Summary
Här tillhandahålls ett protokoll för time-lapse-avbildning av okulär morfogenes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt ljusarkmikroskop och en arbetsstation för bildbehandling för att analysera de resulterande data. Detta protokoll beskriver procedurerna för embryoanestesi, inbäddning i låg smälttemperatur agaros, suspension i bildkammaren, inställning av bildparametrarna och slutligen analys av bilddata med hjälp av bildanalysprogramvara.
Abstract
Utveckling av ryggradsdjurs ögon är en komplex process som börjar nära slutet av embryogastrulationen och kräver exakt samordning av cellmigration, spridning och differentiering. Time-lapse-föreställning ger unik inblick i cellernas beteende under ögonutveckling eftersom det gör att vi kan visualisera okulogenes in vivo. Zebrafiskar är en utmärkt modell för att visualisera denna process på grund av deras mycket bevarade ryggradsdjursöga och deras förmåga att utvecklas snabbt och externt samtidigt som de förblir optiskt transparenta. Time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskögonutveckling underlättas avsevärt genom användning av den transgena zebrafisklinjen Tg (rx3: GFP). I den utvecklande framhjärnan markerar rx3: GFP-uttrycket cellerna i det enda ögonfältet, och GFP fortsätter att uttryckas som ögonfältet evaginates för att bilda en optisk vesiklar, som sedan invaginates för att bilda en optisk kopp. Högupplöst time lapse-avbildning av rx3: GFP-uttryck tillåter oss därför att spåra ögonprimoret genom tiden när det utvecklas till näthinnan. Ljusarkmikroskopi är en idealisk metod för att avbilda okulär morfogenes över tid på grund av dess förmåga att penetrera tjockare prover för fluorescerande avbildning, minimera fotoblekning och fototoxicitet och bild med hög hastighet. Här tillhandahålls ett protokoll för time-lapse-avbildning av okulär morfogenes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt ljusarkmikroskop och en arbetsstation för bildbehandling för att analysera de resulterande data. Detta protokoll beskriver procedurerna för embryoanestesi, inbäddning i låg smälttemperatur agaros, suspension i bildkammaren, inställning av bildparametrarna och slutligen analys av bilddata med hjälp av bildanalysprogramvara. Den resulterande datasetet kan ge värdefulla insikter i processen med okulär morfogenes, liksom störningar i denna process som ett resultat av genetisk mutation, exponering för farmakologiska medel eller andra experimentella manipulationer.
Introduction
Embryonal utveckling är en komplex process som kräver exakt samordning av många olika händelser. Bildandet av ryggradsdjurens öga börjar i den utvecklande framhjärnan, där en del av cellerna specificeras som ögonfältet. Dessa celler kommer att vaginera mot ytan ektoderm, vilket ger upphov till två bilaterala optiska vesiklar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt med ytektodermen inducerar sedan en invagination av den optiska vesikeln i en optisk kopp. Ytektodermen kommer att ge upphov till ögats främre strukturer, såsom linsen och hornhinnan, medan den optiska koppen kommer att ge upphov till neural näthinnan och retinal pigmenterat epitel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Störningar i denna process kan leda till medfödda defekter såsom mikroftalmi, anoftalmi och kolobom (MAC). För närvarande finns det inga alternativ för att korrigera dessa defekter 3,5,6,7,9,10,11,12. Ytterligare studier av mekanismerna för okulär morfogenes och de problem som kan leda till MAC kommer att ge en grund för kunskap som potentiellt kommer att leda till behandlingar. Ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellernas dynamiska beteenden under ögonutveckling är time-lapse-föreställning, vilket gör att denna process kan visualiseras och karakteriseras in vivo och i realtid.
Zebrafisk (Danio rerio) är en utmärkt modell för att visualisera tidig okulär utveckling med hjälp av time-lapse-avbildning. De har ett mycket konserverat ryggradsdjursöga och har förmågan att utvecklas snabbt och externt samtidigt som de förblir optiskt transparenta1. Zebrafisk ger en stor resurs för time-lapse-avbildning på grund av dessa egenskaper som däggdjursmodeller saknar. Time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskögonutveckling underlättas avsevärt genom användning av den transgena zebrafisklinjen Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) är en transkriptionsfaktor som är väsentlig för ögonutveckling14. Rx3 är den första av de tre rx-generna i zebrafisken som ska uttryckas, vilket börjar sitt uttryck mitt i gastrulationen, cirka 8 timmar efter befruktning (hpf)15,16. Rx3: GFP-transgenen kan visualiseras i den utvecklande framhjärnan med början vid 1 somitstadiet (ss), cirka 10 hpf 15,17,18,19,20. I den utvecklande framhjärnan markerar rx3: GFP-uttrycket cellerna i enögonfältet, och GFP (grönt fluorescerande protein) fortsätter att uttryckas genom resten av okulär morfogenes. Högupplöst time lapse-avbildning av rx3: GFP-uttryck tillåter oss därför att spåra fältet med ett öga genom tiden när det utvecklas till näthinnan 17,18,20.
Time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskutveckling har främst utförts med hjälp av konfokal eller Lightsheet-mikroskopi. Konfokalmikroskopi är fördelaktig eftersom den möjliggör exakt avbildning av prover längs z-axeln och minskar fluorescerande bakgrundssignal. Det är emellertid begränsat av den tid det tar att förvärva en bild, provpositionens styvhet och dess benägenhet mot fotoblekning och fototoxicitet hos levande prover. Ljusarkmikroskopi är en idealisk metod för att avbilda okulär morfogenes över tid på grund av dess förmåga att penetrera tjockare prover för fluorescerande avbildning, ökad flexibilitet i provorientering, minimerad fotoblekning och fototoxicitet och avbildning med hög hastighet 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Den rumsliga upplösningen som kan uppnås med nuvarande ljusarkmikroskopisystem är cirka 250-500 nanometer (nm). Även om detta inte skiljer sig signifikant från vad som kan erhållas med konfokalmikroskopi, kan provet roteras fritt och avbildas från flera vinklar, vilket förbättrar både bilddjup och upplösning och erbjuder mycket större flexibilitet för in vivo-tidsfördröjningsavbildningsexperiment än konfokalplattformen27,32 . Av dessa skäl blir Lightsheet-mikroskopi snabbt den föredragna metoden för time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskutveckling. Detta protokoll beskriver stegen för att kvantifiera okulogenes genom avbildning av Rx3: GFP transgen zebrafisk med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt Lightsheet-mikroskop33 och beskriver en pipeline för bildanalys med hjälp av arivis mjukvaruplattform.
Protocol
Alla experiment som involverar användning av zebrafisk utfördes i enlighet med protokoll som fastställts av University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Provberedning
- Sätt upp ett parningspar Tg (Rx3: GFP) zebrafisk i en gated cross tank natten innan avbildning planeras. Morgonen därpå drar du i grinden när lamporna tänds i fiskanläggningen 34,35.
OBS: Parningsparet av fisk som väljs bör vara mellan 4 månader och 2 år och kan lätt särskiljas som man eller kvinna baserat på kroppsform ochfärg 35. - Kontrollera korsen varje halvtimme för embryon och notera vilken tid embryon först visualiseras i botten av korstanken. Överför embryona till en petriskål och håll embryona vid 28,5 °C i cirka 10 timmar för att utvecklas till 1-2 somitstadiet (ss). Börja avbilda vid 1-2 somitstadiet (ss).
- För att screena för närvaron av somiter, observera embryon under ett stereoskop vid 10 hpf och räkna antalet somiter1.
OBS: Alla embryon som ligger bortom det enda somitstadiet bör inte användas för detta experiment. - Av embryon som befinner sig i det enda somitstadiet, skärm för GFP-uttryck med hjälp av en fluorescensadapter i kombination med ett stereomikroskop för att bekräfta närvaron av Rx3: GFP-transgenen. När 3-5 GFP-positiva individer har identifierats, använd fina pincett för att dekorionera embryon och överföra dem till en liten petriskål som innehåller E3-embryobuffert med en glaspipett35.
- Bedöva embryona genom att överföra dem till 0,5 ml E3 embryobuffert (pH 7) innehållande 0,168 mg/ml trikain (MS222) i ett mikrocentrifugrör35,36. Spontana muskelrörelser börjar så tidigt som 17 hpf37. Se till att embryon sövs till bild bortom denna tidpunkt.
- Bädda in embryona i 1% låg smälttemperatur agaros i 0,168 mg / ml trikain och E3.
OBS: Detta är den optimala koncentrationen av agaros med låg smälttemperatur för att embryot ska kunna hållas på plats men förbli tillräckligt smidigt för att tillåta embryots tillväxt under avbildningstiden 30,31. - Förbered en 10 ml lösning med 2% låg smälttemperatur agaros i E3-buffert. Värm den i en mikrovågsugn för att lösa upp agaros med 15 s intervaller för att förhindra att lösningen kokar över. Låt lösningen svalna tillräckligt för att hålla utan obehag men inte så mycket att den stelnar och inte skadar embryon. När agarosen är tillräckligt sval, tillsätt 0,5 ml till embryon i röret av Tricaine i E3 och försiktigt pipettera lösningen och embryon för att blanda.
- Använd en 1 mm glaskapillär och polytetrafluoretylenkolv (PTFE) och dra upp embryon i agaroslösningen i kapillären. Se till att dra totalt 3-5 embryon (flera embryon) i kapillären för att öka sannolikheten för att ha ett välpositionerat embryo.
OBS: På grund av embryonernas runda natur vid denna tidpunkt är det utmanande att garantera en specifik orientering i kapillären. Helst kommer embryonets kropp att placeras i sidled i kapillären, vilket möjliggör största möjliga positionering inom mikroskopet. - Låt agaros stelna under en period av 30-60 s vid rumstemperatur. Placera kapillären i en bägare på 0,168 mg/ml trikain i E3-bufferten tills den är redo att avbildas (figur 1A).
OBS: Överskottet av 2% låg smälttemperatur agaroslösning kan tillåtas stelna och därefter värmas upp i framtida experiment. - Placera kapillären i provhållaren (figur 1B-F) enligt beskrivningen i steg 2.5.
2. Zeiss Lightsheet Z.1-inställning
- Slå på varje komponent i mikroskopet och datorn i följande ordning: 1) System, 2) PC, sedan 3) Inkubation (Figur 2A).
- Placera 20x bildmålet och 10x belysningsmålet i mikroskopkammaren. Matcha objektivinställningarna i Zen-programvarugränssnittet under fliken Underhåll .
- Skjut in kammaren (figur 2C) i huset på spåret (figur 2B) med slangen vänd utåt. Slangen ansluts till lämpliga portar till höger som visas i figur 2E.
- Fäst förlängningslinjen på sprutan med lockmekanismen (figur 2D); fyll den med Tricaine i E3 och placera den i hållaren fäst till höger om mikroskopet35. Anslut förlängningen som är fäst vid sprutan fylld med Tricaine i E3 längst ner till höger om kammaren med lockmekanismen. Tryck på kolven för att fylla kammaren med Tricaine/E3-bufferten. Stäng dörren till kammaren.
- Placera kapillären med provet i kapillärprovhållaren. Kapillärprovhållaren består av två gummihylsor, en metallprovhållarskiva, en metallstam och ett metalllock (figur 1B). Klicka på metallhöljet i mitten av metallskivan (Figur 1C). Placera de två gummipropparna i manteln, med slitsarna vända mot mantelns ändar följt av kapillären. Skjut kapillären genom mitten av gummipropparna. Fäst den på plats med metalllocket när markören är vid basen av metallhöljet (figur 1D).
- Placera kapillärprovhållaren på toppen av mikroskopet, med de vita markeringarna i linje (figur 1E,F). Stäng locket.
- Klicka på knappen Hitta kapillär i programvarugränssnittet (Figur 3A). Använd ErgoDrive-kontrollpanelen, en manuell enhet som styr kapillärorienteringen (figur 3E), för att flytta kapillären och placera den strax ovanför målet (figur 3B).
- Öppna locket och tryck försiktigt på kolven tills den del av agaros som innehåller embryot hänger under kapillärbotten och ligger framför målet (figur 3C).
- Stäng av Hitta kapillär och klicka på knappen Hitta prov (Figur 3A). Detta växlar vyn från provkammarens webbkamera till mikroskopmålet (figur 3D). Använd den här vyn för att justera provets position mer exakt. Stäng av Hitta exempel (figur 3A).
- Växla över till fliken Förvärv . Markera rutorna för Z-Stack och Time Series.
- I fönstret Parametrar för förvärvsläge väljer du inställningen Dual Side Lightsheet och markerar rutorna för Online Dual Side Fusion och Pivot Scanning.
- I fönstret Kanaler väljer du 488 kanal, ställer in lasereffekten på 1 och exponeringstiden på 7,5 ms.
- Klicka sedan på knappen Kontinuerlig för att få en levande bild av embryot. Använd ErgoDrive-kontrollpanelen för att justera embryots position tills ögonfältet är direkt vänt mot kameran. Fortsätt justera vänster och höger ljusark i kanalparametrarna tills ögonfältet är tillräckligt i fokus.
- Ställ in Z-Stack-parametrarna med ErgoDrive-kontrollpanelen för att gå igenom Z-planet. Ställ in den första och den sista Z-positionen runt 500 μm bortom den sista detekterbara fluorescerande signalen. Detta lämnar utrymme för ögonfältet att förbli i ram när embryot växer under hela time-lapse-avbildningssessionen. När du har ställt in Z-Stack-intervallet klickar du på knappen Optimal för att ställa in stegstorleken till 0,477 μm, den optimala inställningen.
- Ställ in inkubationsparametrarna genom att markera rutan för Peltier-enheten för att hålla temperaturen vid 28 °C. I fönstret Tidsserie väljer du frekvens och tidsintervall för att hämta bilder. I detta protokoll ställdes parametrarna in på bild var 5: e minut, för totalt 166 intervaller.
- Klicka på knappen Starta experiment . Välj mappen för att spara bilduppsättningen. Ställ in bildprefixet och tryck på Spara för att starta avbildningen.
OBS: Mikroskopet kommer nu att köras genom varje bilduppsättning med det angivna intervallet. - När time-lapse-avbildningssessionen har slutförts skickar du scenen till belastningsläget och tar bort kapillärprovhållaren. Ta isär kapillärprovhållaren i omvänd ordning som den sattes ihop och använd kolven för att avlägsna provet och överskottet av agaros från kapillären. Öppna kammardörren. Använd sprutan för att ta bort kammarvätskan från kammaren, koppla bort och ta bort kammaren, skölj sedan med vatten och lufttorka.
3. Bildanalys
- Öppna programmet arivis Vision4D.
- Klicka på Arkiv och välj sedan Importera fil. Välj alla .czi-filer från timelapse-avbildningssessionen och öppna. Nästa fönster öppnas med alternativen för hur du importerar filerna; välj Z-stackar som Ramar för att beställa z-stackarna i den ordning som erhållits. När filerna har importerats sparas programvaran som en enda .sis-fil. För att ange platsen för filen som ska sparas, välj mappen innan du klickar på Importera.
- När filen har importerats är arivis nu redo att återge en video av timelapse-bilderna. Klicka på 4D-visningskuben i det nedre vänstra hörnet och ikonen Scale Bar (Figur 4D-E). Klicka på videoikonen för att ta storyboard aktivitetsfältet längst ner på skärmen (Figur 4C).
- I aktivitetsfältet Storyboard väljer du Lägg till nyckelbildssekvens (Figur 4F). Ange videons varaktighet i sekunder, avmarkera rutan Skapa rotation och markera Använd tidsprogression för att inkludera de specifika tidpunkterna i videon. Programvaran visar dessa parametrar till höger om Storyboard aktivitetsfält för eventuella justeringar när som helst. Spara Storyboard för att tillämpa samma parametrar på flera bilduppsättningar (Figur 4F).
- Klicka på Exportera film för att spara en video av time-lapse-avbildningen (Figur 4F). Ange inställningarna för filmexport, inklusive filnamn och plats, videoformat (.mp4), videoupplösning (1 080 p), bildfrekvens (60 FPS) och dataupplösning (1 297 x 1 297 x 784). Lägg till tidsstämplar här, om så önskas. När dessa parametrar har ställts in väljer du Spela in (Figur 4F).
- Steg 3.4 och 3.5 kan upprepas med ändringar i steg 3.4 för att skapa rotationsvideor vid specifika tidpunkter. När du lägger till en nyckelbildssekvens till storyboardet markerar du rutan Skapa rotation och avmarkerar Använd tidsprogression. Följ sedan samma instruktioner som i steg 3.5.
- Om du vill återge en högupplöst bild i valfri riktning vid en viss tidpunkt väljer du kameraikonen i 4D Viewer för att få en högupplöst bild (figur 4C).
- Om du vill skapa en pipeline för analys väljer du flaskikonen för att komma åt analyspanelen (figur 4B). Klicka på rullgardinsmenyn Analysåtgärder i panelen Analysåtgärder. Som ett exempel visar protokollet nedan åtgärdssekvensen för en volymanalyspipeline. Kör eller ångra varje steg i pipelinen individuellt för att finjustera varje parameter (tabell 1).
- Klicka på den blå triangeln högst upp i pipelinen så att pipelinen kan köras.
OBS: Detta tar lite tid beroende på datorns hastighet. När pipelinen har optimerats kan pipelinen enkelt exporteras och importeras till arivis och tillämpas på flera datauppsättningar i en batchanalys. - För att komma åt batchanalys, klicka på Batchanalys under fliken Analys .
- När pipelinen har körts dras ett fönster upp med alla objekt som hittats. Få åtkomst till detta manuellt via tabellikonen (figur 4B). Högst upp i det här fönstret klickar du på rutan märkt Funktionskolumner för att hämta en lista över funktioner som kan ge information om objektet av intresse. För ögonfältsvolymanalysen inkluderar dessa funktioner Yta, Volym (Volym, VoxelCount), Intensiteter #1 (Medelvärde), Attribut (ID, Typ) och Tidspunkt (Första). Klicka på Exportera för att exportera data till ett kalkylark.
Representative Results
Datauppsättningen som visas här avbildades med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. Ett Tg(Rx3:GFP)-embryo avbildades med början i 1 somitstadium (ss) till 24 hpf, en total tidsperiod på 14 timmar, med bilderna förvärvade med 5 minuters mellanrum. Time-lapse-avbildning möjliggör enkelt val och jämförelse av alla tidpunkter som visar en fenotyp av intresse. Figur 5 visar en uppsättning högupplösta bilder som återgavs från den dorsala utsiktspunkten vid utvalda utvecklingstidspunkter. Rörledningen som körs i arivis Vision4D bygger en mask som representerar det utvecklande ögat som identifieras av fluorescerande signal. I figur 5 och videor 1-6 kan masken visualiseras i jämförelse med den fluorescerande återgivningen av det utvecklande ögat. Dessutom visar tabell 2 volymdata från det utvecklande ögat vid varje avbildningspunkt. Den här datauppsättningen innehåller segmentnamn, id, volym i både μm3 och voxelantal, objektets genomsnittliga fluorescensintensitet, den tidpunkt då objektet identifierades och objektets yta i μm2. Det är viktigt att notera att när ögonfältet separeras i två optiska vesiklar (med början vid tidpunkt 64) finns det fortfarande en tredje region som är Rx3: GFP-positiv i framhjärnan, vilket kommer att bidra till hypotalamus38,39,40 (Figur 5D-M). Detta visas i volymdata som representeras i tabell 2 (markerad med gult med början vid tidpunkt 71) och kan enkelt separeras ut från de optiska vesiklarna, eftersom den är mycket mindre i volym än någon av de optiska vesiklarna.
Figur 1: Provberedning. (A) Placering av embryon i en glaskapillär. Pilen pekar på ett embryo i kapillären. B) Kapillär- och kapillärhållardelar av glas. C) Delvis monterad kapillärhållare. D) Fullt monterad kapillärhållare. (E) Monteringskammare för ljusplåt. Pilen indikerade den vita linjen som används för att orientera kapillärhållaren. (F) Kapillärhållare korrekt monterad i ljusplåten. Pilen visar de matchande vita linjerna, vilket indikerar kapillärhållarens korrekta orientering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Ljusarksavbildningsuppsättning. (A) Växel för att slå på ljusarket, datorn och inkubationsenheten. Siffrorna anger operationsordningen. (B) Objektiv kammare för ljusark. (C) Bildkammare. (D) Spruta och slangar som kommer att anslutas till bildkammaren. (E) Bildkammaren korrekt placerad i målkammaren med alla rör anslutna till lämpliga portar till höger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Provpositionering. (A) Leta reda på kapillär - och hitta provknappar i Zen-programvaran som indikeras av pilarna. (B) Placeringen på glaskapillären. Pilen indikerar kanten på glaskapillären placerad strax ovanför objektivets lins. C) Embryosuspensionen bortom glaskapillären. Pilen indikerade embryot suspenderat i agaros under glaskapillären framför målets lins. (D) Syn på embryot genom målet. (E) ErgoDrive-kontrollpanelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Viktiga ikoner för att navigera i arivis Vison4D. Varje panel har ikonfunktionen identifierad från vänster till höger. (A) Öppna, spara, stäng. (B) Analyspanel, Visa objekttabell, Öppna spårredigerare. (C) Kopiera aktuellt visningsinnehåll som en bild till Urklipp, Växla bokmärken, Skapa en högupplöst bild för den aktuella vyn, Växla Storyboard. (D) Visa måttruta, Visa orienteringskors, Visa förklaring, Visa skalningsfält. (E) Visa som 2D-visare, Visa som gallerivisare, Visa som 4D-visare, Visa som infovisare, Visa som projektionsvisare. F) Uppdatera alla nyckelrutor, lägg till nyckelbild, lägg till nyckelbildssekvens, infoga nyckelram, ta bort alla nyckelramar, exportera film, ladda storyboard, spara storyboard, justera måltiden för hela filmen, första nyckelramen, spela, pausa, stoppa, sista nyckelramen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Högupplösta bilder och ögonfältsmasker. (A-M) En uppsättning högupplösta bilder som återgavs från de dorsala utsiktspunkterna; (A'-M') ögonfältsmaskerna för varje motsvarande tidpunkt. Varje bilduppsättning noteras av den tid den förvärvades från början av avbildningen och motsvarande utvecklingsstadium i antingen somitstadium (ss) eller timmar efter befruktning (hpf). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Time-lapse-video av Tg (rx3: GFP) zebrafiskembryo från 1 ss-24 hpf. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Video 2: Time-lapse-video av Tg (rx3: GFP) zebrafiskembryo från 1 ss-24 hpf med ögonfältet som identifierats av arivis Vision4D-rörledningen. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Video 3: 360 ° rotation av ett Tg (rx3: GFP) zebrafiskembryo vid 1 ss. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Video 4: 360 ° rotation av en Tg (rx3: GFP) zebrafisk embryo ögonfältmask vid 1 ss. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Video 5: 360 ° rotation av ett Tg (rx3: GFP) zebrafiskembryo vid 24 hpf. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Video 6: 360 ° rotation av en Tg (rx3: GFP) zebrafisk embryo ögonfältmask vid 24 hpf. Högerklicka här för att ladda ner videon (spara länk som).
Tabell 1: arivis Vision4D-pipeline för volymanalys av det utvecklande ögonfältet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Volym och yta för det utvecklande ögonfältet som förvärvats av arivis Vision4D. Raderna som hänför sig till presumtiv hypotalamus markeras i gult för att skilja dem från de optiska vesiklarna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
I detta protokoll användes Lightsheet-mikroskopet för att utföra time-lapse-avbildning av ögonutveckling och de resulterande data analyserades. Den resulterande datasetet kan ge värdefulla insikter i processen med okulär morfogenes, liksom störningar i denna process som ett resultat av genetisk mutation, exponering för farmakologiska medel eller andra experimentella parametrar. Här visade protokollet hur denna dataset kan erhållas och gav ett exempel på hur man analyserar ögonfältets volym genom tidig utveckling. Dessa data befanns vara reproducerbara och konsekventa (mindre än 10% variation i volym) över biologiska replikat, med tanke på att små skillnader i embryostaging före starten av körningen kan leda till viss variation i slutliga volymmätningar.
Försiktighet bör iakttas vid embryots inledande positionering i kapillären och vid placering av det inbäddade embryot framför målet. Orientering spelar en viktig roll för att förhindra att embryot växer och rör sig ur målets syn. Embryona har en rund form på 10 hpf, vilket gör det utmanande att garantera en specifik orientering i kapillären. Helst kommer embryonets kropp att placeras i sidled i kapillären. Att ladda flera embryon i kapillären ökar sannolikheten för att ha ett välpositionerat embryo.
I denna procedur är embryot inbäddat i agaros för att suspendera det framför bild- och belysningsmålen. Att välja rätt koncentration av agaros med låg smälttemperatur är kritisk. För hög koncentration kommer att begränsa embryot och förhindra att det utvecklas ordentligt; för låg koncentration kommer att resultera i att agarosen faller isär och inte håller embryot. Den koncentration som är optimal för detta protokoll är en slutlig koncentration av 1% låg smälttemperatur agaros 30,31.
Ett annat element som bör beaktas är mättnadsnivån. När ögonfältet växer och differentieras intensifieras styrkan hos Rx3: GFP-signalen. Därför, när du ställer in de ursprungliga bildparametrarna, bör exponeringen och lasereffekten minskas för att undermätta bilden. Detta förhindrar att bilden blir övermättad eftersom Rx3: GFP blir ljusare med tiden. Ändringar kan göras för att korrigera för undermättnad i bildbehandling men övermättnad kan inte korrigeras efter att bilderna har förvärvats.
Det finns några ytterligare ändringar som kan göras i detta protokoll som kan vara fördelaktiga för vissa projekt som inte beskrivs i detta dokument. Det är till exempel möjligt att ställa in Multiview-avbildning i bildförvärvet. Denna parameter skulle göra det möjligt för flera embryon vid olika positioner längs y-axeln att avbildas sekventiellt vid varje tidsintervall. Samtidigt som datamängden läggs till komplexitet skulle det öka datainsamlingshastigheten. När det gäller bildbehandling är det dessutom möjligt att kvantifiera ögonfältet med andra parametrar. Här beskrev vi hur man kvantifierar data när det gäller ögonfältvolymen. Alternativt kan en rörledning göras för att kvantifiera och spåra enskilda celler eller bestämma hastigheten för optisk vesikle evagination.
Som tidigare nämnts har både konfokal- och Lightsheet-mikroskopi använts för att utföra time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskar. Lightsheet valdes specifikt för detta projekt på grund av dess överlägsna förmåga att avbilda genom ett tjockt (>1 mm) prov, eftersom det är utrustat med en inkubationsenhet för att upprätthålla en idealisk temperaturmiljö för zebrafiskembryot, och eftersom dess förmåga att avbilda i snabbare takt än konfokalmikroskopi möjliggör bildförvärv vid de många tidsintervaller som krävs för detta protokoll ingen åtföljande skada eller fotoblekning av embryot21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det är också viktigt att notera att Lightsheet-mikroskopet är utrustat för att avbilda signalen från flera fluoroforer. Lightsheet-mikroskopet som används i denna studie har fasta tillståndets laser excitationslinjer vid 405, 445, 488, 515, 561 och 638 nm, vilket kan vara användbart för avbildning av transgena embryon som uttrycker mer än en fluorescerande reportertransgen.
Medan detta protokoll beskriver instruktioner för bildförvärvsanalys specifikt med hjälp av Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System och arivis Vision4D-analysprogramvara, finns det andra kommersiellt tillgängliga Lightsheet-mikroskop gjorda av Leica, Olympus och Luxendo, samt bildanalysprogramvara från Imaris, som kan användas för att uppnå liknande resultat. Valet av utrustning och programvara för detta protokoll bestämdes av tillgängligheten hos vår institution.
Sammanfattningsvis förväntas detta protokoll ge en solid utgångspunkt för att genomföra time-lapse-avbildning med hjälp av Lightsheet-mikroskopi och för bildkvantifiering av tidig ögonutveckling hos zebrafiskar.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av Office of The Director of the National Institutes of Health (NIH) under award Number S10OD020067 och av NIH award R01EY021769 (till A.C.M.). Vi är tacksamma för hjälp av Doug Harrison och Jim Begley i Arts & Sciences Imaging Center vid University of Kentucky, och till Lucas Vieira Francisco och Evelyn M. Turnbaugh för expert zebrafiskvård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Wilson, S. W., Houart, C.
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
