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Developmental Biology

वयस्क माउस स्वाद स्टेम सेल से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी और संस्कृति

Published: April 5, 2021 doi: 10.3791/62300
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology and the Rocky Mountain Taste and Smell Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के पीछे के स्वाद पपीला से अलग स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने और प्रसंस्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

स्वाद की भावना जीभ पर स्वाद कलियों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना होते हैं। यह नित्य कारोबार स्थानीय जनक कोशिकाओं द्वारा संचालित होता है और चिकित्सा उपचारों की एक भीड़ द्वारा व्यवधान से ग्रस्त स्वाद कार्य प्रदान करता है, जो बदले में जीवन की गुणवत्ता को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। इस प्रकार, दवा उपचार के संदर्भ में इस प्रक्रिया का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद जनक समारोह और टीआरसी उत्पादन कैसे प्रभावित होते हैं। नैतिक चिंताओं और मानव स्वाद ऊतक की सीमित उपलब्धता को देखते हुए, माउस मॉडल, जो मनुष्यों के समान एक स्वाद प्रणाली है, आमतौर पर उपयोग किया जाता है । वीवो विधियों की तुलना में, जो समय लेने वाले, महंगे हैं, और उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, मुरीन भाषाई ऑर्गेनॉइड कई प्रतिकृति और कम चूहों के साथ तेजी से चलाने के लिए प्रयोगों को सक्षम कर सकते हैं। यहां, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है और वयस्क चूहों के परिष्कार पैपिला (सीवीपी) से अलग स्वाद जनक कोशिकाओं से स्वाद ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक मानकीकृत विधि प्रस्तुत की गई है। सीवीपी एक्सप्रेस एलजीआर 5 में प्रोजेनिटर कोशिकाओं का स्वाद लें और एलजीआर 5ईजीएफपी-आईईईएस-क्रेर्ट2 एलील ले जाने वाले चूहों से ईजीएफपी फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है। सॉर्ट कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल-आधारित 3 डी संस्कृति प्रणाली पर चढ़ाया जाता है और 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। ऑर्गेनॉइड प्रसार के माध्यम से संस्कृति अवधि के पहले 6 दिनों के लिए विस्तार करते हैं और फिर एक भेदभाव चरण में प्रवेश करते हैं, जिसके दौरान वे गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ सभी तीन स्वाद सेल प्रकार उत्पन्न करते हैं। ऑर्गेनॉइड को आरएनए अभिव्यक्ति और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए विकास प्रक्रिया के दौरान 12 दिन या किसी भी समय परिपक्वता पर काटा जा सकता है। वयस्क स्टेम कोशिकाओं से भाषाई ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए संस्कृति विधियों का मानकीकरण प्रजनन क्षमता में सुधार करेगा और स्वाद की शिथिलता का सामना करने वाले रोगियों की मदद करने के लिए लड़ाई में एक शक्तिशाली दवा स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड को आगे बढ़ाएगा।

Introduction

कृंतकों में, भाषाई स्वाद कलियों को फंगसफॉर्म पैपिली में रखा जाता है जो पूर्वकाल में वितरित होता है, द्विपक्षीय पत्ते papillae पीछे, साथ ही जीभ1के पोस्टरोडर्सल मिडलाइन पर एक एकल परिधीय पैपिला (सीवीपी) । प्रत्येक स्वाद कली 50-100 अल्पकालिक, तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना है, जिसमें टाइप आई ग्लियल जैसी समर्थन कोशिकाएं, प्रकार II कोशिकाएं शामिल हैं जो मीठे, कड़वे और उमामी का पता लगाती हैं, और टाइप III कोशिकाएं जो खट्टे2,3,4का पता लगाती हैं। माउस सीवीपी में, बेसल लैमिना के साथ एलजीआर 5+ स्टेम सेल सभी टीआरसी प्रकारों के साथ-साथ गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं5। स्वाद वंश का नवीनीकरण करते समय, एलजीआर 5 बेटी कोशिकाओं को पहले पोस्ट-मिटोटिक स्वाद अग्रदूत कोशिकाओं (टाइप IV कोशिकाओं) के रूप में निर्दिष्ट किया जाता है जो स्वाद की कली में प्रवेश करते हैं और तीन टीआरसी प्रकार6में से किसी में अंतर करने में सक्षम हैं। टीआरसी का तेजी से कारोबार चिकित्सा उपचारों द्वारा व्यवधान के लिए अतिसंवेदनशील स्वाद प्रणाली को प्रस्तुत करता है, जिसमें विकिरण और कुछदवा उपचार7,8,9,10, 11,12,13शामिल हैं। इस प्रकार, स्वाद स्टेम सेल विनियमन और टीआरसी भेदभाव के संदर्भ में स्वाद प्रणाली का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद की शिथिलता को कम या कैसे रोका जाए।

चूहे स्वाद विज्ञान में वीवो अध्ययन के लिए एक पारंपरिक मॉडल हैं क्योंकि उनके पास मनुष्यों के समान ही स्वाद प्रणाली है14,15,16. हालांकि, चूहों उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए आदर्श नहीं हैं, क्योंकि वे काम करने के लिए बनाए रखने और समय लेने वाले महंगे हैं। इसे दूर करने के लिए, हाल के वर्षों में इन विट्रो ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों का विकास किया गया है। स्वाद ऑर्गेनॉइड देशी सीवीपी ऊतक से उत्पन्न किया जा सकता है, एक प्रक्रिया जिसमें ऑर्गेनॉइड अलग माउस सीवीपी एपिथेलियम सुसंस्कृत पूर्व वीवो17से बंद हो जाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड वीवो स्वाद प्रणाली के अनुरूप एक बहुस्तरीय एपिथेलियम प्रदर्शित करते हैं। ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने का एक अधिक कुशल तरीका जिसे पूर्व वीवो सीवीपी संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है , रेन एटअल द्वारा 201418में विकसित किया गया था। अनुकूल तरीकों और संस्कृति मीडिया पहले आंतों के ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए विकसित, वे माउस सीवीपी से एकल Lgr5-GFP+ जनक कोशिकाओं को अलग और उन्हें मैट्रिक्स जेल19में चढ़ाया । इन एकल कोशिकाओं ने भाषाई ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जो संस्कृति के पहले 6 दिनों के दौरान पैदा होते हैं, 8 दिन के आसपास अंतर करना शुरू कर देते हैं, और संस्कृति अवधि के अंत तक गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाएं और सभी तीन टीआरसी प्रकार18,20होते हैं। आज तक, भाषाई ऑर्गेनॉइड मॉडल प्रणाली का उपयोग करने वाले कई अध्ययन17,18,20,21, 22प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि, इन ऑर्गेनॉइड को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाले तरीके और संस्कृति की स्थिति प्रकाशनों(अनुपूरक तालिका 1)में भिन्न होती है। इस प्रकार, इन तरीकों को वयस्क माउस सीवीपी के एलजीआर 5+ जनक से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए एक विस्तृत मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए यहां समायोजित और अनुकूलित किया गया है।

भाषाई ऑर्गेनॉइड स्वाद सेल विकास और नवीकरण ड्राइविंग सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करते हैं। चूंकि भाषाई ऑर्गेनॉइड के अनुप्रयोगों का विस्तार होता है और अधिक प्रयोगशालाएं इन विट्रो ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग करने की ओर बढ़ती हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र प्रजनन क्षमता में सुधार के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित करने और अपनाने का प्रयास करे। स्वाद विज्ञान के भीतर एक मानक उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड की स्थापना उच्च थ्रूपुट अध्ययनों को सक्षम करेगी जो अलग-अलग चिढ़ाती है कि एकल स्टेम कोशिकाएं वयस्क स्वाद प्रणाली की विभेदित कोशिकाओं को कैसे उत्पन्न करती हैं। इसके अतिरिक्त, भाषाई ऑर्गेनॉइड को स्वाद होमोस्टेसिस पर संभावित प्रभावों के लिए तेजी से स्क्रीन दवाओं के लिए नियोजित किया जा सकता है, जिसकी जांच पशु मॉडलों में अधिक अच्छी तरह से की जा सकती है। यह दृष्टिकोण अंततः उन उपचारों को ईजाद करने के प्रयासों में वृद्धि करेगा जो भविष्य के दवा प्राप्तकर्ताओं के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार करते हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, पशु कल्याण अधिनियम, और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में एक AAALAC-मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया गया, और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा कोलोराडो Anschutz चिकित्सा परिसर में मंजूरी दे दी गई । Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल चूहों जैक्सन प्रयोगशाला, स्टॉक नंबर 008875 से कर रहे हैं ।

नोट: प्रोटोकॉल की सुचारू और समय पर प्रगति सुनिश्चित करने के लिए शुरुआत से पहले निम्नलिखित चरणों को पूरा किया जाना चाहिए: 37 डिग्री सेल्सियस तक पानी स्नान सेट करें, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र सेट, इंजेक्शन और 10 मिलीग्राम/mL Dispase, कोलेजनेस, और इलास्टेज स्टॉक समाधान (सामग्री की तालिकादेखें), से मैट्रिक्स जेल को हटाने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (~ ७५० μL एक ४८-अच्छी तरह से थाली के लिए आवश्यक) और के लिए बर्फ में शीशी जलमग्न द्वारा विगलन द्वारा कम से कम 3-4 घंटे, बिना पतला एफबीएस में प्री-कोट माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब कम से कम 30 मिनट (ऊतक संग्रह के लिए दो 2 एमएल ट्यूब, अलग कोशिकाओं के लिए दो 1.5 एमएल ट्यूब, और सेल सॉर्टर से एकल कोशिकाओं के संग्रह के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब; उपयोग से पहले अतिरिक्त एफबीएस हटा दें)।

1. सीवीपी एपिथेलियम का अलगाव

नोट: एक पूर्ण 48-अच्छी प्लेट के लिए पर्याप्त एलजीआर 5+ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, एक ही ट्यूब और प्रक्रिया में एक साथ तीन Lgr5-EGFP CVPs इकट्ठा करें। महत्वपूर्ण बात, फसल और एक अलग ट्यूब में समानांतर में कम से कम एक जंगली प्रकार के कूड़े के सीवीपी की प्रक्रिया और FACS मापदंडों सेट करने के लिए एक गेटिंग नियंत्रण के रूप में इसका उपयोग (प्रतिनिधि परिणामदेखें) ।

  1. आईएसीयूसी विनियमों के अनुसार सीओ2 श्वासावरोध के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें, इसके बाद द्विपक्षीय थोराकोटॉमी, ग्रीवा अव्यवस्था, डेपुटेशन या एक्साइनिटेशन जैसी एक अनुमोदित माध्यमिक विधि।
  2. गालों को काटने और जबड़े को तोड़ने के लिए बड़े बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। जीभ को उठाएं और मौखिक गुहा के फर्श से जीभ को अलग करने के लिए भाषाई फ्रेनलम को काट लें। जीभ को काटकर बाँझ बर्फ-ठंडे डल्बेको के फॉस्फेट-बफर खारा (dPBS) में सीए2 + और एमजी2 +के साथ इकट्ठा करें ।
  3. एक रेजर ब्लेड(चित्रा 1A,धराशायी रेखा)के साथ इंटरमोलर एमिनेंस के बस पूर्वकाल को काटकर पूर्वकाल की जीभ को हटा दें और त्यागें। पीछे की जीभ से किसी भी बाल और अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करें।
  4. इंजेक्शन एंजाइम समाधान के 200-300 माइक्रोन के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें (अंतिम एकाग्रता: 2 मिलीग्राम/एमएल टाइप-आई कोलेजनेस और 5 मिलीग्राम/एमएल डिस्पास द्वितीय सीए2 + //एमजी2 +युक्त dPBS में, 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से पतला) और सीवीपी(चित्रा 1B,चित्रा 1B, ब्लैक बॉक्स)। एपिथेलियम और अंतर्निहित ऊतकों (लैमिना प्रोप्रिया, मांसपेशी) के बीच सीवीपी के पार्श्व किनारों पर एंजाइम समाधान इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के रूप में जीभ से धीरे-धीरे और लगातार सिरिंज वापस ले लें।
  5. ठीक 33 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बाँझ Ca2+/ /
  6. एपिथेलियम में द्विपक्षीय रूप से छोटी कटौती करें और अतिरिक्त ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करके सीवीपी के लिए सिर्फ पूर्वकाल करें, और इसे ठीक संदंश के साथ उठाकर एपिथेलियम को धीरे-धीरे छील दें। एक बार जब ट्रेंच एपिथेलियम अंतर्निहित कनेक्टिव ऊतक से मुक्त हो जाता है, तो इसे एफबीएस के साथ पूर्व-लेपित एक खाली 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। सीवीपी एपिथेलियम(चित्रा 1C,D)को अलग करने से पहले या बाद में एपिथेलियल ट्रिमिंग करें।

2. सीवीपी एपिथेलियम का विघटन

नोट: सीवीपी एपिथेलियम और चढ़ाना के वियोजन चित्र 2में रेखांकन का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

  1. dissociation एंजाइम कॉकटेल जोड़ें (अंतिम एकाग्रता: 2 मिलीग्राम/mL प्रकार-मैं Collagenaase, 2 मिलीग्राम/mL Elastase, और 5 मिलीग्राम/mL Dispase द्वितीय सीए2 +//एमजी2 +में-युक्त DPBS, 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से पतला) खुली CVP epithelia (२०० μl प्रति सीवीपी) युक्त ट्यूबों के लिए जोड़ें । 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट। भंवर संक्षेप में हर 15 मिनट ।
    नोट: एंजाइम कॉकटेल इनक्यूबेशन के अंतिम 15 मिनट के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में Prewarm 0.25% ट्रिप्पसिन-EDTA।
  2. इनक्यूबेशन बाद, भंवर (तीन दालें) फिर 1 मिनट के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ट्रिट करें। ऊतक के टुकड़ों के बसने के बाद, जीनोटाइप के अनुरूप नए एफबीएस-लेपित 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में अलग कोशिकाओं के पहले संग्रह वाले सुपरनैक्टेंट को पिपेट करें। शेष ऊतक टुकड़ों को आगे की प्रक्रिया के रूप में कदम 2.3 में वर्णित है। नीचे।
    1. 370 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सुपरनेट को पैलेट से पेलेट कोशिकाओं में स्पिन करें।
    2. परिणामी सुपरनाट को हटा दें और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) बफर (1 m EDTA, 25 mM HEPES (पीएच 7.0) और सीए2 + /एमजी 2 +-मुक्तपीबीएस (50 माइक्रोन प्रति सीवीपी) में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। बर्फ पर स्टोर करें।
  3. चरण 2.2.1 और 2.2.2 को ले जाते समय, शेष ऊतक टुकड़ों को चरण 2.2 से अलग करें, जो मूल 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पूर्व-गर्म 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए (200 माइक्रोल पर सीवीपी) जोड़कर जोड़ते हैं। भंवर संक्षेप में हर 10 मिनट ।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, टिश्यू पीस (तीन दालों) वाली ट्यूब को भंवर करें फिर 1 मिनट के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ट्रिट करें। ऊतक के टुकड़े बसने के बाद, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में सुपरनैट्ट को पाइपेट करें जिसमें चरण 2.2.2 से कोशिकाएं होती हैं। शेष ऊतक टुकड़ों वाली ट्यूबों को त्यागें।
    1. 370 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अलग कोशिकाओं के साथ ट्यूबों को स्पिन करें।
    2. FACS बफर (सीवीपी प्रति 100 μL) में सुपरनैंट और रिसिम्प सेल छर्रों को हटा दें। बर्फ पर स्टोर करें।
  5. कोशिकाओं को 30 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से पास करें और FACS से पहले सेल मिश्रण में DAPI (λउत्सर्जन = 450 एनएम) जोड़ें। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल (λउत्तेजन = 488 एनएम; λउत्सर्जन = 530 एनएम) का उपयोग करके FACS के माध्यम से एलजीआर 5-जीएफपी+ कोशिकाओं को अलग करें। एक ताजा FBS-लेपित १.५ मिलीएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में १०० माइक्रोम नोजल का उपयोग करके कोशिकाओं को सॉर्ट करें जिसमें सीए2 + /एमजी 2 +मुफ्त dPBS के३०० माइक्रोएल युक्त हैं । चढ़ाना तक बर्फ पर कोशिकाओं को रखें।

3. Lgr5-EGFP कोशिकाओं की चढ़ाना

  1. प्रवाह साइटोमीटर से प्राप्त एलजीआर 5+ सेल निलंबन की मात्रा निर्धारित करें।
  2. सॉर्टर से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, प्रति μL कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। फिर, चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित (हम एक ४८ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से २०० कोशिकाओं का उपयोग करें) और एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में निलंबित कोशिकाओं की कुल मात्रा हस्तांतरण ।
  3. 370 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूब को पैलेट कोशिकाओं (गोली दिखाई नहीं दे सकता है) पर स्पिन करें। सुपरनेट निकालें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  4. धीरे-धीरे मैट्रिक्स जेल की उचित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से रीस करें (48-अच्छी प्लेटों के लिए 15 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से); मैट्रिक्स जेल में कोशिकाओं को अच्छी तरह से वितरित करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्रत्येक कुएं के केंद्र में मैट्रिक्स जेल/सेल मिश्रण के 15 माइक्रोन रखें। मैट्रिक्स जेल को जेलिंग से रोकने के लिए चढ़ाना के दौरान 50 एमएल शंकु नली में बर्फ पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें। कुओं में कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए हर तीन कुओं को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके चढ़ाना भर में मैट्रिक्स जेल/सेल मिश्रण मिश्रण जारी रखें ।
  5. मैट्रिक्स जेलिंग की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,~ 95% आर्द्रता) में प्लेट रखें। फिर, प्रत्येक कुएं में कमरे के तापमान WENRAS + Y27632 मीडिया के 300 μL जोड़ें और इनक्यूबेटर के लिए प्लेट वापस।

4. ऑर्गेनॉइड रखरखाव

नोट: ऑर्गेनॉइड पारंपरिक ऑर्गेनॉइड मीडिया (वेनआर) में उगाए जाते हैं जिसमें रीकॉम्बिनेंट ईजीएफ और 50% वातानुकूलित मीडिया होते हैं जिनमें Wnt3a, नोगिन और आर-स्पॉन्डिन23शामिल हैं। ड्रग्स A8301 और SB202190 संस्कृति अवधि के पहले 6 दिनों के लिए जोड़ा जाता है विकास (WENRAS मीडिया)(चित्रा 5)का अनुकूलन, तो भेदभाव (WENR मीडिया)20को बढ़ावा देने के लिए हटा दिया । Y27632 अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए संस्कृति के पहले 2 दिनों के लिए जोड़ा जाता है। संस्कृति समय रेखा के सापेक्ष मीडिया की स्थिति को चित्र 4में प्रस्तुत किया गया है ।

  1. चढ़ाना के दो दिन बाद, 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं से वेनरास + Y27632 मीडिया को हटा दें, जिससे कोई क्रॉस-संदूषण सुनिश्चित न हो। मैट्रिक्स जेल को बाधित नहीं करने के लिए कुएं के किनारे नीचे WENRAS मीडिया के 300 μL जोड़ें। थाली को इनक्यूबेटर में लौटाएं।
  2. संस्कृति चरण(चित्रा 4)के लिए उपयुक्त मीडिया का उपयोग करके, हर 2 दिनों में मीडिया को बदलें। 12 दिन तक ऑर्गेनॉइड बनाए रखें, जब ऑर्गेनॉइड फसल के लिए तैयार हों।

5. आरएनए प्रोसेसिंग

  1. आरएनए के लिए ऑर्गेनॉइड की कटाई
    1. मैट्रिक्स जेल को विकृत करने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर 48-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
    2. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, ऑर्गेनॉइड मीडिया को खींचें; फिर, जैसा कि मीडिया को अच्छी तरह से वापस कर दिया जाता है, स्क्रैच करने के लिए पिपेट की नोक का उपयोग करें और मैट्रिक्स जेल को आगे तोड़ें। सामग्री को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, एक ट्यूब में तीन कुओं की सामग्री पूलिंग करें। कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
    3. किसी भी ऑर्गेनॉइड को हटाने के बिना जितना संभव हो उतना मीडिया सुपरनेट निकालें; फिर, कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए फिर से ट्यूबों को स्पिन करें।
    4. शेष मीडिया को हटा दें और ऑर्गेनॉइड को 350μl lysis बफर + β-मर्केप्टो इथेनॉल (एमई) (10 माइक्रोन एमे प्रति 1 मिलियन प्रति 1 मिलियन) में फिर से खर्च करें। तत्काल आरएनए निष्कर्षण या स्टोर के लिए बर्फ पर नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण
    1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से आरएनए मात्रा को मापें। सीडीएनए सिंथेसिस किट का उपयोग करके रिवर्स-टाइप आरएनए।
    2. 200 एनएम प्री-मान्य फॉरवर्ड एंड रिवर्स प्राइमर(टेबल 1)और फ्लोरोसेंट पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ 5 एनजी आरएनए के बराबर सीडीएनए मिलाएं। क्यूआरटी-पीसीआर रिएक्शन को 40 चक्रों के लिए चलाएं: 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, फिर 60 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।

6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. ऑर्गेनॉइड की कटाई और फिक्सिंग
    1. मैट्रिक्स जेल को ढीला करने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर 48-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
    2. ऑर्गेनॉइड मीडिया को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 400 माइक्रोन आइस-कोल्ड पीबीएस जोड़ें। फिर, पीबीएस को हटा दें और प्रत्येक कुएं में बर्फ-कोल्ड सेल रिकवरी समाधान के 400 माइक्रोन जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे रॉक ।
    3. पीबीएस में 1% बीएसए के साथ 1 एमएल पिपेट टिप कोट करें, और मैट्रिक्स जेल को तोड़ने के लिए अच्छी तरह से ऊपर और नीचे की सामग्री को धीरे-धीरे पिपेट करें। ऑर्गेनॉइड को बर्फ पर रखे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. प्रत्येक को 300 माइक्रोन पीबीएस + 1% बीएसए के साथ कुल्लाएं और किसी भी शेष ऑर्गेनॉइड को संबंधित ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब से सेल रिकवरी सॉल्यूशन/पीबीएस + बीएसए को हटा दें। बर्फ के 400 μL जोड़ें ठंड PBS, तो एक और बर्फ ठंडा PBS कुल्ला के साथ दोहराने।
    5. पीबीएस निकालें और 300 माइक्रोन बर्फ-ठंड 4% पीएफए (0.1 एम पीबी में) के साथ ऑर्गेनॉइड को 20 मिनट के लिए ठीक करें, कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करें। पीएफए निकालें और 400 माइक्रोन आइस-कोल्ड पीबीएस के साथ ऑर्गेनॉइड कुल्ला।
    6. पीबीएस निकालें; फिर, 400 μL PBS + 1% बीएसए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. 500 माइक्रोन पीबीएस + 1% बीएसए में ऑर्गेनॉइड कुल्ला। फिर, ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (5% सामान्य बकरी या गधे सीरम, 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन, 0.3% ट्राइटन एक्स 100 इन 1x पीबीएस पीएच 7.3) में ऑर्गेनॉइड को 2 घंटे के लिए, कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे कमाल करते हैं।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को अवरुद्ध करने में पतला) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 रातों के लिए धीरे से रॉक करें।
    3. 500 माइक्रोन पीबीएस + 0.2% ट्राइटन के साथ 1 एच के लिए ऑर्गेनॉइड 4x धोएं, कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे कमाल करें। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (समाधान को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी) और रात भर रॉक ऑर्गेनॉइड जोड़ें, प्रकाश से संरक्षित, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. 500 माइक्रोन पीबीएस + 0.2% ट्राइटन के साथ 1 एच के लिए ऑर्गेनॉइड 3x धोएं, जो कमरे के तापमान पर हल्के और कमाल से सुरक्षित हैं। DAPI के साथ इनक्यूबेट 20 मिनट के लिए 0.1 M पीबी में 1:10,000 पतला, कमाल और कमरे के तापमान पर कवर किया।
    5. ऑर्गेनॉइड को 0.1 मीटर पीबी के साथ 20 मिनट के लिए 3x धोएं, धीरे-धीरे कमाल करें और कमरे के तापमान पर कवर करें।
  3. उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए ऑर्गेनॉइड की स्लाइड बढ़ती है।
    नोट: स्लाइड बढ़ते प्रक्रिया के कदम-दर-कदम तस्वीरें चित्रा 7में दिखाई गई हैं ।
    1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गैर विषैले मॉडलिंग मिट्टी के ~1 मिमी मोटी 22 x 22 मिमी वर्ग परिधि बनाएं।
    2. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब से 0.1 एम पीबी निकालें, और धीरे-धीरे पसंद के 100 माइक्रोल बढ़ते माध्यम में ऑर्गेनॉइड को फिर से ढिंढा करें; फिर, मिट्टी वर्ग के केंद्र में स्थानांतरित करें।
    3. जब तक बढ़ते माध्यम लगभग शीर्ष करने के लिए है मिट्टी वर्ग भरें। फिर, मिट्टी पर 22 x 22 मिमी वर्ग कवरलिप रखें और सील करने के लिए कवरस्लिप के किनारों पर मजबूती से दबाएं। इसे निर्माता के निर्देशों (यहां, 1-2 दिनों के लिए कमरे का तापमान) के अनुसार इलाज करने दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

चूहों में एक सीवीपी होता है, जो जीभ पर पीछे स्थित होता है, जिसमें से एलजीआर 5+ स्टेम कोशिकाओं को अलग किया जासकता है (चित्रा 1A,ब्लैक बॉक्स)। सीवीपी(चित्रा 1 B)के तहत और उसके आसपास एंजाइम समाधान के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप संयोजी ऊतक के एपिथेलियम और पाचन की मामूली सूजन होती है। 33 मिनट इनक्यूबेशन के बाद पर्याप्त पाचन प्राप्त किया जाता है, जो अंतर्निहित ऊतक से सीवीपी एपिथेलियम के आसान पृथक्करण की अनुमति देता है। सीवीपी एपिथेलियम को छीलने का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए सीवीपी से पर्याप्त दूरी पर कटौती की जानी चाहिए कि खाइयों को बाधित या क्षतिग्रस्त न किया जाए(चित्रा 1C)। यह सीवीपी को नुकसान पहुंचाए बिना संदंश का उपयोग करके एपिथेलियम को पकड़ने में भी सक्षम बनाता है। सीवीपी के आसपास के एपिथेलियम को ट्रिम करने से गैर-लक्षित कोशिकाओं को हटा दिया जाता है और ऊतक द्रव्यमान को कम करके निम्नलिखित चरणों की दक्षता बढ़जाती है (चित्र 1 डी)। यह जांचना महत्वपूर्ण है कि माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सीवीपी एपिथेलियम जोड़ने से पहले दो खाइयां(चित्रा 1C,काले तीर)मौजूद हैं; सीवीपी के सफल छीलने में वॉन एबरर की ग्रंथियों और नलिकाओं(चित्रा 1D,काले तीर)का हिस्सा शामिल है। यदि खुली एपिथेलियम में इन दो अपारदर्शी संरचनाओं को शामिल नहीं किया जाता है, तो कनेक्टिव ऊतक के अधूरे पाचन के कारण खाई एपिथेलियम सबसे अधिक संभावना उठी है।

Lgr5-EGFP कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए उचित FACS सेटिंग्स स्थापित करने के लिए, अलग सीवीपी से कोशिकाओं को अलग से जंगली प्रकार और Lgr5-EGFP चूहों से प्राप्त कर रहे हैं । वाइल्ड टाइप सीवीपी कोशिकाओं का विश्लेषण पहले गेटिंग पैरामीटर स्थापित करने के लिए किया जाता है, एक प्रक्रिया जिसमें कोशिकाओं की आबादी को ब्याज24की विशेषताओं द्वारा स्कैटरप्लॉट आउटपुट के भीतर वर्गीकृत किया जाता है। यहां, चार मापदंडों अंततः चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया । पहला पैरामीटर, आगे तितर बितर, पता चला सतह क्षेत्र के आधार पर कणों और मलबे बाहर फिल्टर । यह पैरामीटर तरह(चित्र 3)के दौरान सभी पता लगाया घटनाओं के ~ 70% को हटा देता है। चौड़ाई पैरामीटर एकल कोशिकाओं (सिंगलेट) का चयन सुनिश्चित करने के लिए आकार के आधार पर घटनाओं को और फिल्टर करता है। लगभग 90% घटनाएं सिंगल्स(चित्र 3)हैं। परमाणु मार्कर DAPI मृत लेकिन जीवित कोशिकाओं द्वारा नहीं लिया जाता है और इस तरह मृत कोशिकाओं को हल करने की अनुमति देता है25. यह प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता को अनुकूलित करता है, क्योंकि 90% से अधिक घटनाएं लाइव सेल(चित्र 3)हैं। अंत में, जीएफपी गेटिंग पैरामीटर जंगली प्रकार की कोशिकाओं के ऑटोफ्लोरेसेंस स्तर से ऊपर सेट किए जाते हैं। जंगली प्रकार की कोशिकाओं को एकत्र नहीं किया जाता है; वे पूरी तरह से GFP फ्लोरेसेंस के लिए एक गेटिंग नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। जंगली प्रकार के नमूने से निर्धारित गेटिंग मापदंडों के साथ, एलजीआर 5-ईजीएफपी नमूने से कोशिकाओं को संग्रह के लिए हल किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से चलाया जाता है। गेट्स Lgr5-EGFP तरह की शुरुआत में समायोजित किया जा सकता है कुछ सेल आबादी के स्पष्ट क्लस्टरिंग को समायोजित करने के लिए, लेकिन काफी मध्य तरह नहीं बदला जाना चाहिए । यह पाया गया कि तीन पूल्ड Lgr5-EGFP CVPs के वियोजन ~500,000 कोशिकाओं की पैदावार, 10,000 GFP+ कोशिकाओं के एक औसत सहित.

उचित मीडिया और संस्कृति की स्थिति इष्टतम विकास और ऑर्गेनॉइड के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं । भाषाई ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों ने आंतों के ऑर्गेनॉइड क्षेत्र के बाद अपने मीडिया घटकों को मॉडलिंग की, जिसमें Wnt3a, ईजीएफ, नोगिन, और आर-स्पॉन्डिन17,18,19,20,21,22शामिल हैं। हालांकि, जब भाषाई ऑर्गेनॉइड को समान विधि (वेनआर मीडिया) का उपयोग करके सुसंस्कृत किया जाता है, तो ऑर्गेनॉइड कुशलता से विकसित नहीं होते हैं(चित्रा 5A)। मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड में, ड्रग्स A8301 (एक TGFß सिग्नलिंग अवरोधक) और SB202190 (एक p38 MAPKinase सिग्नलिंग अवरोधक) का उपयोग ऑर्गेनॉइड विकास26को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। दरअसल, इन अवरोधकों (WENRAS मीडिया) को जोड़ने से भाषाई ऑर्गेनॉइड(चित्रा 5A)के मजबूत विकास को प्रेरित करता है। दिलचस्प बात यह है कि 6 दिनों के बाद मीडिया से इन अवरोधकों को हटाने के परिणामस्वरूप सामान्य टीआरसी मार्कर केसीएनक्यू1की उच्च अभिव्यक्ति होती है, जिसमें A8301 और SB202190 का सुझाव स्वाद सेल भेदभाव(चित्रा 5B)में बाधा डालता है। इस प्रकार, इष्टतम विकास और भेदभाव वेनरास मीडिया में ऑर्गेनॉइड को 0-6 दिनों से और वेनआर मीडिया द्वारा क्रमशः 6-12(चित्रा 4, चित्रा 5)दिनों से प्राप्त किया जाता है।

ऑर्गेनॉइड सेल प्रकार संरचना क्यूआरटी-पीसीआर या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की विशेषता हो सकती है। परिपक्व ऑर्गेनॉइड में दोनों स्वाद कोशिकाएं होती हैं, जो केसीएनक्यू1 और केआरटी8 द्वारा चिह्नित होती हैं, और गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाएं, Krt13/KRT13(चित्रा 6,8A)द्वारा चिह्नित हैं। यह पता चलता है अलग LGR5+ कोशिकाओं विट्रो में एक समान शक्ति के रूप में वे वीवो में करते हैं, वयस्क जीभ में, Lgr5-GFP+ कोशिकाओं दोनों स्वाद और गैर स्वाद वंश5का उत्पादन । इसके अलावा, Krt13 सभी 3 टीआरसी मार्कर(चित्रा 6)की तुलना में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है, जिसमें यह सुझाव दिया जाता है कि ऑर्गेनॉइड मुख्य रूप से गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं से बना होता है। वास्तव में, जीन अभिव्यक्ति27 के सापेक्ष मात्राकरण इंगित करता है Krt13 जनरल टीआरसी मार्कर Kcnq1 (छात्र टीपरीक्षण, पी = 0.0004) से 50x अधिक व्यक्त की है । यह उम्मीद की जाती है, क्योंकि जीभ में स्वाद बनाम गैर-स्वाद एपिथेलियम1का समान अनुपात होता है। ऑर्गेनॉइड तीनों टीआरसी प्रकारों को व्यक्तकरते हैं (चित्र 6,8B, सी)। टाइप I कोशिकाएं (Entpd2द्वारा चिह्नित) और कड़वे प्रकार II कोशिकाएं (Gnat3द्वारा चिह्नित) अत्यधिक स्वाद ऑर्गेनॉइड में व्यक्त की जाती हैं, जबकि खट्टे संवेदन प्रकार III कोशिकाएं (Car4द्वारा चिह्नित) कम आम हैं(चित्र 6)। वीवो में देखे जाने वाले असतत स्वाद कली संरचनाओं के बजाय टीआरसी को ऑर्गेनॉइड(चित्रा 8) मेंबेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है ।

Figure 1
चित्र 1:विच्छेदित जीभ और खुली सीवीपी एपिथेलियम। (क)जीभ को विच्छेदित किया जाता है, और पूर्वकाल जीभ को अंतःमोलर एमिनेंस (धराशायी रेखा) के बस पूर्वकाल को काटकर हटा दिया जाता है, पीछे की जीभ को छोड़ दिया जाता है, जिसमें सीवीपी (ब्लैक बॉक्स)(बी)एक सुई को अंतरमोलर एमिनेंस (ब्लैक एरो) में सिर्फ पूर्वकाल में डाला जाता है, और एंजाइम मिश्रण नीचे और सीवीपी (ब्लैक बॉक्स) के बाद के किनारों पर इंजेक्ट किया जाता है। (ग)सीवीपी खाइयों (काले तीर) और(डी)छंटनी की खुली सीवीपी एपिथेलियम के आसपास untrimmed खुली एपिथेलियम । खाइयों के सफल छीलने के बाद वॉन एबर की ग्रंथियां और नलिकाएं(डी,काले तीर) दिखाई देती हैं। स्केल बार: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:भाषाई ऑर्गेनॉइड जनरेशन का वर्कफ्लो। ज़बान Lgr5 से हटा दिया जाता है-EGFP चूहों। सीवीपी ट्रेंच एपिथेलिया (लाल बॉक्स) अंतर्निहित संयोजी ऊतक से खुली जाती है और एकल कोशिकाओं में अलग हो जाती है। जीएफपी+ कोशिकाओं को अलग किया जाता है और मैट्रिक्स जेल में 48-अच्छी प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 200 कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई के लिए गेटिंग। (ए)नियंत्रण (जंगली प्रकार सीवीपी कोशिकाओं) चलाने के FACS फाटकों कि आगे तितर बितर के माध्यम से मलबे और टूटी हुई कोशिकाओं को खत्म निर्धारित करता है, पक्ष तितर बितर चौड़ाई के माध्यम से सिंगल्स की पहचान करता है, DAPIneg DAPI+ मृत कोशिकाओं से रहते हैं, और जंगली प्रकार की कोशिकाओं के autofluenceence स्तर स्थापित करता है । (ख)पहले से निर्धारित गेट्स को मलबे मुक्त, एकल, लाइव, एलजीआर 5-ईजीएफपी+ कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रायोगिक रन (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP कोशिकाओं) पर लागू किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:भाषाई ऑर्गेनॉइड कल्चर टाइमलाइन और आवश्यक मीडिया। रॉक अवरोधक Y27632 संस्कृति के पहले 48 घंटे के लिए मीडिया में जोड़ा जाता है सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए। प्रसार चरण के दौरान, ऑर्गेनॉइड को विकास को अनुकूलित करने के लिए A8301 और SB202190 (WENRAS) युक्त वातानुकूलित माध्यम खिलाया जाता है। इन दवाओं को मीडिया (WENR) से 6 दिन में शुरू करने के लिए भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए रोका जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ड्रग्स A8301 और SB202190 ऑर्गेनॉइड विकास और भेदभाव को प्रभावित करते हैं । (A)या तो WENR मीडिया (दिन 0-12), WENRAS मीडिया (दिन 0-12), या WENRAS (दिन 0-6), तो WENR (दिन 6-12) में उगाया ऑर्गेनॉइड की ब्राइटफील्ड छवियां । छवियों को लाइव इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संस्कृति के दिन 2, 6 दिन और संस्कृति के दिन 12 पर कब्जा कर लिया गया था। स्केल बार: ऑर्गेनॉइड भेदभाव के दौरान ड्रग्स A8301 और SB202190 मौजूद होने पर वैश्विक टीआरसी मार्कर केसीएनक्यू1 की 400 माइक्रोन(बी)सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति काफी कम हो जाती है। प्रत्येक बिंदु एक जैविक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें तीन पूल्ड कुएं शामिल थे। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति (क्षैतिज रेखा) में औसत परिवर्तन तीन जैविक प्रतिकृति औसत से गणना की गई थी । त्रुटि सलाखों: ±SD. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:भाषाई ऑर्गेनॉइड विहित स्वाद सेल मार्कर व्यक्त करते हैं। चक्र सीमा में परिवर्तन (सीटी) वैश्विक टीआरसी मार्कर Kcnq1के मूल्य, गैर स्वाद epithelial मार्कर साइटोकेराटिन 13(Krt13),प्रकार मैं टीआरसी मार्कर Entpd2,प्रकार द्वितीय कड़वा टीआरसी मार्कर Gnat3,और प्रकार III खट्टा टीआरसी मार्कर Car4,हाउसकीपिंग जीन Rpl19की तुलना में । प्रत्येक बिंदु एक जैविक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें ४८-अच्छी थाली से तीन पूल्ड कुएं शामिल थे । प्रत्येक मार्कर के लिए सीटी मूल्य (क्षैतिज रेखा) में औसत परिवर्तन की गणना तीन जैविक प्रतिकृति के औसत से की गई थी। अकर्षित छात्र का टी-टेस्ट, * पी < 0.05। त्रुटि सलाखों: ± एसडी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए भाषाई ऑर्गेनॉइड का बढ़ना। (A)गैर विषैले मॉडलिंग मिट्टी की ~ 1 मिमी मोटी स्ट्रिंग बनाई गई है। (ख)मिट्टी को 24 मिमी x 75 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में ~ 20 मिमी x 20 मिमी वर्ग के रूप में मूर्तिकला दिया गया है। (ग)बढ़ते माध्यम में निलंबित 22 मिमी x 22 मिमी वर्ग कवरलिप सील ऑर्गेनॉइड। स्केल बार: 10 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:अक्षुण्ण भाषाई ऑर्गेनॉइड की इम्यूनोलबेलिंग। फिक्स्ड, इम्यूनो दाग वाले ऑर्गेनॉइड की कॉन्फोकल छवियां। (A)गैर स्वाद एपिथेलियल मार्कर KRT13 (हरा) और जनरल टीआरसी मार्कर KRT8 (मजेंटा) के लिए दाग ऑर्गेनॉइड का ऑप्टिकल सेक्शन । (ख)टाइप I ग्लियल-जैसे सेल मार्कर एनटीपीडासे2 (ग्रीन) और केआरटी8 (मजेंटा) के लिए दाग वाले एक ऑर्गेनॉइड के कॉन्फोकल जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण । (ग)दो आंशिक रूप से दिखाए गए ऑर्गेनॉइड (सफेद-धराशायी रूपरेखा) के एक कॉन्फोकल जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण और टाइप III खट्टा का पता लगाने वाले सेल मार्कर CAR4 (ग्रीन) और कड़वा पता लगाने वाले प्रकार II सेल मार्कर गस्टडुसिन (मजेंटा) के लिए एक पूर्ण ऑर्गेनॉइड दाग। स्केल बार: ए, बी और सी न्यूक्लियर मार्कर डीएपीआई (नीला, सही कॉलम) के लिए 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन का नाम फॉरवर्ड प्राइमर (5'-3') रिवर्स प्राइमर (5'-3') मूल्यांकन संख्या
कार4 CTGCTAGCAAAGGGAACC सीटीसीसीएक्टगटगटगगेटटी NM_007607.2
Entpd2 GACAAGAATGACACAGGTATCTGG GTTCAAGACATCATCAACCAGACTC NM_009849.2
Gnat3 एटीकैगाटसीकैगटीसी TGGTTTTCACCCGGGAATGT NM_001081143.1
केसीएनक्यू1 टीटीटीटीटीएटीसीसीसीसीसीटीसीएजी जीटीटीजीसीटीजीजीजीगाग NM_008434.2
केआरटी13 TCATCTCGGTTTTTCACTGGA TGATCTTCTCTCGTTGAGAG NM_010662.2
आरपीएल19 GGTCTGGTTTTATCCCAATG CCCGGGAATGGACAGTCA NM_009078.2

तालिका 1: मात्रात्मक आरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर दृश्य।

अनुपूरक तालिका 1: प्रकाशित भाषाई ऑर्गेनॉइड संस्कृति मीडिया घटकों की तुलना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

यहां रिपोर्ट वयस्क माउस स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने, बनाए रखने और प्रसंस्करण के लिए एक कुशल और आसानी से दोहराने योग्य विधि है। यह पाया गया कि 8 से 20 सप्ताह पुराने Lgr5-EGFP चूहों से तीन CVPs का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक उपयोग के लिए ~१०,००० GFP+ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, ५० कुओं में ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से २०० कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया । सीवीपी ट्रेंच एपिथेलिया को हटाने के लिए ताजा निर्मित Dispase द्वितीय और टाइप-I कोलेज समाधान के साथ भाषाई एपिथेलियम इंजेक्शन द्वारा अनुकूलित किया जाता है, जिसके बाद 33 मिनट की इनक्यूबेशन होती है। हालांकि, एक छोटे से इनक्यूबेशन समय, पुराने एंजाइम aliquots, विभिन्न बहुत सारे, या विभिन्न निर्माताओं से एंजाइमों का उपयोग अधूरा खाई हटाने में परिणाम कर सकते हैं। इसके विपरीत, एक लंबा इनक्यूबेशन समय ऊतक के अधिक पाचन का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप स्वाद ऊतक अखंडता की हानि होती है। छीलने के बाद, सीवीपी खाइयों के लिए आगे संवर्धन सीवीपी के आसपास के एपिथेलियम को ट्रिम करके किया गया था।

यह महत्वपूर्ण है कि वियोजन और संग्रह प्रक्रिया के दौरान उपयोग की जाने वाली सभी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को ऊतक और कोशिकाओं को ट्यूबों की प्लास्टिक की दीवारों से चिपके रहने से रोकने के लिए एफबीएस के साथ लेपित किया जाता है, जो अलग कोशिकाओं की वसूली को काफी कम कर देता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। एफबीएस के हल्के कोट का उपयोग करना और उपयोग करने से पहले ट्यूबों से अतिरिक्त तरल को हटाना ट्रिप्सिन या अन्य एंजाइमों पर संभावित अवरोधक प्रभावों को कम करता है।

भाषाई ऑर्गेनॉइड को एलजीआर 5+ कोशिकाओं की पूर्व छंटाई के बिना अलग सीवीपी ऊतक से सफलतापूर्वक उगाया गयाहै। यद्यपि इस विधि के परिणामस्वरूप ऑर्गेनॉइड का गठन होता है, हमने पाया है कि इन ऑर्गेनॉइड के एक छोटे अनुपात में अलग-थलग जनकों (डेटा नहीं दिखाए गए) से उगाए गए लोगों की तुलना में स्वाद कोशिकाएं होती हैं। Lgr5-EGFP+ कोशिकाओं के लिए प्रवाह छंटाई स्वाद सक्षम जनकों के लिए समृद्ध होती है, जिसके परिणामस्वरूप स्वाद-परिपूर्ण ऑर्गेनॉइड का अनुपात अधिक होता है। वर्तमान में, हम जीएफपी ऑटोफ्लोरेसेंस (चित्र 3) की दहलीज से ऊपर सभी कोशिकाओंको इकट्ठा करते हैं; हालांकि, यह संभव है कि जीएफपी चमक का स्तर चर ऑर्गेनॉइड बनाने दक्षता या स्वाद योग्यता से जुड़े हैं। इस परिकल्पना का अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन भविष्य के काम के लिए एक आशाजनक अवसर है क्योंकि यह स्वाद सेल युक्त ऑर्गेनॉइड के और संवर्धन की अनुमति दे सकता है।

यह सर्वविदित है कि चढ़ाना घनत्व ऑर्गेनॉइड भेदभाव की दक्षता को प्रभावित करता है, और हम अनुशंसा करते हैं कि इष्टतम चढ़ाना घनत्व प्रयोग28से पहले निर्धारित किया जाए। चढ़ाना घनत्व की स्थापना करते समय कुओं के आकार और गहराई के साथ-साथ मैट्रिक्स जेल की मात्रा पर विचार किया जाना चाहिए। हमारे प्रारंभिक काम (डेटा नहीं दिखाया गया) के आधार पर, हम पाते हैं कि 48-अच्छी प्लेट में, मैट्रिक्स जेल के 15 माइक्रोन और 200 कोशिकाओं का एक चढ़ाना घनत्व प्रति अच्छी तरह से कुशल ऑर्गेनॉइड विस्तार और सभी तीन टीआरसी प्रकारों के भेदभाव की अनुमति देता है। हमने पाया है कि भाषाई ऑर्गेनॉइड को सफलतापूर्वक और कम ग्रोथ फैक्टर बेसमेंट झिल्ली एक्सट्रैक्ट (आरजीएफ बीएमई), एक सिंथेटिक और कम महंगे मैट्रिक्स जेल विकल्प में पुन: पेश किया जा सकता है। अन्य वैकल्पिक मैट्रिस भी भाषाई ऑर्गेनॉइड संस्कृति का समर्थन कर सकते हैं, लेकिन इस संभावना की जांच करने के लिए आगे परीक्षण की आवश्यकता है।

चढ़ाना के दौरान, एकत्र कोशिकाओं को अच्छी तरह से किया जाना चाहिए, लेकिन धीरे से सेल निलंबन सजातीय रखने के लिए अक्सर ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मैट्रिक्स जेल में फिर से निलंबित कर दिया । कोशिका-मैट्रिक्स जेल मिश्रण युक्त ट्यूब को भी पूरी चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए ताकि मैट्रिक्स जेल को ट्यूब के किनारों पर जेलिंग से रोका जा सके। ये उपाय कुओं में कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करते हैं, हाथ चढ़ाना कोशिकाओं को और अधिक प्रजनन परिणाम उपज । विशेष रूप से, माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों में हाल की घटनाएं सेल वितरण के लिए उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रदान करती हैं और भविष्य के काम29के लिए एक आशाजनक उपकरण है।

सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए, प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए कम से कम तीन कुओं को पूल करना आवश्यक पाया गया ताकि प्रतिकृति(चित्रा 6)में पर्याप्त आरएनए और स्थिरता प्राप्त की जा सके। यह भी निर्धारित किया गया था कि विशिष्ट निर्माता के निर्देशों के अनुसार तुरंत काटे गए ऑर्गेनॉइड को निकाला गया आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा का अनुकूलन करता है। जबकि यहां परीक्षण नहीं किया गया है, भंडारण अभिकर्षकों में फ्लैश-फ्रीजिंग या पुनर्प्रापणन जैसे अन्य भंडारण विकल्प भी आरएनए उपज और गुणवत्ता को संरक्षित कर सकते हैं।

ऑर्गेनॉइड पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को किसी भी अवशिष्ट मैट्रिक्स जेल और पूरे ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम में प्रवेश करना चाहिए। पिछली रिपोर्टों में, ऑर्गेनॉइड को मैट्रिक्स जेल में निलंबित करते हुए ठीक किया गया था, जिसके बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति17,18को प्रकट करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की अत्यधिक उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती थी। अन्य रिपोर्टों के समान, निर्धारण से पहले सेल रिकवरी समाधान का उपयोग करके मैट्रिक्स जेल से ऑर्गेनॉइड को हटाना उच्च एंटीबॉडी एकाग्रता30, 31की आवश्यकता के बिना धुंधला करने की दक्षता बढ़ाने के लिए पाया गया था। हालांकि, कुछ स्वाद सेल मार्कर, उदाहरण के लिए, CAR4 का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, 3 रातों के लिए प्राथमिक एंटीसेरा में ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेटिंग करने से एंटीबॉडी बाइंडिंग की संभावना बढ़ जाती है। हालांकि, इस विधि से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस भी बढ़ सकती है यदि ऑर्गेनॉइड इम्यूनोदाता के बाद अपर्याप्त रूप से धोए जाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को बचाया जा सकता है और एक सप्ताह से कम समय के लिए संग्रहीत होने पर एक या अधिक बार सफलतापूर्वक फिर से उपयोग किया जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इष्टतम इमेजिंग के लिए, ऑर्गेनॉइड को अपनी 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए मॉडलिंग क्ले की मिट्टी परिधि के शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखकर घुड़सवार किया जाता है। कवर ग्लास को सीधे स्लाइड कंप्रेस पर रखें और ऑर्गेनॉइड को तोड़दें, उचित विश्लेषण को रोकते हैं।

ऑर्गेनॉइड संस्कृति एक अत्यधिक लागू, लागत कुशल तकनीक है। कुछ अनुप्रयोगों में शामिल हैं, लेकिन रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग और स्टेम सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान३२के अध्ययन तक ही सीमित नहीं हैं । इसलिए, प्रयोगशालाओं में प्रजनन क्षमता की अनुमति देने के लिए ऑर्गेनॉइड मॉडल का मानकीकरण करना महत्वपूर्ण है। भविष्य में, भाषाई ऑर्गेनॉइड को पास करने के लिए एक मानकीकृत विधि विकसित करना उपयोगी होगा जो यह गारंटी देता है कि स्वाद स्टेम सेल शक्ति को धारावाहिक मार्ग पर प्रचारित किया जा सकता है, जिससे अतिरिक्त जानवरों को अधिक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने की आवश्यकता कम हो जाती है। महत्वपूर्ण बात, जबकि भाषाई ऑर्गेनॉइड स्वाद और गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं दोनों से बना होते हैं, इन कोशिकाओं का संगठन वीवो स्वाद प्रणाली की तुलना में अलग होता है। वीवो में ऑर्गेनॉइड और स्वाद एपिथेलियम के बीच विसंगतियां ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया के कारण हो सकती हैं और / या क्योंकि ऑर्गेनॉइड स्वाद कली माइक्रोएनवायरनमेंट के साथ बातचीत की कमी होती है, जिसमें स्वाद कली गठन और रखरखाव के लिए आवश्यक लेमिना प्रोप्रिया शामिल है22,33,34,35. भाषाई ऑर्गेनॉइड संस्कृति में नसों या वैक्यूलेचर को शामिल करने के लिए भविष्य का काम, वर्तमान में अन्य ऑर्गेनॉइड प्रणालियों में अपनाई जा रही रणनीति, वीवो स्वाद एपिथेलियम36,37में अधिक सटीक मॉडलिंग की अनुमति दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक WNR वातानुकूलित मीडिया और मूल्यवान चर्चा प्रदान करने के लिए डॉ पीटर डेम्पसे और मोनिका ब्राउन (कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैंपस ऑर्गेनॉइड और ऊतक मॉडलिंग साझा संसाधन) के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सेल छंटाई विशेषज्ञता के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो कैंसर सेंटर सेल टेक्नोलॉजीज और फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधनों, विशेष रूप से दिमित्री बैटुरिन को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, और NIH/NCI R21 CA21 CA236480 लैब के लिए, और R21DC016131 और R21DC016131-02S1 डीजी के लिए, और F32 DC015958 EJG के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG Molecular Probes A11056, RRID: AB_142628 1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG Molecular Probes A11010, RRID:AB_2534077 1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG Invitrogen A11075, RRID:AB_2534119 1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG Molecular Probes A31573, RRID:AB_2536183 1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG Molecular Probes A21247, RRID:AB_141778 1:2000
DAPI (for FACS) Thermo Fischer 62247
DAPI (for immunohistochemistry) Invitrogen D3571, RRID:AB_2307445 1:10000
Goat anti-CAR4 R&D Systems AF2414, RRID:AB_2070332 1:50
Guinea pig anti-KRT13 Acris Antibodies BP5076, RRID:AB_979608 1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-395, RRID:AB_673678 1:250
Rabbit anti-NTPDASE2 CHUQ mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 1:300
Rat anti-KRT8 DSHB TROMA-IS, RRID: AB_531826 1:100
Equipment
2D rocker Benchmark Scientific Inc. BR2000
3D Rotator Lab-Line Instruments 4630
Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific S407992
Centrifuge Eppendorf 5415D
CO2 tank Airgas CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator Thermo Scientific 4110 184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte Sartorius Model: S3 Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100 Cytomation Inc Model: S13211997  Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker New Brunswick Scientific Excella E1
Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5417R
Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
 Stereomicroscope Zeiss Stemi SV6
Thermal Cycler Bio-Rad 580BR
Vortex Fisher Scientific 12-812
Water bath Precision 51220073
Media
A83 01 Sigma SML0788-5MG Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 Supplement Gibco 17504044 Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin Gibco 15750-060 Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax Gibco 35050061 Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES Gibco 15630080 Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF Peprotech 315-09-1MG Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin Peprotech 250-38 Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine Sigma A9165 Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide Sigma N0636-100g Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep Gibco 15140-122 Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin InvivoGen ant-pm-1 Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190 R&D Systems 1264 Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug APExBIO A3008-10 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
2-Mercaptoethanol, min. 98% Sigma M3148-25ML β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1420-2700
48-well plates Thermo Scientific 150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets Fisherbrand 12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Life Science A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer QIAGEN 1015750
Cell Recovery Solution Corning 354253
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I Sigma Life Science C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear R&D Systems 3533-005-02 Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II) Sigma-Aldrich (Roche) 4942078001
Disposable Filters Sysmex 04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) Gibco 10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+  Sigma Life Sciences D8662-500ML
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0) Promega V4231
Elastase Lyophilized Worthington Biochemical LS002292
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
HEPES Solution Sigma Life Science H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA Thermo Scientific 25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1706691
Modeling Clay, Gray Sargent Art 22-4084
Needle BD Syringe 305106
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
RNeasy Micro Kit QIAGEN 74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 022363204
Sodium Chloride Fisher Chemical 7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher Chemical 7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous Fisher Bioreagents 7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools 14002-14
Triton X-100 Sigma Life Science T8787-100ML
VWR micro cover glass VWR 48366067 22x22mm

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References

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