Summary
Her er det gitt en protokoll for tidsforløpavbildning av okulær morfogenese ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig lysarkmikroskop og en bildebehandlingsarbeidsstasjon for å analysere de resulterende dataene. Denne protokollen beskriver prosedyrene for embryobedøvelse, innebygging i lav smeltetemperatur, suspensjon i bildekammeret, oppsett av bildeparametere og til slutt analyse av bildedata ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
Abstract
Virveldyr øyeutvikling er en kompleks prosess som begynner nær slutten av embryo gastrulation og krever presis koordinering av cellemigrasjon, spredning og differensiering. Tidsforløp imagining gir unik innsikt i oppførselen til celler under øyeutvikling fordi det lar oss visualisere oculogenese in vivo. Sebrafisk er en utmerket modell for å visualisere denne prosessen på grunn av deres høyt bevarte virveldyrøye og deres evne til å utvikle seg raskt og eksternt mens de forblir optisk gjennomsiktige. Tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafisk øyeutvikling er sterkt tilrettelagt ved bruk av den transgene sebrafisklinjen Tg (rx3:GFP). I utviklingen av forebrain markerer rx3:GFP-uttrykket cellene i det ene øyefeltet, og GFP fortsetter å bli uttrykt når øyefeltet evaginerer for å danne en optisk vesicle, som deretter invaginerer for å danne en optisk kopp. Høyoppløselig tidsforløp bildebehandling av rx3: GFP uttrykk, derfor tillater oss å spore øyet primordium gjennom tiden som det utvikler seg til netthinnen. Lightsheet-mikroskopi er en ideell metode for å avbilde okulær morfogenese over tid på grunn av sin evne til å trenge inn i tykkere prøver for fluorescerende avbildning, minimere fotobleaching og fototoksisitet og bilde med høy hastighet. Her er det gitt en protokoll for tidsforløpavbildning av okulær morfogenese ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig lysarkmikroskop og en bildebehandlingsarbeidsstasjon for å analysere de resulterende dataene. Denne protokollen beskriver prosedyrene for embryobedøvelse, innebygging i lav smeltetemperatur, suspensjon i bildekammeret, oppsett av bildeparametere og til slutt analyse av bildedata ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Det resulterende datasettet kan gi verdifull innsikt i prosessen med okulær morfogenese, samt perturbasjoner til denne prosessen som følge av genetisk mutasjon, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle manipulasjoner.
Introduction
Embryonisk utvikling er en kompleks prosess som krever presis koordinering av mange forskjellige hendelser. Dannelsen av virveldyrøyet begynner i utviklingen av forebrain, hvor en del av cellene er spesifisert som øyefeltet. Disse cellene vil unngå mot overflaten ektoderm, noe som gir opphav til to bilaterale optiske vesikler 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt med overflaten ectoderm induserer deretter en invaginering av den optiske vesicle i en optisk kopp. Overflaten ektoderm vil gi opphav til fremre strukturer i øyet, som linsen og hornhinnen, mens den optiske koppen vil gi opphav til nevral netthinne og netthinnen pigmentert epitel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Forstyrrelser i denne prosessen kan føre til medfødte feil som mikroftalami, anophthalmia og coloboma (MAC). På dette tidspunktet er det ingen alternativer for å rette opp disse feilene 3,5,6,7,9,10,11,12. Videre studier av mekanismene for okulær morfogenese og problemene som kan føre til MAC vil gi et grunnlag av kunnskap som potensielt vil føre til behandlinger. Et kraftig verktøy for å undersøke cellenes dynamiske oppførsel under øyeutvikling er tidsforløp imagining, noe som gjør at denne prosessen kan visualiseres og karakteriseres i vivo og i sanntid.
Sebrafisk (Danio rerio) er en utmerket modell for å visualisere tidlig okulær utvikling ved hjelp av tidsforløpavbildning. De har et svært konservert virveldyrøye og har evnen til å utvikle seg raskt og eksternt mens de forblir optisk gjennomsiktig1. Sebrafisk gir en flott ressurs for tidsforløpavbildning på grunn av disse egenskapene som pattedyrmodeller mangler. Tidsforløpavbildningsstudier av sebrafisk øyeutvikling er sterkt tilrettelagt ved bruk av den transgene sebrafisklinjen Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) er en transkripsjonsfaktor som er avgjørende for øyeutvikling14. Rx3 er den første av de tre rx genene i sebrafisken som skal uttrykkes, og starter sitt uttrykk midt i gastrulation, ca 8 h post befruktning (hpf)15,16. Rx3:GFP-transgene kan visualiseres i den utviklende forebrain fra og med 1 somite stadium (ss), ca 10 hpf 15,17,18,19,20. I utviklingen av forebrain markerer rx3:GFP-uttrykket cellene i det ene øyefeltet, og GFP (grønt fluorescerende protein) fortsetter å uttrykkes gjennom resten av okulær morfogenese. Høyoppløselig tidsforløp bildebehandling av rx3: GFP uttrykk, derfor tillater oss å spore enkelt øye feltet gjennom tiden som det utvikler seg til netthinnen 17,18,20.
Tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafiskutvikling har primært blitt utført ved hjelp av konfekt- eller Lightsheet-mikroskopi. Konfektmikroskopi er fordelaktig ved at den muliggjør presis avbildning av prøver langs z-aksen og reduserer fluorescerende bakgrunnssignal. Det er imidlertid begrenset av hvor lang tid det tar å skaffe seg et bilde, prøveposisjonsstivhet og dets tilbøyelighet til fotobleaching og fototoksisitet av levende prøver. Lightsheet-mikroskopi er en ideell metode for å avbilde okulær morfogenese over tid på grunn av dens evne til å trenge inn i tykkere prøver for fluorescerende avbildning, økt fleksibilitet i prøveretningen, minimert fotobleaching og fototoksisitet, og bildebehandling med høy hastighet 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Den romlige oppløsningen som kan oppnås med dagens lysarkmikrokopisystemer er ca. 250-500 nanometer (nm). Selv om dette ikke er vesentlig forskjellig fra det som kan oppnås med konfektmikroskopi, kan prøven fritt roteres og avbildes fra flere vinkler, forbedre både bildedybde og oppløsning, og gi mye større fleksibilitet for in vivo tidsforløp bildebehandling eksperimenter enn den konfiskere plattformen27,32 . Av disse grunnene blir Lightsheet-mikroskopi raskt den foretrukne metoden for tidsforløpavbildningsstudier av sebrafiskutvikling. Denne protokollen beskriver trinnene for kvantifisering av oculogenese gjennom avbildning av Rx3:GFP transgen sebrafisk ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig Lightsheet-mikroskop33 og beskriver en rørledning for bildeanalyse ved hjelp av arivis-programvareplattformen.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer bruk av sebrafisk ble utført i samsvar med protokoller etablert av University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Prøvepreparering
- Sett opp et par Tg(Rx3:GFP) sebrafisk i en inngjerdet krysstank kvelden før bildebehandling er planlagt. Neste morgen trekker du porten når lysene tennes i fiskeanlegget34,35.
MERK: Parringsparet med fisk som velges, skal være mellom 4 måneder og 2 år og kan lett skilles ut som mann eller kvinne basert på kroppsform og fargelegging35. - Kontroller kryssene hver halvtime for embryoer og legg merke til når embryoer først visualiseres i bunnen av krysstanken. Overfør embryoene til en Petri-tallerken og vedlikehold embryoene ved 28,5 °C i ca. 10 timer for å utvikle seg til 1-2 somittstadiet (ss). Begynn å bilde på 1-2 somite scenen (ss).
- For å screene for tilstedeværelse av somitter, observere embryoene under et stereoskop ved 10 hkf og telle antall somitter1.
MERK: Alle embryoer som er utenfor det ene somite stadiet, bør ikke brukes til dette eksperimentet. - Ut av embryoene som er på det ene somite stadiet, skjerm for GFP-uttrykk ved hjelp av en fluorescensadapter i kombinasjon med et stereomikroskop for å bekrefte tilstedeværelsen av Rx3: GFP-transgene. Når 3-5 GFP positive individer er identifisert, bruk fine tang for å dechorionate embryoene og overføre dem til en liten Petri-tallerken som inneholder E3 embryobuffer med en glasspipette35.
- Bedøv embryoene ved å overføre dem til 0,5 ml E3 embryobuffer (pH 7) som inneholder 0,168 mg/ml trikain (MS222) i et mikrocentrifugerør35,36. Spontane muskelbevegelser begynner så tidlig som 17 hkf37. Sørg for at embryoer bedøves til bilde utover dette tidspunktet.
- Bygg inn embryoene i 1% lav smeltetemperatur agarose i 0,168 mg / ml trikain og E3.
MERK: Dette er den optimale konsentrasjonen av lav smeltetemperatur som er agarose for å tillate at embryoet holdes på plass, men forblir bøyelig nok til å tillate veksten av embryoet over bildetiden 30,31. - Forbered en 10 ml løsning med 2% lav smeltetemperatur agarose i E3 buffer. Varm den opp i en mikrobølgeovn for å oppløse agarose med 15 s intervaller, for å forhindre at løsningen koker over. La løsningen avkjøles nok til å holde uten ubehag, men ikke så mye at den størkner, og ikke forårsake skade på embryoene. Når agarose er tilstrekkelig kjølig, tilsett 0,5 ml til embryoene i trikainrøret i E3 og rør forsiktig løsningen og embryoene som skal blandes.
- Bruk et 1 mm glasskapillært og polytetrafluoretylenstempeble (PTFE) til å trekke opp embryoene i agaroseoppløsningen inn i kapillæren. Sørg for å trekke totalt 3-5 embryoer (flere embryoer) inn i kapillæren for å øke sannsynligheten for å ha et godt posisjonert embryo.
MERK: På grunn av embryoenes runde natur på dette tidspunktet, er det utfordrende å garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt sett vil embryoets kropp plasseres lateralt i kapillæren, noe som gir størst enkel posisjonering i mikroskopet. - La agarose størkne over en periode på 30-60 s ved romtemperatur. Plasser kapillæren i et beger på 0,168 mg/ml trikain i E3-buffer til den er klar til bilde (figur 1A).
MERK: Den overskytende 2% lav smeltetemperatur agarose løsningen kan få lov til å størkne og deretter oppvarmes i fremtidige eksperimenter. - Plasser kapillæren i prøveholderen (figur 1B-F) som beskrevet i trinn 2.5.
2. Zeiss Lightsheet Z.1-oppsett
- Slå på hver komponent i mikroskopet og datamaskinen i følgende rekkefølge: 1) System, 2) PC, deretter 3) Inkubasjon (figur 2A).
- Plasser 20x bildebehandlingsmålet og 10x belysningsmålet i mikroskopkammeret. Match målinnstillingene i Zen Software-grensesnittet under Vedlikehold-fanen .
- Skyv kammeret (figur 2C) inn i huset på sporet (figur 2B) med slangen vendt ut. Slangen kobles til de aktuelle portene til høyre som vist i figur 2E.
- Fest forlengelsesledningen til sprøyten med luerlåsmekanismen (figur 2D); fyll den med Tricaine i E3 og legg den i holderen festet til høyre for mikroskopet35. Koble forlengelsen som er festet til sprøyten fylt med Tricaine i E3 nederst til høyre i kammeret med luerlåsmekanismen. Skyv stempelet for å fylle kammeret med Tricaine/E3-bufferen. Lukk døren til kammeret.
- Plasser kapillæren med prøven i kapillærprøveholderen. Kapillærprøveholderen består av to gummihylser, en metallprøveholderskive, en metallstamme og en metallhette (figur 1B). Klikk metallhylsen inn i midten av metallskiven (figur 1C). Plasser de to gummiproppene i hylsen, med spaltene vendt mot endene av hylsen etterfulgt av kapillæren. Skyv kapillæren gjennom midten av gummiproppene. Fest den med metallhetten når markøren er på bunnen av metallhylsen (figur 1D).
- Plasser kapillærprøveholderen på toppen av mikroskopet, med de hvite merkene på linje (figur 1E,F). Lukk lokket.
- Klikk på Finn kapillær-knappen på programvaregrensesnittet (figur 3A). Bruk ErgoDrive-kontrollpanelet, en manuell enhet som styrer kapillærretningen (figur 3E), til å flytte kapillæren og plassere den like over målet (figur 3B).
- Åpne lokket, og skyv stempelet forsiktig til den delen av agarose som inneholder embryoet henger under kapillærbunnen og er foran målet (figur 3C).
- Slå av Finn kapillær og klikk på Finn eksempel-knappen (figur 3A). Dette bytter visning fra prøvekammerets webkamera til mikroskopmålet (figur 3D). Bruk denne visningen til å justere plasseringen av prøven mer nøyaktig. Slå av Finn prøve (figur 3A).
- Bytt til kategorien Anskaffelse . Merk av for Z-Stack og Time Series.
- I vinduet Parametere for anskaffelsesmodus velger du innstillingen for To sidelysark og merker av for Online Dual Side Fusion og Pivot Scanning.
- I Kanaler-vinduet velger du 488 kanal, setter laserstrømmen til 1 og eksponeringstiden til 7,5 ms.
- Deretter klikker du på Kontinuerlig-knappen for å få live utsikt over embryoet. Bruk ErgoDrive-kontrollpanelet til å justere embryoets posisjon til øyefeltet vender direkte mot kameraet. Fortsett å justere venstre og høyre lysark i kanalparameterne til øyefeltet er tilstrekkelig i fokus.
- Angi Z-Stack-parameterne ved hjelp av ErgoDrive-kontrollpanelet for å gå gjennom Z-planet. Still inn den første og siste Z-posisjonen rundt 500 μm utover det siste påvisbare fluorescerende signalet. Dette gir rom for øyefeltet til å forbli i rammen når embryoet vokser gjennom hele tidsforløpets bildeøkt. Etter å ha angitt rekkevidden til Z-Stack, klikker du på Optimal-knappen for å sette trinnstørrelsen til 0,477 μm, den optimale innstillingen.
- Still inn inkubasjonsparametrene ved å merke av i boksen for Peltier-enheten for å holde temperaturen ved 28 °C. I Tidsserie-vinduet velger du frekvensen og tidsintervallet for å hente bilder. I denne protokollen ble parametrene satt til bilde hvert 5.
- Klikk på Start eksperiment-knappen . Velg mappen for å lagre bildesettet. Angi bildeprefikset, og trykk Lagre for å starte avbildningen.
MERK: Mikroskopet vil nå gå gjennom hvert bilde som er angitt med det angitte intervallet. - Når tidsforløpavbildningsøkten er fullført, sender du fasen til lasteposisjonen og fjerner kapillærprøveholderen. Ta fra hverandre kapillærprøveholderen i omvendt rekkefølge at den ble satt sammen og bruk stempelet til å fjerne prøven og overflødig agarose fra kapillæren. Åpne kammerdøren. Bruk sprøyten til å fjerne kammervæsken fra kammeret, koble fra og fjern kammeret, skyll deretter med vann og lufttørk.
3. Bildeanalyse
- Åpne arivis Vision4D-programmet.
- Klikk på Fil, og velg deretter Importer fil. Velg alle CZI-filer fra tidsforløp-bildebehandlingsøkten, og åpne. Det neste vinduet åpnes med alternativene for hvordan du importerer filene; Velg Z-stabler som rammer for å ordne z-stakkene i den rekkefølgen som er oppnådd. Når filene er importert, lagrer programvaren som en enkelt SIS-fil. Hvis du vil angi plasseringen for filen som skal lagres, velger du mappen før du klikker Importer.
- Når filen er importert, er arivis nå klar til å gjengi en video av tidsforløpbildene. Klikk på 4D-visningskuben nederst til venstre og skalalinjeikonet (figur 4D-E). Klikk på videoikonet for å bringe Storyboard-oppgavelinjen til bunnen av skjermen (figur 4C).
- Velg Legg til nøkkelbildesekvens (figur 4F) på oppgavelinjen i dreieboken. Angi varigheten til videoen i sekunder, fjern merket for Opprett rotasjon, og merk av for Bruk tidsprogresjon til å inkludere de bestemte tidspunktene i videoen. Programvaren viser disse parametrene til høyre for Storyboard oppgavelinjen for eventuelle justeringer når som helst. Lagre dreieboken for å bruke de samme parameterne på flere bildesett (figur 4F).
- Klikk eksporter film for å lagre en video av bildet av tidsforløpet (figur 4F). Angi innstillingene for filmeksport, inkludert filnavn og -plassering, videoformat (.mp4), videooppløsning (1 080 s), bildefrekvens (60 FPS) og dataoppløsning (1 297 x 1 297 x 784). Legg om ønskelig til tidsstempler her. Når disse parameterne er angitt, velger du Record (figur 4F).
- Trinn 3.4 og 3.5 kan gjentas med endring i trinn 3.4 for å lage rotasjonsvideoer på bestemte tidspunkter. Når du legger til en nøkkelbildesekvens i dreieboken, merker du av for Opprett rotasjon og fjerner merket for Bruk tidsprogresjon. Følg deretter de samme instruksjonene som i trinn 3.5.
- Hvis du vil gjengi et bilde med høy oppløsning i en hvilken som helst retning når som helst, velger du Kamera-ikonet i 4D-visningsprogrammet for å få et bilde med høy oppløsning (figur 4C).
- Hvis du vil bygge en rørledning for analyse, velger du Kolbeikonet for å få tilgang til analysepanelet (figur 4B). Klikk rullegardinmenyen Analyseoperasjoner i Analyse-panelet. Som et eksempel demonstrerer protokollen under sekvensen av operasjoner for en volumanalysepipeline. Kjør eller angre hvert trinn i datasamlebåndet individuelt for å finjustere hver parameter (tabell 1).
- Klikk på den blå trekanten øverst i rørledningen for å la rørledningen kjøre.
MERK: Dette vil ta litt tid, avhengig av hastigheten på datamaskinen. Når datasamlebåndet er optimalisert, kan datasamlebåndet enkelt eksporteres og importeres til arivis og brukes på flere datasett i en satsvis analyse. - Hvis du vil ha tilgang til satsvis analyse, klikker du Satsvis analyse på Analyse-fanen .
- Når rørledningen er kjørt, trekker et vindu opp med alle objektene som er funnet. Få tilgang til dette manuelt via tabellikonet (figur 4B). Øverst i dette vinduet klikker du på boksen merket Funksjonskolonner for å hente opp en liste over funksjoner som kan gi informasjon om objektet av interesse. For volumanalysen for øyefeltet inkluderer disse funksjonene Overflateområde, Volum (Volum, VoxelCount), Intensiteter #1 (Gjennomsnitt), Attributter (ID, Type) og Tidspunkt (Først). Klikk Eksporter for å eksportere dataene til et regneark.
Representative Results
Datasettet som vises her, ble avbildet ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Et Tg(Rx3:GFP)-embryo ble avbildet fra og med 1 somite stadium (ss) til og med 24 hkf, en total tidsperiode på 14 timer, med bildene anskaffet med 5 minutters intervaller. Tidsforløpavbildning gir enkel utvelgelse og sammenligning av ethvert tidspunkt som viser en fenotype interesse. Figur 5 viser et sett med bilder med høy oppløsning som ble gjengitt fra det dorsale utsiktspunktet ved utvalgte utviklingstidspunkter. Rørledningen som kjøres i arivis Vision4D bygger en maske som representerer det utviklende øyet som identifisert av fluorescerende signal. I figur 5 og videoer 1-6 kan masken visualiseres i forhold til fluorescerende gjengivelse av det utviklende øyet. I tillegg viser Tabell 2 volumdataene fra det utviklende øyet på hvert bildepunkt. Dette datasettet inkluderer segmentnavnet, ID-en, volumet i både μm3 og voxel count, objektets gjennomsnittlige fluorescensintensitet, tidspunktet objektet ble identifisert, og objektets overflateareal i μm2. Det er viktig å merke seg at når øyefeltet separeres i to optiske vesicles (starter ved Timepoint 64), er det fortsatt en tredje region som er Rx3: GFP positiv i forebrain, noe som vil bidra til hypothalamus38,39,40 (Figur 5D-M). Dette vises i volumdataene som er representert i tabell 2 (uthevet i gult fra og med tidspunkt 71) og kan enkelt skilles ut fra de optiske vesikler, siden det er mye mindre i volum enn noen av de optiske vesicle.
Figur 1: Prøvepreparering. (A) Plassering av embryoer i en glasskapillær. Pilen peker på et embryo i kapillæren. (B) Glass kapillær og kapillærholder deler. (C) Delvis montert kapillærholder. (D) Fullt montert kapillærholder. (E) Monteringskammer for lysark. Pilen indikerte den hvite linjen som ble brukt til å orientere kapillærholderen. (F) Kapillærholder riktig montert i Lightsheet. Pilen viser de matchende hvite linjene, noe som indikerer riktig retning av kapillærholderen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av Lightsheet-bildebehandling. (A) Sentralbord for å slå på Lightsheet,datamaskin og inkubasjonsenhet. Tallene angir rekkefølgen på operasjonene. (B) Lightsheet objektivt kammer. (C) Bildekammer. (D) Sprøyte og slanger som skal kobles til bildekammeret. (E) Bildekammeret er riktig plassert i objektivkammeret med alle rørene koblet til de aktuelle portene til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempelposisjonering. (A) Finn kapillær- og finn prøveknapper i Zen-programvare som angitt av pilene. (B) Plasseringen på glasskapillæren. Pilen angir kanten på glasskapillæren plassert like over objektivet til målet. (C) Embryoets suspensjon utover glasskapillæren. Pilen indikerte embryoet suspendert i agarose under glasskapillæren foran objektivets linse. (D) Syn på embryoet gjennom målet. (E) ErgoDrive kontrollpanel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Viktige ikoner for å navigere i arivis Vison4D. Hvert panel har ikonfunksjonen identifisert fra venstre mot høyre. (A) Åpne, Lagre, Lukk. (B) Analysepanel, Vis objekttabell, Åpne Sporredigering. (C) Kopier gjeldende seerinnhold som et bilde til utklippstavlen, Aktiver/deaktiver bokmerker, Opprett et bilde med høy oppløsning for gjeldende visning, Aktiver/deaktiver dreiebok. (D) Vis målboks, Vis retningskors, Vis forklaring, Vis skalalinje. (E) Vis som 2D-visningsprogram, Vis som gallerivisningsprogram, Vis som 4D-visningsprogram, Vis som infovisningsprogram, Vis som projeksjonsvisningsprogram. F) Oppdater alle nøkkelbilder, Legg til nøkkelbilde, Legg til nøkkelbildesekvens, Sett inn nøkkelbilde, Fjern alle nøkkelbilder, Eksporter film, Last inn dreiebok, Lagre dreiebok, Juster måltidet for hele filmen, Første nøkkelbilde, Spill av, Pause, Stopp, Siste nøkkelbilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilder med høy oppløsning og øyefeltmasker. (A-M) Et sett med bilder med høy oppløsning som ble gjengitt fra de dorsale utsiktspunktene. (A'-M') øyefeltmaskene for hvert tilsvarende tidspunkt. Hvert bildesett er notert når det ble anskaffet fra starten av bildet og det tilsvarende utviklingsstadiet i enten somite stadium (ss) eller timer etter befruktning (hpf). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Tidsforløp video av Tg(rx3:GFP) sebrafisk embryo fra 1 ss-24 hpf. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Video 2: Time-lapse video av Tg(rx3:GFP) sebrafisk embryo fra 1 ss-24 hpf med øyefeltet som identifisert av arivis Vision4D rørledningen. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Video 3: 360° rotasjon av et Tg(rx3:GFP) sebrafiskembryo ved 1 ss. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Video 4: 360° rotasjon av en Tg(rx3:GFP) sebrafisk embryo øyefeltmaske ved 1 ss. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Video 5: 360° rotasjon av et Tg(rx3:GFP) sebrafiskembryo ved 24 hkf. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Video 6: 360° rotasjon av en Tg(rx3:GFP) sebrafisk embryo øyefeltmaske ved 24 hkf. Høyreklikk her for å laste ned videoen (lagre lenken som).
Tabell 1: arivis Vision4D rørledning for volumanalyse av det utviklende øyefeltet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Volum og overflateareal i det utviklende øyefeltet ervervet av arivis Vision4D. Radene knyttet til den presumptive hypothalamus er uthevet i gult for å skille dem fra de optiske vesiklene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
I denne protokollen ble Lightsheet-mikroskopet brukt til å utføre tidsforløpavbildning av øyeutvikling og de resulterende dataene ble analysert. Det resulterende datasettet kan gi verdifull innsikt i prosessen med okulær morfogenese, samt perturbasjoner til denne prosessen som følge av genetisk mutasjon, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle parametere. Her demonstrerte protokollen hvordan dette datasettet kan oppnås og ga et eksempel på hvordan man analyserer volumet av øyefeltet gjennom tidlig utvikling. Disse dataene ble funnet å være reproduserbare og konsistente (mindre enn 10% variasjon i volum) på tvers av biologiske replikeringer, med tanke på at små forskjeller i embryooppsamling før starten av løpet kan føre til en viss variasjon i endelige volummålinger.
Det bør tas hensyn til den første plasseringen av embryoet i kapillæren og i plassering av det innebygde embryoet foran målet. Orientering spiller en viktig rolle i å forhindre at embryoet vokser og beveger seg ut av målets syn. Embryoene har en rund form på 10 hkf, noe som gjør det utfordrende å garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt sett vil embryoets kropp bli plassert lateralt i kapillæren. Lasting av flere embryoer i kapillæren vil øke sannsynligheten for å ha et godt posisjonert embryo.
I denne prosedyren er embryoet innebygd i agarose for å suspendere det foran avbildnings- og belysningsmålene. Å velge riktig konsentrasjon av den lave smeltetemperaturen er kritisk. For høy konsentrasjon vil begrense embryoet og forhindre at det utvikler seg riktig; for lav konsentrasjon vil føre til at agarose faller fra hverandre og ikke holder embryoet. Konsentrasjonen optimal for denne protokollen er en endelig konsentrasjon på 1% lav smeltetemperatur agarose30,31.
Et annet element som bør tas i betraktning er metningsnivået. Etter hvert som øyefeltet vokser og skiller seg ut, intensiveres styrken til Rx3:GFP-signalet. Når du angir de første bildeparameterne, bør derfor eksponeringen og lasereffekten reduseres for å undermette bildet. Dette forhindrer at bildet blir overmettet etter hvert som Rx3:GFP blir lysere over tid. Endringer kan gjøres for å korrigere for undermetning i bildebehandling, men overmetning kan ikke korrigeres etter at bildene er anskaffet.
Det er noen flere endringer som kan gjøres i denne protokollen som kan være fordelaktige for noen prosjekter som ikke er beskrevet i dette dokumentet. Det er for eksempel mulig å definere Multiview-avbildning i bildeanskaffelsesoppsettet. Denne parameteren vil tillate at flere embryoer i forskjellige posisjoner langs y-aksen blir sekvensielt avbildet ved hvert tidsintervall. Når du legger til kompleksitet i datasettet, vil det øke frekvensen av datainnsamling. I tillegg, når det gjelder bildebehandling, er det mulig å kvantifisere øyefeltet med andre parametere. Her beskrev vi hvordan du kvantifiserer dataene når det gjelder øyefeltvolumet. Alternativt kan en rørledning gjøres for å kvantifisere og spore individuelle celler eller bestemme frekvensen av optisk vesicle evaginering.
Som tidligere nevnt har både konfekt- og Lightsheet-mikroskopi blitt brukt til å utføre tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafisk. Lightsheet ble spesielt valgt for dette prosjektet på grunn av sin overlegne evne til å bilde gjennom en tykk (>1 mm) prøve, fordi den er utstyrt med en inkubasjonsenhet for å opprettholde et ideelt temperaturmiljø for sebrafiskembryoet, og fordi dens evne til å bildese med en raskere hastighet enn konfokal mikroskopi tillater bildeanskaffelse ved de mange tidsintervallene som kreves for denne protokollen, ingen tilhørende skade eller fotobleaching avembryoet 21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det er også viktig å merke seg at Lightsheet-mikroskopet er utstyrt for å avbilde signalet fra flere fluoroforer. Lightsheet-mikroskopet som brukes i denne studien har solid state laser eksitasjonslinjer ved 405, 445, 488, 515, 561 og 638 nm, noe som kan være nyttig for avbildning av transgene embryoer som uttrykker mer enn en fluorescerende reportertransgene.
Mens denne protokollen beskriver instruksjoner for bildeanskaffelsesanalyse spesielt ved hjelp av Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System og arivis Vision4D analyseprogramvare, er det andre kommersielt tilgjengelige Lightsheet-mikroskoper laget av Leica, Olympus og Luxendo, samt bildeanalyseprogramvare av Imaris, som kan brukes til å oppnå lignende resultater. Valg av utstyr og programvare for denne protokollen ble bestemt av tilgjengeligheten ved vår institusjon.
Oppsummert forventes det at denne protokollen vil gi et solid utgangspunkt for å utføre tidsforløpavbildning ved hjelp av Lightsheet-mikroskopi, og for bilde kvantifisering av tidlig øyeutvikling i sebrafisk.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Office of The Director of the National Institutes of Health (NIH) under Prisnummer S10OD020067 og av NIH-prisen R01EY021769 (til A.C.M.). Vi er takknemlige for hjelpen fra Doug Harrison og Jim Begley i Arts &Sciences Imaging Center ved University of Kentucky, og til Lucas Vieira Francisco og Evelyn M. Turnbaugh for ekspert sebrafiskpleie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Wilson, S. W., Houart, C.
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
