Summary
Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.
Abstract
Der Geschmackssinn wird durch Geschmacksknospen auf der Zunge vermittelt, die sich aus sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs) zusammensetzen. Dieser kontinuierliche Umsatz wird von lokalen Vorläuferzellen angetrieben und macht die Geschmacksfunktion anfällig für Störungen durch eine Vielzahl von medizinischen Behandlungen, was wiederum die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung dieses Prozesses im Kontext der medikamentösen Behandlung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, ob und wie die Funktion des Geschmacksvorläufers und die TRC-Produktion beeinflusst werden. Angesichts der ethischen Bedenken und der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Geschmacksgewebe werden häufig Mausmodelle verwendet, die ein ähnliches Geschmackssystem wie der Mensch haben. Im Vergleich zu In-vivo-Methoden, die zeitaufwendig, teuer und für Hochdurchsatzstudien nicht nutzbar sind, können murine linguale Organoide experimente mit vielen Replikaten und weniger Mäusen schnell durchführen. Hier wurden zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst und eine standardisierte Methode zur Erzeugung von Geschmacksorganoiden aus Geschmacksvorläuferzellen vorgestellt, die aus der Circumvallat-Papille (CVP) erwachsener Mäuse isoliert wurden. Geschmacksvorläuferzellen im CVP exprimieren LGR5 und können mittels EGFP-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) von Mäusen isoliert werden, die ein Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-Allel tragen. Sortierte Zellen werden auf ein Matrix-Gel-basiertes 3D-Kultursystem auf plattiert und 12 Tage lang kultiviert. Organoide dehnen sich für die ersten 6 Tage der Kulturperiode durch Proliferation aus und treten dann in eine Differenzierungsphase ein, in der sie alle drei Geschmackszelltypen zusammen mit Nicht-Geschmacksepithelzellen erzeugen. Organoide können bei der Reifung am Tag 12 oder jederzeit während des Wachstumsprozesses für die RNA-Expression und immunhistochemische Analyse entnommen werden. Die Standardisierung von Kulturmethoden zur Herstellung von lingualen Organoiden aus adulten Stammzellen wird die Reproduzierbarkeit verbessern und linguale Organoide als leistungsfähiges Arzneimittel-Screening-Werkzeug im Kampf gegen Patienten mit Geschmacksstörungen fördern.
Introduction
Bei Nagetieren sind linguale Geschmacksknospen in fungiformen Papillen untergebracht, die anterior verteilt sind, bilaterale Blattpapillen nach dem Hinterteil sowie eine einzelne zirkumvallate Papille (CVP) an der posterodorsalen Mittellinie der Zunge1. Jede Geschmacksknospen besteht aus 50-100 kurzlebigen, sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs), zu denen gliaartige Unterstützungszellen vom Typ I, Zellen vom Typ II, die süße, bittere und Umami erkennen, und Typ III-Zellen, die saure2,3,4erkennen , umfassen. Im CVP der Maus produzieren LGR5+ Stammzellen entlang der Basallamina alle TRC-Typen sowie Nicht-Geschmacksepithelzellen5. Bei der Erneuerung der Geschmackslinie werden LGR5-Tochterzellen zunächst als postmiotische Geschmacksvorläuferzellen (Typ IV-Zellen) spezifiziert, die in eine Geschmacksknospen eintreten und in der Lage sind, sich in einen der drei TRC-Typen6 zudifferenzieren. Der schnelle Umsatz von TRCs macht das Geschmackssystem anfällig für Störungen durch medizinische Behandlungen, einschließlich Bestrahlung und bestimmter medikamentöser Therapien7,8,9,10,11,12,13. Daher ist die Untersuchung des Geschmackssystems im Kontext der Regulierung von Geschmacksstammzellen und der TRC-Differenzierung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie Geschmacksstörungen gemildert oder verhindert werden können.
Mäuse sind ein traditionelles Modell für In-vivo-Studien in der Geschmackswissenschaft, da sie ein Geschmackssystem haben, das ähnlich wie Menschen organisiert ist14,15,16. Mäuse sind jedoch nicht ideal für Studien mit hohem Durchsatz, da sie teuer in der Wartung und zeitaufwendig in der Arbeit sind. Um dies zu überwinden, wurden in den letzten Jahren in vitro Organoidkulturmethoden entwickelt. Geschmacksorganoide können aus nativem CVP-Gewebe erzeugt werden, einem Prozess, bei dem Organoide aus isoliertem Maus-CVP-Epithel abknabknabken, das ex vivo17kultiviert wird. Diese Organoide zeigen ein mehrschichtiges Epithel, das mit dem In-vivo-Geschmackssystem übereinstimmt. Ein effizienterer Weg zur Erzeugung von Organoiden, die keine Ex-vivo-CVP-Kultur erfordern, wurde von Ren etal. im Jahr 201418entwickelt. Sie adaptierten Methoden und Nährmedien, die zuerst entwickelt wurden, um Darmorganoide zu züchten, isolierten einzelne Lgr5-GFP+ Vorläuferzellen aus Maus-CVP und plattierten sie mit Matrixgel19. Diese einzelnen Zellen erzeugten linguale Organoide, die sich während der ersten 6 Tage der Kultur vermehren, beginnen sich um Tag 8 zu differenzieren und enthalten am Ende der Kulturperiode nicht schmeckende Epithelzellen und alle drei TRC-Typen18,20. Bis heute wurden mehrere Studien veröffentlicht, die das linguale Organoidmodellsystem verwenden17,18,20,21,22; Die Methoden und Kulturbedingungen, die zur Erzeugung dieser Organoide verwendet werden, variieren jedoch je nach Veröffentlichung (Ergänzende Tabelle 1). Daher wurden diese Methoden hier angepasst und optimiert, um ein detailliertes standardisiertes Protokoll für die Kultur von lingualen Organoiden zu präsentieren, die von LGR5+ Vorläufern der adulten Maus CVP abgeleitet sind.
Linguale Organoide bieten ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der zellbiologischen Prozesse, die die Entwicklung und Erneuerung von Geschmackszellen vorantreiben. Da sich die Anwendungen von lingualen Organoiden ausweiten und immer mehr Labore sich der Verwendung von In-vitro-Organoidmodellen zuwenden, ist es wichtig, dass das Feld bestrebt ist, standardisierte Protokolle zu entwickeln und einzuführen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die Etablierung von lingualen Organoiden als Standardwerkzeug in der Geschmackswissenschaft würde Hochdurchsatzstudien ermöglichen, die auseinandernehmen, wie einzelne Stammzellen die differenzierten Zellen des adulten Geschmackssystems erzeugen. Darüber hinaus könnten linguale Organoide eingesetzt werden, um Medikamente schnell auf mögliche Auswirkungen auf die Geschmacksöostase zu untersuchen, die dann in Tiermodellen gründlicher untersucht werden könnten. Dieser Ansatz wird letztendlich die Bemühungen verstärken, Therapien zu entwickeln, die die Lebensqualität zukünftiger Arzneimittelempfänger verbessern.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren, dem Tierschutzgesetz und der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, stammen vom Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten vor Beginn abgeschlossen werden, um einen reibungslosen und rechtzeitigen Ablauf des Protokolls zu gewährleisten: Wasserbad auf 37 ° C einstellen, Zentrifuge auf 4 ° C einstellen, Injektions- und Dissoziationsenzymlösungen aus den 10 mg / ml Dispase-, Kollagenase- und Elastase-Stammlösungen herstellen (siehe Materialtabelle),Matrixgel aus dem Gefrierschrank mit -20 ° C entfernen (~ 750 μL für eine 48-Well-Platte erforderlich) und auftauen, indem Sie die Durchstechflasche in Eis tauchen für bei mindestens 3-4 h, Mikrozentrifugenröhrchen in unverdünntem FBS durch sanftes Schaukeln bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vorbeschichten (zwei 2-ml-Röhrchen für die Gewebeentnahme, zwei 1,5-ml-Röhrchen für dissoziierte Zellen und ein 1,5-ml-Röhrchen für die Sammlung einzelner Zellen aus dem Zellsortierer; überschüssiges FBS vor Gebrauch entfernen).
1. Isolierung des CVP-Epithels
HINWEIS: Um genügend LGR5+ -Zellen für eine vollständige 48-Well-Platte zu erhalten, sammeln Sie drei Lgr5-EGFP-CVPs in derselben Röhre und verarbeiten Sie sie gleichzeitig. Wichtig ist, dass Sie das CVP von mindestens einem Wildtyp-Littermat parallel in einem separaten Rohr ernten und verarbeiten und es als Gating-Kontrolle zum Einstellen von FACS-Parametern verwenden (siehe Repräsentative Ergebnisse).
- Euthanisieren Sie die Mäuse mit CO 2-Erstickung gemäß den IACUC-Vorschriften, gefolgt von einer zugelassenen Sekundärmethode wie bilateraler Thorakotomie, zervikaler Dislokation, Enthauptung oder Exsanguination.
- Verwenden Sie eine große sterile Dissektionsschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie die Zunge an und schneiden Sie das linguale Frenulum, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen. Schneiden Sie die Zunge aus und sammeln Sie sie in steriler eiskalter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (dPBS) mit Ca2+ und Mg2+.
- Entfernen und entsorgen Sie die vordere Zunge, indem Sie nur die intermolare Eminenz mit einer Rasierklinge vorn schneiden (Abbildung 1A, gestrichelte Linie). Verwenden Sie ein zartes Aufgabentuch, um Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge zu entfernen.
- 1 ml Spritze mit 200-300 μL Injektionsenzymlösung füllen (Endkonzentration: 2 mg/ml Typ-I-Kollagenase und 5 mg/ml Dispase II in Ca2+/Mg2+-haltige dPBS, verdünnt aus 10 mg/ml Stammlösungen) und eine 30 G x 1/2 Nadel knapp über der intermolaren Eminenz(Abbildung 1B,schwarzer Pfeil)bis knapp vor dem CVP einsetzen(Abbildung 1B), Black Box). Injizieren Sie die Enzymlösung unter und an den seitlichen Rändern des CVP zwischen dem Epithel und den darunter liegenden Geweben (Lamina propria, Muskel). Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich aus der Zunge, während die Injektion durchgeführt wird.
- Inkubieren Sie die Zunge in sterilem Ca2+/Mg2+-freiem dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 min.
- Machen Sie kleine Schnitte im Epithel bilateral und nur vor dem CVP mit einer extra feinen Dissektionsschere und schälen Sie das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Zette anheben. Sobald das Grabenepithel frei vom darunter liegenden Bindegewebe ist, legen Sie es in ein leeres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit FBS vorbeschichtet ist. Führen Sie das Epitheltrimmen vor oder nach dem Ablösen des CVP-Epithels durch (Abbildung 1C, D).
2. Dissoziation des CVP-Epithels
HINWEIS: Dissoziation des CVP-Epithels und Beschichtung sind in Abbildung 2grafisch dargestellt.
- Der Dissoziationsenzymcocktail (Endkonzentration: 2 mg/ml Typ-I-Kollagenase, 2 mg/ml Elastase und 5 mg/ml Dispase II in Ca2+/Mg2+-enthaltend dPBS, verdünnt aus 10 mg/ml Stammlösungen) wird in Röhrchen mit geschälten CVP-Epithelien (200 μL pro CVP) geben. Inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad für 45 min. Wirbel kurz alle 15 min.
HINWEIS: 0,25% Trypsin-EDTA im 37 °C Wasserbad während der letzten 15 Minuten der Enzymcocktail-Inkubation vorwärmen. - Nach der Inkubation, Wirbel (drei Impulse) dann triturate mit einer Glas-Pasteur-Pipette für 1 min. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetten Sie den Überstand, der die erste Sammlung dissoziierter Zellen enthält, in neue FBS-beschichtete 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die dem Genotyp entsprechen. Verarbeiten Sie die verbleibenden Gewebestücke wie in Schritt 2.3 beschrieben weiter. unter.
- Den Überstand für 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen drehen.
- Entfernen Sie den resultierenden Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) Puffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) und 1% FBS in Ca2+/Mg2+-freiem PBS (50 μL pro CVP)). Auf Eis lagern.
- Bei der Durchführung der Schritte 2.2.1 und 2.2.2 dissoziieren Sie die verbleibenden Gewebestücke aus Schritt 2.2, indem Sie den ursprünglichen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorgewärmte 0,25% Trypsin-EDTA (200 μL pro CVP) zugaben und in einem 37 °C-Wasserbad für 30 min inkubieren. Wirbel kurz alle 10 min.
- Nach der Inkubation das Röhrchen mit den Gewebestücken (drei Impulse) vortexen und dann mit einer Pasteur-Pipette aus Glas für 1 min triturieren. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, wird der Überstand in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettet, die Zellen aus Schritt 2.2.2 enthalten. Entsorgen Sie die Röhrchen mit den verbleibenden Gewebestücken.
- Die Röhrchen mit dissoziierten Zellen 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen drehen.
- Entfernen Sie den Überstand und die Zellpellets in FACS Buffer (100 μL pro CVP). Auf Eis lagern.
- Führen Sie die Zellen durch einen 30 μm Nylon-Mesh-Filter und fügen Sie DAPI (λEmission = 450 nm) vor DEM FACS zu Zellmischungen hinzu. Isolieren Sie Lgr5-GFP+ Zellen über FACS unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteinkanals (λAnregung = 488 nm; λEmission = 530 nm). Sortieren Sie die Zellen mit einer 100 μm-Düse in ein frisches FBS-beschichtetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μL Ca2+/Mg2+ freiem dPBS. Legen Sie die Zellen bis zur Beschichtung auf Eis.
3. Beschichtung von Lgr5-EGFP-Zellen
- Bestimmen Sie das Volumen der LGR5+ Zellsuspension, die vom Durchflusszytometer empfangen wird.
- Berechnen Sie basierend auf der Anzahl der Zellen, die vom Sortierer erhalten wurden, die Anzahl der Zellen pro μL. Bestimmen Sie dann das Volumen, das benötigt wird, um die gewünschte Anzahl von Zellen für die Beschichtung zu erhalten (wir verwenden 200 Zellen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte) und übertragen Sie dieses Gesamtvolumen der suspendierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- Drehen Sie das Röhrchen für 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen (Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar). Entfernen Sie den Überstand und legen Sie das Rohr auf Eis.
- Das Zellpellet vorsichtig in der entsprechenden Menge Matrixgel (15 μL pro Vertiefung für 48-Well-Platten) wieder aufschnappen; Pipette sanft auf und ab, um die Zellen in Matrixgel gründlich zu verteilen. Legen Sie 15 μL Matrixgel/Zell-Mischung in die Mitte jeder Vertiefung. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen während der Beschichtung in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis, um zu verhindern, dass Matrixgel geliert. Mischen Sie weiterhin die Matrixgel/Zell-Mischung während der gesamten Beschichtung, indem Sie alle drei Vertiefungen auf und ab pipettieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Vertiefungen zu gewährleisten.
- Legen Sie die Platte für 10 min in den Inkubator (37 °C, 5% CO2,~95% Luftfeuchtigkeit), damit matrix geliert werden kann. Dann fügen Sie 300 μL WENRAS + Y27632-Medien bei Raumtemperatur in jede Vertiefung hinzu und geben Sie die Platte in den Inkubator zurück.
4. Organoid-Erhaltung
HINWEIS: Organoide werden in herkömmlichen organoiden Medien (WENR) gezüchtet, die rekombinante EGF und 50% konditionierte Medien enthalten, die Wnt3a, Noggin und R-Spondin23enthalten. Die Medikamente A8301 und SB202190 werden für die ersten 6 Tage der Kulturperiode hinzugefügt, um das Wachstum zu optimieren (WENRAS-Medien)(Abbildung 5),dann entfernt, um die Differenzierung zu fördern (WENR-Medien)20. Y27632 wird für die ersten 2 Tage der Kultur hinzugefügt, um das Überleben zu fördern. Die Medienbedingungen in Bezug auf die Kulturzeitleiste sind in Abbildung 4 dargestellt.
- Entfernen Sie zwei Tage nach der Beschichtung weNRAS + Y27632-Medien aus jeder Vertiefung mit einer 1-ml-Pipette, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination besteht. Fügen Sie 300 μL WENRAS-Medien an der Seite des Brunnens hinzu, um das Matrixgel nicht zu stören. Bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück.
- Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage, indem Sie die entsprechenden Medien für die Kulturphase verwenden (Abbildung 4). Halten Sie Organoide bis zum Tag 12, wenn die Organoide zur Ernte bereit sind.
5. RNA-Verarbeitung
- Gewinnung von Organoiden für RNA
- Legen Sie die 48-Well-Platte für 30 Minuten auf Eis, um das Matrixgel zu depolymerisieren.
- Ziehen Sie mit einer 1 ml Pipette das organoide Medium hoch; Dann, wenn das Medium in den Brunnen zurückgeführt wird, verwenden Sie die Spitze der Pipette, um das Matrixgel zu zerkratzen und weiter aufzubrechen. Übertragen Sie den Inhalt in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bündeln Sie den Inhalt von drei Vertiefungen in einem Rohr. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie so viel Medienüberstand wie möglich, ohne Organoide zu entfernen; dann die Rohre erneut für 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur drehen.
- Entfernen Sie die verbleibenden Medien und resuspendieren Sie die Organoide in 350 μL Lysepuffer + β-Mercaptoethanol (βME) (10 μL βME pro 1 ml Lysepuffer). Legen Sie die Proben zur sofortigen RNA-Extraktion auf Eis oder lagern Sie sie bei -80 °C.
- Quantitative RT-PCR-Analyse
- Messen Sie die RNA-Menge mit einem Spektralphotometer. Reverse-transkribierte RNA mit einem cDNA Synthesis Kit.
- Mischen Sie cDNA äquivalent zu 5 ng RNA mit 200 nM vorvalidierten Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Tabelle 1) und fluoreszierendem PCR Master Mix. Führen Sie die qRT-PCR-Reaktion für 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s, dann 60 °C für 60 s durch.
6. Immunhistochemie
- Entnahme und Fixierung der Organoide
- 48-Well-Platte für 30 Minuten auf Eis legen, um das Matrixgel zu lösen.
- Entfernen Sie das organoide Medium und fügen Sie 400 μL eiskaltes PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Entfernen Sie dann PBS und fügen Sie 400 μL eiskalte Zellrückgewinnungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. 30 min sanft bei 4 °C schaukeln.
- Beschichten Sie eine 1 mL Pipettspitze mit 1% BSA in PBS und pipetieren Sie den Inhalt der Vertiefung vorsichtig nach oben und unten, um das Matrixgel aufzubrechen. Übertragen Sie die Organoide in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird.
- Spülen Sie jeden Brunnen mit 300 μL PBS + 1% BSA ab und übertragen Sie alle verbleibenden Organoide in die entsprechenden Röhrchen. Cell Recovery Solution/PBS + BSA aus jeder Tube entfernen. Fügen Sie 400 μL eiskaltes PBS hinzu und wiederholen Sie es dann mit einer weiteren eiskalten PBS-Spülung.
- PBS entfernen und Organoide mit 300 μL eiskaltem 4% PFA (in 0,1 M PB) für 20 min fixieren und bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie PFA und spülen Sie Organoide mit 400 μL eiskaltem PBS.
- PBS entfernen; Fügen Sie dann 400 μL PBS + 1% BSA hinzu. Bei 4 °C lagern.
- Immunfluoreszenzfärbung
- Organoide in 500 μL PBS + 1% BSA ausspülen. Dann Organoide in Blockierungslösung (5% normales Ziegen- oder Eselserum, 1% Rinderserumalbumin, 0,3% Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) für 2 h inkubieren und bei Raumtemperatur sanft schaukeln.
- Die primäre Antikörperlösung (primäre Antikörper in Blockierungslösung verdünnt) fünken und 3 Nächte bei 4 °C vorsichtig einschlagen.
- Organoide 4x für 1 h mit 500 μL PBS + 0,2% Triton waschen und bei Raumtemperatur sanft schaukeln. Sekundäre Antikörperlösung (sekundäre Antikörper in Blocklösung verdünnt) und Gesteinsorganoide über Nacht, vor Licht geschützt, bei 4 °C hinzufügen.
- Organoide 3x für 1 h mit 500 μL PBS + 0,2% Triton waschen, lichtgeschützt und bei Raumtemperatur sanft schaukelnd. Mit DAPI verdünnt 1:10.000 in 0,1 M PB für 20 min inkubieren, schaukeln und bei Raumtemperatur abdecken.
- Die Organoide 3x 20 min mit 0,1 M PB waschen, sanft schaukeln und bei Raumtemperatur abdecken.
- Objektträgermontage von Organoiden für die invertierte konfokale Mikroskopie.
HINWEIS: Schritt-für-Schritt-Bilder des Diamontagevorgangs sind in Abbildung 7 dargestellt.- Erstellen Sie einen ~ 1 mm dicken 22 x 22 mm quadratischen Umfang aus ungiftigem Modellierton auf einem Objektträger.
- Entfernen Sie 0,1 M PB aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie organoide vorsichtig in einem 100 μL-Montagemedium Ihrer Wahl. Dann in die Mitte des Tonquadrates übertragen.
- Füllen Sie das Tonquadrat, bis das Montagemedium fast bis zur Spitze ist. Dann 22 x 22 mm quadratischen Abdeckrlip über Ton legen und fest auf die Seiten des Coverlips drücken, um zu versiegeln. Gemäß Herstellerangaben aushärten lassen (hier Raumtemperatur 1-2 Tage) und bei 4 °C lagern.
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Representative Results
Mäuse haben ein CVP, das sich posterior auf der Zunge befindet, aus dem LGR5+ Stammzellen isoliert werden können (Abbildung 1A, Black Box). Die Injektion einer Enzymlösung unter und um das CVP (Abbildung 1B) führt zu einer leichten Schwellung des Epithels und einer Verdauung des Bindegewebes. Eine ausreichende Verdauung wird nach einer 33-minütigen Inkubation erreicht, die eine einfache Trennung des CVP-Epithels vom darunter liegenden Gewebe ermöglicht. Beim Versuch, das CVP-Epithel zu schälen, sollten Schnitte in ausreichendem Abstand zum CVP vorgenommen werden, um sicherzustellen, dass Gräben nicht gestört oder beschädigt werden (Abbildung 1C). Dies ermöglicht es auch, das Epithel mit einer Zette zu greifen, ohne das CVP zu beschädigen. Das Trimmen des Epithels, das das CVP umgibt, entfernt Nicht-Zielzellen und erhöht die Effizienz der folgenden Schritte, indem die zu manipulierende Gewebemasse verringert wird (Abbildung 1D). Es ist wichtig zu überprüfen, ob die beiden Gräben (Abbildung 1C, schwarze Pfeile) vorhanden sind, bevor CVP-Epithel zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt wird; Erfolgreiches Peeling des CVP umfasst einen Teil der Von Ebner-Drüsen und -Kanäle (Abbildung 1D, schwarze Pfeile). Wenn das geschälte Epithel diese beiden undurchsichtigen Strukturen nicht enthält, ist das Grabenepithel höchstwahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Verdauung des Bindegewebes gerissen.
Um die richtigen FACS-Einstellungen für die Sammlung von Lgr5-EGFP-Zellen festzulegen, werden Zellen aus dissoziierten CVPs getrennt von Wildtyp- und Lgr5-EGFP-Mäusen erhalten. Wildtyp-CVP-Zellen werden zuerst analysiert, um Gating-Parameter zu ermitteln, ein Prozess, bei dem Populationen von Zellen innerhalb der Scatterplot-Ausgabe nach interessanten Merkmalen kategorisiert werden24. Hier wurden vier Parameter verwendet, um letztendlich Zellen für die Beschichtung zu identifizieren. Der erste Parameter, die Vorwärtsstreuung, filtert Partikel und Ablagerungen basierend auf der detektierten Oberfläche heraus. Dieser Parameter entfernt ~70 % aller während der Sortierung erkannten Ereignisse (Abbildung 3). Der width-Parameter filtert Ereignisse basierend auf der Größe weiter, um die Auswahl einzelner Zellen (Singlets) sicherzustellen. Etwa 90 % der Ereignisse sind Singlets (Abbildung 3). Der Kernmarker DAPI wird von toten, aber nicht lebenden Zellen aufgenommen und ermöglicht so das Aussortieren toter Zellen25. Dieses Protokoll optimiert die Zelllebensfähigkeit, da über 90% der Ereignisse lebende Zellen sind (Abbildung 3). Schließlich werden die GFP-Gating-Parameter über dem Autofluoreszenzniveau von Wildtypzellen eingestellt. Wildtypzellen werden nicht gesammelt; sie werden ausschließlich als Gating-Kontrolle für die GFP-Fluoreszenz verwendet. Mit Gating-Parametern, die aus der Wildtypprobe bestimmt werden, werden dann Zellen aus der Lgr5 -EGFP-Probe durch das Durchflusszytometer geführt, um zur Sammlung sortiert zu werden. Gates können zu Beginn der Lgr5-EGFP-Sortierung angepasst werden, um eine klare Clusterung bestimmter Zellpopulationen zu ermöglichen, sollten jedoch in der Mitte nicht signifikant verändert werden. Es wurde festgestellt, dass die Dissoziation von drei gepoolten Lgr5-EGFP-CVPs ~ 500.000 Zellen ergibt, einschließlich durchschnittlich 10.000 GFP+ Zellen.
Die richtigen Medien- und Kulturbedingungen sind entscheidend für ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung von Organoiden. Frühere Studien mit lingualen Organoiden modellierten ihre Medienkomponenten nach denen aus dem intestinalen Organoidfeld, einschließlich Wnt3a, EGF, Noggin und R-Spondin17,18,19,20,21,22. Wenn jedoch linguale Organoide mit einer ähnlichen Methode kultiviert werden (WENR-Medien), wachsen Organoide nicht effizient (Abbildung 5A). In menschlichen Darmorganoiden werden die Medikamente A8301 (ein TGFß-Signalhemmer) und SB202190 (ein p38-MAPKinase-Signalhemmer) verwendet, um das Organoidwachstum zu fördern26. Tatsächlich induziert die Zugabe dieser Inhibitoren (WENRAS-Medien) ein robustes Wachstum von lingualen Organoiden (Abbildung 5A). Interessanterweise führt die Entfernung dieser Inhibitoren aus dem Medium nach 6 Tagen zu einer höheren Expression des allgemeinen TRC-Markers Kcnq1,was darauf hindeutet, dass A8301 und SB202190 die Differenzierung der Geschmackszellen behindern (Abbildung 5B). Somit wird ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung erreicht, indem Organoide in WENRAS-Medien von den Tagen 0-6 bzw. WENR-Medien von den Tagen 6-12(Abbildung 4, Abbildung 5)kultiviert werden.
Die Zusammensetzung des Organoidzelltyps kann durch qRT-PCR oder Immunhistochemie charakterisiert werden. Reife Organoide enthalten sowohl Geschmackszellen, gekennzeichnet durch Kcnq1 und KRT8, als auch Nicht-Geschmacksepithelzellen, gekennzeichnet durch Krt13/KRT13 (Abbildung 6, 8A). Dies deutet darauf hin, dass isolierte LGR5+ -Zellen in vitro eine ähnliche Potenz haben wie in vivo, da Lgr5-GFP+ -Zellen in der erwachsenen Zunge sowohl Geschmacks- als auch Nicht-Geschmackslinien produzieren5. Darüber hinaus wird Krt13 in höheren Konzentrationen exprimiert als alle 3 TRC-Marker (Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass Organoide überwiegend aus nicht schmeckenden Epithelzellen bestehen. Tatsächlich zeigt die relative Quantifizierung der Genexpression27, dass Krt13 50x höher exprimiert wird als der allgemeine TRC-Marker Kcnq1 (Student's t-test, p = 0,0004). Dies wird erwartet, da die Zunge einen ähnlichen Anteil an Geschmack gegenüber Nicht-Geschmacksepithelhat 1. Organoide exprimiert alle drei TRC-Typen (Abbildung 6, 8B, C). Typ-I-Zellen (gekennzeichnet durch Entpd2)und bittere Typ-II-Zellen (gekennzeichnet durch Gnat3)werden stark in Geschmacksorganoiden exprimiert, während sauer schmeckende Typ-III-Zellen (gekennzeichnet durch Car4)seltener sind (Abbildung 6). TRCs sind zufällig in Organoiden verteilt (Abbildung 8) und nicht in diskreten Geschmacksknospenstrukturen, die in vivobeobachtet werden.
Abbildung 1: Sezierte Zunge und geschältes CVP-Epithel. (A) Die Zunge wird seziert, und die vordere Zunge wird entfernt, indem nur vor der intermolaren Eminenz (gestrichelte Linie) geschnitten wird, wobei die hintere Zunge, die das CVP (Black Box) enthält, verlassen wird (B) Eine Nadel wird nur anterior zur intermolaren Eminenz (schwarzer Pfeil) eingeführt, und enzymgemisch wird unter und an die seitenrändernden Kanten des CVP (Black Box) injiziert. (C) Ungetrimmtes geschältes Epithel, das die CVP-Gräben umgibt (schwarze Pfeile) und (D) getrimmtes geschältes CVP-Epithel. Von Ebners Drüsen und Gänge (D, schwarze Pfeile ) sind nach erfolgreichem Abblättern der Gräben sichtbar. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Arbeitsablauf der lingualen Organoiderzeugung. Die Zunge wird von Lgr5-EGFP-Mäusen entfernt. Die CVP-Grabenepithelien (rote Box) werden aus dem darunter liegenden Bindegewebe geschält und in einzelne Zellen dissoziiert. GFP+ -Zellen werden isoliert und in Matrixgel mit einer Dichte von 200 Zellen pro Vertiefung in einer 48-Well-Platte plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gating für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. (A) Der Kontrolllauf (Wildtyp-CVP-Zellen) bestimmt die FACS-Gatter, die Trümmer und gebrochene Zellen über Vorwärtsstreuung eliminieren, identifiziert Singlets über die Seitenstreubreite, trennt DAPIneg live von DAPI+ toten Zellen und stellt den Autofluoreszenzgrad von Wildtypzellen fest. (B) Zuvor festgelegte Gatter werden auf den Versuchslauf (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP-Zellen) aufgebracht, um trümmerfreie, einzelne, lebende Lgr5-EGFP+ Zellen zu isolieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zeitleiste der lingualen Organoidkultur und erforderliche Medien. Der ROCK-Inhibitor Y27632 wird dem Medium für die ersten 48 Stunden der Kultur zugesetzt, um das Überleben der Zellen zu fördern. Während der Proliferationsphase werden Organoide mit konditioniertem Medium gefüttert, das A8301 und SB202190 (WENRAS) enthält, um das Wachstum zu optimieren. Diese Medikamente werden ab Tag 6 den Medien (WENR) vorenthalten, um die Differenzierung zu fördern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Medikamente A8301 und SB202190 beeinflussen das Organoidwachstum und die Differenzierung. (A) Hellfeldbilder von Organoiden, die entweder in WENR-Medien (Tag 0-12), WENRAS-Medien (Tag 0-12) oder WENRAS (Tag 0-6), dann WENR (Tag 6-12) gezüchtet wurden. Die Bilder wurden an Tag 2, Tag 6 und Tag 12 der Kultur mit Live-Imaging-Software aufgenommen. Maßstabsbalken: 400 μm (B) Die relative Genexpression eines globalen TRC-Markers Kcnq1 ist signifikant reduziert, wenn die Medikamente A8301 und SB202190 während der Organoiddifferenzierung vorhanden sind. Jeder Punkt repräsentiert ein biologisches Replikat, das drei gepoolte Brunnen umfasste. Die mittlere Veränderung der relativen Genexpression (horizontale Linie) wurde durch Mittelung von drei biologischen Replikaten berechnet. Fehlerbalken: ±SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Linguale Organoide exprimiert kanonische Geschmackszellmarker. Veränderung des Zyklusschwellenwerts (Ct) des globalen TRC-Markers Kcnq1, des nicht-geschmacksepithelialen Markers Cytokeratin 13 (Krt13), des Typ I TRC-Markers Entpd2, des Typ II bitteren TRC-Markers Gnat3und des sauren TRC-Markers Car4vom Typ III im Vergleich zum Housekeeping-Gen Rpl19. Jeder Punkt repräsentiert ein biologisches Replikat, das drei gepoolte Brunnen aus einer 48-Brunnen-Platte umfasste. Die mittlere Änderung des Ct-Wertes (horizontale Linie) für jeden Marker wurde durch Mittelung von drei biologischen Replikaten berechnet. Ungepaarter Student's t-Test, *p < 0,05. Fehlerbalken: ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Montage von lingualen Organoiden für die invertierte konfokale Mikroskopie. (A) Es entsteht eine ~1 mm dicke Schnur aus ungiftigem Modellierton. (B) Der Ton wird als ~20 mm x 20 mm Quadrat in der Mitte eines 24 mm x 75 mm Mikroskopobjektträgers geformt. (C) Ein quadratischer Abdeckrlip von 22 mm x 22 mm versiegelt organoide, die im Montagemedium aufgehängt sind. Maßstabsleiste: 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Immunmarkierung intakter lingualer Organoide. Konfokale Bilder von fixierten, immungefärbten Organoiden. (A) Optischer Schnitt eines Organoids, das für den nicht geschmacksepithelialen Marker KRT13 (grün) und den allgemeinen TRC-Marker KRT8 (magenta) gefärbt ist. (B) Maximale Projektion eines konfokalen z-Stapels eines Organoids, das für den gliaartigen Zellmarker Typ I NTPDase2 (grün) und KRT8 (magenta) gefärbt ist. (C) Maximale Projektion eines konfokalen z-Stapels von zwei teilweise gezeigten Organoiden (weiß gestrichelte Umrisse) und einem vollständigen Organoid, das für den sauren Zellmarker CAR4 (grün) vom Typ III gefärbt ist, und des bitter detektierenden Zellmarkers GUSTDUCIN (Magenta). Maßstabsleiste: 100 μm für A, B und C. Kernmarker DAPI (blau, rechte Spalte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Genname | Vorwärts grundieren (5'-3') | Reverse Primer (5'-3') | Assession-Nummer | ||||||
| Auto4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078,2 | ||||||
Tabelle 1: Primersequenzen für die quantitative RT-PCR.
Ergänzende Tabelle 1: Vergleich der veröffentlichten lingualen organoiden Nährmedienkomponenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird eine effiziente und leicht wiederholbare Methode zur Kultivierung, Aufrechterhaltung und Verarbeitung von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen berichtet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von drei CVPs von 8 bis 20 Wochen alten Lgr5 -EGFP-Mäusen ausreicht, um ~ 10.000 GFP+ -Zellen für den experimentellen Einsatz zu erhalten, was zu 50 Wells mit einer Dichte von 200 Zellen pro Well in 48-Well-Platten führt. Die Entfernung von CVP-Grabenepithelien wird optimiert, indem das Lingualenepithel mit frisch hergestellter Dispase II- und Typ-I-Kollagenaselösung injiziert wird, gefolgt von einer 33-minütigen Inkubation. Eine kürzere Inkubationszeit, alte Enzymal aliquoten, unterschiedliche Lots oder die Verwendung von Enzymen verschiedener Hersteller können jedoch zu einer unvollständigen Grabenentfernung führen. Umgekehrt führt eine längere Inkubationszeit zu einer Überverdauung des Gewebes, was zu einem Verlust der Integrität des Geschmacksgewebes führt. Nach dem Peeling erfolgte die weitere Anreicherung für CVP-Gräben, indem das das CVP umgebende Epithel entfernt wurde.
Es ist wichtig, dass alle Mikrozentrifugenröhrchen, die während des Dissoziations- und Entnahmeprozesses verwendet werden, mit FBS beschichtet sind, um zu verhindern, dass Gewebe und Zellen an den Kunststoffwänden der Röhrchen haften, was die Erholung isolierter Zellen erheblich reduziert (Daten nicht gezeigt). Die Verwendung einer leichten Schicht FBS und das Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit aus den Röhrchen vor der Verwendung minimiert mögliche hemmende Wirkungen auf Trypsin oder andere Enzyme.
Linguale Organoide wurden erfolgreich aus dissoziiertem CVP-Gewebe ohne vorherige Sortierung von LGR5+ Zellengezüchtet 17. Obwohl diese Methode zur Bildung von Organoiden führt, haben wir festgestellt, dass ein geringerer Anteil dieser Organoide Geschmackszellen enthält als diejenigen, die aus isolierten Vorläuferzellen gezüchtet wurden (Daten nicht gezeigt). Die Flusssortierung für Lgr5-EGFP+ Zellen reichert sich für geschmackskompetente Vorläufer an, was zu einem höheren Anteil an geschmacksintensiven Organoiden führt. Derzeit sammeln wir alle Zellen oberhalb der Schwelle der GFP-Autofluoreszenz (Abbildung 3); Es ist jedoch möglich, dass GFP-Helligkeitsstufen mit variabler Organoidbildungseffizienz oder Geschmackskompetenz verbunden sind. Diese Hypothese wurde noch nicht getestet, ist aber ein vielversprechender Weg für zukünftige Arbeiten, da sie eine weitere Anreicherung von geschmackszellhaltigen Organoiden ermöglichen könnte.
Es ist bekannt, dass die Beschichtungsdichte die Effizienz der Organoiddifferenzierung beeinflusst, und wir empfehlen, die optimale Beschichtungsdichte vor dem Experimentieren zu bestimmen28. Größe und Tiefe der Vertiefungen sowie das Matrixgelvolumen sollten bei der Bestimmung der Beschichtungsdichte berücksichtigt werden. Basierend auf unseren Vorarbeiten (Daten nicht gezeigt) stellen wir fest, dass in einer 48-Well-Platte 15 μL Matrixgel und eine Beschichtungsdichte von 200 Zellen pro Vertiefung eine effiziente Organoidexpansion und Differenzierung aller drei TRC-Typen ermöglichen. Wir haben herausgefunden, dass linguale Organoide erfolgreich und reproduzierbar in Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract (RGF BME), einer synthetischen und kostengünstigeren Matrixgel-Alternative, kultiviert werden können. Andere alternative Matrizen können auch die linguale Organoidkultur unterstützen, aber weitere Tests sind erforderlich, um diese Möglichkeit zu untersuchen.
Während der Beschichtung sollten gesammelte Zellen gründlich, aber schonend in Matrixgel resuspendiert werden, indem häufig auf und ab pipettiert wird, um die Zellsuspension homogen zu halten. Das Röhrchen, das die Zell-Matrix-Gel-Mischung enthält, sollte auch während des gesamten Beschichtungsprozesses auf Eis gehalten werden, um zu verhindern, dass Matrixgel an den Seiten des Röhrchens geliert. Diese Maßnahmen sorgen für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf die Vertiefungen und liefern reproduzierbarere Ergebnisse bei der Handbeschichtung von Zellen. Insbesondere die jüngsten Entwicklungen in mikrofluidischen Technologien bieten Optionen mit hohem Durchsatz für die Zelldosierung und sind ein vielversprechendes Werkzeug für zukünftige Arbeiten29.
Um die Genexpression in kultivierten Organoiden zu beurteilen, wurde festgestellt, dass es notwendig ist, mindestens drei Vertiefungen für jedes biologische Replikat zu bündeln, um eine ausreichende RNA und Konsistenz über Replikate hinweg zu erhalten (Abbildung 6). Es wurde auch festgestellt, dass die sofortige Lyse entnommener Organoide nach spezifischen Herstelleranweisungen die Qualität und Quantität der extrahierten RNA optimiert. Obwohl hier nicht getestet, können andere Speicheroptionen wie Flash-Freezing oder Resuspension in Speicherreagenzien auch die RNA-Ausbeute und -Qualität erhalten.
Die Durchführung der Immunhistochemie an Organoiden kann eine Herausforderung sein, da primäre und sekundäre Antikörper jedes verbleibende Matrixgel und das gesamte Organoidepithel durchdringen müssen. In früheren Berichten wurden Organoide fixiert, während sie noch in Matrixgel suspendiert waren, was anschließend extrem hohe Konzentrationen der primären Antikörperlösung erforderte, um die Proteinexpression aufzudecken17,18. Ähnlich wie in anderen Berichten wurde festgestellt, dass die Entfernung von Organoiden aus Matrixgel mit Cell Recovery Solution vor der Fixierung die Effizienz der Färbung erhöht, ohne dass eine hohe Antikörperkonzentration erforderlich ist30,31; Der Nachweis einiger Geschmackszellmarker, z. B. CAR4, erfordert jedoch eine höhere Antikörperkonzentration. Darüber hinaus erhöht die Inkubation von Organoiden in primären Antiseren für 3 Nächte die Wahrscheinlichkeit einer Antikörperbindung. Diese Methode kann jedoch auch die Hintergrundfluoreszenz erhöhen, wenn Organoide nach der Immunfärbung unzureichend gewaschen werden. Wichtig ist, dass verdünnte primäre Antikörperlösung gespeichert und ein oder mehrere Male erfolgreich wiederverwendet werden kann, wenn sie weniger als eine Woche gelagert wird (Daten nicht gezeigt). Für eine optimale Bildgebung werden Organoide montiert, indem ein Coverlip auf einen Tonumfang aus Modelliermasse gelegt wird, um ihre 3D-Struktur zu erhalten. Wenn Sie das Deckglas direkt auf den Objektträger legen, werden Organoide komprimiert und bricht sie, wodurch eine ordnungsgemäße Analyse verhindert wird.
Die Organoidkultur ist eine hoch anwendbare, kostengünstige Technik. Einige Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening und das Studium der Stammzell- und Entwicklungsbiologie32. Daher ist es entscheidend, Organoidmodelle zu standardisieren, um eine Reproduzierbarkeit über Labore hinweg zu ermöglichen. In Zukunft wäre es sinnvoll, eine standardisierte Methode zur Weitergabe von lingualen Organoiden zu entwickeln, die garantiert, dass die Geschmacksstammzellpotenz über serielle Passagen verbreitet werden kann, wodurch der Bedarf an zusätzlichen Tieren zur Erzeugung von mehr Organoiden reduziert wird. Wichtig ist, dass, während linguale Organoide sowohl aus Geschmacks- als auch aus Nicht-Geschmacksepithelzellen bestehen, sich die Organisation dieser Zellen vom In-vivo-Geschmackssystem unterscheidet. Diskrepanzen zwischen Organoiden und Geschmacksepithel in vivo können auf die für die Organoidkultur verwendeten Medien zurückzuführen sein und/oder darauf, dass Organoide keine Wechselwirkung mit der Mikroumgebung der Geschmacksknospen haben, einschließlich wichtiger Signale von Gustatornerven und der Lamina propria, die für die Bildung und Aufrechterhaltung von Geschmacksknospen erforderlich sind22,33,34,35. Zukünftige Arbeiten zur Integration von Nerven oder Vaskulaturen in die linguale Organoidkultur, eine Strategie, die derzeit in anderen Organoidsystemen übernommen wird, könnten eine genauere Modellierung des In-vivo-Geschmacksepithels ermöglichen36,37.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Peter Dempsey und Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) für die Bereitstellung von WNR-konditionierten Medien und wertvollen Diskussionen. Wir danken auch dem University of Colorado Cancer Center Cell Technologies und Flow Cytometry Shared Resources, insbesondere Dmitry Baturin, für die Expertise in der Zellsortierung. Diese Arbeit wurde finanziert durch: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 und NIH/NCI R21 CA236480 an LAB und R21DC016131 und R21DC016131-02S1 an DG und F32 DC015958 an EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
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