Summary
여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.
Abstract
척추동물 눈 발달은 배아 위축이 끝날 무렵에 시작되며 세포 이동, 증식 및 분화의 정확한 조정이 필요한 복잡한 과정입니다. 타임랩스 상상은 눈 발달 동안 세포의 행동에 대한 독특한 통찰력을 제공하는데, 이는 우리가 생체 내에서 오큘로제네시스를 시각화할 수 있게 해주기 때문이다. Zebrafish는 고도로 보존 된 척추 동물의 눈과 광학적으로 투명하게 유지하면서 신속하고 외부적으로 발달 할 수있는 능력으로 인해이 과정을 시각화 할 수있는 훌륭한 모델입니다. 제브라피쉬 눈 발달에 대한 타임랩스 이미징 연구는 형질전환 제브라피쉬 라인 Tg(rx3:GFP)의 사용에 의해 크게 촉진된다. 발달하는 전뇌에서 rx3 : GFP 발현은 단일 안구장의 세포를 표시하고, GFP는 안구장이 시낭을 형성하기 위해 회피 할 때 계속 표현되며, 그 다음 질부에서 광학 컵을 형성합니다. 따라서 rx3 : GFP 발현의 고해상도 시간 경과 영상은 망막으로 발전함에 따라 시간을 통해 눈 원초를 추적 할 수있게합니다. 라이트시트 현미경 검사는 형광 이미징을 위해 더 두꺼운 샘플을 관통하고, 광표백 및 광독성을 최소화하고, 고속으로 이미지를 촬영할 수 있기 때문에 시간이 지남에 따라 안구 형태 형성을 이미지화하는 이상적인 방법입니다. 여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다. 결과 데이터 세트는 안구 형태 형성 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수있을뿐만 아니라 유전 적 돌연변이, 약리학 적 제제에 대한 노출 또는 기타 실험 조작의 결과로이 과정에 대한 혼란을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
배아 발달은 많은 다른 사건의 정확한 조정을 필요로하는 복잡한 과정입니다. 척추 동물의 눈의 형성은 발달하는 전뇌에서 시작되며, 세포의 일부가 안구장으로 지정됩니다. 이 세포들은 표면 외배엽쪽으로 질질되어 두 개의 양측 광학 소포 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10을 일으킨다. 표면 외배엽과의 접촉은 광학 소포의 질을 광학 컵으로 유도합니다. 표면 외배엽은 수정체와 각막과 같은 눈의 전방 구조를 발생시키는 반면, 광학 컵은 신경 망막과 망막 색소 상피 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12를 발생시킵니다. . 이 과정의 중단은 미세 프탈혈증, anophthalmia 및 coloboma (MAC)와 같은 선천적 결함으로 이어질 수 있습니다. 현재로서는 이러한 결함 3,5,6,7,9,10,11,12를 수정할 수 있는 옵션이 없습니다. 안구 형태 형성의 메커니즘과 MAC으로 이어질 수있는 문제에 대한 추가 연구는 잠재적으로 치료로 이어질 수있는 지식의 기초를 제공 할 것입니다. 눈 발달 동안 세포의 역동적 인 행동을 조사하는 한 가지 강력한 도구는 시간 경과 상상이며,이 과정을 생체 내 및 실시간으로 시각화하고 특성화 할 수 있습니다.
Zebrafish (Danio rerio)는 타임랩스 이미징을 사용하여 초기 안구 발달을 시각화하는 훌륭한 모델입니다. 그들은 고도로 보존 된 척추 동물의 눈을 가지고 있으며 광학적으로 투명하게 유지하면서 신속하고 외부적으로 발달 할 수있는 능력을 가지고 있습니다1. Zebrafish는 포유류 모델이 부족한 이러한 특성으로 인해 타임랩스 이미징을위한 훌륭한 자원을 제공합니다. 제브라피쉬 눈 발달에 대한 타임랩스 이미징 연구는 형질전환 제브라피쉬 라인 Tg(rx3:GFP)13의 사용에 의해 크게 촉진된다. Rx3 (망막 호메오박스 단백질 3)는 눈 발달에 필수적인 전사 인자이다14. Rx3는 제브라피쉬에서 발현되는 3개의 rx 유전자 중 첫 번째로, 그의 발현을 시작으로 위태화 중간, 약 8시간 후 수정(hpf)15,16이다. rx3:GFP 전이유전자는 1 소마이트 단계(ss), 대략 10 hpf 15,17,18,19,20에서 시작하는 발달 전뇌에서 시각화될 수 있다. 발달하는 전뇌에서, rx3:GFP 발현은 단일 안구장의 세포를 표시하고, GFP(녹색 형광 단백질)는 안구 형태형성의 나머지 부분을 통해 계속 발현된다. 따라서 rx3 : GFP 발현의 고해상도 시간 경과 이미징을 통해 망막 17,18,20으로 발전함에 따라 시간을 통해 단일 안구장을 추적 할 수 있습니다.
제브라피쉬 발달에 대한 타임랩스 이미징 연구는 주로 공초점 또는 라이트시트 현미경을 사용하여 수행되었다. 공초점 현미경은 z축을 따라 샘플의 정밀한 이미징을 허용하고 형광 배경 신호를 감소시킨다는 점에서 유리하다. 그러나, 이미지를 획득하는 데 걸리는 시간, 샘플 위치 강성, 그리고 살아있는 샘플의 광표백 및 광독성에 대한 성향에 의해 제한된다. 라이트시트 현미경 검사는 형광 이미징을 위해 더 두꺼운 샘플을 관통할 수 있는 능력, 샘플 방향의 유연성 향상, 광표백 및 광독성 최소화, 고속 이미징 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30으로 인해 시간이 지남에 따라 안구 형태 형성을 이미지화하는 이상적인 방법입니다. ,31. 현재 광 시트 현미경 복사 시스템으로 달성 할 수있는 공간 분해능은 약 250-500 나노 미터 (nm)입니다. 이것은 공초점 현미경으로 얻을 수있는 것과 크게 다르지 않지만 샘플을 여러 각도에서 자유롭게 회전하고 이미징 할 수있어 이미징 깊이와 해상도를 모두 향상시키고 공초점 플랫폼27,32보다 생체 내 시간 경과 이미징 실험에 훨씬 더 큰 유연성을 제공합니다. . 이러한 이유로, 라이트시트 현미경 검사는 제브라피쉬 개발에 대한 타임랩스 이미징 연구에 널리 사용되는 방법이 되고 있습니다. 이 프로토콜은 상업적으로 입수가능한 라이트시트 현미경(33)을 사용하여 Rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬의 이미징을 통해 오큘로제네시스를 정량화하는 단계를 설명하고, 아리비스 소프트웨어 플랫폼을 이용한 이미지 분석을 위한 파이프라인을 상세히 기술한다.
Protocol
제브라피쉬의 사용과 관련된 모든 실험은 켄터키 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 수립 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 시료 준비
- 이미징이 계획되기 전날 밤 게이트 크로스 탱크에 Tg (Rx3 : GFP) 제브라 피쉬의 짝짓기 쌍을 설정하십시오. 다음날 아침 물고기 시설34,35에서 불이 켜지면 문을 당깁니다.
참고 : 선택한 짝짓기 쌍은 생후 4 개월에서 2 세 사이이어야하며 체형과 채색35에 따라 남성 또는 여성으로 쉽게 구별됩니다. - 배아에 대한 매 반 시간마다 십자가를 확인하고 배아가 교차 탱크의 바닥에서 처음 시각화되는 시간을 기록하십시오. 배아를 페트리 접시로 옮기고 배아를 약 10시간 동안 28.5°C에서 유지하여 1-2 소마이트 단계(ss)로 발전시킨다. 1-2 소마이트 단계 (ss)에서 이미지를 시작하십시오.
- 소미트의 존재를 스크리닝하려면 10 hpf의 스테레오스코프로 배아를 관찰하고 소마이트의 수1을 계산하십시오.
참고 : 단일 소마이트 단계를 초과하는 배아는이 실험에 사용해서는 안됩니다. - 단일 소마이트 단계에 있는 배아 밖에서, Rx3:GFP 전이유전자의 존재를 확인하기 위해 입체현미경과 조합된 형광 어댑터를 사용하여 GFP 발현을 스크리닝한다. 일단 3-5 GFP 양성 개체가 확인되면, 미세한 포셉을 사용하여 배아를 데코리온화하고 유리 피펫35가있는 E3 배아 버퍼가 들어있는 작은 페트리 접시로 옮깁니다.
- 배아를 미세원심분리 튜브 35,36의 0.168 mg/mL 트리카인(MS222)을 함유하는0.5 mL E3 배아 완충액(pH 7)으로 옮겨 마취시킨다. 자발적인 근육 운동은 17 hpf37만큼 일찍 시작됩니다. 배아가 이 시점을 넘어 이미지를 나타내기 위해 마취되도록 하십시오.
- 배아를 0.168 mg/mL 트리카인 및 E3의 1% 낮은 용융 온도 아가로스에 내장시킨다.
참고 : 이것은 배아가 제자리에 유지되도록 허용하지만 이미징 시간 과정30,31에 걸쳐 배아의 성장을 허용 할만큼 충분히 유연하게 유지되도록 낮은 용융 온도 아가로스의 최적 농도입니다. - E3 완충액 중의 2% 저융점 아가로오스의 용액 10 mL를 제조하였다. 전자 레인지에서 가열하여 용액이 끓는 것을 방지하기 위해 15 초 간격으로 아가로스를 용해시킵니다. 용액이 불편 함없이 유지되기에 충분히 차갑지 만 응고되지 않고 배아에 해를 끼치 지 않도록하십시오. 아가로스가 충분히 차가워지면 E3의 Tricaine 튜브에있는 배아에 0.5 mL를 넣고 용액과 배아를 부드럽게 피펫하여 혼합하십시오.
- 1 mm 유리 모세관과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 플런저를 사용하여, 아가로스 용액 내의 배아를 모세관으로 끌어올린다. 모세관 안으로 총 3-5개의 배아(다중 배아)를 끌어당겨 잘 배치된 배아를 가질 가능성을 높여야 합니다.
참고 :이 시점에서 배아의 둥근 특성으로 인해 모세 혈관에서 특정 방향을 보장하는 것은 어렵습니다. 이상적으로, 배아의 몸체는 모세관에 옆으로 위치하여 현미경 내에서 가장 쉽게 배치 할 수 있습니다. - 아가로스가 실온에서 30-60 초에 걸쳐 응고되도록하십시오. 모세관 0.168mg/mL 트리카인의 비이커에 E3 버퍼에 넣고 이미지를 촬영할 준비가 될 때까지 놓습니다(그림 1A).
참고 : 초과 2 % 낮은 용융 온도 아가로스 용액은 향후 실험에서 응고 및 이후에 재가열되도록 허용 될 수 있습니다. - 단계 2.5에 설명된 바와 같이 모세관을 샘플 홀더(도 1B-F) 내로 놓는다.
2. 자이스 라이트 시트 Z.1 설정
- 현미경과 컴퓨터의 각 구성 요소를 다음 순서로 켭니다: 1) 시스템, 2) PC, 3) 인큐베이션(그림 2A).
- 20x 이미징 대물렌즈와 10x 조명 조준을 현미경 챔버에 넣습니다. 유지 관리 탭의 Zen Software 인터페이스의 목표 설정을 일치시킵니다.
- 챔버(그림 2C)를 튜브가 바깥쪽을 향하도록 트랙(그림 2B)의 하우징으로 밀어 넣습니다. 튜브는 그림 2E와 같이 오른쪽에 있는 적절한 포트에 연결됩니다.
- 루어-락 기구를 사용하여 주사기에 연장선을 부착한다(그림 2D); E3의 Tricaine으로 채우고 현미경35의 오른쪽에 부착 된 홀더에 놓습니다. E3의 Tricaine으로 채워진 주사기에 부착 된 연장을 루어 잠금 메커니즘으로 챔버의 오른쪽 하단에 연결하십시오. 플런저를 밀어 챔버를 Tricaine/E3 버퍼로 채웁니다. 챔버의 문을 닫으십시오.
- 샘플이 있는 모세관을 모세관 샘플 홀더에 넣습니다. 모세관 샘플 홀더는 두 개의 고무 슬리브, 금속 샘플 홀더 디스크, 금속 스템 및 금속 캡으로 구성됩니다(그림 1B). 금속 디스크의 중앙으로 금속 덮개를 클릭합니다(그림 1C). 두 개의 고무 마개를 칼집에 넣고 슬릿이 칼집 끝을 향하게하고 모세관이 뒤 따른다. 고무 마개 중앙을 통해 모세관을 밀어 넣습니다. 마커가 금속 덮개의 바닥에 있으면 금속 뚜껑을 제자리에 고정합니다(그림 1D).
- 모세관 샘플 홀더를 현미경 상단에 놓고 흰색 표시가 정렬되어 있습니다(그림 1E,F). 뚜껑을 닫습니다.
- 소프트웨어 인터페이스에서 모세관 찾기 단추를 클릭합니다(그림 3A). 모세관 방향을 제어하는 수동 장치인 ErgoDrive 제어판(그림 3E)을 사용하여 모세관을 이동하고 목표 바로 위에 배치합니다(그림 3B).
- 뚜껑을 열고, 배아를 포함하는 아가로오스의 섹션이 모세관 바닥 아래에 매달려 목표물 앞에 있을 때까지 플런저를 부드럽게 밀었다(도 3C).
- 모세관 찾기를 끄고 샘플 찾기 단추를 클릭합니다(그림 3A). 이렇게 하면 뷰가 샘플 챔버의 웹캠에서 현미경 대물로 전환됩니다(그림 3D). 이 뷰를 사용하여 샘플의 위치를 보다 정확하게 조정할 수 있습니다. 샘플 찾기를 끕니다(그림 3A).
- 획득 탭으로 전환합니다. Z-스택 및 시계열 확인란을 선택합니다.
- 획득 모드 매개변수 창에서 듀얼 사이드 라이트시트 설정을 선택하고 온라인 듀얼 사이드 퓨전 및 피벗 스캔 확인란을 선택합니다.
- 채널 창에서 488 채널을 선택하고 레이저 파워를 1로 설정하고 노출 시간을 7.5ms로 설정합니다.
- 그런 다음 연속 버튼을 클릭하여 배아의 라이브 뷰를 얻으십시오. ErgoDrive 컨트롤 패널을 사용하여 안구장이 카메라를 직접 향할 때까지 배아의 위치를 조정합니다. 눈 필드에 충분히 초점이 맞춰질 때까지 채널 매개변수의 왼쪽 및 오른쪽 라이트시트를 계속 조정합니다.
- ErgoDrive 제어판을 사용하여 Z-Stack 매개변수를 설정하여 Z- 평면을 통과합니다. 첫 번째 및 마지막 Z-위치를 마지막으로 검출 가능한 형광 신호를 넘어 약 500 μm로 설정하십시오. 이것은 배아가 타임랩스 이미징 세션 동안 성장함에 따라 안구장이 프레임에 남아있을 수있는 공간을 남겨 둡니다. Z-Stack의 범위를 설정 한 후 최적 버튼을 클릭하여 스텝 크기를 최 적 설정 인 0.477 μm로 설정하십시오.
- 온도를 28°C로 유지하기 위해 펠티에 유닛의 박스를 체크하여 인큐베이션 파라미터를 설정한다. 시계열 창에서 이미지를 획득할 빈도와 시간 간격을 선택합니다. 이 프로토콜에서, 파라미터들은 총 166개의 간격 동안 매 5분마다 이미지화되도록 설정되었다.
- 실험 시작 단추를 클릭합니다. 이미지 세트를 저장할 폴더를 선택합니다. 이미지 접두사를 설정하고 저장을 눌러 이미징을 시작합니다.
참고: 이제 현미경은 지정된 간격으로 설정된 각 이미지를 통해 실행됩니다. - 타임랩스 이미징 세션이 완료된 후, 스테이지를 로드 위치로 보내고, 모세관 샘플 홀더를 제거한다. 모세관 샘플 홀더를 역순으로 떼어내어 함께 넣고, 플런저를 사용하여 모세관으로부터 샘플 및 과량의 아가로스를 제거하였다. 챔버 도어를 엽니다. 주사기를 사용하여 챔버에서 챔버 액체를 제거하고 챔버를 분리 및 제거한 다음 물로 헹구고 공기 건조하십시오.
3. 이미지 분석
- arivis Vision4D 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
- 파일을 클릭 한 다음 파일 가져 오기를 선택하십시오. 타임랩스 이미징 세션에서 모든 .czi 파일을 선택하고 엽니다. 다음 창이 열리고 파일을 가져오는 방법에 대한 옵션이 표시됩니다. Z-스택을 프레임으로 선택하여 Z-스택을 얻은 순서대로 정렬합니다. 파일을 가져오면 소프트웨어는 단일 .sis 파일로 저장됩니다. 저장할 파일의 위치를 지정하려면 가져오기를 클릭하기 전에 폴더를 선택합니다.
- 파일을 가져온 후 arivis는 이제 타임랩스 이미지의 비디오를 렌더링할 준비가 되었습니다. 왼쪽 하단에 있는 4D 뷰어 큐브와 배율 표시줄 아이콘을 클릭합니다(그림 4D-E). 비디오 아이콘을 클릭하여 스토리보드 작업 표시줄을 화면 아래쪽으로 가져옵니다(그림 4C).
- 스토리보드 작업 표시줄에서 키프레임 시퀀스 추가를 선택합니다(그림 4F). 비디오의 지속 시간(초)을 지정하고, 회전 만들기 상자의 선택을 취소하고, 시간 진행률 사용을 선택하여 비디오에 특정 시점을 포함시킵니다. 이 소프트웨어는 언제든지 조정할 수 있도록 스토리 보드 작업 표시 줄의 오른쪽에 이러한 매개 변수를 표시합니다. 스토리보드를 저장하여 동일한 매개 변수를 여러 이미지 세트에 적용합니다(그림 4F).
- 동영상 내보내기를 클릭하여 타임랩스 이미징 비디오를 저장합니다(그림 4F). 파일 이름 및 위치, 비디오 형식(.mp4), 비디오 해상도(1,080p), 프레임 속도(60FPS) 및 데이터 해상도(1,297 x 1,297 x 784)를 포함한 동영상 내보내기 설정을 지정합니다. 원하는 경우 여기에 타임스탬프를 추가합니다. 이러한 매개 변수가 설정되면 기록을 선택합니다(그림 4F).
- 3.4단계와 3.5단계를 반복하여 3.4단계를 반복하여 특정 시점에 회전 비디오를 만들 수 있습니다. 스토리보드에 키프레임 시퀀스를 추가할 때 회전 만들기 상자를 선택하고 시간 진행률 사용의 선택을 취소합니다. 그런 다음 3.5단계와 동일한 지침을 따릅니다.
- 개별 시점에서 임의의 방향으로 고해상도 이미지를 렌더링하려면 4D 뷰어에서 카메라 아이콘을 선택하여 고해상도 이미지를 가져옵니다(그림 4C).
- 분석용 파이프라인을 구축하려면 플라스크 아이콘을 선택하여 [분석 ] 패널에 액세스합니다(그림 4B). [분석 ] 패널에서 [분석 작업 ] 드롭다운 메뉴를 클릭합니다. 예를 들어, 프로토콜은 볼륨 분석 파이프라인에 대한 작업 시퀀스를 아래에 보여 줍니다. 파이프라인의 각 단계를 개별적으로 실행하거나 실행 취소하여 각 매개 변수를 미세 조정합니다(표 1).
- 파이프라인 위쪽에 있는 파란색 삼각형을 클릭하여 파이프라인을 실행할 수 있도록 합니다.
참고: 컴퓨터 속도에 따라 다소 시간이 걸립니다. 파이프라인이 최적화되면 파이프라인을 쉽게 내보내고 아리비스로 가져와서 배치 분석에서 여러 데이터 세트에 적용할 수 있습니다. - 배치 분석에 액세스하려면 분석 탭에서 배치 분석을 클릭합니다.
- 파이프라인이 실행되면 발견된 모든 개체가 있는 창이 열립니다. 테이블 아이콘을 통해 수동으로 액세스합니다(그림 4B). 이 창의 맨 위에서 피쳐 열(Feature Column )이라는 상자를 클릭하여 관심 대상에 대한 정보를 제공할 수 있는 기능 목록을 가져옵니다. 안구 필드 볼륨 분석의 경우 이러한 기능에는 표면적, 볼륨(볼륨, VoxelCount), 강도 #1(평균), 속성(Id, 유형) 및 시점(첫 번째)이 포함됩니다. 내보내기 를 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
Representative Results
여기에 표시된 데이터 세트는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 이미지화되었습니다. Tg(Rx3:GFP) 배아는 1 소마이트 단계(ss)에서 시작하여 총 14hpf의 24hpf까지 영상화되었으며, 5분 간격으로 획득된 이미지를 얻었다. 타임랩스 이미징을 사용하면 관심 표현형을 보여주는 모든 시점을 쉽게 선택하고 비교할 수 있습니다. 그림 5는 선택된 발달 시점의 등쪽 유리한 지점에서 렌더링된 고해상도 이미지 집합을 보여 줍니다. arivis Vision4D에서 실행되는 파이프라인은 형광 신호로 식별되는 발달하는 눈을 나타내는 마스크를 구축합니다. 도 5 및 비디오 1-6에서, 마스크는 발달하는 눈의 형광 렌더링과 비교하여 시각화될 수 있다. 또한, 표 2는 모든 이미징 포인트에서 현상 안구로부터의 부피 데이터를 표시한다. 이 데이터 세트에는 세그먼트 이름, id,μm3 및 복셀 카운트의 부피, 개체의 평균 형광 강도, 개체가 식별된 시점 및 개체의 표면적이μm2로 포함됩니다. 안구장이 두 개의 광소포로 분리될 때(Timepoint 64에서 시작), 전뇌에 Rx3:GFP 양성인 세 번째 영역이 남아 시상하부38,39,40에 기여한다는 점에 유의하는 것이 중요하다(도 5D-M). 이것은 표 2에 표현된 부피 데이터(Timepoint 71에서 시작하여 노란색으로 강조 표시됨)에 나타나며, 어느 하나의 광학 소포보다 부피가 훨씬 작기 때문에 광학 소포로부터 쉽게 분리될 수 있다.
그림 1: 샘플 준비 . (A) 유리 모세관에서 배아의 위치. 화살표는 모세관의 배아를 가리 킵니다. (B) 유리 모세관 및 모세관 홀더 부품. (C) 부분적으로 조립된 모세관 홀더. (D) 완전히 조립된 모세관 홀더. (E) 라이트 시트 장착 챔버. 화살표는 모세관 홀더의 방향을 지정하는 데 사용되는 흰색 선을 나타냅니다. (F) 라이트시트에 모세관 홀더가 제대로 장착됨. 화살표는 모세관 홀더의 적절한 방향을 나타내는 일치하는 흰색 선을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 라이트시트 이미징 설정. (A) 라이트시트, 컴퓨터 및 인큐베이션 유닛을 켜는 배전반. 숫자는 작업 순서를 나타냅니다. (B) 라이트 시트 대물 챔버. (C) 이미징 챔버. (d) 이미징 챔버에 연결될 주사기 및 튜빙. (e) 이미징 챔버는 오른쪽의 적절한 포트에 연결된 모든 튜브와 함께 대물 챔버 내에 적절하게 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 샘플 위치 지정 . (A) 화살표로 표시된 Zen Software에서 모세관 찾기 및 샘플 단추 찾기 . (b) 유리 모세관 상의 위치. 화살표는 목표물의 렌즈 바로 위에 위치한 유리 모세관의 가장자리를 나타냅니다. (c) 유리 모세관을 넘어선 배아 현탁액. 화살표는 목표물의 렌즈 앞에있는 유리 모세관 아래의 아가로스에 매달려있는 배아를 나타냅니다. (d) 목적을 통한 배아의 관점. (E) ErgoDrive 제어판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: arivis Vison4D를 탐색하기 위한 중요한 아이콘. 각 패널에는 왼쪽에서 오른쪽으로 식별되는 아이콘 기능이 있습니다. (A) 열기, 저장, 닫기. (B) 분석 패널, 객체 테이블 표시, 트랙 편집기 열기. (C) 현재 뷰어 콘텐츠를 클립 보드에 이미지로 복사하고, 책갈피를 토글하고, 현재보기의 고해상도 이미지 만들기, 스토리 보드 토글. (D) 측정 상자 표시, 방향 십자 표시, 범례 표시, 배율 막대 표시. (E) 2D 뷰어로 표시, 갤러리 뷰어로 표시, 4D 뷰어로 표시, 정보 뷰어로 표시, 프로젝션 뷰어로 표시. F) 모든 키프레임 새로 고침, 키프레임 추가, 키프레임 시퀀스 추가, 키프레임 삽입, 모든 키프레임 제거, 동영상 내보내기, 스토리보드 로드, 스토리보드 저장, 전체 동영상의 목표 시간 조정, 첫 번째 키프레임, 재생, 일시 중지, 중지, 마지막 키프레임. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 고해상도 이미지 및 아이 필드 마스크. (A-M) 등쪽 유리한 지점에서 렌더링된 고해상도 이미지 집합입니다. (A'-M') 아이 필드는 각각의 대응하는 시점들에 대해 마스크한다. 각 이미지 세트는 이미징 시작부터 획득 한 시간과 소마이트 단계 (ss) 또는 수정 후 시간 (hpf)의 해당 발달 단계에 의해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 1 ss-24 hpf에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아의 타임랩스 비디오. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
비디오 2 : 아리비스 Vision4D 파이프 라인에 의해 확인 된 안구와 함께 1 ss-24 hpf에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아의 타임랩스 비디오. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
비디오 3 : 1 ss에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아의 360 ° 회전. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
비디오 4 : 1 ss에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아 아이 필드 마스크의 360 ° 회전. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
비디오 5 : 24 hpf에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아의 360 ° 회전. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
비디오 6 : 24 마력에서 Tg (rx3 : GFP) 제브라 피쉬 배아 아이 필드 마스크의 360 ° 회전. 비디오를 다운로드하려면 여기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오 (다른 이름으로 링크 저장).
표 1: 개발 안구장의 부피 분석을 위한 arivis Vision4D 파이프라인. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: arivis Vision4D에 의해 획득된 발달 안구장의 부피 및 표면적. 추정 시상 하부와 관련된 행은 시낭과 구별하기 위해 노란색으로 강조 표시됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜에서, 라이트시트 현미경은 눈 발달의 타임랩스 이미징을 수행하기 위해 사용되었고, 그 결과 데이터가 분석되었다. 결과 데이터 세트는 안구 형태 형성 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수있을뿐만 아니라 유전 적 돌연변이, 약리학 적 제제에 대한 노출 또는 기타 실험 매개 변수의 결과로이 과정에 대한 혼란을 제공 할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 이 데이터 세트를 얻을 수 있는 방법을 시연하고 초기 개발을 통해 안구 필드의 볼륨을 분석하는 방법의 예를 제공했습니다. 이 데이터는 생물학적 반복실험 전반에 걸쳐 재현 가능하고 일관성이 있는 것으로 밝혀졌으며(부피의 10% 미만) 실행 시작 전에 배아 스테이징의 약간의 차이가 최종 부피 측정에서 약간의 변동을 초래할 수 있다는 점을 명심해야 합니다.
모세관 내의 배아의 초기 위치 및 포매된 배아를 목표 앞에 위치시킬 때 주의를 기울여야 한다. 오리엔테이션은 배아가 성장하고 목표의 관점에서 벗어나는 것을 막는 데 중요한 역할을합니다. 배아는 10 hpf에서 둥근 모양을 가지므로 모세 혈관에서 특정 방향을 보장하기가 어렵습니다. 이상적으로, 배아의 몸체는 모세관에서 측방으로 위치할 것이다. 모세관에 여러 개의 배아를 로딩하면 잘 배치 된 배아를 가질 가능성이 높아집니다.
이 절차에서, 배아는 이미징 및 조명 목표 앞에서 그것을 중단시키기 위해 아가로스에 매립된다. 낮은 용융 온도 아가로스의 정확한 농도를 선택하는 것이 중요합니다. 농도가 너무 높으면 배아가 수축되어 제대로 발달하지 못하게됩니다. 농도가 너무 낮으면 아가로스가 떨어져 나가고 배아를 보유하지 못하게됩니다. 이 프로토콜에 최적 농도는 1% 낮은 용융 온도 아가로스30,31의 최종 농도이다.
고려해야 할 또 다른 요소는 채도 수준입니다. 눈밭이 성장하고 차별화됨에 따라 Rx3:GFP 신호의 강도가 강화됩니다. 따라서 초기 이미징 파라미터를 설정할 때 노출 및 레이저 파워를 줄여 이미지를 과포화시켜야 합니다. 이렇게 하면 시간이 지남에 따라 Rx3:GFP가 밝아짐에 따라 이미지가 과포화되는 것을 방지할 수 있습니다. 이미지 처리에서 불포화를 수정하기 위해 수정할 수 있지만 이미지를 획득한 후에는 과채도를 수정할 수 없습니다.
이 프로토콜에 대해 수행할 수 있는 몇 가지 추가 수정이 있으며, 이는 이 문서에서 설명되지 않은 일부 프로젝트에 유리할 수 있습니다. 예를 들어, 영상 획득 셋업에서 멀티뷰 이미징을 설정할 수 있다. 이 매개 변수를 사용하면 y축을 따라 서로 다른 위치에 있는 여러 배아를 각 시간 간격마다 순차적으로 이미징할 수 있습니다. 데이터 집합에 복잡성을 추가하면서 데이터 수집 속도가 증가합니다. 추가적으로, 이미지 처리의 관점에서, 다른 파라미터들에 의해 안구장을 정량화할 수 있다. 여기에서는 안구 장 부피의 관점에서 데이터를 정량화하는 방법을 설명했습니다. 또는 개별 세포를 정량화하고 추적하거나 시낭 질의 속도를 결정하기 위해 파이프 라인을 만들 수 있습니다.
앞서 언급했듯이, 공초점 및 라이트 시트 현미경 검사는 모두 제브라 피쉬의 타임랩스 이미징 연구를 수행하는 데 사용되었습니다. 라이트시트는 두꺼운 (>1 mm) 샘플을 통해 이미징하는 능력이 우수하기 때문에 제브라피쉬 배아에 이상적인 온도 환경을 유지하기 위해 인큐베이션 유닛을 갖추고 있기 때문에, 그리고 공초점 현미경보다 빠른 속도로 이미징 할 수있는 능력이 있기 때문에이 프로토콜에 필요한 수많은 시간 간격으로 이미지 획득을 가능하게하기 때문에 배아(21)의 손상이나 광표백이 수반되지 않기 때문에이 프로젝트를 위해 특별히 선택되었습니다. 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. 또한 Lightsheet 현미경은 여러 형광단의 신호를 이미지화할 수 있도록 장착되어 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 본 연구에 사용된 라이트시트 현미경은 405, 445, 488, 515, 561 및 638 nm에서 고체 레이저 여기 라인을 가지며, 이는 하나 이상의 형광 리포터 트랜스진을 발현하는 트랜스제닉 배아를 이미징하는데 유용할 수 있다.
이 프로토콜은 Lightsheet Z.1 이중 조명 현미경 시스템 및 arivis Vision4D 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집 분석에 대한 지침을 자세히 설명하지만 라이카, 올림푸스 및 룩센도가 만든 다른 상용 라이트 시트 현미경과 Imaris의 이미지 분석 소프트웨어가 있으므로 유사한 결과를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 장비 및 소프트웨어의 선택은 우리 기관의 가용성에 의해 결정되었습니다.
요약하면,이 프로토콜은 Lightsheet 현미경을 사용하여 타임랩스 이미징을 수행하고 제브라 피쉬에서 초기 눈 발달의 이미지 정량화를 위한 견고한 출발점을 제공 할 것으로 예상됩니다.
Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 간행물에보고 된 연구는 수상 번호 S10OD020067 및 NIH 상 R01EY021769 (A.C.M.)에 따라 국립 보건원 (NIH) 국장의 사무실에서 지원했습니다. 켄터키 대학의 예술 및 과학 이미징 센터에서 더그 해리슨과 짐 베글리의 도움과 전문가 제브라피쉬 치료를 위해 루카스 비에이라 프란시스코 및 에블린 M. 턴보우의 도움에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
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