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Developmental Biology

Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Published: April 5, 2021 doi: 10.3791/62296
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Kentucky

Summary

Ici, un protocole est fourni pour l’imagerie time-lapse de la morphogenèse oculaire à l’aide d’un microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce et d’un poste de travail de traitement d’images pour analyser les données résultantes. Ce protocole détaille les procédures d’anesthésie embryonnaire, l’intégration dans l’agarose à basse température de fusion, la suspension dans la chambre d’imagerie, la mise en place des paramètres d’imagerie et enfin l’analyse des données d’imagerie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Abstract

Le développement oculaire des vertébrés est un processus complexe qui commence vers la fin de la gastrulation embryonnaire et nécessite une coordination précise de la migration, de la prolifération et de la différenciation cellulaires. L’imagination en accéléré offre un aperçu unique du comportement des cellules pendant le développement de l’œil, car elle nous permet de visualiser l’oculogenèse in vivo. Les poissons-zèbres sont un excellent modèle pour visualiser ce processus en raison de leur œil de vertébré hautement conservé et de leur capacité à se développer rapidement et extérieurement tout en restant optiquement transparents. Les études d’imagerie en accéléré du développement des yeux du poisson-zèbre sont grandement facilitées par l’utilisation de la ligne transgénique de poisson-zèbre Tg(rx3:GFP). Dans le cerveau antérieur en développement, l’expression de rx3:GFP marque les cellules du champ oculaire unique, et la GFP continue d’être exprimée lorsque le champ oculaire s’évase pour former une vésicule optique, qui s’envahit ensuite pour former une coupe optique. L’imagerie accélérée haute résolution de l’expression de rx3:GFP nous permet donc de suivre le primordium oculaire à travers le temps à mesure qu’il se développe dans la rétine. La microscopie à feuille de lumière est une méthode idéale pour imager la morphogenèse oculaire au fil du temps en raison de sa capacité à pénétrer dans des échantillons plus épais pour l’imagerie fluorescente, à minimiser le photoblanchiment et la phototoxicité, et à imager à grande vitesse. Ici, un protocole est fourni pour l’imagerie time-lapse de la morphogenèse oculaire à l’aide d’un microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce et d’un poste de travail de traitement d’images pour analyser les données résultantes. Ce protocole détaille les procédures d’anesthésie embryonnaire, l’intégration dans l’agarose à basse température de fusion, la suspension dans la chambre d’imagerie, la mise en place des paramètres d’imagerie et enfin l’analyse des données d’imagerie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. L’ensemble de données qui en résulte peut fournir des informations précieuses sur le processus de morphogenèse oculaire, ainsi que sur les perturbations de ce processus résultant d’une mutation génétique, d’une exposition à des agents pharmacologiques ou d’autres manipulations expérimentales.

Introduction

Le développement embryonnaire est un processus complexe qui nécessite la coordination précise de nombreux événements différents. La formation de l’œil des vertébrés commence dans le cerveau antérieur en développement, où une partie des cellules est spécifiée comme champ oculaire. Ces cellules vont s’évasiner vers l’ectoderme de surface, donnant naissance à deux vésicules optiques bilatérales 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Le contact avec l’ectoderme de surface induit alors une invagination de la vésicule optique dans une coupe optique. L’ectoderme de surface donnera naissance aux structures antérieures de l’œil, telles que le cristallin et la cornée, tandis que la coupe optique donnera naissance à la rétine neurale et à l’épithélium pigmenté rétinien 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Les perturbations de ce processus peuvent entraîner des anomalies congénitales telles que la microphtalmie, l’anophtalmie et le colobome (MAC). À l’heure actuelle, il n’y a pas d’options pour corriger ces défauts 3,5,6,7,9,10,11,12. D’autres études sur les mécanismes de la morphogenèse oculaire et les problèmes qui peuvent conduire à la MAC fourniront une base de connaissances qui mènera potentiellement à des traitements. Un outil puissant pour étudier les comportements dynamiques des cellules pendant le développement oculaire est l’imagination time-lapse, qui permet de visualiser et de caractériser ce processus in vivo et en temps réel.

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un excellent modèle pour visualiser le développement oculaire précoce à l’aide de l’imagerie time-lapse. Ils ont un œil de vertébré hautement conservé et possèdent la capacité de se développer rapidement et extérieurement tout en restant optiquementtransparents 1. Le poisson-zèbre fournit une excellente ressource pour l’imagerie time-lapse en raison de ces caractéristiques qui manquent aux modèles de mammifères. Les études d’imagerie en accéléré du développement oculaire du poisson-zèbre sont grandement facilitées par l’utilisation de la ligne transgénique de poisson-zèbre Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) est un facteur de transcription essentiel au développement de l’œil14. Rx3 est le premier des trois gènes rx du poisson-zèbre à être exprimé, commençant son expression au milieu de la gastrulation, environ 8 h après la fécondation (hpf)15,16. Le transgène rx3:GFP peut être visualisé dans le cerveau antérieur en développement à partir du stade 1 somite (ss), environ 10 chf 15,17,18,19,20. Dans le cerveau antérieur en développement, l’expression de rx3:GFP marque les cellules du champ oculaire unique, et la GFP (protéine fluorescente verte) continue d’être exprimée par le reste de la morphogenèse oculaire. L’imagerie accélérée haute résolution de l’expression rx3:GFP nous permet donc de suivre le champ oculaire unique à travers le temps à mesure qu’il se développe dans la rétine 17,18,20.

Les études d’imagerie en accéléré du développement du poisson-zèbre ont principalement été réalisées à l’aide de la microscopie confocale ou Lightsheet. La microscopie confocale est avantageuse en ce qu’elle permet l’imagerie précise des échantillons le long de l’axe z et réduit le signal de fond fluorescent. Cependant, il est limité par le temps qu’il faut pour acquérir une image, la rigidité de la position de l’échantillon et sa propension au photoblanchiment et à la phototoxicité des échantillons vivants. La microscopie à feuille de lumière est une méthode idéale pour imager la morphogenèse oculaire au fil du temps en raison de sa capacité à pénétrer dans des échantillons plus épais pour l’imagerie fluorescente, de sa flexibilité accrue dans l’orientation des échantillons, de la minimisation du photoblanchiment et de la phototoxicité, et de l’imagerie à grande vitesse 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. La résolution spatiale réalisable avec les systèmes de microcopie à feuille de lumière actuels est d’environ 250 à 500 nanomètres (nm). Bien que cela ne soit pas significativement différent de ce qui peut être obtenu avec la microscopie confocale, l’échantillon peut être librement tourné et imagé sous plusieurs angles, améliorant à la fois la profondeur et la résolution de l’imagerie, et offrant une bien plus grande flexibilité pour les expériences d’imagerie en accéléré in vivo que la plate-forme confocale27,32 . Pour ces raisons, la microscopie Lightsheet devient rapidement la méthode privilégiée pour les études d’imagerie time-lapse du développement du poisson-zèbre. Ce protocole décrit les étapes de la quantification de l’oculogenèse par l’imagerie du poisson-zèbre transgénique Rx3:GFP à l’aide d’un microscope Lightsheet33 disponible dans le commerce et détaille un pipeline pour l’analyse d’images à l’aide de la plate-forme logicielle arivis.

Protocol

Toutes les expériences impliquant l’utilisation de poisson-zèbre ont été réalisées conformément aux protocoles établis par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky (IACUC).

1. Préparation de l’échantillon

  1. Installez une paire d’accouplement de poissons-zèbres Tg(Rx3:GFP) dans un réservoir croisé fermé la nuit avant que l’imagerie ne soit planifiée. Le lendemain matin, tirez la porte alors que les lumières s’allument dans l’installation de pêche34,35.
    REMARQUE: Le couple de poissons d’accouplement sélectionné doit être âgé de 4 mois à 2 ans et se distingue facilement comme mâle ou femelle en fonction de la forme du corps et de la coloration35.
  2. Vérifiez les croix toutes les demi-heures pour les embryons et notez à quelle heure les embryons sont visualisés pour la première fois dans le fond du réservoir transversal. Transférer les embryons dans une boîte de Pétri et maintenir les embryons à 28,5 °C pendant environ 10 h pour se développer au stade 1-2 somite (ss). Commencez à imager au stade 1-2 somite (ss).
  3. Pour dépister la présence de somites, observez les embryons sous un stéréoscope à 10 hpf et comptez le nombre de somites1.
    REMARQUE: Les embryons qui sont au-delà du stade unique de somite ne doivent pas être utilisés pour cette expérience.
  4. Parmi les embryons qui sont au stade unique de somite, dépister l’expression de GFP à l’aide d’un adaptateur de fluorescence en combinaison avec un stéréomicroscope pour confirmer la présence du transgène Rx3:GFP. Une fois que 3 à 5 personnes positives à la GFP ont été identifiées, utilisez des pinces fines pour déséchorioner les embryons et transférez-les dans une petite boîte de Pétri contenant un tampon embryonnaire E3 avec une pipetteen verre 35.
  5. Anesthésier les embryons en les transférant dans un tampon embryonnaire E3 de 0,5 mL (pH 7) contenant 0,168 mg/mL de Tricaïne (MS222) dans un tube de microcentrifugation35,36. Les mouvements musculaires spontanés commencent dès 17 hpf37. Assurez-vous que les embryons sont anesthésiés à l’image au-delà de ce point temporel.
  6. Incorporer les embryons dans 1% d’agarose à basse température de fusion dans 0,168 mg / mL de Tricaïne et E3.
    REMARQUE: Il s’agit de la concentration optimale d’agarose à basse température de fusion pour permettre à l’embryon d’être maintenu en place mais de rester suffisamment souple pour permettre la croissance de l’embryon au cours du temps d’imagerie30,31.
  7. Préparer une solution de 10 mL d’agarose à basse température de fusion à 2 % dans un tampon E3. Chauffez-le dans un four à micro-ondes pour dissoudre l’agarose à des intervalles de 15 s, pour éviter que la solution ne bouille. Laissez la solution refroidir suffisamment pour tenir sans inconfort, mais pas au point de se solidifier et de ne pas nuire aux embryons. Une fois que l’agarose est suffisamment froide, ajouter 0,5 mL aux embryons dans le tube de Tricaine dans E3 et pipeter doucement la solution et les embryons à mélanger.
  8. À l’aide d’un capillaire en verre de 1 mm et d’un piston en polytétrafluoroéthylène (PTFE), remontez les embryons de la solution d’agarose dans le capillaire. Assurez-vous de tirer un total de 3 à 5 embryons (embryons multiples) dans le capillaire pour augmenter la probabilité d’avoir un embryon bien positionné.
    REMARQUE: En raison de la nature ronde des embryons à ce moment-là, il est difficile de garantir une orientation spécifique dans le capillaire. Idéalement, le corps de l’embryon sera positionné latéralement dans le capillaire, ce qui permettra une plus grande facilité de positionnement dans le microscope.
  9. Laissez l’agarose se solidifier sur une période de 30 à 60 s à température ambiante. Placer le capillaire dans un bécher de 0,168 mg/mL de Tricaine dans un tampon E3 jusqu’à ce qu’il soit prêt à être photographié (Figure 1A).
    REMARQUE: L’excès de solution d’agarose à basse température de fusion de 2% peut être autorisé à se solidifier et ensuite réchauffé dans de futures expériences.
  10. Placer le capillaire dans le porte-échantillon (figure 1B-F) comme décrit à l’étape 2.5.

2. Configuration de Zeiss Lightsheet Z.1

  1. Allumez chaque composant du microscope et de l’ordinateur dans l’ordre suivant : 1) Système, 2) PC, puis 3) Incubation (Figure 2A).
  2. Placez l’objectif d’imagerie 20x et l’objectif d’éclairage 10x dans la chambre du microscope. Faites correspondre les paramètres d’objectif dans l’interface zen Software sous l’onglet Maintenir .
  3. Faites glisser la chambre (Figure 2C) dans le boîtier sur la voie (Figure 2B) avec le tube tourné vers l’extérieur. Le tube se connecte aux orifices appropriés sur la droite, comme illustré à la figure 2E.
  4. Fixez la ligne d’extension à la seringue à l’aide du mécanisme de verrouillage (Figure 2D); remplissez-le de Tricaine en E3 et placez-le dans le support fixé à droite du microscope35. Connectez l’extension fixée à la seringue remplie de Tricaine en E3 en bas à droite de la chambre avec le mécanisme luer-lock. Poussez le piston pour remplir la chambre avec le tampon Tricaine/E3. Fermez la porte de la chambre.
  5. Placez le capillaire avec l’échantillon dans le porte-échantillon capillaire. Le porte-échantillon capillaire comprend deux manchons en caoutchouc, un disque porte-échantillon en métal, une tige en métal et un capuchon en métal (figure 1B). Cliquez sur la gaine métallique au centre du disque métallique (Figure 1C). Placez les deux bouchons en caoutchouc dans la gaine, les fentes faisant face aux extrémités de la gaine suivies du capillaire. Faites glisser le capillaire au milieu des bouchons en caoutchouc. Fixez-le en place avec le capuchon métallique une fois que le marqueur est à la base de la gaine métallique (Figure 1D).
  6. Placez le porte-échantillon capillaire sur le dessus du microscope, avec les marques blanches alignées (Figure 1E,F). Fermez le couvercle.
  7. Cliquez sur le bouton Localiser capillaire sur l’interface du logiciel (Figure 3A). Utilisez le panneau de commande ErgoDrive, un dispositif manuel qui contrôle l’orientation capillaire (Figure 3E), pour déplacer le capillaire et le positionner juste au-dessus de l’objectif (Figure 3B).
  8. Ouvrez le couvercle et appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que la section d’agarose contenant l’embryon soit suspendue sous le fond capillaire et se trouve devant l’objectif (Figure 3C).
  9. Désactivez Localiser les capillaires et cliquez sur le bouton Localiser l’échantillon (Figure 3A). Cela permet de basculer la vue de la webcam de la chambre d’échantillonnage vers l’objectif du microscope (Figure 3D). Utilisez cette vue pour ajuster plus précisément la position de l’échantillon. Désactivez Localiser l’échantillon (Figure 3A).
  10. Basculez vers l’onglet Acquisition . Cochez les cases Z-Stack et Time Series.
  11. Dans la fenêtre Paramètres du mode d’acquisition , choisissez le paramètre Dual Side Lightsheet et cochez les cases Fusion double face en ligne et Balayage pivotant.
  12. Dans la fenêtre Canaux , choisissez 488 canaux, réglez la puissance laser sur 1 et le temps d’exposition sur 7,5 ms.
  13. Ensuite, cliquez sur le bouton Continu pour obtenir une vue en direct de l’embryon. Utilisez le panneau de commande ErgoDrive pour régler la position de l’embryon jusqu’à ce que le champ oculaire soit directement face à la caméra. Continuez à régler les feuilles lumineuses gauche et droite dans les paramètres Canaux jusqu’à ce que le champ oculaire soit suffisamment mis au point.
  14. Définissez les paramètres Z-Stack à l’aide du panneau de commande ErgoDrive pour vous déplacer dans le plan Z. Réglez la première et la dernière position Z autour de 500 μm au-delà du dernier signal fluorescent détectable. Cela laisse de la place pour que le champ oculaire reste dans le cadre au fur et à mesure que l’embryon se développe tout au long de la séance d’imagerie en accéléré. Après avoir défini la plage du Z-Stack, cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille du pas à 0,477 μm, le réglage optimal.
  15. Réglez les paramètres d’incubation en cochant la case de l’unité Peltier pour maintenir la température à 28 °C. Dans la fenêtre Série chronologique , choisissez la fréquence et l’intervalle de temps pour acquérir des images. Dans ce protocole, les paramètres ont été réglés sur l’image toutes les 5 minutes, pour un total de 166 intervalles.
  16. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience . Choisissez le dossier dans lequel enregistrer l’ensemble d’images. Définissez le préfixe de l’image et appuyez sur Enregistrer pour démarrer l’imagerie.
    REMARQUE: Le microscope va maintenant parcourir chaque ensemble d’images à l’intervalle spécifié.
  17. Une fois la séance d’imagerie time-lapse terminée, envoyez la scène à la position de charge et retirez le porte-échantillon capillaire. Démontez le porte-échantillon capillaire dans l’ordre inverse dans lequel il a été assemblé et utilisez le piston pour retirer l’échantillon et l’excès d’agarose du capillaire. Ouvrez la porte de la chambre. Utilisez la seringue pour retirer le liquide de la chambre, débranchez et retirez la chambre, puis rincez à l’eau et séchez à l’air.

3. Analyse d’images

  1. Ouvrez le logiciel arivis Vision4D.
  2. Cliquez sur Fichier, puis choisissez Importer un fichier. Sélectionnez tous les fichiers .czi de la session d’imagerie time-lapse et ouvrez-les. La fenêtre suivante s’ouvre avec les options sur la façon d’importer les fichiers; sélectionnez Z-stacks comme Frames pour ordonner les z-stacks dans l’ordre obtenu. Une fois les fichiers importés, le logiciel enregistre en un seul fichier .sis. Pour spécifier l’emplacement du fichier à enregistrer, sélectionnez le dossier avant de cliquer sur Importer.
  3. Une fois le fichier importé, arivis est maintenant prêt à restituer une vidéo des images time-lapse. Cliquez sur le cube de la visionneuse 4D dans le coin inférieur gauche et sur l’icône de la barre d’échelle (Figure 4D-E). Cliquez sur l’icône vidéo pour placer la barre des tâches Storyboard en bas de l’écran (Figure 4C).
  4. Dans la barre des tâches Storyboard , choisissez Ajouter une séquence d’images clés (Figure 4F). Spécifiez la durée de la vidéo en secondes, décochez la case Créer une rotation et cochez la case Utiliser la progression temporelle pour inclure les points temporels spécifiques dans la vidéo. Le logiciel affiche ces paramètres à droite de la barre des tâches Storyboard pour tout ajustement à tout moment. Enregistrez le storyboard pour appliquer les mêmes paramètres à plusieurs jeux d’images (Figure 4F).
  5. Cliquez sur Exporter le film pour enregistrer une vidéo de l’imagerie time-lapse (Figure 4F). Spécifiez les paramètres d’exportation du film, notamment le nom et l’emplacement du fichier, le format vidéo (.mp4), la résolution vidéo (1 080 p), la fréquence d’images (60 IPS) et la résolution des données (1 297 x 1 297 x 784). Ajoutez des horodatages ici, si vous le souhaitez. Une fois ces paramètres définis, choisissez Enregistrer (Figure 4F).
  6. Les étapes 3.4 et 3.5 peuvent être répétées avec la modification de l’étape 3.4 pour créer des vidéos de rotation à des moments spécifiques. Lorsque vous ajoutez une séquence d’images clés au storyboard, cochez la case Créer une rotation , puis décochez utiliser la progression temporelle. Ensuite, suivez les mêmes instructions qu’à l’étape 3.5.
  7. Pour restituer une image haute résolution à n’importe quelle orientation et à n’importe quel point temporel, sélectionnez l’icône Caméra dans la visionneuse 4D pour obtenir une image haute résolution (Figure 4C).
  8. Pour créer un pipeline à des fins d’analyse, choisissez l’icône Flacon pour accéder au panneau Analyse (Figure 4B). Dans le panneau Analyse , cliquez sur le menu déroulant Opérations d’analyse . À titre d’exemple, le protocole illustre ci-dessous la séquence d’opérations pour un pipeline d’analyse de volume. Exécutez ou annulez chaque étape du pipeline individuellement pour affiner chaque paramètre (Tableau 1).
  9. Cliquez sur le triangle bleu en haut du pipeline pour permettre au pipeline de s’exécuter.
    REMARQUE: Cela prendra un certain temps en fonction de la vitesse de l’ordinateur. Une fois le pipeline optimisé, il peut être facilement exporté et importé dans arivis et appliqué à plusieurs jeux de données dans une analyse par lots.
  10. Pour accéder à l’analyse par lots, cliquez sur Analyse par lots sous l’onglet Analyse .
  11. Une fois le pipeline exécuté, une fenêtre s’affiche avec tous les objets trouvés. Accédez-y manuellement via l’icône Tableau (Figure 4B). En haut de cette fenêtre, cliquez sur la case intitulée Colonnes de fonctionnalités pour afficher une liste de fonctionnalités pouvant fournir des informations sur l’objet d’intérêt. Pour l’analyse du volume du champ oculaire, ces caractéristiques incluent la surface, le volume (Volume, VoxelCount), les intensités #1 (moyenne), les attributs (Id, Type) et le point temporel (First). Cliquez sur Exporter pour exporter les données vers une feuille de calcul.

Representative Results

Le jeu de données affiché ici a été imagé à l’aide du protocole décrit ci-dessus. Un embryon Tg(Rx3:GFP) a été imagé à partir du stade 1 somite (ss) à 24 hpf, soit une période totale de 14 h, avec les images acquises à des intervalles de 5 minutes. L’imagerie time-lapse permet de sélectionner et de comparer facilement n’importe quel point temporel qui montre un phénotype d’intérêt. La figure 5 illustre un ensemble d’images haute résolution qui ont été rendues du point de vue dorsal à certains points temporels de développement. Le pipeline exécuté dans arivis Vision4D construit un masque qui représente l’œil en développement tel qu’identifié par un signal fluorescent. Dans la figure 5 et les vidéos 1 à 6, le masque peut être visualisé par rapport au rendu fluorescent de l’œil en développement. En outre, le tableau 2 affiche les données de volume de l’œil en développement à chaque point d’imagerie. Cet ensemble de données comprend le nom du segment, l’id, le volume en μm3 et le nombre de voxels, l’intensité moyenne de fluorescence de l’objet, le point temporel où l’objet a été identifié et la surface de l’objet en μm2. Il est important de noter que lorsque le champ oculaire se sépare en deux vésicules optiques (à partir du point temporel 64), il reste une troisième région qui est Rx3:GFP positive dans le cerveau antérieur, ce qui contribuera à l’hypothalamus38,39,40 (Figure 5D-M). Cela apparaît dans les données de volume représentées dans le tableau 2 (surligné en jaune à partir du point de temps 71) et peut facilement être séparé des vésicules optiques, car il est beaucoup plus petit en volume que l’une ou l’autre vésicule optique.

Figure 1
Figure 1: Préparation de l’échantillon. (A) Positionnement des embryons dans un capillaire en verre. La flèche pointe vers un embryon dans le capillaire. (B) Parties capillaires et porte-capillaires en verre. C) Porte-capillaire partiellement assemblé. (D) Porte-capillaire entièrement assemblé. (E) Chambre de montage Lightsheet. La flèche indiquait la ligne blanche utilisée pour orienter le porte-capillaire. (F) Support capillaire correctement monté dans le Lightsheet. La flèche montre les lignes blanches correspondantes, indiquant la bonne orientation du porte-capillaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Configuration de l’imagerie Lightsheet. (A) Standard pour allumer la Lightsheet, l’ordinateur et l’unité d’incubation. Les chiffres indiquent l’ordre des opérations. (B) Chambre d’objectif Lightsheet. (C) Chambre d’imagerie. (D) Seringue et tuyau qui seront raccordés à la chambre d’imagerie. (E) La chambre d’imagerie correctement positionnée à l’intérieur de la chambre d’objectif avec tous les tubes connectés aux orifices appropriés à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Positionnement de l’échantillon. (A) Localisez les boutons Capillaire et Localiser l’échantillon dans zen Software comme indiqué par les flèches. (B) Le positionnement sur le capillaire en verre. La flèche indique le bord du capillaire en verre positionné juste au-dessus de la lentille de l’objectif. (C) La suspension embryonnaire au-delà du capillaire en verre. La flèche indiquait l’embryon suspendu dans l’agarose sous le capillaire de verre devant la lentille de l’objectif. (D) Vue de l’embryon à travers l’objectif. (E) Le panneau de commande ErgoDrive. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Icônes importantes pour naviguer dans arivis Vison4D. Chaque panneau a la fonction d’icône identifiée de gauche à droite. (A) Ouvrir, Enregistrer, Fermer. (B) Panneau d’analyse, Afficher la table des objets, Ouvrir l’éditeur de piste. (C) Copiez le contenu actuel de la visionneuse sous forme d’image dans le presse-papiers, basculez les signets, créez une image haute résolution pour la vue actuelle, basculez le storyboard. (D) Afficher la boîte de mesure, Afficher la croix d’orientation, Afficher la légende, Afficher la barre d’échelle. (E) Afficher en tant que visionneuse 2D, Afficher en tant que visionneuse de galerie, Afficher en tant que visionneuse 4D, Afficher en tant que visionneuse d’informations, Afficher en tant que visionneuse de projection. F) Actualiser toutes les images clés, Ajouter une image clé, Ajouter une séquence d’images clés, Insérer une image clé, Supprimer toutes les images clés, Exporter le film, Charger le storyboard, Enregistrer le storyboard, Ajuster la durée cible de l’ensemble du film, Première image clé, Lecture, Pause, Arrêt, Dernière image clé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Images haute résolution et masques de champ oculaire. (A-M) Ensemble d’images haute résolution rendues à partir des points de vue dorsaux; (A'-M') les masques de champ oculaire pour chaque point temporel correspondant. Chaque ensemble d’images est noté par le moment où il a été acquis à partir du début de l’imagerie et le stade de développement correspondant au stade de la somite (ss) ou des heures après la fécondation (hpf). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Vidéo time-lapse de l’embryon de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) de 1 ss-24 hpf. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous).

Vidéo 2: Vidéo en accéléré de l’embryon de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) de 1 ss-24 hpf avec le champ oculaire identifié par le pipeline arivis Vision4D. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous). 

Vidéo 3 : Rotation à 360° d’un embryon de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) à 1 ss. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous). 

Vidéo 4: Rotation à 360° d’un masque oculaire embryonnaire de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) à 1 ss. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous). 

Vidéo 5 : Rotation à 360° d’un embryon de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) à 24 hpf. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous). 

Vidéo 6: Rotation à 360° d’un masque oculaire embryonnaire de poisson zèbre Tg(rx3:GFP) à 24 hpf. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo (enregistrer le lien sous). 

Tableau 1 : pipeline arivis Vision4D pour l’analyse volumique du champ oculaire en développement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Volume et surface du champ oculaire en développement acquis par arivis Vision4D. Les rangées relatives à l’hypothalamus présumé sont surlignées en jaune pour les distinguer des vésicules optiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Dans ce protocole, le microscope Lightsheet a été utilisé pour effectuer une imagerie en accéléré du développement oculaire et les données résultantes ont été analysées. L’ensemble de données qui en résulte peut fournir des informations précieuses sur le processus de morphogenèse oculaire, ainsi que sur les perturbations de ce processus résultant d’une mutation génétique, d’une exposition à des agents pharmacologiques ou d’autres paramètres expérimentaux. Ici, le protocole a démontré comment cet ensemble de données peut être obtenu et a fourni un exemple de la façon d’analyser le volume du champ oculaire au début du développement. Ces données se sont avérées reproductibles et cohérentes (variation de volume inférieure à 10 %) entre les réplicats biologiques, en gardant à l’esprit que de légères différences dans la stadification embryonnaire avant le début de l’exécution peuvent entraîner une certaine variation dans les mesures de volume finales.

Des précautions doivent être prises dans le positionnement initial de l’embryon dans le capillaire et dans le positionnement de l’embryon intégré devant l’objectif. L’orientation joue un rôle important pour empêcher l’embryon de croître et de sortir de la vue de l’objectif. Les embryons ont une forme ronde à 10 hpf, ce qui rend difficile la garantie d’une orientation spécifique dans le capillaire. Idéalement, le corps de l’embryon sera positionné latéralement dans le capillaire. Le chargement de plusieurs embryons dans le capillaire augmentera la probabilité d’avoir un embryon bien positionné.

Dans cette procédure, l’embryon est incorporé dans l’agarose afin de le suspendre devant les objectifs d’imagerie et d’éclairage. Il est essentiel de choisir la concentration correcte de l’agarose à basse température de fusion. Une concentration trop élevée resserrera l’embryon et l’empêchera de se développer correctement; une concentration trop faible entraînera l’effondrement de l’agarose et la non-rétention de l’embryon. La concentration optimale pour ce protocole est une concentration finale de 1% d’agarose à basse température de fusion30,31.

Un autre élément à prendre en considération est le niveau de saturation. Au fur et à mesure que le champ oculaire grandit et se différencie, la force du signal Rx3:GFP s’intensifie. Par conséquent, lors du réglage des paramètres d’imagerie initiaux, l’exposition et la puissance du laser doivent être réduites pour sous-saturer l’image. Cela empêchera l’image de devenir sursaturée à mesure que le Rx3:GFP devient plus lumineux au fil du temps. Des modifications peuvent être apportées pour corriger la sous-saturation dans le traitement de l’image, mais la sursaturation ne peut pas être corrigée après l’acquisition des images.

Quelques modifications supplémentaires peuvent être apportées à ce protocole qui peuvent être avantageuses pour certains projets qui ne sont pas décrits dans le présent document. Par exemple, il est possible de configurer l’imagerie Multiview dans la configuration d’acquisition d’image. Ce paramètre permettrait d’imager séquentiellement plusieurs embryons à différentes positions le long de l’axe des y à chaque intervalle de temps. Tout en ajoutant de la complexité à l’ensemble de données, cela augmenterait le taux de collecte de données. De plus, en termes de traitement d’image, il est possible de quantifier le champ oculaire par d’autres paramètres. Ici, nous avons décrit comment quantifier les données en termes de volume du champ oculaire. Alternativement, un pipeline pourrait être fait pour quantifier et suivre les cellules individuelles ou déterminer le taux d’évagation des vésicules optiques.

Comme mentionné précédemment, la microscopie confocale et la microscopie Lightsheet ont été utilisées pour effectuer des études d’imagerie accélérée du poisson-zèbre. Lightsheet a été spécifiquement choisi pour ce projet en raison de sa capacité supérieure à imager à travers un échantillon épais (>1 mm), parce qu’il est équipé d’une unité d’incubation pour maintenir un environnement de température idéal pour l’embryon de poisson zèbre, et parce que sa capacité à imager à un rythme plus rapide que la microscopie confocale permet l’acquisition d’images aux nombreux intervalles de temps requis pour ce protocole sans dommage d’accompagnement ou photoblanchiment de l’embryon21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Il est également important de noter que le microscope Lightsheet est équipé pour imager le signal de plusieurs fluorophores. Le microscope Lightsheet utilisé dans cette étude a des raies d’excitation laser à l’état solide à 405, 445, 488, 515, 561 et 638 nm, ce qui pourrait être utile pour l’imagerie d’embryons transgéniques exprimant plus d’un transgène rapporteur fluorescent.

Bien que ce protocole détaille les instructions pour l’analyse d’acquisition d’images en utilisant spécifiquement le système de microscope à double éclairage Lightsheet Z.1 et le logiciel d’analyse arivis Vision4D, il existe d’autres microscopes Lightsheet disponibles dans le commerce fabriqués par Leica, Olympus et Luxendo, ainsi que le logiciel d’analyse d’images par Imaris, qui pourraient être utilisés pour obtenir des résultats similaires. Le choix de l’équipement et des logiciels pour ce protocole a été déterminé par la disponibilité dans notre établissement.

En résumé, on s’attend à ce que ce protocole fournisse un point de départ solide pour la réalisation d’une imagerie accélérée à l’aide de la microscopie Lightsheet et pour la quantification d’images du développement oculaire précoce chez le poisson-zèbre.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le Bureau du Directeur des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de bourse S10OD020067 et par le prix R01EY021769 des NIH (à A.C.M.). Nous sommes reconnaissants de l’aide de Doug Harrison et Jim Begley au Arts & Sciences Imaging Center de l’Université du Kentucky, ainsi que de Lucas Vieira Francisco et Evelyn M. Turnbaugh pour les soins experts du poisson zèbre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

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References

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Biologie du développement numéro 170 imagerie en accéléré microscopie Lightsheet imagerie en direct poisson-zèbre développement des yeux rétine
Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish
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Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).

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