されたウサギ(A)ECG電極の位置、左腕は黄色い点で示されている。右腕は白い点で示されます。左足は赤い点で示されます。右脚の前足の地面は緑色の点で示されます。(B)ECGおよびEEG電極が付いている抑制剤のウサギ。(C)ウサギの下にブースター、首の泡とカットPVCパイプを含む小さなウサギを収容するために適切な修正を有する拘束剤で若いウサギ。(D) EEG電極の位置を持つサシッカーのウサギ。右正面はオレンジ色の点で示されます。左正面は赤い点で示されます。右後頭は黄色の点で示されます。左後頭は青い点で示されます。参照は黒い点で示されます。(E)恐怖症刺激剤とミラーブースのセットアップを備えたサビサーのウサギ。光源は白い点で示されます。(F)ウサギの耳が剃られ、アルコールで拭かれた後の限界耳静脈。(G)血管カテーテルを持つウサギは、左の限界耳静脈にしっかりとテープでつながれた。射出プラグの部位は青い点で示される。(H)一方行バルブを含むTピースでカプノグラフィーチューブに付着したフェイスマスクを持つウサギ。(I) キャプノグラフィーチューブに接続されたフェイスマスクとTピースの図。インスピレーションの間に、部屋の空気は一方通行弁(緑の矢印)を通してTピースに入ることができる。有効期限の間、CO2は、キャプノグラフィーチューブ(黄色の矢印)に入ることによってTピースを残します。死んだスペースの量が少ないため、TピースにほとんどCO2が保持されず、一般的に5mmHg未満です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:同時ウサギビデオ-脳脳-ECG-カプノグラフィーオキシメトリー. (B)ラビット#2からの同時ビデオ-EEG-ECG記録のビューでズーム。(LL:左肢、RA:右腕、LA:左腕)(C) カプノグラフィー(黄色)とプレチスモグラフィー(青色)の同時記録。この図には、影響を受けたCO2、終点潮汐CO2、呼吸数、脈拍数、パルスオキシメトリーを示す測定値が含まれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: ウサギのECG.(A) ベースライン ECG.リードは、標準的な双極前立面の四肢リード構成とユニポーラ構成(RA:右腕、LL:左肢、LA:左腕)で、Czリードを頭部にリファレンスとして示しています。(B) 早期心室複合体.(C) シナス・ブラディカルディア(D) シナス頻脈.(E)P波開始、P波ピーク、P波端、QRS波開始、QRS波ピーク、QRS波端、STセグメント高さ、T波ピーク、T波端を標識したベースラインウサギECGトレース。(F)ECG測定。心拍数を除くすべての測定値はミリ秒単位で、1分あたりの拍数です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: ベースラインEEGおよびスペクトル解析. (A) ベースライン記録中のEEGトレース(B)EEGのスペクトル分析は、デルタ波動活動が全てのリードにおいて支配的な周波数であることを示す。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されましたが、1Hzに設定された低周波フィルタ(=高パスフィルタ)と120Hzに設定された高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)でデータが表示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: 睡眠スピンドルEEGトレースとスペクトル解析(A) 睡眠スピンドル中の EEG トレース。(B)脳波のスペクトル分析は、ヒトの睡眠スピンドルに関連する周波数に類似した12〜15Hzの追加波の存在を示す。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。(C) 睡眠スピンドルの複数の脳のモンタージュは、それらが人間の発見と一致している頭部(Cz)の中心から生じることを示す。全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=高パスフィルタ)と59 Hzに設定された高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。
図9:頂点波トレースとスペクトル解析を行う。(B)頂点波のスペクトル解析では、頂点波の周波数に大きな違いは見られない。これは、視覚的に周波数が1Hz未満であるために予想されますが(C)頂点波の複数の脳波モンタージュは、人間の発見と一致する頭部の中心から生じることを示しています。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:ウサギの動きによって引き起こされるEEGアーティファクト。 (B) 左目まばたき時の EEG(C) 呼吸の存在に関連する鼻のリズミカルな動きの間のEEG.(D)の動きを舐める時のEEG。(E)頭を下げるウサギのエピソードの間にEEG。(F)全身の複雑な意識的な動きの間のEEG。これらの動きのビデオ-EEGは補足映画3-11で利用可能です。全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=高パスフィルタ)と59 Hzに設定された高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。
図11: 泳動中のEEG( A)3Hzの目を開いた3Hzの感知刺激の間に、EEGトレース。(B)後頭リードに見られる3Hzのピークを有する3Hzの感光刺激のスペクトル分析は、前頭リードではない。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図12: シータバーストのEEGトレースとスペクトル解析シータバーストは、すべてのEEGリードで断続的に見られます。これらの波の周波数は約4-6 Hzです.デルタ(δ:最大4 Hz)シータ(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:32Hz)波(≥ γ:32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図13:大振幅シータバーストのEEGトレースおよびスペクトル解析大きな振幅シータバーストはシータ波に外観と周波数が似ていますが、振幅が大きくなります。振幅の急激な変化は、これらの波の一部をより鋭く見せます。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。ビデオ-脳-ECGの記録は補足ムービー12で示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図14:ポリスパイク波のEEGトレースとスペクトル解析ポリスパイク波は断続的に、同時にすべてのリードで見られます。スペクトル解析では、6 Hz(δ:最大4Hz)シータ(θ:4〜8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波の周りに基本周波数を持つ複数の高調波ピークがあります。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。ビデオ-脳-ECGの記録は補足ムービー13で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図15:低電圧ポリスパイク波のEEGトレースとスペクトル解析低電圧ポリスパイク波はポリスパイク波に似ていますが、振幅は低くなります。スペクトル解析は、ポリスパイクの分析と似ています。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図16:リズミカルガンマバーストのEEGトレースとスペクトル解析バーストパターンのリズミカルガンマバーストは、前リード線で最もはっきりと見られます。周波数解析では、前導線に50〜55 Hz前後で見られる追加のピークがあります。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されたが、1Hzに設定された低周波フィルタ(=高パスフィルタ)と120Hzに設定された高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示された。ビデオ-EEG-ECG記録は補足ムービー14に示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図17: ポストヒタル一般化されたEEG抑制のEEGトレースおよびスペクトル解析対応する周波数ヒストグラムを用いた後方一般化されたEEG抑制。デルタ(δ:最大4Hz)シータ波(θ:4-8 Hz)波アルファ(α:8-15 Hz)波ベータ(β:15-32 Hz)波ガンマ(γ:≥32Hz)波。Y軸は、ログパワースペクトル密度10*log10(μV2/Hz)です。全帯域幅の電図データはフィルタなしで取得されましたが、データは1Hzに設定された低周波フィルタ(=ハイパスフィルタ)と59 Hzの高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)で表示されました。ビデオ-脳脳-ECGの記録は補足ムービー15で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図18: 発作後の突然死のシーケンス 一匹のウサギがPTZプロトコルの間に突然死を経験し、死のシーケンスが詳細に説明されています。脳波の症状は緑色で示されています。時間ゼロは発作の臨床的終わりである。その後、ポスト・アイクタル・エレクトロ・サイレンス(ECS)が続きます。呼吸データは赤で示され、無呼吸の発症を示す。心電図情報は、青色の色合いで示されています。このウサギは、心臓ブロック、複数の頻脈性不整脈、徐脈、そして最終的には黒星によって示される収縮期を経験した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:拘束されたウサギの発作スケール.発作の重症度の増加は、ますます持続し、より一般化されたてんかん運動活動に関連している。ビデオの例は 、補足映画 17-22で入手できます。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足映画1:ベースラインウサギビデオ-脳脳-ECGは、ライトをオンにして記録します。 ウサギが拘束剤に置かれた後、ウサギはよりリラックスして、ベースライン録音を行うことができます。ビデオは、ウサギがこの記録中に動いないことを示しています。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー2:ベースラインウサギビデオ-脳脳-ECGは、ライトをオフにして記録します。感光の実験を行うためには、室内の照明をオフにする必要があります。部屋の中でライトを消しても、EEGまたはECGの記録に大きな影響はありません。重要なことに、ビデオカメラは、ウサギが暗闇の中で見ることができるように赤外線を持っています。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー3:左目の動きから筋肉のアーティファクト。この論文で説明する方法は、筋の人工物とてんかんの排出を識別することができます。この周期的な大振幅波は発作と混同する可能性がありますが、左目の動きと同時に起こり、筋肉活動によって引き起こされる可能性が高くなります。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー4:左目のまばたきからの筋肉のアーティファクト。ビデオ-EEGの記録は、EEG上で目の点滅を検出し、また、それがビデオで見られる目の点滅と同時に発生することを決定することができます。目の点滅は、左側のEEGリードに横向きにします。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 5: 顎筋からの筋肉のアーティファクト. ビデオ-EEGは頭と首の小さな筋肉の動きを検出することができます。ビデオは、この動きが脳からのてんかんの排出の代わりに筋肉によるものであると判断するのに非常に貴重です。予想通り、この動きに関連する信号は後頭リードから生じる。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足映画 6: 舐めから筋肉のアーティファクト. EEGトレースは、発作活動と一致する可能性のある大きなリズミカルな鋭い波を示しています。ビデオは、これらの波が舌の動きによって引き起こされ、てんかんの排出ではないことを示しています。予想通り、この動きに関連する信号は後頭部から生じる。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー7:口の動きからの筋肉のアーティファクト。デルタ範囲で見られる新しい波は、口の動きに関連付けられます。重要なことに、これはシータ波が現れたときに口の動きを視覚化することによって、断続的に二次性脳症に対して減速と区別することができる。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー8:ヘッドターンからの筋肉のアーティファクト。前頭リードに見られる振幅の大きく、遅く、一過性の減少は、ウサギの頭の回転に関連しています。動きの前にてんかんの排出が存在しないことに注意することが重要です。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー9:ヘッドエクステンションからの筋肉のアーティファクト。大きく、遅く、一時的な振幅の増加は、ウサギが頭を持ち上げているとき、すべてのリードで見られます。動きの前にてんかんの排出がない。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー10:頭部屈曲からの筋肉のアーティファクト。ウサギが頭を下に伸ばすと、すべてのリードの振幅が非常に大きく低下します。動きの前にてんかんの排出がない。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー11:複雑な動きからの筋肉のアーティファクト。 サクサーにいる間、ウサギは頭とその全身を含む複雑な動きをします。これは、発作誘発薬が与えられる前に、ベースライン記録中に発生しました。この急速に起こる動きは、EEG上で高振幅および高周波バーストとして記録された。さらに、前頭リードに見られるリズミカルな鋭い波は、ビデオ上の波と同期して見ることができる鼻の動きによるものです。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー12:大振幅シータバーストのビデオ-EEG。PTZ注入後、いくつかのウサギは、すべてのリードでEEGの断続的な減速を示した。これらの異常な波は、通常、動きと関連していなかった。シータ範囲の波のこれらのバーストは、発作活動の典型的なものではありませんが、それらは人間の脳症に関連しています。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 13: ポリスパイクのビデオ-EEG. 鋭い波は、注射後、発作中、または後回期にすぐに見ることができます。これらの知見は、ヒトに見られるものと同様であり、発作活動に関連している。ポリスパイクの間に、右耳はけいれん、発作の物理的な症状に気づく。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー14:リズミカルガンバーストのビデオ-EEG。高周波バーストは、ビデオに示すものと同様に、PTZの後回し投与後に時折発生する場合が多い。これらの高周波ガンマガンバーストの生理学的原因は不明である。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 15: ポスト一般化脳症抑制のビデオ-EEG. ポストヒタル期間において、特に一般化されたトニッククローニック発作の後、すべてのリードにおいてEEGの抑制がしばしばある。ポストヒタル期間中の大きな振幅偏向は、ミオクロニックジャークからの筋肉の人工的な原因であることが示されています。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー16:電気脳沈黙のビデオ-EEG。このビデオでは、この方法の高い信号対ノイズ比を示します。最小のEEG活性を使用すると、EEGからの評価信号はありません。この特異性は、脳死の時間を決定する際に重要です。また、脳死後に残留心機能が生じることが多いということに留意すべきである。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 17: 発作スケールステージのビデオ-EEG 0. 発作のスケールは発作の広がりおよび持続時間を決定することによって運動の発作の重症度を等級付けするように設計されている。段階0では、目に見える発作活性はありませんが、EEGではてんかん放電が見られる可能性があります。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 18: 発作スケールステージのビデオ-EEG. 発作スケールのステージ1は、短い部分的な発作の存在によって識別される。一般的に部分的な発作は、他の身体部分ではなく、頭部に限定される。これは、単一の頭ジャーク、単一の耳のけいれんまたはEEG上のてんかん放電に関連する他の短い、非リズミカルな運動活動として現れる可能性があります。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 19: 発作スケールステージのビデオ-EEG ステージ 2. 発作スケールのステージ2は、非持続全身発作によって同定される。多くの場合、全身はミオクロニックジャークを受けます。これは、リズミシティの欠如によって後の段階と区別されます。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 20: 発作スケールステージのビデオ-EEG ステージ 3. 発作スケールのステージ3は、運動症状の点で頭部に限定された持続的でリズミカルな発作によって識別される。示されているウサギは、耳とまぶたのリズミカルなけいれんを持っています。ウサギは短い全身筋液性ジャークを経験するが、リズミカルな全身けいれんに進行しない。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 21: 発作スケールステージのビデオ-EEG ステージ 4. 発作スケールのステージ4は、全身を含む持続的でリズミカルな発作によって識別される。ビデオで見られるように、ウサギの体はミオクローヌスに関与していますが、耳、目、頭の動きは比較的少ないです。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 22: 発作スケールステージのビデオ-EEG ステージ 5. 発作の強壮相と凝固相の両方の存在によって識別される場合の発作スケールの最終段階。最初は体全体のまとまりの動きがある。これは、強壮剤の段階が続き、次いで発作が解決するまで発作のクローニック段階によって行われる。時折、ウサギはこの段階の後に突然死を経験するが、彼らはより低い重症度の発作の後に死ぬことはめったにありません。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この実験的なセットアップは、特に心臓および/または神経疾患のモデルにおいて、ウサギにおける詳細な同時ビデオ-EEG-ECG-オキシメトリー-カプノグラフィーの記録および分析を促進する。この記事の結果は、この方法が発作や不整脈を検出し、それらを電図アーティファクトから区別することができることを示しています。ウサギにプロコンバルサントを与えたときに期待される結果が得られ、発作を引き起こした。ビデオ-EEGの記録から得られたデータは、運動発作の重症度の増加と、感知性の高まり、例えば、感電反応、脳症およびてんかんの排出を区別するためにさらに分析することができた。種々のタイプのてんかんの排出は、さらに特徴付け、運動活動と相関していた。ECGの分析は、高いシグナル対雑音比を生み出し、心周期の各電気相関の同定と定量を可能にする方法を実証した。この方法はまた、早期心室複合体、徐脈、心臓ブロック、頻脈、頻脈性不整脈および収縮期を含む心臓異常の存在を検出することができた。多系統疾患の神経・心臓相互作用をさらに調査するための堅牢な方法の開発は、これらの疾患をよりよく理解するために必要な重要な技術進歩を提供する。さらに、時間の経過に及う呼吸機能のモニタリングは、発作後の呼吸不全の理解と突然死への寄与を促進する。
このセットアップはまた、心臓の安全性試験などの薬物研究のための堅牢なシステムを提供します。これらの技術を用いた研究プロジェクトは、神経、心臓、呼吸症状の相互作用をリアルタイムで調査することができます。げっ歯類の心臓に関して多くの研究が行われてきたが、イオンチャネル発現、作用電位特性、心電図測定はヒトに類似しているので、ウサギの心臓の結果は翻訳研究に適している。これは、臨床的に使用されるビデオ-EEG-ECGセットアップであるため、将来的には、ブタ、イヌまたは羊などの大型哺乳類にも同じ設計を適用することができます。さらに、この記録設定は自由に動くウサギの頭蓋内脳細胞モニタリングに使用することができ、様々な生理学的状態、自発的な神経心事象を取り巻く、そして突然死に先立つより広範な記録を可能にする。これらの方法は、SUDEPのメカニズムを解明し、脳と心臓の疾患の治療に向けた新しい治療法を見つけるために非常に貴重です。
この記事で紹介するプロトコルには、高い信号対ノイズ比のデータを生成するために従わなければならない多くの重要な手順があります。重要なのは、実験が始まる前に、ウサギは脊髄損傷を引き起こし得る大きな身体の動きを制限するために、拘束剤で固定されなければならない。すべての電極は信号の質のために点検される。すべての電極が騒がしい場合は、参照電極を交換して信号を改善することができます。単一の電極が騒がしい場合は、その1つの電極を皮膚の奥深くに押し込むか、取り外して再移植する必要があります。実験中、ウサギの動きが電極を変位させる可能性があります。できるだけ早く、カメラの視界を妨げずに電極を交換して、実験からデータを収集できるようにします。
この研究で概説されている方法論の利点は、研究者が多数の動物をスクリーニングすることを容易にし、費用対効果が高い。このプロトコルには制限があります。ウサギに対する拘束の生理学的影響を具体的に調べる研究はほとんど行われていないが、ウサギは拘束を非常に良好に許容していることがわかった。聴覚システムの多くの研究は、光の拘束で目覚めウサギに行われてきた。これらの条件下では、ウサギはストレスや不快感の兆候なしで何時間も静かに座っています39.拘束剤に入れられた後、ウサギはめったに拘束者を逃れようとしません。彼らは、EEG上の睡眠スピンドルの存在によって指摘されるように、ベースラインに近く、しばしば眠りに落ちる心拍数を示す。ウサギは、ストレスを感じていることを示唆する視覚、心拍数、または他の症状を示しません。
今後の方向性は、遠隔測定EEGおよびECG記録のためのシステムを開発することです。これにより、様々な生理学的状態、自発的発作の検出、てんかんにおける突然の予期せぬ死に先立つ神経-心臓変化のカスケード(SUDEP)の間のより詳細な分析が可能になる。技術的な制約とウサギのEEGに関する相対的な文献の欠如のために、提示された方法が最初に開発されました。この方法を自由に動かすウサギに適応させるためには、連続的なビデオモニタリング、頭蓋内脳脳インプラント、皮下脳電図電極が必要です。しかし、慢性呼吸カポノグラフィーは実現不可能であろう。制度規制(IACUC)により、方法論は≤5時間の記録を拘束者に提供します。げっ歯類では、発熱、聴覚、最大電気ショック、過換気、睡眠不足、薬物誘発発作16、40、42、43などの挑発的な手段を用いて、閾値、ダイナミクス、および発作の種類を評価することが一般的である。このプロトコルは、前述の挑発的な措置のいずれかをテストすることを可能にします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、この研究が米国心臓協会、米国てんかん学会、SUNYアップステート薬理学省からの助成金によって支持されたことを認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container | PFIZER (HOSPIRA) | 7983-09 | Dilutant |
| 10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle | Sur-Vet | SS-10L2025 | Used as a flush after drug injection |
| 4x4 gauze sponges | Fisher Scientific | 22-415-469 | Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter |
| Apple Sauce | Kirkland | 897971 | Vehicle for oral medications |
| Computer | Dell | Optiplex 5040 | Acquisition computer |
| E-4031 | Tocris | 1808 | Agent known to prolong the QT interval |
| ECG Electrode | RhythmLink | RLSND116-2.5 | 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEG Electrode | RhythmLink | RLSP513 | 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEGLAB (2020) | Swartz Center for Computational Neuroscience | Open Access | Can perform spectral analysis of EEG |
| Ethernet-to-ethernet adapter | Linksys | USB3G16 | Adapter for connecting the camera to the computer |
| Euthanasia-III Solution | Med-Pharmex | ANADA 200-280 | Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance |
| Foam padding | Generic | N/A | Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression |
| Heparin Lock Flush | Medline | EMZ50051240 | To maintain patency of angiocatheter |
| IR Light | Bosch | EX12LED-3BD-8W | Facilitates recordings in the dark |
| LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) | ADInstruments | N/A | ECG Analysis |
| JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge | Smiths Medical | 3060 | Used to catherize marginal ear vein |
| MATLAB (R2019b, Update 5) | MathWorks | N/A | Required to run EEGLAB |
| Microphone | Sony Stereo | ECM-D570P | Recording of audible manifestions of seizures |
| Micropore Medical Tape, Paper, White | 3M | 1530-1 | Used to secure wires and create ear splint |
| Natus NeuroWorks | Natus | LC101-8 | Acquisition and review software |
| Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume) | Sigma-Aldrich | 88580 | Dilutions prepared in saline |
| Photic Stimulator | Grass | PS22 | Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses |
| Plastic wire organizer / bundler | 12Vwire.com | LM-12-100-BLK | Bundle wires to cut down on noise |
| PS 22 Photic Stimulator | Grass Instruments | BZA641035 | Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity |
| PVC pipe | Generic | N/A | Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury |
| Quantum Amplifier | Natus | 13926 | Amplifier / digitizer |
| Quantum HeadBox Amplifier | Natus | 22134 | 64-pin breakout box |
| Rabbit Restrainer | Plas-Labs | 501-TC | Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study. |
| Rubber pad (booster) | Generic | N/A | Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression |
| SpO2 ear clip | NONIN | 61000 | PureSAT/SpO2 |
| SpO2 sensor adapter | NONIN | 13931 | XPOD PureSAT/SpO2 |
| SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output | Sony | SRG-X120 | Impela Camera |
| Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer | Sur-Vet | 13882 | Used to inject intravenous medications |
| Veterinary Injection Plug Luer Lock | Sur-Vet | SRIP2V | Injection plug for inserting the needle for intravenous medication |
| Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply | Covidien | 5110 | To prepare ear vein before catheterization |
References
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