Summary
Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van beeldanalysesoftware.
Abstract
De ontwikkeling van gewervelde ogen is een complex proces dat begint aan het einde van de embryo-gastrulatie en vereist de precieze coördinatie van celmigratie, proliferatie en differentiatie. Time-lapse imagining biedt uniek inzicht in het gedrag van cellen tijdens de ontwikkeling van de ogen, omdat het ons in staat stelt om oculogenese in vivo te visualiseren. Zebravissen zijn een uitstekend model om dit proces te visualiseren vanwege hun zeer geconserveerde gewervelde oog en hun vermogen om zich snel en extern te ontwikkelen terwijl ze optisch transparant blijven. Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen worden sterk vergemakkelijkt door het gebruik van de transgene zebravislijn Tg (rx3: GFP). In de zich ontwikkelende voorhersenen markeert rx3: GFP-expressie de cellen van het enkele oogveld en GFP blijft tot expressie komen als het oogveld evaginat om een optische blaasjes te vormen, die vervolgens invagineert om een optische cup te vormen. Hoge resolutie timelapse beeldvorming van rx3: GFP-expressie stelt ons daarom in staat om het oog primordium door de tijd te volgen terwijl het zich ontwikkelt tot het netvlies. Lightsheet-microscopie is een ideale methode om oculaire morfogenese in de loop van de tijd in beeld te brengen vanwege het vermogen om dikkere monsters voor fluorescerende beeldvorming te penetreren, fotobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren en met een hoge snelheid te beeld te geven. Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van beeldanalysesoftware. De resulterende dataset kan waardevolle inzichten bieden in het proces van oculaire morfogenese, evenals verstoringen van dit proces als gevolg van genetische mutatie, blootstelling aan farmacologische agentia of andere experimentele manipulaties.
Introduction
Embryonale ontwikkeling is een complex proces dat de precieze coördinatie van veel verschillende gebeurtenissen vereist. De vorming van het gewervelde oog begint in de zich ontwikkelende voorhersenen, waar een deel van de cellen wordt gespecificeerd als het oogveld. Deze cellen zullen evaginaateren naar het oppervlak ectoderm, wat aanleiding geeft tot twee bilaterale optische blaasjes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Contact met het oppervlakte-ectoderm induceert vervolgens een invaginatie van het optische blaasje in een optische beker. Het oppervlakte-ectoderm zal aanleiding geven tot de voorste structuren van het oog, zoals de lens en het hoornvlies, terwijl de optische cup aanleiding zal geven tot het neurale netvlies en het retinale gepigmenteerde epitheel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Verstoringen in dit proces kunnen leiden tot aangeboren afwijkingen zoals microftalmie, anoftalmie en coloboom (MAC). Op dit moment zijn er geen opties om deze defecten te corrigeren 3,5,6,7,9,10,11,12. Verdere studies van de mechanismen van oculaire morfogenese en de problemen die kunnen leiden tot MAC zullen een basis van kennis bieden die mogelijk zal leiden tot behandelingen. Een krachtig hulpmiddel om het dynamische gedrag van cellen tijdens de oogontwikkeling te onderzoeken, is time-lapse imagining, waardoor dit proces in vivo en in realtime kan worden gevisualiseerd en gekarakteriseerd.
Zebravissen (Danio rerio) zijn een uitstekend model om vroege oculaire ontwikkeling te visualiseren met behulp van time-lapse beeldvorming. Ze hebben een sterk geconserveerd gewerveld oog en bezitten het vermogen om zich snel en extern te ontwikkelen terwijl ze optisch transparant blijven1. Zebravissen bieden een geweldige bron voor time-lapse beeldvorming vanwege deze kenmerken die zoogdiermodellen missen. Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen worden sterk vergemakkelijkt door het gebruik van de transgene zebravislijn Tg (rx3: GFP) 13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) is een transcriptiefactor die essentieel is voor de ontwikkeling van het oog14. Rx3 is de eerste van de drie rx-genen in de zebravis die tot expressie wordt gebracht en begint zijn expressie halverwege de gastrulatie, ongeveer 8 uur na de bevruchting (hpf)15,16. Het rx3:GFP transgen kan worden gevisualiseerd in de zich ontwikkelende voorhersenen vanaf de 1 somite fase (ss), ongeveer 10 hpf 15,17,18,19,20. In de zich ontwikkelende voorhersenen markeert rx3:GFP-expressie de cellen van het enkele oogveld en GFP (groen fluorescerend eiwit) blijft tot expressie komen door de rest van de oculaire morfogenese. Hoge resolutie timelapse beeldvorming van rx3: GFP-expressie stelt ons daarom in staat om het enkele oogveld door de tijd te volgen terwijl het zich ontwikkelt tot het netvlies 17,18,20.
Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen zijn voornamelijk uitgevoerd met behulp van confocale of Lightsheet-microscopie. Confocale microscopie is voordelig omdat het de nauwkeurige beeldvorming van monsters langs de z-as mogelijk maakt en het fluorescerende achtergrondsignaal vermindert. Het wordt echter beperkt door de hoeveelheid tijd die het kost om een afbeelding te verkrijgen, de stijfheid van de monsterpositie en de neiging tot fotobleaching en fototoxiciteit van levende monsters. Lightsheet-microscopie is een ideale methode om oculaire morfogenese in de loop van de tijd in beeld te brengen vanwege het vermogen om dikkere monsters te penetreren voor fluorescerende beeldvorming, verhoogde flexibiliteit in monsteroriëntatie, geminimaliseerde fotobleaching en fototoxiciteit en beeldvorming met een hoge snelheid 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 31. De ruimtelijke resolutie die haalbaar is met de huidige lichtplaatmicroscopiesystemen is ongeveer 250-500 nanometer (nm). Hoewel dit niet significant verschilt van wat kan worden verkregen met confocale microscopie, kan het monster vrij worden gedraaid en vanuit meerdere hoeken worden afgebeeld, waardoor zowel de beelddiepte als de resolutie worden verbeterd en veel meer flexibiliteit wordt geboden voor in vivo time-lapse beeldvormingsexperimenten dan het confocale platform27,32 . Om deze redenen wordt Lightsheet-microscopie snel de favoriete methode voor time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen. Dit protocol beschrijft de stappen voor het kwantificeren van oculogenese door middel van de beeldvorming van Rx3: GFP transgene zebravissen met behulp van een in de handel verkrijgbare Lightsheet-microscoop33 en beschrijft een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van het arivis-softwareplatform.
Protocol
Alle experimenten met het gebruik van zebravissen werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn opgesteld door de University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Monstervoorbereiding
- Zet een paringspaar Tg (Rx3: GFP) zebravis op in een omheinde kruistank de nacht voordat de beeldvorming is gepland. Trek de volgende ochtend aan de poort als de lichten aangaan in de visfaciliteit 34,35.
OPMERKING: Het paringspaar van geselecteerde vissen moet tussen de 4 maanden en 2 jaar oud zijn en gemakkelijk te onderscheiden zijn als mannelijk of vrouwelijk op basis van lichaamsvorm en kleuring35. - Controleer de kruisen elk half uur op embryo's en noteer hoe laat embryo's voor het eerst worden gevisualiseerd in de bodem van de kruistank. Breng de embryo's terug in een petrischaaltje en houd de embryo's ongeveer 10 uur op 28,5 °C om zich te ontwikkelen tot het 1-2 somietstadium (ss). Begin te beeldlen in de 1-2 somite fase (ss).
- Om te screenen op de aanwezigheid van somites, observeer je de embryo's onder een stereoscoop op 10 hpf en tel je het aantal somites1.
OPMERKING: Embryo's die zich buiten het enkele somietstadium bevinden, mogen niet voor dit experiment worden gebruikt. - Van de embryo's die zich in het enkele somite-stadium bevinden, wordt gescreend op GFP-expressie met behulp van een fluorescentieadapter in combinatie met een stereomicroscoop om de aanwezigheid van het Rx3: GFP-transgen te bevestigen. Zodra 3-5 GFP-positieve personen zijn geïdentificeerd, gebruikt u een fijne tang om de embryo's te dechorioneren en ze over te brengen in een kleine petrischaal met E3-embryobuffer met een glazen pipet35.
- Verdoof de embryo's door ze over te brengen in een microcentrifugebuis van 0,5 ml E3-embryobuffer (pH 7) met 0,168 mg/ml Tricaïne (MS222) in een microcentrifugebuis35,36. Spontane spierbewegingen beginnen al bij 17 pkf37. Zorg ervoor dat embryo's worden verdoofd om voorbij dit tijdspunt te beelden.
- Embed de embryo's in 1% lage smelttemperatuur agarose in 0,168 mg / ml Tricaïne en E3.
OPMERKING: Dit is de optimale concentratie van agarose bij lage smelttemperatuur om het embryo op zijn plaats te houden, maar buigzaam genoeg te blijven om de groei van het embryo gedurende de beeldvormingstijd30,31 mogelijk te maken. - Bereid een 10 ml oplossing van 2% lage smelttemperatuur agarose in E3 buffer. Verwarm het in een magnetron om agarose op te lossen met intervallen van 15 s, om te voorkomen dat de oplossing overkookt. Laat de oplossing voldoende afkoelen om zonder ongemak vast te houden, maar niet zo veel dat het stolt en geen schade toebrengt aan de embryo's. Zodra de agarose voldoende is afgekoeld, voegt u 0,5 ml toe aan de embryo's in de buis van Tricaine in E3 en pipetteer u de oplossing en embryo's voorzichtig om te mengen.
- Trek met behulp van een 1 mm glazen capillair en polytetrafluorethyleen (PTFE) zuiger de embryo's in de agarose-oplossing in het capillair. Zorg ervoor dat u in totaal 3-5 embryo's (meerdere embryo's) in het capillair trekt om de kans op een goed gepositioneerd embryo te vergroten.
OPMERKING: Vanwege de ronde aard van de embryo's op dit moment, is het een uitdaging om een specifieke oriëntatie in het capillair te garanderen. Idealiter wordt het lichaam van het embryo zijdelings in het capillair geplaatst, waardoor het grootste gemak van positionering in de microscoop mogelijk is. - Laat de agarose stollen over een periode van 30-60 s bij kamertemperatuur. Plaats het capillair in een bekerglas van 0,168 mg/ml Tricaïne in E3-buffer totdat het klaar is om in beeld te worden gebracht (figuur 1A).
OPMERKING: De overtollige agarose-oplossing met lage smelttemperatuur van 2% kan in toekomstige experimenten worden laten stollen en vervolgens opnieuw worden opgewarmd. - Plaats het capillair in de monsterhouder (figuur 1B-F) zoals beschreven in stap 2.5.
2. Zeiss Lightsheet Z.1 setup
- Schakel elk onderdeel van de microscoop en de computer in de volgende volgorde in: 1) Systeem, 2) PC en vervolgens 3) Incubatie (Figuur 2A).
- Plaats het 20x beeldobjectief en het 10x verlichtingsobjectief in de microscoopkamer. Stem de objectieve instellingen in de Zen Software-interface onder het tabblad Onderhouden overeen .
- Schuif de kamer (figuur 2C) in de behuizing op het spoor (figuur 2B) met de buis naar buiten gericht. De buis wordt aangesloten op de juiste poorten aan de rechterkant, zoals weergegeven in figuur 2E.
- Bevestig de verlenglijn aan de spuit met het luervergrendelingsmechanisme (figuur 2D); vul het met Tricaine in E3 en plaats het in de houder rechts van de microscoop35. Sluit de uitschuifinrichting die is bevestigd aan de spuit gevuld met Tricaine in E3 rechtsonder in de kamer aan met het luervergrendelingsmechanisme. Druk op de zuiger om de kamer te vullen met de Tricaine/E3-buffer. Sluit de deur naar de kamer.
- Plaats het capillair met het monster in de houder van het capillaire monster. De capillaire monsterhouder bestaat uit twee rubberen hoezen, een metalen monsterhouderschijf, een metalen steel en een metalen dop (figuur 1B). Klik de metalen mantel in het midden van de metalen schijf (figuur 1C). Plaats de twee rubberen stoppen in de schede, met de spleten naar de uiteinden van de schede gevolgd door het capillair. Schuif het capillair door het midden van de rubberen stoppen. Bevestig het op zijn plaats met de metalen dop zodra de marker zich aan de basis van de metalen mantel bevindt (figuur 1D).
- Plaats de houder van het capillaire monster op de bovenkant van de microscoop, waarbij de witte vlekken worden uitgelijnd (figuur 1E,F). Sluit de klep.
- Klik op de knop Capillair zoeken op de software-interface (Figuur 3A). Gebruik het ErgoDrive-bedieningspaneel, een handmatig apparaat dat de capillaire oriëntatie regelt (figuur 3E), om het capillair te bewegen en net boven het doel te plaatsen (figuur 3B).
- Open het deksel en druk zachtjes op de zuiger totdat het gedeelte van agarose met het embryo onder de capillaire bodem hangt en zich voor het objectief bevindt (figuur 3C).
- Schakel Locate Capillary uit en klik op de knop Locate Sample (Figuur 3A). Hierdoor wordt het zicht van de webcam van de monsterkamer naar het microscoopobjectief verplaatst (figuur 3D). Gebruik deze weergave om de positie van het monster nauwkeuriger aan te passen. Schakel Voorbeeld zoeken uit (afbeelding 3A).
- Ga naar het tabblad Acquisitie . Vink de vakjes aan voor Z-Stack en Time Series.
- Kies in het venster Parameters acquisitiemodus de instelling Dual Side Lightsheet en vink de selectievakjes aan voor Online Dual Side Fusion en Pivot Scanning.
- Kies in het venster Kanalen de optie 488-kanaals, stel het laservermogen in op 1 en de belichtingstijd op 7,5 ms.
- Klik vervolgens op de knop Continu om een live weergave van het embryo te krijgen. Gebruik het ErgoDrive-bedieningspaneel om de positie van het embryo aan te passen totdat het oogveld direct naar de camera is gericht. Ga door met het aanpassen van de linker- en rechterlichtbladen in de parameters Kanalen totdat het oogveld voldoende scherp is.
- Stel de Z-Stack-parameters in met behulp van het ErgoDrive-bedieningspaneel om door het Z-vlak te bewegen. Stel de eerste en de laatste Z-posities ongeveer 500 μm na het laatste detecteerbare fluorescerende signaal in. Dit laat ruimte voor het oogveld om in beeld te blijven terwijl het embryo groeit gedurende de time-lapse beeldvormingssessie. Nadat u het bereik van de Z-Stack hebt ingesteld, klikt u op de knop Optimaal om de stapgrootte in te stellen op 0,477 μm, de optimale instelling.
- Stel de incubatieparameters in door het vakje voor de Peltier-eenheid aan te vinken om de temperatuur op 28 °C te houden. Kies in het venster Tijdreeks de frequentie en het tijdsinterval om afbeeldingen te verkrijgen. In dit protocol werden de parameters ingesteld om elke 5 minuten in beeld te worden gebracht, voor een totaal van 166 intervallen.
- Klik op de knop Experiment starten . Kies de map om de afbeeldingenset op te slaan. Stel het afbeeldingsvoorvoegsel in en druk op Opslaan om de afbeelding te starten.
OPMERKING: De microscoop zal nu door elke afbeelding gaan die is ingesteld met het opgegeven interval. - Nadat de time-lapse-beeldvormingssessie is voltooid, stuurt u het podium naar de belastingspositie en verwijdert u de capillaire monsterhouder. Haal de houder van het capillaire monster uit elkaar in de omgekeerde volgorde waarin deze is samengesteld en gebruik de zuiger om het monster en overtollige agarose uit het capillair te verwijderen. Open de kamerdeur. Gebruik de spuit om de kamervloeistof uit de kamer te verwijderen, ontkoppel en verwijder de kamer en spoel vervolgens af met water en droog aan de lucht.
3. Beeldanalyse
- Open het softwareprogramma arivis Vision4D.
- Klik op Bestand en kies vervolgens Bestand importeren. Selecteer alle .czi-bestanden uit de time-lapse-beeldbewerkingssessie en open. Het volgende venster wordt geopend met de opties voor het importeren van de bestanden; selecteer Z-stacks als Frames om de z-stacks in de verkregen volgorde te ordenen. Zodra de bestanden zijn geïmporteerd, slaat de software op als een enkel .sis-bestand. Als u de locatie wilt opgeven voor het op te slaan bestand, selecteert u de map voordat u op Importeren klikt.
- Nadat het bestand is geïmporteerd, is arivis nu klaar om een video van de time-lapse-afbeeldingen weer te geven. Klik op de 4D Viewer Cube in de linkerbenedenhoek en het pictogram Schaalbalk (Figuur 4D-E). Klik op het videopictogram om de taakbalk Storyboard naar de onderkant van het scherm te brengen (figuur 4C).
- Kies op de taakbalk Storyboard de optie Hoofdframereeks toevoegen (afbeelding 4F). Geef de duur van de video in seconden op, schakel het selectievakje Rotatie maken uit en vink tijdsprogressie gebruiken aan om de specifieke tijdspunten in de video op te nemen. De software geeft deze parameters weer aan de rechterkant van de Storyboard-taakbalk voor eventuele aanpassingen op elk gewenst moment. Sla het Storyboard op om dezelfde parameters toe te passen op meerdere afbeeldingensets (Afbeelding 4F).
- Klik op Film exporteren om een video van de time-lapse-beeldvorming op te slaan (figuur 4F). Geef de instellingen voor het exporteren van films op, waaronder de bestandsnaam en -locatie, de video-indeling (.mp4), de videoresolutie (1.080 p), de framerate (60 FPS) en de gegevensresolutie (1.297 x 1.297 x 784). Voeg hier tijdstempels toe, indien gewenst. Zodra deze parameters zijn ingesteld, kiest u Record (figuur 4F).
- Stap 3.4 en 3.5 kunnen worden herhaald met wijziging van stap 3.4 om rotatievideo's op specifieke tijdstippen te maken. Wanneer u een hoofdframereeks aan het storyboard toevoegt, schakelt u het selectievakje Rotatie maken in en schakelt u Tijdprogressie gebruiken uit. Volg vervolgens dezelfde instructies als in stap 3.5.
- Als u een afbeelding met een hoge resolutie in elke richting op een afzonderlijk tijdstip wilt weergeven, selecteert u het pictogram Camera in de 4D-viewer om een afbeelding met een hoge resolutie te verkrijgen (afbeelding 4C).
- Als u een pijplijn voor analyse wilt maken, kiest u het pictogram Kolf om toegang te krijgen tot het deelvenster Analyse (afbeelding 4B). Klik in het deelvenster Analyse op het vervolgkeuzemenu Analysebewerkingen . Als voorbeeld toont het protocol hieronder de volgorde van bewerkingen voor een pijplijn voor volumeanalyse. Voer elke stap van de pijplijn afzonderlijk uit of maak deze ongedaan om elke parameter te verfijnen (tabel 1).
- Klik op het blauwe driehoekje boven aan de pijplijn om de pijpleiding te laten lopen.
OPMERKING: Dit duurt enige tijd, afhankelijk van de snelheid van de computer. Zodra de pijplijn is geoptimaliseerd, kan de pijplijn eenvoudig worden geëxporteerd en geïmporteerd naar arivis en worden toegepast op meerdere gegevenssets in een batchanalyse. - Om toegang te krijgen tot batchanalyse, klikt u op Batchanalyse onder het tabblad Analyse .
- Nadat de pijplijn is uitgevoerd, trekt een venster omhoog met alle gevonden voorwerpen. Open dit handmatig via het tabelpictogram (figuur 4B). Klik boven in dit venster op het vak Met het label Functiekolommen om een lijst met functies weer te geven die informatie kunnen geven over het object van interesse. Voor de analyse van het oogveldvolume omvatten deze functies oppervlakte, volume (volume, VoxelCount), intensiteiten #1 (gemiddelde), kenmerken (Id, Type) en Tijdpunt (eerste). Klik op Exporteren om de gegevens naar een spreadsheet te exporteren.
Representative Results
De dataset die hier wordt weergegeven, is afgebeeld met behulp van het hierboven beschreven protocol. Een Tg(Rx3:GFP) embryo werd afgebeeld vanaf het 1 somite stadium (ss) tot 24 hpf, een totale tijdsperiode van 14 uur, waarbij de beelden met intervallen van 5 minuten werden verkregen. Time-lapse imaging maakt eenvoudige selectie en vergelijking van elk tijdstip mogelijk dat een fenotype van belang laat zien. Figuur 5 toont een reeks beelden met hoge resolutie die werden weergegeven vanuit het dorsale gezichtspunt op geselecteerde ontwikkelingstijdpunten. De pijplijn in arivis Vision4D bouwt een masker dat het zich ontwikkelende oog vertegenwoordigt zoals geïdentificeerd door fluorescerend signaal. In figuur 5 en video's 1-6 kan het masker worden gevisualiseerd in vergelijking met de fluorescerende weergave van het zich ontwikkelende oog. Bovendien toont tabel 2 de volumegegevens van het zich ontwikkelende oog op elk beeldvormingspunt. Deze dataset bevat de segmentnaam, id, volume in zowel μm3 als voxeltelling, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het object, het tijdstip waarop het object werd geïdentificeerd en het oppervlak van het object in μm2. Het is belangrijk op te merken dat wanneer het oogveld zich scheidt in twee optische blaasjes (beginnend bij tijdpunt 64), er een derde gebied overblijft dat Rx3: GFP-positief is in de voorhersenen, wat zal bijdragen aan de hypothalamus38,39,40 (figuur 5D-M). Dit komt tot uiting in de volumegegevens in tabel 2 (geel gemarkeerd vanaf tijdpunt 71) en kan gemakkelijk worden gescheiden van de optische blaasjes, omdat het veel kleiner is in volume dan beide optische blaasjes.
Figuur 1: Monstervoorbereiding. (A) Plaatsing van embryo's in een glazen capillair. De pijl wijst naar een embryo in het capillair. (B) Delen van de capillaire en capillaire houder van glas. (C) Gedeeltelijk geassembleerde capillaire houder. (D) Volledig geassembleerde capillaire houder. (E) Lightsheet montagekamer. De pijl gaf de witte lijn aan die werd gebruikt om de capillaire houder te oriënteren. (F) Capillaire houder correct gemonteerd in de Lightsheet. De pijl toont de bijpassende witte lijnen, die de juiste oriëntatie van de capillaire houder aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Lightsheet imaging set-up. (A) Schakelbord om de Lightsheet, computer en incubatie-eenheid in te schakelen. De nummers geven de volgorde van de operaties aan. (B) Lightsheet objectieve kamer. (C) Beeldvormingskamer. (D) Spuit en slang die op de beeldvormingskamer worden aangesloten. (E) De beeldvormingskamer is correct gepositioneerd in de objectiefkamer met alle buizen aangesloten op de juiste poorten aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monsterpositionering. (A) Lokaliseer capillaire en lokaliseer monsterknoppen in Zen Software zoals aangegeven door de pijlen. (B) De positionering op het glazen capillair. De pijl geeft de rand van het glazen capillair aan dat net boven de lens van het objectief is geplaatst. (C) De embryosuspensie voorbij het glazen capillair. De pijl gaf het embryo aan dat in agarose onder het glazen capillair voor de lens van het objectief hing. D) Zicht op het embryo door het doel. (E) Het ErgoDrive-bedieningspaneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Belangrijke pictogrammen voor het navigeren door arivis Vison4D. Elk paneel heeft de pictogramfunctie die van links naar rechts wordt geïdentificeerd. (A) Openen, Opslaan, Sluiten. (b) Analysepaneel, tabel Objecten weergeven, Trackeditor openen. (C) Kopieer de huidige viewerinhoud als een afbeelding naar het klembord, Schakel bladwijzers in, Maak een afbeelding met hoge resolutie voor de huidige weergave, Schakel Storyboard in. (D) Toon maatvak, Toon oriëntatiekruis, Toon Legenda, Toon schaalbalk. (E) Weergeven als 2D-viewer, Weergeven als galerijviewer, Weergeven als 4D-viewer, Weergeven als infoviewer, Weergeven als projectieviewer. F) Vernieuw alle hoofdframes, Hoofdframe toevoegen, Hoofdframereeks toevoegen, Hoofdframe invoegen, Alle hoofdframes verwijderen, Film exporteren, Storyboard laden, Storyboard opslaan, De doeltijd van de hele film aanpassen, Eerste hoofdframe, Afspelen, Pauzeren, Stoppen, Laatste hoofdframe. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Afbeeldingen met hoge resolutie en oogveldmaskers. (A-M) Een reeks beelden met hoge resolutie die werden weergegeven vanuit de dorsale uitkijkpunten; (A'-M') de oogveldmaskers voor elk overeenkomstig tijdspunt. Elke beeldset wordt genoteerd tegen het moment dat het werd verkregen vanaf het begin van de beeldvorming en de bijbehorende ontwikkelingsstadia in somite-stadium (ss) of uren na bevruchting (hpf). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Time-lapse video van Tg(rx3:GFP) zebravis embryo van 1 ss-24 hpf. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Video 2: Time-lapse video van Tg(rx3:GFP) zebravis embryo van 1 ss-24 hpf met het oogveld zoals geïdentificeerd door de arivis Vision4D pijplijn. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Video 3: 360° rotatie van een Tg(rx3:GFP) zebravis embryo op 1 ss. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Video 4: 360° rotatie van een Tg(rx3:GFP) zebravis embryo oogveldmasker op 1 ss. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Video 5: 360° rotatie van een Tg(rx3:GFP) zebravis embryo bij 24 hpf. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Video 6: 360° rotatie van een Tg(rx3:GFP) zebravis embryo oogveldmasker bij 24 hpf. Klik hier met de rechtermuisknop om de video te downloaden (link opslaan als).
Tabel 1: arivis Vision4D pijplijn voor volumeanalyse van het zich ontwikkelende oogveld. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Volume en oppervlakte van het zich ontwikkelende oogveld verworven door arivis Vision4D. De rijen met betrekking tot de vermoedelijke hypothalamus zijn geel gemarkeerd om ze te onderscheiden van de optische blaasjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
In dit protocol werd de Lightsheet-microscoop gebruikt om time-lapse-beeldvorming van oogontwikkeling uit te voeren en de resulterende gegevens werden geanalyseerd. De resulterende dataset kan waardevolle inzichten bieden in het proces van oculaire morfogenese, evenals verstoringen van dit proces als gevolg van genetische mutatie, blootstelling aan farmacologische agentia of andere experimentele parameters. Hier demonstreerde het protocol hoe deze dataset kan worden verkregen en gaf het een voorbeeld van hoe het volume van het oogveld door vroege ontwikkeling kan worden geanalyseerd. Deze gegevens bleken reproduceerbaar en consistent te zijn (minder dan 10% variatie in volume) tussen biologische replicaties, rekening houdend met het feit dat kleine verschillen in embryostadiëring voorafgaand aan het begin van de run kunnen leiden tot enige variatie in de uiteindelijke volumemetingen.
Voorzichtigheid is geboden bij de eerste positionering van het embryo in het capillair en bij het positioneren van het ingebedde embryo voor het doel. Oriëntatie speelt een belangrijke rol bij het voorkomen dat het embryo groeit en uit het zicht van het doel beweegt. De embryo's hebben een ronde vorm bij 10 pkf, wat het een uitdaging maakt om een specifieke oriëntatie in het capillair te garanderen. Idealiter wordt het lichaam van het embryo zijdelings in het capillair geplaatst. Het laden van meerdere embryo's in het capillair verhoogt de kans op een goed gepositioneerd embryo.
Bij deze procedure wordt het embryo ingebed in agarose om het op te hangen voor de beeldvormings- en verlichtingsdoelstellingen. Het kiezen van de juiste concentratie van de lage smelttemperatuur agarose is van cruciaal belang. Een te hoge concentratie zal het embryo vernauwen en verhinderen dat het zich goed ontwikkelt; een te lage concentratie zal ertoe leiden dat de agarose uit elkaar valt en het embryo niet vasthoudt. De optimale concentratie voor dit protocol is een eindconcentratie van 1% lage smelttemperatuur agarose30,31.
Een ander element waarmee rekening moet worden gehouden, is het verzadigingsniveau. Naarmate het oogveld groeit en differentieert, wordt de sterkte van het Rx3:GFP-signaal intenser. Daarom moeten bij het instellen van de initiële beeldparameters de belichting en het laservermogen worden verminderd om het beeld te onderverzadigen. Dit voorkomt dat het beeld oververzadigd raakt naarmate de Rx3:GFP na verloop van tijd helderder wordt. Er kunnen wijzigingen worden aangebracht om te corrigeren voor onderverzadiging in de beeldverwerking, maar oververzadiging kan niet worden gecorrigeerd nadat de afbeeldingen zijn verkregen.
Er zijn een paar extra wijzigingen die in dit protocol kunnen worden aangebracht die voordelig kunnen zijn voor sommige projecten die niet in dit artikel worden beschreven. Zo is het mogelijk om Multiview imaging in te stellen in de beeldacquisitie-set. Met deze parameter kunnen meerdere embryo's op verschillende posities langs de y-as achtereenvolgens in beeld worden gebracht bij elk tijdsinterval. Hoewel het de dataset complexer maakt, zou het de snelheid van gegevensverzameling verhogen. Bovendien is het in termen van beeldverwerking mogelijk om het oogveld te kwantificeren door andere parameters. Hier hebben we beschreven hoe we de gegevens kunnen kwantificeren in termen van het oogveldvolume. Als alternatief kan een pijplijn worden gemaakt om individuele cellen te kwantificeren en te volgen of de snelheid van evaginatie van optische blaasjes te bepalen.
Zoals eerder vermeld, zijn zowel confocale als Lightsheet-microscopie gebruikt om time-lapse beeldvormingsstudies van zebravissen uit te voeren. Lightsheet werd specifiek gekozen voor dit project vanwege zijn superieure vermogen om door een dik (> 1 mm) monster te fotograferen, omdat het is uitgerust met een incubatie-eenheid om een ideale temperatuuromgeving voor het zebravisembryo te behouden, en omdat het vermogen om sneller te beeld te geven dan confocale microscopie zorgt voor beeldverwerving met de vele tijdsintervallen die nodig zijn voor dit protocol, geen begeleidende schade of fotobleaching van het embryo21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Het is ook belangrijk op te merken dat de Lightsheet-microscoop is uitgerust om het signaal van meerdere fluoroforen in beeld te brengen. De Lightsheet-microscoop die in deze studie wordt gebruikt, heeft solid state laser-excitatielijnen op 405, 445, 488, 515, 561 en 638 nm, wat nuttig kan zijn voor het afbeelden van transgene embryo's die meer dan één fluorescerend reportertransgen tot expressie brengen.
Hoewel dit protocol instructies beschrijft voor beeldacquisitieanalyse, specifiek met behulp van het Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System en arivis Vision4D-analysesoftware, zijn er andere in de handel verkrijgbare Lightsheet-microscopen gemaakt door Leica, Olympus en Luxendo, evenals beeldanalysesoftware van Imaris, die kunnen worden gebruikt om vergelijkbare resultaten te bereiken. De selectie van apparatuur en software voor dit protocol werd bepaald door de beschikbaarheid bij onze instelling.
Samenvattend wordt verwacht dat dit protocol een solide startpunt zal bieden voor het uitvoeren van time-lapse beeldvorming met behulp van Lightsheet-microscopie en voor beeldkwantificering van vroege oogontwikkeling bij zebravissen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het Office of The Director van de National Institutes of Health (NIH) onder awardnummer S10OD020067 en door NIH award R01EY021769 (aan A.C.M.). We zijn dankbaar voor de hulp van Doug Harrison en Jim Begley in het Arts & Sciences Imaging Center aan de Universiteit van Kentucky, en lucas Vieira Francisco en Evelyn M. Turnbaugh voor deskundige zebravisverzorging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Wilson, S. W., Houart, C.
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
