Summary
Aquí, se proporciona un protocolo para imágenes de lapso de tiempo de la morfogénesis ocular utilizando un microscopio de hoja de luz disponible comercialmente y una estación de trabajo de procesamiento de imágenes para analizar los datos resultantes. Este protocolo detalla los procedimientos para la anestesia embrionaria, la incrustación en agarosa a baja temperatura de fusión, la suspensión en la cámara de imágenes, la configuración de los parámetros de imagen y, finalmente, el análisis de los datos de imágenes utilizando un software de análisis de imágenes.
Abstract
El desarrollo del ojo de los vertebrados es un proceso complejo que comienza cerca del final de la gastrulación embrionaria y requiere la coordinación precisa de la migración, proliferación y diferenciación celular. La imaginación de lapso de tiempo ofrece una visión única del comportamiento de las células durante el desarrollo ocular porque nos permite visualizar la oculogénesis in vivo. El pez cebra es un excelente modelo para visualizar este proceso debido a su ojo vertebrado altamente conservado y su capacidad para desarrollarse rápida y externamente sin dejar de ser ópticamente transparente. Los estudios de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo del ojo de pez cebra se facilitan en gran medida mediante el uso de la línea transgénica de pez cebra Tg (rx3: GFP). En el cerebro anterior en desarrollo, la expresión de rx3: GFP marca las células del campo ocular único, y GFP continúa expresándose a medida que el campo ocular evagina para formar una vesícula óptica, que luego se invagina para formar una copa óptica. Las imágenes de lapso de tiempo de alta resolución de la expresión de rx3: GFP, por lo tanto, nos permiten rastrear el primordio ocular a través del tiempo a medida que se desarrolla en la retina. La microscopía de hoja de luz es un método ideal para obtener imágenes de la morfogénesis ocular a lo largo del tiempo debido a su capacidad para penetrar muestras más gruesas para imágenes fluorescentes, minimizar el fotoblanqueo y la fototoxicidad, e imagen a alta velocidad. Aquí, se proporciona un protocolo para imágenes de lapso de tiempo de la morfogénesis ocular utilizando un microscopio de hoja de luz disponible comercialmente y una estación de trabajo de procesamiento de imágenes para analizar los datos resultantes. Este protocolo detalla los procedimientos para la anestesia embrionaria, la incrustación en agarosa a baja temperatura de fusión, la suspensión en la cámara de imágenes, la configuración de los parámetros de imagen y, finalmente, el análisis de los datos de imágenes utilizando un software de análisis de imágenes. El conjunto de datos resultante puede proporcionar información valiosa sobre el proceso de morfogénesis ocular, así como perturbaciones de este proceso como resultado de una mutación genética, exposición a agentes farmacológicos u otras manipulaciones experimentales.
Introduction
El desarrollo embrionario es un proceso complejo que requiere la coordinación precisa de muchos eventos diferentes. La formación del ojo de los vertebrados comienza en el cerebro anterior en desarrollo, donde una parte de las células se especifica como el campo ocular. Estas células evaginarán hacia el ectodermo superficial, dando lugar a dos vesículas ópticas bilaterales 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. El contacto con el ectodermo superficial induce entonces una invaginación de la vesícula óptica en una copa óptica. El ectodermo superficial dará lugar a las estructuras anteriores del ojo, como el cristalino y la córnea, mientras que la copa óptica dará lugar a la retina neural y al epitelio pigmentado retiniano 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Las interrupciones en este proceso pueden conducir a defectos congénitos como microftalmia, anoftalmía y coloboma (MAC). En este momento, no hay opciones para corregir estos defectos 3,5,6,7,9,10,11,12. Estudios adicionales de los mecanismos de la morfogénesis ocular y los problemas que pueden conducir a mac proporcionarán una base de conocimiento que potencialmente conducirá a tratamientos. Una poderosa herramienta para investigar los comportamientos dinámicos de las células durante el desarrollo del ojo es la imaginación de lapso de tiempo, que permite visualizar y caracterizar este proceso in vivo y en tiempo real.
El pez cebra (Danio rerio) es un excelente modelo para visualizar el desarrollo ocular temprano utilizando imágenes de lapso de tiempo. Tienen un ojo vertebrado altamente conservado y poseen la capacidad de desarrollarse rápida y externamente mientras permanecen ópticamentetransparentes 1. El pez cebra proporciona un gran recurso para la obtención de imágenes de lapso de tiempo debido a estas características de las que carecen los modelos de mamíferos. Los estudios de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo del ojo de pez cebra se facilitan en gran medida mediante el uso de la línea transgénica de pez cebra Tg(rx3: GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) es un factor de transcripción esencial para el desarrollo ocular14. Rx3 es el primero de los tres genes rx en el pez cebra en ser expresado, comenzando su expresión a mitad de la gastrulación, aproximadamente 8 h después de la fertilización (hpf)15,16. El transgén rx3:GFP se puede visualizar en el cerebro anterior en desarrollo a partir de la 1 etapa de somita (ss), aproximadamente 10 hpf 15,17,18,19,20. En el cerebro anterior en desarrollo, la expresión de rx3:GFP marca las células del campo ocular único, y GFP (proteína verde fluorescente) continúa expresándose a través del resto de la morfogénesis ocular. Las imágenes de lapso de tiempo de alta resolución de la expresión rx3: GFP, por lo tanto, nos permiten rastrear el campo ocular único a través del tiempo a medida que se desarrolla en la retina 17,18,20.
Los estudios de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo del pez cebra se han realizado principalmente utilizando microscopía confocal o de hoja de luz. La microscopía confocal es ventajosa porque permite la obtención de imágenes precisas de muestras a lo largo del eje Z y reduce la señal de fondo fluorescente. Sin embargo, está limitado por la cantidad de tiempo que lleva adquirir una imagen, la rigidez de la posición de la muestra y su propensión al fotoblanqueo y la fototoxicidad de las muestras vivas. La microscopía de hoja de luz es un método ideal para obtener imágenes de la morfogénesis ocular a lo largo del tiempo debido a su capacidad para penetrar muestras más gruesas para imágenes fluorescentes, mayor flexibilidad en la orientación de la muestra, fotoblanqueo y fototoxicidad minimizados, e imágenes a alta velocidad 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. La resolución espacial alcanzable con los sistemas de microcopia de láminas de luz actuales es de aproximadamente 250-500 nanómetros (nm). Aunque esto no es significativamente diferente de lo que se puede obtener con la microscopía confocal, la muestra se puede girar y tomar imágenes libremente desde múltiples ángulos, mejorando tanto la profundidad como la resolución de la imagen, y ofreciendo una flexibilidad mucho mayor para los experimentos de imágenes de lapso de tiempo in vivo que la plataforma confocal27,32 . Por estas razones, la microscopía Lightsheet se está convirtiendo rápidamente en el método favorito para los estudios de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo del pez cebra. Este protocolo describe los pasos para cuantificar la oculogénesis a través de la obtención de imágenes de peces cebra transgénicos Rx3: GFP utilizando un microscopio Lightsheet33 disponible comercialmente y detalla una tubería para el análisis de imágenes utilizando la plataforma de software arivis.
Protocol
Todos los experimentos que involucran el uso de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos establecidos por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky (IACUC).
1. Preparación de la muestra
- Configure un par de apareamiento de pez cebra Tg (Rx3: GFP) en un tanque cruzado cerrado la noche antes de que se planifiquen las imágenes. A la mañana siguiente tire de la puerta cuando se enciendan las luces en la instalación de pesca34,35.
NOTA: El par de peces de apareamiento seleccionados debe tener entre 4 meses y 2 años de edad y se distinguen fácilmente como macho o hembra en función de la forma del cuerpo y la coloración35. - Verifique los cruces cada media hora en busca de embriones y anote a qué hora se visualizan los embriones por primera vez en el fondo del tanque cruzado. Transfiera los embriones a una placa de Petri y mantenga los embriones a 28,5 °C durante aproximadamente 10 h para desarrollarse hasta la etapa de somita 1-2 (ss). Comience a crear imágenes en la etapa de somita 1-2 (ss).
- Para detectar la presencia de somitas, observe los embriones bajo un estereoscopio a 10 hpf y cuente el número de somitas1.
NOTA: Cualquier embrión que esté más allá de la etapa de somita única no debe usarse para este experimento. - De los embriones que se encuentran en la etapa de somita única, examine la expresión de GFP utilizando un adaptador de fluorescencia en combinación con un estereomicroscopio para confirmar la presencia del transgén Rx3: GFP. Una vez que se hayan identificado 3-5 individuos GFP positivos, use fórceps finos para descoronar los embriones y transfiéralos a una pequeña placa de Petri que contenga tampón de embriones E3 con una pipetade vidrio 35.
- Anestesiar los embriones transfiriéndolos a un tampón embrionario E3 de 0,5 ml (pH 7) que contiene 0,168 mg/ml de tricaína (MS222) en un tubo de microcentrífuga35,36. Los movimientos musculares espontáneos comienzan tan pronto como 17 hpf37. Asegúrese de que los embriones estén anestesiados para obtener imágenes más allá de este punto de tiempo.
- Incrustar los embriones en agarosa a baja temperatura de fusión al 1% en 0,168 mg/ml de tricaína y E3.
NOTA: Esta es la concentración óptima de agarosa a baja temperatura de fusión para permitir que el embrión se mantenga en su lugar, pero permanezca lo suficientemente flexible como para permitir el crecimiento del embrión durante el curso de tiempo de imagen30,31. - Prepare una solución de 10 ml de agarosa a 2% a baja temperatura de fusión en tampón E3. Calentarlo en un horno de microondas para disolver la agarosa utilizando intervalos de 15 s, para evitar que la solución hierva. Deje que la solución se enfríe lo suficiente como para sostenerla sin molestias, pero no tanto como para que se solidifique y no cause daño a los embriones. Una vez que la agarosa esté lo suficientemente fría, agregue 0.5 ml a los embriones en el tubo de Tricaine en E3 y pipetee suavemente la solución y los embriones para mezclar.
- Usando un émbolo capilar de vidrio de 1 mm y politetrafluoroetileno (PTFE), tire de los embriones en la solución de agarosa hacia el capilar. Asegúrese de tirar de un total de 3-5 embriones (embriones múltiples) en el capilar para aumentar la probabilidad de tener un embrión bien posicionado.
NOTA: Debido a la naturaleza redonda de los embriones en este punto de tiempo, es difícil garantizar una orientación específica en el capilar. Idealmente, el cuerpo del embrión se colocará lateralmente en el capilar, lo que permitirá la mayor facilidad de posicionamiento dentro del microscopio. - Deje que la agarosa se solidifique durante un período de 30-60 s a temperatura ambiente. Coloque el capilar en un vaso de precipitados de 0,168 mg/ml de tricaína en tampón E3 hasta que esté listo para la imagen (Figura 1A).
NOTA: Se puede permitir que la solución de agarosa de baja temperatura de fusión al 2% en exceso se solidifique y posteriormente se vuelva a calentar en futuros experimentos. - Coloque el capilar en el soporte de la muestra (Figura 1B-F) como se describe en el paso 2.5.
2. Configuración de Zeiss Lightsheet Z.1
- Encienda cada componente del microscopio y la computadora en el siguiente orden: 1) Sistema, 2) PC, luego 3) Incubación (Figura 2A).
- Coloque el objetivo de imagen 20x y el objetivo de iluminación 10x en la cámara del microscopio. Haga coincidir la configuración del objetivo en la interfaz de Zen Software en la pestaña Mantener .
- Deslice la cámara (Figura 2C) dentro de la carcasa de la vía (Figura 2B) con el tubo hacia afuera. El tubo se conecta a los puertos apropiados a la derecha, como se muestra en la Figura 2E.
- Conecte la línea de extensión a la jeringa con el mecanismo luer-lock (Figura 2D); llénelo con Tricaine en E3 y colóquelo en el soporte unido a la derecha del microscopio35. Conecte la extensión conectada a la jeringa llena de Tricaine en E3 a la parte inferior derecha de la cámara con el mecanismo luer-lock. Empuje el émbolo para llenar la cámara con el tampón Tricaine/E3. Cierre la puerta de la cámara.
- Coloque el capilar con la muestra en el soporte de la muestra capilar. El portamuestras capilar comprende dos manguitos de goma, un disco de soporte de muestra de metal, un vástago de metal y una tapa de metal (Figura 1B). Haga clic en la funda de metal en el centro del disco de metal (Figura 1C). Coloque los dos tapones de goma en la vaina, con las rendijas mirando hacia los extremos de la vaina seguidos por el capilar. Deslice el capilar a través del centro de los tapones de goma. Sujéntelo en su lugar con la tapa de metal una vez que el marcador esté en la base de la vaina de metal (Figura 1D).
- Coloque el soporte de muestra capilar en la parte superior del microscopio, con las marcas blancas alineadas (Figura 1E, F). Cierre la tapa.
- Haga clic en el botón Localizar capilar en la interfaz del software (Figura 3A). Utilice el panel de control ErgoDrive, un dispositivo manual que controla la orientación capilar (Figura 3E), para mover el capilar y colocarlo justo por encima del objetivo (Figura 3B).
- Abra la tapa y empuje suavemente el émbolo hasta que la sección de agarosa que contiene el embrión cuelgue debajo de la parte inferior capilar y esté frente al objetivo (Figura 3C).
- Desactive Localizar capilar y haga clic en el botón Localizar muestra (Figura 3A). Esto cambia la vista de la cámara web de la cámara de muestra al objetivo del microscopio (Figura 3D). Utilice esta vista para ajustar la posición de la muestra con mayor precisión. Desactive Localizar ejemplo (Figura 3A).
- Cambie a la pestaña Adquisición . Marque las casillas de Z-Stack y Time Series.
- En la ventana Parámetros del modo de adquisición , elija la configuración hoja de luz de doble lado y marque las casillas de Fusión de doble lado en línea y Escaneo dinámico.
- En la ventana Canales , elija 488 canales, establezca la potencia del láser en 1 y el tiempo de exposición en 7,5 ms.
- A continuación, haga clic en el botón Continuo para obtener una vista en vivo del embrión. Utilice el panel de control ErgoDrive para ajustar la posición del embrión hasta que el campo ocular esté directamente frente a la cámara. Continúe ajustando las hojas de luz izquierda y derecha en los parámetros canales hasta que el campo ocular esté lo suficientemente enfocado.
- Establezca los parámetros de Z-Stack utilizando el panel de control ErgoDrive para moverse a través del plano Z. Establezca la primera y la última posición Z alrededor de 500 μm más allá de la última señal fluorescente detectable. Esto deja espacio para que el campo ocular permanezca en el marco a medida que el embrión crece a lo largo de la sesión de imágenes de lapso de tiempo. Después de configurar el rango del Z-Stack, haga clic en el botón Óptimo para establecer el tamaño del paso en 0.477 μm, la configuración óptima.
- Ajuste los parámetros de incubación marcando la casilla de la unidad Peltier para mantener la temperatura a 28 °C. En la ventana Series temporales , elija la frecuencia y el intervalo de tiempo para adquirir imágenes. En este protocolo, los parámetros se establecieron en la imagen cada 5 minutos, para un total de 166 intervalos.
- Haga clic en el botón Iniciar experimento . Elija la carpeta para guardar el conjunto de imágenes. Establezca el prefijo de la imagen y presione Guardar para iniciar la imagen.
NOTA: El microscopio ahora se ejecutará a través de cada conjunto de imágenes en el intervalo especificado. - Una vez completada la sesión de imágenes de lapso de tiempo, envíe el escenario a la posición de carga y retire el soporte de muestra capilar. Desmonte el soporte de muestra capilar en el orden inverso al que se armó y use el émbolo para eliminar la muestra y el exceso de agarosa del capilar. Abra la puerta de la cámara. Use la jeringa para extraer el líquido de la cámara de la cámara, desconecte y retire la cámara, luego enjuague con agua y seque al aire.
3. Análisis de imágenes
- Abra el programa de software arivis Vision4D.
- Haga clic en Archivo y, a continuación, elija Importar archivo. Seleccione todos los archivos .czi de la sesión de imágenes de lapso de tiempo y ábralos. La siguiente ventana se abre con las opciones sobre cómo importar los archivos; seleccione Z-stacks como Frames para ordenar las z-stacks en el orden obtenido. Una vez que se han importado los archivos, el software se guarda como un solo archivo .sis. Para especificar la ubicación del archivo que se va a guardar, seleccione la carpeta antes de hacer clic en Importar.
- Después de importar el archivo, arivis ahora está listo para renderizar un video de las imágenes de lapso de tiempo. Haga clic en el cubo del visor 4D en la esquina inferior izquierda y en el icono de la barra de escala (Figura 4D-E). Haga clic en el icono de vídeo para llevar la barra de tareas del guión gráfico a la parte inferior de la pantalla (Figura 4C).
- En la barra de tareas del guión gráfico , elija Agregar secuencia de fotogramas clave (Figura 4F). Especifique la duración del vídeo en segundos, desactive la casilla Crear rotación y marque la casilla Usar progresión de tiempo para incluir los puntos de tiempo específicos en el vídeo. El software muestra estos parámetros a la derecha de la barra de tareas del guión gráfico para cualquier ajuste en cualquier momento. Guarde el guión gráfico para aplicar los mismos parámetros a varios conjuntos de imágenes (Figura 4F).
- Haga clic en Exportar película para guardar un video de la imagen de lapso de tiempo (Figura 4F). Especifique la configuración de exportación de películas, incluidos el nombre y la ubicación del archivo, el formato de vídeo (.mp4), la resolución de vídeo (1.080 p), la velocidad de fotogramas (60 FPS) y la resolución de datos (1.297 x 1.297 x 784). Agregue marcas de tiempo aquí, si lo desea. Una vez establecidos estos parámetros, elija Registro (Figura 4F).
- Los pasos 3.4 y 3.5 se pueden repetir con la modificación del paso 3.4 para crear videos de rotación en puntos de tiempo específicos. Al agregar una secuencia de fotogramas clave al guión gráfico, marque la casilla Crear rotación y desactive Usar progresión de tiempo. A continuación, siga las mismas instrucciones que en el paso 3.5.
- Para representar una imagen de alta resolución en cualquier orientación y en cualquier punto de tiempo individual, seleccione el icono Cámara en el Visor 4D para obtener una imagen de alta resolución (Figura 4C).
- Para crear una canalización para el análisis, elija el icono Flask para acceder al panel Análisis (Figura 4B). En el panel Análisis , haga clic en el menú desplegable Operaciones de análisis . Como ejemplo, el protocolo muestra a continuación la secuencia de operaciones para una canalización de análisis de volumen. Ejecute o deshaga cada paso de la canalización individualmente para ajustar cada parámetro (Tabla 1).
- Haga clic en el triángulo azul en la parte superior de la tubería para permitir que la tubería se ejecute.
NOTA: Esto tomará algún tiempo dependiendo de la velocidad de la computadora. Una vez que se ha optimizado la canalización, la canalización se puede exportar e importar a arivis con facilidad y aplicarse a múltiples conjuntos de datos en un análisis por lotes. - Para acceder al análisis por lotes, haga clic en Análisis por lotes en la pestaña Análisis .
- Después de que se ejecuta la tubería, se abre una ventana con todos los objetos encontrados. Acceda a esto manualmente a través del icono Tabla (Figura 4B). En la parte superior de esta ventana, haga clic en el cuadro columnas de características para obtener una lista de características que pueden proporcionar información sobre el objeto de interés. Para el análisis del volumen del campo ocular, estas características incluyen Área de superficie, Volumen (Volumen, VoxelCount), Intensidades # 1 (Media), Atributos (Id, Tipo) y Punto de tiempo (Primero). Haga clic en Exportar para exportar los datos a una hoja de cálculo.
Representative Results
El conjunto de datos que se muestra aquí se obtuvo una imagen utilizando el protocolo descrito anteriormente. Se tomó una imagen de un embrión Tg(Rx3:GFP) a partir de la etapa de 1 somita (ss) a 24 hpf, un período de tiempo total de 14 h, con las imágenes adquiridas a intervalos de 5 minutos. Las imágenes de lapso de tiempo permiten una fácil selección y comparación de cualquier punto de tiempo que muestre un fenotipo de interés. La Figura 5 muestra un conjunto de imágenes de alta resolución que se representaron desde el punto de vista dorsal en puntos de tiempo de desarrollo seleccionados. La canalización ejecutada en arivis Vision4D construye una máscara que representa el ojo en desarrollo identificado por la señal fluorescente. En la Figura 5 y los Videos 1-6, la máscara se puede visualizar en comparación con la representación fluorescente del ojo en desarrollo. Además, la Tabla 2 muestra los datos de volumen del ojo en desarrollo en cada punto de imagen. Este conjunto de datos incluye el nombre del segmento, id, volumen tanto en μm3 como en el recuento de vóxeles, la intensidad media de fluorescencia del objeto, el punto de tiempo en el que se identificó el objeto y el área de superficie del objeto en μm2. Es importante tener en cuenta que cuando el campo ocular se separa en dos vesículas ópticas (a partir del punto de tiempo 64), queda una tercera región que es Rx3:GFP positiva en el cerebro anterior, lo que contribuirá al hipotálamo 38,39,40 (Figura 5D-M). Esto aparece en los datos de volumen representados en la Tabla 2 (resaltados en amarillo a partir del punto de tiempo 71) y se puede separar fácilmente de las vesículas ópticas, ya que es mucho más pequeño en volumen que cualquiera de las vesículas ópticas.
Figura 1: Preparación de la muestra. (A) Posicionamiento de embriones en un capilar de vidrio. La flecha apunta a un embrión en el capilar. (B) Partes capilares y capilares de vidrio. (C) Soporte capilar parcialmente ensamblado. (D) Soporte capilar completamente ensamblado. (E) Cámara de montaje de lámina ligera. La flecha indicaba la línea blanca utilizada para orientar el soporte capilar. (F) Soporte capilar correctamente montado en la hoja de luz. La flecha muestra las líneas blancas coincidentes, lo que indica la orientación adecuada del soporte capilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de imágenes de Lightsheet. (A) Centralita para encender Lightsheet, la computadora y la unidad de incubación. Los números indican el orden de las operaciones. (B) Cámara objetivo de hoja ligera. (C) Cámara de imágenes. (D) Jeringa y tubo que se conectarán a la cámara de imágenes. (E) La cámara de imagen correctamente colocada dentro de la cámara objetivo con todos los tubos conectados a los puertos apropiados a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Posicionamiento de la muestra. (A) Localice los botones Capilar y Localice la muestra en el software Zen como lo indican las flechas. (B) La posición en el capilar de vidrio. La flecha indica el borde del capilar de vidrio colocado justo encima de la lente del objetivo. (C) La suspensión embrionaria más allá del capilar de vidrio. La flecha indicaba el embrión suspendido en agarosa debajo del capilar de vidrio frente a la lente del objetivo. (D) Visión del embrión a través del objetivo. (E) El panel de control ErgoDrive. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Iconos importantes para navegar por arivis Vison4D. Cada panel tiene la función de icono identificada de izquierda a derecha. (a) Abrir, Guardar, Cerrar. (B) Panel de análisis, Mostrar tabla de objetos, Abrir editor de pistas. (C) Copie el contenido actual del visor como una imagen en el portapapeles, Alterne marcadores, Cree una imagen de alta resolución para la vista actual, Alterne guión gráfico. (D) Mostrar cuadro de medida, Mostrar cruz de orientación, Mostrar leyenda, Mostrar barra de escala. (E) Mostrar como visor 2D, Mostrar como visor de galería, Mostrar como visor 4D, Mostrar como visor de información, Mostrar como visor de proyección. F) Actualizar todos los fotogramas clave, Agregar fotograma clave, Agregar secuencia de fotogramas clave, Insertar fotograma clave, Eliminar todos los fotogramas clave, Exportar película, Cargar guión gráfico, Guardar guión gráfico, Ajustar el tiempo objetivo de toda la película, Primer fotograma clave, Reproducir, Pausa, Detener, Último fotograma clave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de alta resolución y máscaras de campo ocular. (A-M) Conjunto de imágenes de alta resolución que se representaron desde los puntos de vista dorsales; (A'-M') las máscaras de campo ocular para cada punto de tiempo correspondiente. Cada conjunto de imágenes se anota por el momento en que se adquirió desde el inicio de la imagen y la etapa de desarrollo correspondiente en la etapa de somita (ss) o en las horas posteriores a la fertilización (hpf). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Video de lapso de tiempo del embrión de pez cebra Tg (rx3: GFP) de 1 ss-24 hpf. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Video 2: Video de lapso de tiempo del embrión de pez cebra Tg(rx3: GFP) de 1 ss-24 hpf con el campo ocular identificado por la tubería arivis Vision4D. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Video 3: Rotación de 360° de un embrión de pez cebra Tg(rx3:GFP) a 1 ss. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Video 4: Rotación de 360° de una máscara de campo ocular embrionario de pez cebra Tg(rx3:GFP) a 1 ss. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Video 5: Rotación de 360° de un embrión de pez cebra Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Video 6: Rotación de 360° de una máscara de campo ocular embrionario de pez cebra Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Haga clic derecho aquí para descargar el video (guarde el enlace como).
Tabla 1: canalización arivis Vision4D para el análisis de volumen del campo ocular en desarrollo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Volumen y superficie del campo ocular en desarrollo adquirido por arivis Vision4D. Las filas pertenecientes al hipotálamo presuntivo están resaltadas en amarillo para distinguirlas de las vesículas ópticas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discussion
En este protocolo, se utilizó el microscopio Lightsheet para realizar imágenes de lapso de tiempo del desarrollo ocular y se analizaron los datos resultantes. El conjunto de datos resultante puede proporcionar información valiosa sobre el proceso de morfogénesis ocular, así como perturbaciones de este proceso como resultado de una mutación genética, exposición a agentes farmacológicos u otros parámetros experimentales. Aquí el protocolo demostró cómo se puede obtener este conjunto de datos y proporcionó un ejemplo de cómo analizar el volumen del campo ocular a través del desarrollo temprano. Se encontró que estos datos eran reproducibles y consistentes (menos del 10% de variación en el volumen) en todas las réplicas biológicas, teniendo en cuenta que las ligeras diferencias en la estadificación embrionaria antes del inicio de la carrera pueden conducir a alguna variación en las mediciones del volumen final.
Se debe tener cuidado en el posicionamiento inicial del embrión en el capilar y en el posicionamiento del embrión incrustado frente al objetivo. La orientación juega un papel importante en evitar que el embrión crezca y se mueva fuera de la vista del objetivo. Los embriones tienen una forma redonda a 10 hpf, lo que hace que sea difícil garantizar una orientación específica en el capilar. Idealmente, el cuerpo del embrión se colocará lateralmente en el capilar. La carga de múltiples embriones en el capilar aumentará la probabilidad de tener un embrión bien posicionado.
En este procedimiento, el embrión se incrusta en agarosa para suspenderlo frente a los objetivos de imagen e iluminación. Elegir la concentración correcta de la agarosa a baja temperatura de fusión es fundamental. Una concentración demasiado alta constreñirá el embrión e impedirá que se desarrolle adecuadamente; una concentración demasiado baja dará lugar a que la agarosa se desmorone y no retenga el embrión. La concentración óptima para este protocolo es una concentración final de 1% de agarosa a baja temperatura de fusión30,31.
Otro elemento que debe tenerse en cuenta es el nivel de saturación. A medida que el campo ocular crece y se diferencia, la fuerza de la señal Rx3: GFP se intensifica. Por lo tanto, al establecer los parámetros iniciales de imagen, la exposición y la potencia del láser deben reducirse para subsaturar la imagen. Esto evitará que la imagen se sobresature a medida que el Rx3: GFP se vuelve más brillante con el tiempo. Se pueden hacer modificaciones para corregir la subsaturación en el procesamiento de imágenes, pero la sobresaturación no se puede corregir después de que se hayan adquirido las imágenes.
Hay algunas modificaciones adicionales que se pueden hacer a este protocolo que pueden ser ventajosas para algunos proyectos que no se describen en este documento. Por ejemplo, es posible configurar la imagen Multiview en la configuración de adquisición de imágenes. Este parámetro permitiría que múltiples embriones en diferentes posiciones a lo largo del eje y sean fotografiados secuencialmente en cada intervalo de tiempo. Al tiempo que añade complejidad al conjunto de datos, aumentaría la tasa de recopilación de datos. Además, en términos de procesamiento de imágenes, es posible cuantificar el campo ocular por otros parámetros. Aquí, describimos cómo cuantificar los datos en términos del volumen del campo ocular. Alternativamente, se podría hacer una tubería para cuantificar y rastrear células individuales o determinar la tasa de evaginación de vesículas ópticas.
Como se mencionó anteriormente, tanto la microscopía confocal como la microscopía lightsheet se han utilizado para realizar estudios de imágenes de lapso de tiempo del pez cebra. Lightsheet fue elegido específicamente para este proyecto debido a su capacidad superior para obtener imágenes a través de una muestra gruesa (>1 mm), porque está equipada con una unidad de incubación para mantener un ambiente de temperatura ideal para el embrión de pez cebra, y porque su capacidad para obtener imágenes a un ritmo más rápido que la microscopía confocal permite la adquisición de imágenes en los numerosos intervalos de tiempo requeridos para este protocolo sin daños acompañantes o fotoblanqueo del embrión21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. También es importante tener en cuenta que el microscopio Lightsheet está equipado para obtener imágenes de la señal de múltiples fluoróforos. El microscopio Lightsheet utilizado en este estudio tiene líneas de excitación láser de estado sólido a 405, 445, 488, 515, 561 y 638 nm, lo que podría ser útil para obtener imágenes de embriones transgénicos que expresan más de un transgén reportero fluorescente.
Si bien este protocolo detalla las instrucciones para el análisis de adquisición de imágenes utilizando específicamente el sistema de microscopio de iluminación dual Lightsheet Z.1 y el software de análisis arivis Vision4D, hay otros microscopios Lightsheet disponibles comercialmente fabricados por Leica, Olympus y Luxendo, así como software de análisis de imágenes de Imaris, que podrían usarse para lograr resultados similares. La selección de equipos y software para este protocolo estuvo determinada por la disponibilidad en nuestra institución.
En resumen, se anticipa que este protocolo proporcionará un punto de partida sólido para la realización de imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopía Lightsheet, y para la cuantificación de imágenes del desarrollo ocular temprano en peces cebra.
Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio S10OD020067 y por el premio de los NIH R01EY021769 (a A.C.M.). Estamos agradecidos por la asistencia de Doug Harrison y Jim Begley en el Arts & Sciences Imaging Center de la Universidad de Kentucky, y a Lucas Vieira Francisco y Evelyn M. Turnbaugh por el cuidado experto del pez cebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
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