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Developmental Biology

Rx3: GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish का उपयोग कर Lightsheet माइक्रोस्कोपी द्वारा ओकुलर Morphogenesis visualizing

Published: April 5, 2021 doi: 10.3791/62296
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Kentucky

Summary

यहां, परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप और एक छवि प्रसंस्करण वर्कस्टेशन का उपयोग करके ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह प्रोटोकॉल भ्रूण संज्ञाहरण के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है, कम पिघलने वाले तापमान में एम्बेडिंग, इमेजिंग चैंबर में निलंबन, इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करता है, और अंत में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करता है।

Abstract

कशेरुकी आंखों का विकास एक जटिल प्रक्रिया है जो भ्रूण गैस्ट्रुलेशन के अंत के पास शुरू होती है और सेल माइग्रेशन, प्रसार और भेदभाव के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। टाइम-लैप्स कल्पना आंखों के विकास के दौरान कोशिकाओं के व्यवहार के लिए अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करती है क्योंकि यह हमें विवो में ओकुलोजेनेसिस की कल्पना करने की अनुमति देती है। ज़ेबराफ़िश इस प्रक्रिया को उनकी अत्यधिक संरक्षित कशेरुकी आंखों और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी रहते हुए तेजी से और बाहरी रूप से विकसित करने की उनकी क्षमता के कारण इस प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। ज़ेब्राफ़िश आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययनों को ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन टीजी (आरएक्स 3: जीएफपी) के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया जाता है। विकासशील फोरब्रेन में, आरएक्स 3: जीएफपी अभिव्यक्ति एकल आंख क्षेत्र की कोशिकाओं को चिह्नित करती है, और जीएफपी को व्यक्त किया जाना जारी है क्योंकि आंख क्षेत्र एक ऑप्टिक पुटिका बनाने के लिए evaginates, जो तब एक ऑप्टिक कप बनाने के लिए invaginates। Rx3: GFP अभिव्यक्ति के उच्च रिज़ॉल्यूशन समय अंतराल इमेजिंग, इसलिए, हमें समय के माध्यम से आंखों के प्राइमोर्डियम को ट्रैक करने की अनुमति देता है क्योंकि यह रेटिना में विकसित होता है। Lightsheet माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मोटे नमूनों में प्रवेश करने की अपनी क्षमता के कारण समय के साथ ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की छवि बनाने के लिए एक आदर्श तरीका है, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम करता है, और उच्च गति पर छवि। यहां, परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप और एक छवि प्रसंस्करण वर्कस्टेशन का उपयोग करके ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह प्रोटोकॉल भ्रूण संज्ञाहरण के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है, कम पिघलने वाले तापमान में एम्बेडिंग, इमेजिंग चैंबर में निलंबन, इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करता है, और अंत में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करता है। परिणामी डेटासेट ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, साथ ही आनुवंशिक उत्परिवर्तन, औषधीय एजेंटों के संपर्क, या अन्य प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप इस प्रक्रिया के लिए परेशान करता है।

Introduction

भ्रूण विकास एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए कई अलग-अलग घटनाओं के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। कशेरुकी आंख का गठन विकासशील अग्रमस्तिष्क में शुरू होता है, जहां कोशिकाओं का एक हिस्सा आंख क्षेत्र के रूप में निर्दिष्ट होता है। ये कोशिकाएं सतह एक्टोडर्म की ओर बढ़ेंगी, जिससे दो द्विपक्षीय ऑप्टिक पुटिकाओंको जन्म मिलेगा 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10। सतह एक्टोडर्म के साथ संपर्क तब ऑप्टिक पुटिका के एक ऑप्टिक कप में एक invagination प्रेरित करता है। सतह एक्टोडर्म आंख की पूर्वकाल संरचनाओं को जन्म देगा, जैसे कि लेंस और कॉर्निया, जबकि ऑप्टिक कप तंत्रिका रेटिना और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम को जन्म देगा 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . इस प्रक्रिया में व्यवधान जन्मजात दोषों जैसे माइक्रोफ्थैलमिया, एनोफ्थैलमिया और कोलोबोमा (मैक) को जन्म दे सकता है। इस समय, इन दोषों को ठीक करने के लिए कोई विकल्प नहीं है 3,5,6,7,9,10,11,12. ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के तंत्र के आगे के अध्ययन और मैक को जन्म देने वाली समस्याएं ज्ञान की एक नींव प्रदान करेंगी जो संभावित रूप से उपचार का कारण बनेंगी। आंखों के विकास के दौरान कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण समय-अंतराल कल्पना है, जो इस प्रक्रिया को विवो में और वास्तविक समय में कल्पना और विशेषता की अनुमति देता है।

Zebrafish (Danio rerio) समय-अंतराल इमेजिंग का उपयोग करके शुरुआती ओकुलर विकास की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उनके पास एक अत्यधिक संरक्षित कशेरुकी आंख है और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी रहते हुए तेजी से और बाहरी रूप से विकसित करने की क्षमता रखतेहैं। ज़ेब्राफ़िश इन विशेषताओं के कारण समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक महान संसाधन प्रदान करता है जो स्तनधारी मॉडल की कमी है। ज़ेब्राफ़िश आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययन को ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन टीजी (आरएक्स 3: जीएफपी) 13 के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया जाता है। Rx3 (रेटिना होमोबॉक्स प्रोटीन 3) आंखों के विकास के लिए आवश्यक एक प्रतिलेखन कारकहै। Rx3 ज़ेब्राफ़िश में तीन आरएक्स जीनों में से पहला है, जिसे व्यक्त किया जाना है, इसकी अभिव्यक्ति को मध्य-गैस्ट्रुलेशन शुरू किया गया है, लगभग 8 एच पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) 15,16। Rx3: GFP ट्रांसजीन को 1 सोमाइट चरण (एसएस), लगभग 10 hpf15,17,18,19,20 पर शुरू होने वाले विकासशील अग्रमस्तिष्क में कल्पना की जा सकती है। विकासशील अग्रमस्तिष्क में, आरएक्स 3: जीएफपी अभिव्यक्ति एकल आंख क्षेत्र की कोशिकाओं को चिह्नित करती है, और जीएफपी (हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन) को ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के शेष के माध्यम से व्यक्त किया जाना जारी है। Rx3: GFP अभिव्यक्ति के उच्च रिज़ॉल्यूशन समय अंतराल इमेजिंग, इसलिए, हमें समय के माध्यम से एकल आंख क्षेत्र को ट्रैक करने की अनुमति देता है क्योंकि यह रेटिना 17,18,20 में विकसित होता है।

ज़ेब्राफ़िश विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययन मुख्य रूप से कॉन्फोकल या लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किए गए हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी में लाभप्रद है कि यह z-अक्ष के साथ नमूनों की सटीक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत को कम करता है। हालांकि, यह एक छवि, नमूना स्थिति कठोरता प्राप्त करने में लगने वाले समय की मात्रा, और लाइव नमूनों की फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी की ओर इसकी प्रवृत्ति से सीमित है। लाइटशीट माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मोटे नमूनों में प्रवेश करने की क्षमता, नमूना अभिविन्यास में लचीलापन में वृद्धि, कम से कम फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी, और उच्च गति से इमेजिंग 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 के लिए मोटी नमूनों में प्रवेश करने की क्षमता के कारण समय के साथ ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की छवि बनाने का एक आदर्श तरीका है ,31। वर्तमान प्रकाश शीट माइक्रोकॉपी सिस्टम के साथ प्राप्त स्थानिक रिज़ॉल्यूशन लगभग 250-500 नैनोमीटर (एनएम) है। यद्यपि यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त की जा सकने वाली चीजों से काफी अलग नहीं है, नमूने को स्वतंत्र रूप से घुमाया जा सकता है और कई कोणों से चित्रित किया जा सकता है, जिससे इमेजिंग गहराई और रिज़ॉल्यूशन दोनों में सुधार होता है, और कॉन्फोकल प्लेटफ़ॉर्म27,32 की तुलना में विवो टाइम लैप्स इमेजिंग प्रयोगों के लिए बहुत अधिक लचीलापन प्रदान किया जा सकता है। . इन कारणों से, लाइटशीट माइक्रोस्कोपी जल्दी से ज़ेबराफ़िश विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययनों के लिए पसंदीदा विधि बन रही है। यह प्रोटोकॉल Rx3: GFP ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश की इमेजिंग के माध्यम से oculogenesis को परिमाणित करने के चरणों का वर्णन करता है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप33 का उपयोग करता है और एरिविस सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके छवि विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन का विवरण देता है।

Protocol

ज़ेबराफ़िश के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों को केंटकी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

1. नमूना तैयारी

  1. इमेजिंग की योजना बनाने से पहले रात को एक गेटेड क्रॉस टैंक में टीजी (आरएक्स 3: जीएफपी) ज़ेब्राफ़िश की एक संभोग जोड़ी सेट करें। अगली सुबह गेट को खींचें क्योंकि रोशनी मछली सुविधा34,35 में आती है।
    नोट: चयनित मछली की संभोग जोड़ी उम्र में 4 महीने से 2 साल के बीच होनी चाहिए और शरीर के आकार और रंग35 के आधार पर आसानी से पुरुष या महिला के रूप में प्रतिष्ठित होती है।
  2. भ्रूण के लिए हर आधे घंटे में क्रॉस की जांच करें और ध्यान दें कि क्रॉस टैंक के नीचे भ्रूण को पहली बार किस समय देखा जाता है। भ्रूण को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 1-2 सोमाइट चरण (एसएस) में विकसित होने के लिए लगभग 10 घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को बनाए रखें। 1-2 सोमाइट चरण (एसएस) पर छवि शुरू करें।
  3. सोमाइट्स की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए, 10 एचपीएफ पर एक स्टीरियोस्कोप के तहत भ्रूण का निरीक्षण करें और सोमाइट्स1 की संख्या की गणना करें।
    नोट: कोई भी भ्रूण जो एकल सोमाइट चरण से परे है, इस प्रयोग के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
  4. एकल सोमाइट चरण में हैं कि भ्रूण से बाहर, GFP अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन एक stereomicroscope के साथ संयोजन में एक प्रतिदीप्ति एडाप्टर का उपयोग कर Rx3: GFP transgene की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए। एक बार 3-5 जीएफपी सकारात्मक व्यक्तियों की पहचान करने के बाद, भ्रूण को डिकोरियोनेट करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और उन्हें ग्लास पिपेट35 के साथ ई 3 भ्रूण बफर युक्त एक छोटे से पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  5. भ्रूण को 0.5 mL E3 भ्रूण बफर (pH 7) में स्थानांतरित करके भ्रूण को बेहोश करें जिसमें 0.168 mg/mL ट्राइकेन (MS222) एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब35,36 में होता है। सहज मांसपेशियों के आंदोलनों के रूप में जल्दी के रूप में 17 hpf37 शुरू होता है. सुनिश्चित करें कि भ्रूण इस समय बिंदु से परे छवि के लिए anesthetized हैं।
  6. 0.168 मिलीग्राम / एमएल ट्राइकेन और ई 3 में 1% कम पिघलने वाले तापमान agarose में भ्रूण एम्बेड करें।
    नोट: यह कम पिघलने के तापमान agarose की इष्टतम एकाग्रता है ताकि भ्रूण को जगह में आयोजित किया जा सके, लेकिन इमेजिंग टाइम-कोर्स30,31 पर भ्रूण के विकास की अनुमति देने के लिए पर्याप्त लचीला रहता है।
  7. E3 बफर में 2% कम पिघलने तापमान agarose का एक 10 मिलीलीटर समाधान तैयार करें। इसे माइक्रोवेव ओवन में गर्म करें ताकि 15 एस अंतराल का उपयोग करके एगारोज़ को भंग किया जा सके, ताकि समाधान को उबलने से रोका जा सके। समाधान को असुविधा के बिना रखने के लिए पर्याप्त ठंडा होने की अनुमति दें, लेकिन इतना नहीं कि यह ठोस हो जाए, और भ्रूण को नुकसान न पहुंचाए। एक बार जब agarose पर्याप्त रूप से ठंडा हो जाता है, तो E3 में Tricaine की ट्यूब में भ्रूण में 0.5 mL जोड़ें और मिश्रण करने के लिए समाधान और भ्रूण को धीरे से पाइप करें।
  8. एक 1 मिमी ग्लास केशिका और polytetrafluoroethylene (PTFE) प्लंजर का उपयोग करके, केशिका में agarose समाधान में भ्रूण को खींचें। एक अच्छी तरह से स्थित भ्रूण होने की संभावना को बढ़ाने के लिए केशिका में कुल 3-5 भ्रूण (कई भ्रूण) खींचना सुनिश्चित करें।
    नोट: इस समय बिंदु पर भ्रूण की गोल प्रकृति के कारण, केशिका में एक विशिष्ट अभिविन्यास की गारंटी देना चुनौतीपूर्ण है। आदर्श रूप से, भ्रूण के शरीर को केशिका में पार्श्व रूप से तैनात किया जाएगा, जिससे माइक्रोस्कोप के भीतर स्थिति की सबसे बड़ी आसानी हो सकती है।
  9. कमरे के तापमान पर 30-60 सेकंड की अवधि में एगारोज़ को ठोस होने दें। केशिका को 0.168 मिलीग्राम / एमएल ट्राइकेन के बीकर में ई 3 बफर में रखें जब तक कि छवि के लिए तैयार न हो (चित्रा 1 ए)।
    नोट: अतिरिक्त 2% कम पिघलने तापमान agarose समाधान ठोस करने के लिए अनुमति दी जा सकती है और बाद में भविष्य के प्रयोगों में फिर से गर्म किया जा सकता है।
  10. चरण 2.5 में वर्णित के रूप में नमूना धारक (चित्रा 1B-F) में केशिका रखें।

2. Zeiss Lightsheet Z.1 सेटअप

  1. माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर के प्रत्येक घटक को निम्नलिखित क्रम में स्विच करें: 1) सिस्टम, 2) पीसी, फिर 3) इनक्यूबेशन (चित्र2ए)।
  2. माइक्रोस्कोप कक्ष में 20x इमेजिंग उद्देश्य और 10x रोशनी उद्देश्य रखें। बनाए रखें टैब के अंतर्गत ज़ेन सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में उद्देश्य सेटिंग्स का मिलान करें।
  3. टयूबिंग का सामना करने के साथ ट्रैक (चित्रा 2 बी) पर आवास में कक्ष (चित्रा 2 सी) स्लाइड करें। टयूबिंग दाईं ओर उपयुक्त पोर्ट से कनेक्ट होता है जैसा कि चित्र 2E में दिखाया गया है।
  4. ल्यूर-लॉक तंत्र (चित्रा 2 डी) के साथ सिरिंज के लिए एक्सटेंशन लाइन संलग्न करें; इसे E3 में Tricaine के साथ भरें और इसे माइक्रोस्कोप35 के दाईं ओर से जुड़े धारक में रखें। Luer-लॉक तंत्र के साथ कक्ष के नीचे दाईं ओर E3 में Tricaine के साथ भरा सिरिंज से जुड़े विस्तार कनेक्ट करें। Tricaine/ E3 बफर के साथ कक्ष को भरने के लिए प्लंजर पुश करें। कक्ष का दरवाजा बंद कर दें।
  5. केशिका नमूना धारक में नमूने के साथ केशिका जगह. केशिका नमूना धारक में दो रबर आस्तीन, एक धातु नमूना धारक डिस्क, एक धातु स्टेम और एक धातु टोपी (चित्रा 1 बी) शामिल हैं। धातु डिस्क के केंद्र में धातु म्यान पर क्लिक करें (चित्र1C)। दो रबर स्टॉपर को म्यान में रखें, जिसमें स्लिट्स म्यान के सिरों का सामना कर रहे हैं, जिसके बाद केशिका होती है। रबर स्टॉपर के बीच के माध्यम से केशिका स्लाइड। एक बार मार्कर धातु म्यान (चित्रा 1 डी) के आधार पर है एक बार यह धातु टोपी के साथ जगह में जकड़ना.
  6. केशिका नमूना धारक को माइक्रोस्कोप के शीर्ष पर रखें, सफेद निशान संरेखित करने के साथ (चित्रा 1ई, एफ)। ढक्कन बंद करें।
  7. सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस (चित्रा 3A) पर केशिका का पता लगाएँ बटन पर क्लिक करें। ErgoDrive नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें, एक मैनुअल डिवाइस जो केशिका अभिविन्यास (चित्रा 3E) को नियंत्रित करता है, केशिका को स्थानांतरित करने और इसे उद्देश्य (चित्रा 3 B) के ठीक ऊपर रखने के लिए।
  8. ढक्कन खोलें, और धीरे से प्लंजर पर धक्का दें जब तक कि भ्रूण युक्त एगारोज़ का खंड केशिका तल के नीचे लटका हुआ न हो और उद्देश्य (चित्रा 3 सी) के सामने हो।
  9. केशिका का पता लगाएँ बंद करें और नमूना ढूँढें बटन (चित्रा 3A) पर क्लिक करें। यह नमूना कक्ष के वेबकैमरा से माइक्रोस्कोप उद्देश्य (चित्रा 3 डी) के लिए दृश्य को स्विच करता है। नमूने की स्थिति को अधिक सटीक रूप से समायोजित करने के लिए इस दृश्य का उपयोग करें. नमूना ढूँढें बंद करें (चित्र3A).
  10. अधिग्रहण टैब पर स्विच करें. Z-स्टैक और समय श्रृंखला के लिए बक्से की जाँच करें।
  11. अधिग्रहण मोड पैरामीटर विंडो में, दोहरी साइड लाइटशीट सेटिंग चुनें और ऑनलाइन डुअल साइड फ्यूजन और पिवट स्कैनिंग के लिए बक्से चेक करें.
  12. चैनल विंडो में, 488 चैनल चुनें, लेजर पावर को 1 पर सेट करें, और एक्सपोज़र समय 7.5 एमएस पर सेट करें।
  13. इसके बाद, भ्रूण का लाइव दृश्य प्राप्त करने के लिए निरंतर बटन पर क्लिक करें। जब तक कि नेत्र क्षेत्र सीधे कैमरे का सामना नहीं कर रहा है, तब तक भ्रूण की स्थिति को समायोजित करने के लिए ErgoDrive नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें। चैनल पैरामीटर में बाएं और दाएं लाइटशीट को समायोजित करना जारी रखें जब तक कि आंख फ़ील्ड पर्याप्त रूप से फोकस में न हो।
  14. Z-plane के माध्यम से ले जाने के लिए ErgoDrive नियंत्रण कक्ष का उपयोग कर Z-स्टैक पैरामीटर सेट करें। पिछले पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट सिग्नल से परे 500 μm के आसपास पहला और अंतिम Z-Positions सेट करें। यह आंखों के क्षेत्र को फ्रेम में रहने के लिए जगह छोड़ देता है क्योंकि भ्रूण समय-अंतराल इमेजिंग सत्र के दौरान बढ़ता है। Z-स्टैक की श्रेणी सेट करने के बाद, चरण आकार को 0.477 μm, इष्टतम सेटिंग पर सेट करने के लिए इष्टतम बटन पर क्लिक करें।
  15. तापमान को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए Peltier इकाई के लिए बॉक्स की जाँच करके इनक्यूबेशन पैरामीटर सेट करें। समय श्रृंखला विंडो में, छवियों को प्राप्त करने के लिए आवृत्ति और समय अंतराल चुनें। इस प्रोटोकॉल में, पैरामीटर को कुल 166 अंतरालों के लिए हर 5 मिनट में छवि बनाने के लिए सेट किया गया था।
  16. प्रयोग प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें। छवि सेट को सहेजने के लिए फ़ोल्डर चुनें. छवि उपसर्ग सेट करें और इमेजिंग शुरू करने के लिए सहेजें दबाएं।
    नोट:: माइक्रोस्कोप अब निर्दिष्ट अंतराल पर सेट प्रत्येक छवि के माध्यम से चला जाएगा।
  17. टाइम-लैप्स इमेजिंग सत्र पूरा होने के बाद, चरण को लोड स्थिति में भेजें, और केशिका नमूना धारक को हटा दें। केशिका नमूना धारक को रिवर्स ऑर्डर में अलग करें कि इसे एक साथ रखा गया था और केशिका से नमूना और अतिरिक्त एगारोज़ को हटाने के लिए प्लंजर का उपयोग करें। कक्ष का दरवाजा खोलें। कक्ष से कक्ष तरल को हटाने के लिए सिरिंज का उपयोग करें, कक्ष को डिस्कनेक्ट करें और हटा दें, फिर पानी और हवा के साथ कुल्ला करें।

3. छवि विश्लेषण

  1. Arivis Vision4D सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
  2. फ़ाइल पर क्लिक करें, फिर फ़ाइल आयात करें चुनें। टाइम-लैप्स इमेजिंग सत्र से सभी .czi फ़ाइलों का चयन करें और खोलें. अगली विंडो फ़ाइलों को आयात करने के तरीके पर विकल्पों के साथ खुलती है; प्राप्त क्रम में z-स्टैक का आदेश देने के लिए फ्रेम्स के रूप में Z-स्टैक का चयन करें। एक बार जब फ़ाइलें आयात की जाती हैं, तो सॉफ़्टवेयर एकल .sis फ़ाइल के रूप में सहेजता है. फ़ाइल सहेजी जाने के लिए स्थान निर्दिष्ट करने के लिए, आयात पर क्लिक करने से पहले फ़ोल्डर का चयन करें.
  3. फ़ाइल आयात करने के बाद, एरिविस अब समय-अंतराल छवियों का एक वीडियो प्रस्तुत करने के लिए तैयार है। नीचे-बाएँ कोने में 4D व्यूअर क्यूब और स्केल बार आइकन (चित्रा 4D-E) पर क्लिक करें. Storyboard कार्यपट्टी को स्क्रीन के नीचे लाने के लिए वीडियो आइकन पर क्लिक करें (चित्रा 4C).
  4. Storyboard कार्यपट्टी में, कीफ़्रेम अनुक्रम जोड़ें (चित्र4F) चुनें। सेकंड में वीडियो की अवधि निर्दिष्ट करें, रोटेशन बनाएँ बॉक्स को अनचेक करें, और वीडियो में विशिष्ट टाइमपॉइंट्स शामिल करने के लिए समय प्रगति का उपयोग करें चेक करें. सॉफ़्टवेयर किसी भी समय किसी भी समायोजन के लिए स्टोरीबोर्ड टास्कबार के दाईं ओर इन पैरामीटर्स को प्रदर्शित करता है। एकाधिक छवि सेट (चित्रा 4F) के लिए एक ही पैरामीटर लागू करने के लिए Storyboard सहेजें।
  5. समय-अंतराल इमेजिंग (चित्रा 4 एफ) के वीडियो को सहेजने के लिए निर्यात मूवी पर क्लिक करें। फ़ाइल नाम और स्थान, वीडियो स्वरूप (.mp4), वीडियो रिज़ॉल्यूशन (1,080 p), फ़्रेमरेट (60 FPS), और डेटा रिज़ॉल्यूशन (1,297 x 1,297 x 784) सहित चलचित्र निर्यात सेटिंग्स निर्दिष्ट करें. यदि वांछित हो, तो यहां टाइमस्टैम्प जोड़ें। एक बार जब ये पैरामीटर सेट हो जाते हैं, तो रिकॉर्ड (चित्रा 4F) चुनें।
  6. चरण 3.4 और 3.5 को चरण 3.4 में संशोधन के साथ दोहराया जा सकता है ताकि विशिष्ट टाइमपॉइंट्स पर रोटेशन वीडियो बनाया जा सके। स्टोरीबोर्ड में कोई कीफ्रेम अनुक्रम जोड़ते समय, रोटेशन बनाएँ बॉक्स चेक करें, और समय प्रगति का उपयोग करें अनचेक करें. उसके बाद, चरण 3.5 में के रूप में एक ही निर्देशों का पालन करें।
  7. किसी भी व्यक्तिगत समय बिंदु पर किसी भी ओरिएंटेशन पर एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि रेंडर करने के लिए, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि (चित्रा 4C) प्राप्त करने के लिए 4D व्यूअर में कैमरा आइकन का चयन करें।
  8. विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन बनाने के लिए, विश्लेषण पैनल (चित्रा 4B) तक पहुँचने के लिए फ्लास्क आइकन चुनें. विश्लेषण पैनल में, विश्लेषण ऑपरेशन ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें। एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल एक वॉल्यूम विश्लेषण पाइपलाइन के लिए संचालन के अनुक्रम के नीचे प्रदर्शित करता है। प्रत्येक पैरामीटर (तालिका 1) को ठीक करने के लिए पाइपलाइन के प्रत्येक चरण को अलग-अलग चलाएँ या पूर्ववत् करें.
  9. पाइपलाइन को चलाने की अनुमति देने के लिए पाइपलाइन के शीर्ष पर नीले त्रिभुज पर क्लिक करें।
    नोट:: यह कंप्यूटर की गति के आधार पर कुछ समय लगेगा। एक बार पाइपलाइन को अनुकूलित करने के बाद, पाइपलाइन को आसानी से एरिविस को निर्यात और आयात किया जा सकता है और बैच विश्लेषण में कई डेटासेट पर लागू किया जा सकता है।
  10. बैच विश्लेषण तक पहुँचने के लिए, विश्लेषण टैब के अंतर्गत बैच विश्लेषण पर क्लिक करें.
  11. पाइपलाइन चलने के बाद, एक खिड़की सभी वस्तुओं के साथ खींचती है। तालिका चिह्न (चित्र4B) के माध्यम से इसे मैन्युअल रूप से एक्सेस करें. इस विंडो के शीर्ष पर, उन सुविधाओं की सूची खींचने के लिए सुविधा स्तंभ लेबल वाले बॉक्स पर क्लिक करें जो रुचि की वस्तु के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। आंख क्षेत्र वॉल्यूम विश्लेषण के लिए, इन सुविधाओं में सतह क्षेत्र, वॉल्यूम (वॉल्यूम, VoxelCount), तीव्रता # 1 (माध्य), विशेषताएँ (आईडी, प्रकार), और समय बिंदु (प्रथम) शामिल हैं। एक स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करने के लिए निर्यात पर क्लिक करें।

Representative Results

यहां प्रदर्शित डेटासेट को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चित्रित किया गया था। एक Tg (Rx3: GFP) भ्रूण को 24 hpf के माध्यम से 1 somite चरण (ss) पर शुरू करने के लिए चित्रित किया गया था, 14 घंटे की कुल समय अवधि, 5 मिनट के अंतराल पर अधिग्रहित छवियों के साथ। टाइम-लैप्स इमेजिंग किसी भी समय-बिंदु के आसान चयन और तुलना की अनुमति देता है जो ब्याज के फेनोटाइप को दिखाता है। चित्रा 5 उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का एक सेट प्रदर्शित करता है जो चुनिंदा विकास ता्मक समय बिंदुओं पर पृष्ठीय सुविधाजनक बिंदु से प्रस्तुत किए गए थे। एरिविस विजन 4 डी में चलने वाली पाइपलाइन एक मुखौटा बनाती है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल द्वारा पहचाने जाने वाले विकासशील आंख का प्रतिनिधित्व करती है। चित्रा 5 और वीडियो 1-6 में, विकासशील आंख के फ्लोरोसेंट प्रतिपादन की तुलना में मास्क की कल्पना की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, तालिका 2 प्रत्येक इमेजिंग बिंदु पर विकासशील आंख से वॉल्यूम डेटा प्रदर्शित करता है। इस डेटासेट में सेगमेंट का नाम, आईडी, μm3 और voxel गिनती दोनों में वॉल्यूम, ऑब्जेक्ट की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता, ऑब्जेक्ट की पहचान की गई समय बिंदु, और μm2 में ऑब्जेक्ट की सतह क्षेत्र शामिल है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब आंख क्षेत्र दो ऑप्टिक पुटिकाओं (टाइमपॉइंट 64 से शुरू) में अलग हो जाता है, तो एक तीसरा क्षेत्र रहता है जो अग्रमस्तिष्क में आरएक्स 3: जीएफपी सकारात्मक है, जो हाइपोथैलेमस 38,39,40 (चित्रा 5 डी-एम) में योगदान देगा। यह तालिका 2 में दर्शाए गए वॉल्यूम डेटा में दिखाई देता है (टाइमपॉइंट 71 से शुरू होने वाले पीले रंग में हाइलाइट किया गया है) और आसानी से ऑप्टिक पुटिकाओं से अलग किया जा सकता है, क्योंकि यह ऑप्टिक पुटिका की तुलना में मात्रा में बहुत छोटा है।

Figure 1
चित्र 1: नमूना तैयारी। (ए) कांच के केशिका में भ्रूण की स्थिति। तीर केशिका में एक भ्रूण को इंगित करता है। (बी) ग्लास केशिका और केशिका धारक भागों। (c) आंशिक रूप से इकट्ठा केशिका धारक। (d) पूरी तरह से इकट्ठा केशिका धारक। (ई) लाइटशीट बढ़ते कक्ष। तीर ने केशिका धारक को उन्मुख करने के लिए उपयोग की जाने वाली सफेद रेखा का संकेत दिया। (च) केशिका धारक ठीक से Lightsheet में घुड़सवार. तीर मिलान सफेद लाइनों को दिखाता है, केशिका धारक के उचित अभिविन्यास का संकेत देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Lightsheet इमेजिंग सेट-अप. (A) Lightsheet, कंप्यूटर, और इनक्यूबेशन इकाई को चालू करने के लिए स्विचबोर्ड. संख्याएँ कार्रवाई के क्रम को इंगित करती हैं. (बी) लाइटशीट उद्देश्य कक्ष। (सी) इमेजिंग कक्ष। (डी) सिरिंज और टयूबिंग जो इमेजिंग चैंबर से जुड़ा होगा। (ई) इमेजिंग कक्ष उचित रूप से उद्देश्य कक्ष के भीतर स्थित है, जिसमें सभी ट्यूब दाईं ओर उपयुक्त बंदरगाहों से जुड़ी हुई हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नमूना स्थिति. (A) केशिका का पता लगाएँ और ज़ेन सॉफ़्टवेयर में नमूना बटन का पता लगाएँ जैसा कि तीर द्वारा इंगित किया गया है. (बी) कांच केशिका पर स्थिति। तीर उद्देश्य के लेंस के ठीक ऊपर स्थित ग्लास केशिका के किनारे को इंगित करता है। (c) कांच की केशिका से परे भ्रूण निलंबन। तीर ने उद्देश्य के लेंस के सामने कांच की केशिका के नीचे एगारोज़ में निलंबित भ्रूण का संकेत दिया। (d) उद्देश्य के माध्यम से भ्रूण का दृश्य। (ई) ErgoDrive नियंत्रण कक्ष. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एरिविस Vison4D नेविगेट करने के लिए महत्वपूर्ण माउस. प्रत्येक पैनल में बाएं से दाएं पहचाने जाने वाले आइकन फ़ंक्शन होते हैं। (ए) खोलें, सहेजें, बंद करें। (बी) विश्लेषण पैनल, ऑब्जेक्ट्स तालिका दिखाएँ, खुला ट्रैक संपादक. (C) क्लिपबोर्ड में एक छवि के रूप में वर्तमान दर्शक सामग्री की प्रतिलिपि बनाएँ, बुकमार्क टॉगल करें, वर्तमान दृश्य के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि बनाएँ, स्टोरीबोर्ड टॉगल करें. (D) दिखाएँ माप बॉक्स, दिखाएँ ओरिएंटेशन क्रॉस, दिखाएँ लीजेंड, दिखाएँ स्केल बार. (E) 2D व्यूअर के रूप में दिखाएँ, गैलरी व्यूअर के रूप में दिखाएँ, 4D व्यूअर के रूप में दिखाएँ, जानकारी दर्शक के रूप में दिखाएँ, प्रोजेक्शन व्यूअर के रूप में दिखाएँ. च) सभी Keyframes ताज़ा करें, Keyframe जोड़ें, Keyframe अनुक्रम जोड़ें, Keyframe सम्मिलित करें, सभी Keyframes निकालें, निर्यात मूवी, लोड Storyboard, स्टोरीबोर्ड सहेजें, पूरी फिल्म के लक्ष्य समय को समायोजित करें, पहले Keyframe, प्ले, रोकें, रोकें, रोकें, अंतिम Keyframe. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों और आंखों के क्षेत्र के मुखौटे(ए-एम) उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का एक सेट जो पृष्ठीय सुविधाजनक बिंदुओं से प्रस्तुत किए गए थे; (A'-M') प्रत्येक संबंधित समयबिंदु के लिए आंख क्षेत्र मास्क। प्रत्येक छवि सेट को उस समय तक नोट किया जाता है जब इसे इमेजिंग की शुरुआत से प्राप्त किया गया था और या तो सोमाइट चरण (एसएस) या निषेचन के बाद के घंटों (एचपीएफ) में संबंधित विकास चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: Tg (rx3: GFP) 1 एसएस-24 hpf से zebrafish भ्रूण के समय चूक वीडियो. कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें).

वीडियो 2: Tg (rx3: GFP) के समय-चूक वीडियो zebrafish भ्रूण से 1 एसएस-24 hpf eyefield के साथ के रूप में arivis Vision4D पाइपलाइन द्वारा पहचाना गया. कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें). 

वीडियो 3: 1 एसएस पर एक Tg (rx3: GFP) ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के 360 ° रोटेशन। कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें). 

वीडियो 4: 360 ° एक Tg (rx3: GFP) zebrafish भ्रूण नेत्र क्षेत्र मुखौटा के रोटेशन 1 एसएस पर. कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें). 

वीडियो 5: 24 hpf पर एक Tg (rx3: GFP) zebrafish भ्रूण के 360 ° रोटेशन. कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें). 

वीडियो 6: 24 hpf पर एक Tg (rx3: GFP) zebrafish भ्रूण नेत्र क्षेत्र मुखौटा के 360 ° रोटेशन. कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें (के रूप में लिंक सहेजें). 

तालिका 1: विकासशील नेत्र क्षेत्र की मात्रा विश्लेषण के लिए एरिविस विजन 4 डी पाइपलाइन। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: एरिविस Vision4D द्वारा अधिग्रहित विकासशील नेत्र क्षेत्र की मात्रा और सतह क्षेत्र। अनुमानित हाइपोथैलेमस से संबंधित पंक्तियों को ऑप्टिक पुटिकाओं से अलग करने के लिए पीले रंग में हाइलाइट किया जाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, लाइटशीट माइक्रोस्कोप का उपयोग आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग को करने के लिए किया गया था और परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण किया गया था। परिणामी डेटासेट ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, साथ ही आनुवंशिक उत्परिवर्तन, औषधीय एजेंटों के संपर्क में आने या अन्य प्रयोगात्मक मापदंडों के परिणामस्वरूप इस प्रक्रिया के लिए परेशान करता है। यहां प्रोटोकॉल ने प्रदर्शित किया कि इस डेटासेट को कैसे प्राप्त किया जा सकता है और प्रारंभिक विकास के माध्यम से आंखों के क्षेत्र की मात्रा का विश्लेषण करने के तरीके का एक उदाहरण प्रदान किया गया है। इस डेटा को जैविक प्रतिकृतियों में पुनरुत्पादक और सुसंगत (मात्रा में 10% से कम भिन्नता) पाया गया था, यह ध्यान में रखते हुए कि रन की शुरुआत से पहले भ्रूण स्टेजिंग में मामूली अंतर अंतिम मात्रा माप में कुछ भिन्नता का कारण बन सकता है।

केशिका में भ्रूण की प्रारंभिक स्थिति में और उद्देश्य के सामने एम्बेडेड भ्रूण की स्थिति में देखभाल की जानी चाहिए। अभिविन्यास भ्रूण को बढ़ने और उद्देश्य के दृष्टिकोण से बाहर जाने से रोकने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। भ्रूण में 10 एचपीएफ पर एक गोल आकार होता है, जो केशिका में एक विशिष्ट अभिविन्यास की गारंटी देने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है। आदर्श रूप से, भ्रूण के शरीर को केशिका में पार्श्व रूप से तैनात किया जाएगा। केशिका में कई भ्रूण लोड करने से एक अच्छी तरह से स्थित भ्रूण होने की संभावना बढ़ जाएगी।

इस प्रक्रिया में, भ्रूण को इमेजिंग और रोशनी के उद्देश्यों के सामने निलंबित करने के लिए एगारोज़ में एम्बेडेड किया जाता है। कम पिघलने के तापमान agarose की सही एकाग्रता का चयन महत्वपूर्ण है. एक एकाग्रता का बहुत अधिक भ्रूण को संकुचित करेगा और इसे ठीक से विकसित होने से रोकेगा; एक एकाग्रता के बहुत कम agarose अलग गिरने और भ्रूण पकड़ में परिणाम होगा. इस प्रोटोकॉल के लिए एकाग्रता इष्टतम 1% कम पिघलने के तापमान agarose30,31 की एक अंतिम एकाग्रता है।

एक और तत्व जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए वह संतृप्ति का स्तर है। जैसे-जैसे आईफील्ड बढ़ता है और अंतर करता है, Rx3: GFP सिग्नल की ताकत तेज हो जाती है। इसलिए, प्रारंभिक इमेजिंग पैरामीटर सेट करते समय, छवि को कम करने के लिए एक्सपोज़र और लेजर पावर को कम किया जाना चाहिए। यह छवि को ओवरसैचुरेटेड होने से रोक देगा क्योंकि Rx3: GFP समय के साथ उज्ज्वल हो जाता है। छवि प्रसंस्करण में undersaturation के लिए सही करने के लिए संशोधन किए जा सकते हैं, लेकिन छवियों का अधिग्रहण किया गया है के बाद oversaturation सही नहीं किया जा सकता है।

कुछ अतिरिक्त संशोधन हैं जो इस प्रोटोकॉल में किए जा सकते हैं जो कुछ परियोजनाओं के लिए फायदेमंद हो सकते हैं जो इस पेपर में वर्णित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण सेट अप में मल्टीव्यू इमेजिंग सेट अप करना संभव है। यह पैरामीटर y-अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर कई भ्रूणों को प्रत्येक समय अंतराल पर क्रमिक रूप से चित्रित करने की अनुमति देगा। डेटा सेट में जटिलता जोड़ते समय, यह डेटा संग्रह की दर को बढ़ाएगा। इसके अतिरिक्त, छवि प्रसंस्करण के संदर्भ में, अन्य मापदंडों द्वारा आंख क्षेत्र को मापना संभव है। यहां, हमने बताया कि आंख क्षेत्र की मात्रा के संदर्भ में डेटा को कैसे निर्धारित किया जाए। वैकल्पिक रूप से, अलग-अलग कोशिकाओं को मापने और ट्रैक करने या ऑप्टिक पुटिका विलोपन की दर निर्धारित करने के लिए एक पाइपलाइन बनाई जा सकती है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, दोनों confocal और Lightsheet माइक्रोस्कोपी zebrafish के समय-चूक इमेजिंग अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लाइटशीट को विशेष रूप से इस परियोजना के लिए चुना गया था क्योंकि एक मोटी (>1 मिमी) नमूने के माध्यम से छवि की बेहतर क्षमता के कारण, क्योंकि यह ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के लिए एक आदर्श तापमान वातावरण बनाए रखने के लिए एक इनक्यूबेशन इकाई से सुसज्जित है, और क्योंकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में तेज दर पर छवि बनाने की इसकी क्षमता इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कई समय अंतराल पर छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देती है, भ्रूण21 के साथ कोई नुकसान या फोटोब्लीचिंग नहीं है, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लाइटशीट माइक्रोस्कोप कई फ्लोरोफोर से सिग्नल को प्रतिबिंबित करने के लिए सुसज्जित है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले लाइटशीट माइक्रोस्कोप में 405, 445, 488, 515, 561 और 638 एनएम पर ठोस राज्य लेजर उत्तेजना रेखाएं हैं, जो एक से अधिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक भ्रूण की इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकती हैं।

जबकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से Lightsheet Z.1 दोहरी रोशनी माइक्रोस्कोप सिस्टम और एरिविस Vision4D विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि अधिग्रहण विश्लेषण के लिए निर्देशों का विवरण देता है, Leica, Olympus, और Luxendo द्वारा बनाए गए अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Lightsheet माइक्रोस्कोप हैं, साथ ही Imaris द्वारा छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर, जिसका उपयोग समान परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए उपकरण और सॉफ्टवेयर का चयन हमारे संस्थान में उपलब्धता द्वारा निर्धारित किया गया था।

संक्षेप में, यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रोटोकॉल लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग के संचालन के लिए एक ठोस प्रारंभिक बिंदु प्रदान करेगा, और ज़ेबराफ़िश में शुरुआती आंखों के विकास की छवि परिमाणीकरण के लिए।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या S10OD020067 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के निदेशक के कार्यालय द्वारा और NIH पुरस्कार R01EY021769 (A.C.M. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। हम केंटकी विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान इमेजिंग सेंटर में डौग हैरिसन और जिम बेगले की सहायता के लिए आभारी हैं, और विशेषज्ञ ज़ेबराफ़िश देखभाल के लिए लुकास विएरा फ्रांसिस्को और एवलिन एम टर्नबॉघ के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 170 समय चूक इमेजिंग Lightsheet माइक्रोस्कोपी लाइव इमेजिंग zebrafish आंखों के विकास रेटिना
Rx3: GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish का उपयोग कर Lightsheet माइक्रोस्कोपी द्वारा ओकुलर Morphogenesis visualizing
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Petersen, R. A., Morris, A. C.… More

Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).

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