Summary
Le protocole présente une méthode de culture et de traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches gustatives isolées de la papille gustative postérieure de souris adultes.
Abstract
Le sens du goût est médié par les papilles gustatives sur la langue, qui sont composées de cellules réceptrices du goût (CRT) qui se renouvellent rapidement. Ce renouvellement continu est alimenté par des cellules progénigènes locales et rend la fonction gustative sujette à la perturbation par une multitude de traitements médicaux, ce qui à son tour affecte gravement la qualité de vie. Ainsi, l’étude de ce processus dans le contexte du traitement médicamenteux est essentielle pour comprendre si et comment la fonction progéniteur du goût et la production de CCR sont affectées. Compte tenu des préoccupations éthiques et de la disponibilité limitée des tissus du goût humain, les modèles murins, qui ont un système gustatif similaire à celui des humains, sont couramment utilisés. Par rapport aux méthodes in vivo, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et ne se prêtent pas à des études à haut débit, les organoïdes linguaux murins peuvent permettre d’exécuter rapidement des expériences avec de nombreux répliquants et moins de souris. Ici, des protocoles précédemment publiés ont été adaptés et une méthode standardisée pour générer des organoïdes du goût à partir de cellules progénitres du goût isolées de la papille circumvallate (CVP) de souris adultes est présentée. Les cellules progénitaires du CVP expriment LGR5 et peuvent être isolées via le tri cellulaire activé par fluorescence EGFP (FACS) de souris porteuses d’un allèleLgr5 EGFP-IRES-CreERT2. Les cellules triées sont plaquées sur un système de culture 3D à base de gel matriciel et cultivées pendant 12 jours. Les organoïdes se développent pendant les 6 premiers jours de la période de culture par prolifération, puis entrent dans une phase de différenciation, au cours de laquelle ils génèrent les trois types de cellules gustatives ainsi que des cellules épithéliales sans goût. Les organoïdes peuvent être prélevés à maturation au jour 12 ou à tout moment pendant le processus de croissance pour l’expression de l’ARN et l’analyse immunohistochimique. La normalisation des méthodes de culture pour la production d’organoïdes linguaux à partir de cellules souches adultes améliorera la reproductibilité et fera progresser les organoïdes linguaux en tant qu’outil puissant de dépistage des médicaments dans la lutte contre les patients souffrant de dysfonctionnement du goût.
Introduction
Chez les rongeurs, les papilles gustatives linguales sont logées dans des papilles fongiformes réparties antérieurement, des papilles foliées bilatérales postérieures, ainsi que dans une papille circumvallate unique (CVP) à la ligne médiane postodorale de la langue1. Chaque papille gustative est composée de 50 à 100 cellules réceptrices du goût (CRT) à courte durée de vie et à renouvellement rapide, qui comprennent des cellules de soutien de type I gliales, des cellules de type II qui détectent les cellules douces, amères et umami, et des cellules de type III qui détectent les cellulesacides 2,3,4. Chez la souris CVP, les cellules souches LGR5+ le long de la lame basale produisent tous les types de TRC ainsi que des cellules épithéliales sans goût5. Lors du renouvellement de la lignée gustative, les cellules filles LGR5 sont d’abord spécifiées comme des cellules précurseurs du goût post-mitotique (cellules de type IV) qui pénètrent dans une papille gustative et sont capables de se différencier dans l’un des trois types de TRC6. Le renouvellement rapide des CT rend le système gustatif sensible à la perturbation par les traitements médicaux, y compris les radiations et certaines pharmacothérapies7,8,9,10,11,12,13. Ainsi, l’étude du système gustatif dans le contexte de la régulation des cellules souches du goût et de la différenciation de la CVR est essentielle pour comprendre comment atténuer ou prévenir le dysfonctionnement du goût.
Les souris sont un modèle traditionnel pour les études in vivo en science du goût car elles ont un système gustatif organisé de la même manière que les humains14,15,16. Cependant, les souris ne sont pas idéales pour les études à haut débit, car elles sont coûteuses à entretenir et prennent beaucoup de temps à travailler. Pour surmonter ce problème, des méthodes de culture organoïde in vitro ont été développées ces dernières années. Les organoïdes gustatifs peuvent être générés à partir de tissu CVP natif, un processus dans lequel les organoïdes bourgeonnent à partir de l’épithélium CVP isolé de souris cultivé ex vivo17. Ces organoïdes présentent un épithélium multicouche compatible avec le système gustatif in vivo. Un moyen plus efficace de générer des organoïdes qui ne nécessitent pas de culture ex vivo de CVP a été développé par Ren etal. en 201418. Adaptant les méthodes et les milieux de culture d’abord développés pour développer des organoïdes intestinaux, ils ont isolé des cellules progéniatrices Lgr5-GFP+ uniques de souris CVP et les ont plaquées dans un gel matriciel19. Ces cellules uniques ont généré des organoïdes linguaux qui prolifèrent au cours des 6 premiers jours de culture, commencent à se différencier vers le jour 8 et, à la fin de la période de culture, contiennent des cellules épithéliales sans goût et les trois types de CCR18,20. À ce jour, de multiples études utilisant le système de modèle organoïde lingual ont été publiées17,18,20,21,22; toutefois, les méthodes et les conditions de culture utilisées pour générer ces organoïdes varient d’une publication à l’autre(tableau supplémentaire 1). Ainsi, ces méthodes ont été ajustées et optimisées ici pour présenter un protocole standardisé détaillé pour la culture d’organoïdes linguaux dérivés de LGR5+ progéniteurs de CVP de souris adultes.
Les organoïdes linguaux fournissent un modèle unique pour l’étude des processus biologiques cellulaires qui stimulent le développement et le renouvellement des cellules gustatives. Alors que les applications des organoïdes linguaux se développent et que de plus en plus de laboratoires s’orientent vers l’utilisation de modèles organoïdes in vitro, il est important que le domaine s’efforce de développer et d’adopter des protocoles standardisés pour améliorer la reproductibilité. L’établissement des organoïdes linguaux en tant qu’outil standard dans la science du goût permettrait des études à haut débit qui démêlent comment les cellules souches uniques génèrent les cellules différenciées du système gustatif adulte. De plus, des organoïdes linguaux pourraient être utilisés pour dépister rapidement les médicaments pour les impacts potentiels sur l’homéostasie du goût, qui pourraient ensuite être étudiés plus en profondeur dans des modèles animaux. En fin de compte, cette approche renforcera les efforts visant à concevoir des thérapies qui améliorent la qualité de vie des futurs receveurs de médicaments.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été effectuées dans un établissement accrédité par l’AAALAC conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, à la Loi sur le bien-être des animaux et à la Politique des services de santé publique, et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado. Les souris Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilisées dans ce protocole proviennent du Jackson Laboratory, stock n° 008875.
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées avant de commencer pour assurer une progression en douceur et en temps opportun du protocole: mettre le bain-marie à 37 ° C, régler la centrifugeuse à 4 ° C, faire des solutions enzymatiques d’injection et de dissociation à partir des solutions de 10 mg / mL Dispase, Collagénase et Elastase (voir tableau des matériaux),retirer le gel matriciel du congélateur à -20 ° C (~ 750 μL nécessaire pour une plaque de 48 puits) et décongeler en immergeant le flacon dans de la glace pour à au moins 3-4 h, tubes de microcentrifugation pré-enduits dans des FBS non dilués en se balançant doucement à température ambiante pendant au moins 30 min (deux tubes de 2 mL pour la collecte de tissus, deux tubes de 1,5 mL pour les cellules dissociées et un tube de 1,5 mL pour la collecte de cellules individuelles à partir du trieur de cellules; éliminer l’excès de FBS avant utilisation).
1. Isolement de l’épithélium CVP
REMARQUE: Pour obtenir suffisamment de cellules LGR5+ pour une plaque complète de 48 puits, collectez trois CVP Lgr5-EGFP dans le même tube et traitez simultanément. Il est important de récolter et de traiter le CVP d’au moins un compagnon de litière de type sauvage en parallèle dans un tube séparé et de l’utiliser comme contrôle de contrôle pour définir les paramètres FACS (voir Résultats représentatifs).
- Euthanasier les souris avec une asphyxie au CO2 conformément à la réglementation de l’IACUC, suivie d’une méthode secondaire approuvée telle que la thoracotomie bilatérale, la luxation cervicale, la décapitation ou l’exsanguination.
- Utilisez de gros ciseaux de dissection stériles pour couper les joues et casser la mâchoire. Soulevez la langue et coupez le frein linguale pour séparer la langue du sol de la cavité buccale. Découpez la langue et recueillez-la dans la solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) stérile et glacée de Dulbecco avec Du2+ et Mg2+.
- Retirez et jetez la langue antérieure en coupant juste avant l’éminence intermolaire avec une lame de rasoir(Figure 1A,ligne pointillée). Utilisez une lingette délicate pour enlever les poils et l’excès de liquide de la langue postérieure.
- Remplir la seringue de 1 mL avec 200-300 μL de solution enzymatique injectable (concentration finale : 2 mg/mL de collagénase de type I et 5 mg/mL de Dispase II dans du dPBS contenant du Ca2+/Mg2+,dilué à partir de solutions mères de 10 mg/mL) et insérer une aiguille de 30 G x 1/2 juste au-dessus de l’éminence intermolaire (Figure 1B, flèche noire) jusqu’à ce qu’elle soit juste avant le CVP ( Figure1B, boîte noire). Injecter la solution enzymatique sous et sur les bords latéraux du CVP entre l’épithélium et les tissus sous-jacents (lamina propria, muscle). Retirez la seringue lentement et continuellement de la langue pendant l’injection.
- Incuber la langue dans du dPBS stérile sans Ca2+/ Mg2+à température ambiante pendant 33 min avec précision.
- Faites de petites coupures dans l’épithélium bilatéralement et juste avant le CVP à l’aide de ciseaux à dissection extra fins, et pelez doucement l’épithélium en le soulevant avec une pince fine. Une fois que l’épithélium de tranchée est libre du tissu conjonctif sous-jacent, placez-le dans un tube de microcentrifugation vide de 2 mL pré-enduit de FBS. Effectuer la coupe épithéliale avant ou après le détachement de l’épithélium CVP (Figure 1C, D).
2. Dissociation de l’épithélium CVP
REMARQUE: La dissociation de l’épithélium CVP et le placage sont représentés graphiquement à la figure 2.
- Ajouter le cocktail enzymatique de dissociation (concentration finale : 2 mg/mL de collagénase de type I, 2 mg/mL d’élastase et 5 mg/mL de Dispase II dans du dPBS contenant du Ca2+/Mg2+,dilué à partir de solutions d’essai de 10 mg/mL) dans des tubes contenant de l’épithélium CVP pelé (200 μL par CVP). Incuber au bain-marie à 37 °C pendant 45 min. Vortex brièvement toutes les 15 minutes.
REMARQUE: Pré-pré-pré-température 0,25% de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 ° C pendant les 15 dernières minutes d’incubation du cocktail enzymatique. - Après incubation, vortex (trois impulsions) puis trituration avec une pipette Pasteur en verre pendant 1 min. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipeter le surnageant contenant la première collection de cellules dissociées, dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL revêtus de FBS correspondant au génotype. Traiter les morceaux de tissu restants comme décrit à l’étape 2.3. sous.
- Faire tourner le surnageant pendant 5 min à 370 x g et 4 °C sur des cellules à granulés.
- Retirez le surnageant résultant et ressuspendez la pastille cellulaire dans un tampon facS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) et 1 % FBS dans Ca2+/ Mg2+PBS libre (50 μL par CVP)). Conserver sur la glace.
- Lors de l’exécution des étapes 2.2.1 et 2.2.2, dissocier les morceaux de tissu restants de l’étape 2.2 en ajoutant de la trypsine-EDTA préchauffée à 0,25 % (200 μL par CVP) aux tubes de microcentrifuge de 2 mL d’origine et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Vortex brièvement toutes les 10 minutes.
- Après incubation, vortex le tube contenant des morceaux de tissu (trois impulsions) puis triturer avec une pipette Pasteur en verre pendant 1 min. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipeter le surnageant dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant les cellules de l’étape 2.2.2. Jetez les tubes contenant les morceaux de tissu restants.
- Faire tourner les tubes avec des cellules dissociées pendant 5 min à 370 x g et 4 °C en cellules à granulés.
- Retirez le surnageant et resuspendez les pastilles de cellules dans le tampon FACS (100 μL par CVP). Conserver sur la glace.
- Faire passer les cellules à travers un filtre à mailles de nylon de 30 μm et ajouter du DAPI(émission λ = 450 nm) aux mélanges cellulaires avant le FACS. Isoler les cellules Lgr5-GFP+ via FACS en utilisant le canal protéique fluorescent vert(excitation λ = 488 nm;émission λ = 530 nm). Trier les cellules à l’aide d’une buse de 100 μm dans un tube de microcentrifugationfrais de 1,5 mL revêtu de FBS contenant 300 μL de dPBS libre de Ca2+ / Mg 2 +. Placez les cellules sur de la glace jusqu’au placage.
3. Placage des cellules Lgr5-EGFP
- Déterminer le volume de suspension cellulaire LGR5+ reçue du cytomètre en flux.
- En fonction du nombre de cellules obtenues à partir du trieur, calculez le nombre de cellules par μL. Ensuite, déterminez le volume nécessaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules pour le placage (nous utilisons 200 cellules par puits d’une plaque de 48 puits) et transférez ce volume total de cellules en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation.
- Faire tourner le tube pendant 5 min à 370 x g et 4 °C sur des cellules à granulés (les granulés peuvent ne pas être visibles). Retirez le surnageant et placez le tube sur de la glace.
- Remettez doucement en place la pastille cellulaire dans la quantité appropriée de gel matriciel (15 μL par puits pour les plaques de 48 puits); pipettez doucement de haut en bas pour bien répartir les cellules dans un gel matriciel. Placer 15 μL de mélange de gel matriciel/cellule au centre de chaque puits. Gardez le tube de microcentrifugation sur la glace dans un tube conique de 50 mL pendant le placage pour empêcher le gel matriciel de geler. Continuer à mélanger le mélange de gel matriciel et de mélange cellulaire tout au long du placage en pipetant de haut en bas tous les trois puits pour assurer une répartition uniforme des cellules entre les puits.
- Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5% co2,~95% d’humidité) pendant 10 min pour permettre la gélification du gel matriciel. Ensuite, ajoutez 300 μL de milieu WENRAS + Y27632 à température ambiante à chaque puits et retournez la plaque à l’incubateur.
4. Entretien organoïde
REMARQUE: Les organoïdes sont cultivés dans des milieux organoïdes conventionnels (WENR) comprenant de l’EGF recombinant et des milieux conditionnés à 50% contenant Wnt3a, Noggin et R-spondin23. Les médicaments A8301 et SB202190 sont ajoutés pendant les 6 premiers jours de la période de culture pour optimiser la croissance (supports WENRAS)(Figure 5),puis retirés pour favoriser la différenciation (supports WENR)20. Y27632 est ajouté pour les 2 premiers jours de culture afin de favoriser la survie. Les conditions des médias par rapport à la chronologie de la culture sont présentées à la figure 4.
- Deux jours après le placage, retirer les milieux WENRAS + Y27632 de chaque puits à l’aide d’une pipette de 1 mL, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de contamination croisée. Ajouter 300 μL de milieu WENRAS sur le côté du puits pour ne pas perturber le gel matriciel. Re renvoyer la plaque à l’incubateur.
- Changez le média tous les 2 jours, en utilisant le support approprié pour l’étape de culture (Figure 4). Conservez les organoïdes jusqu’au jour 12, lorsque les organoïdes sont prêts à être prélevés.
5. Traitement de l’ARN
- Prélèvement d’organoïdes pour l’ARN
- Placer la plaque de 48 puits sur la glace pendant 30 min pour dépolymériser le gel matriciel.
- À l’aide d’une pipette de 1 mL, tirer le milieu organoïde vers le haut; puis, lorsque le média est renvoyé au puits, utilisez l’extrémité de la pipette pour rayer et briser davantage le gel matriciel. Transférer le contenu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, en remettant en commun le contenu de trois puits dans un tube. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
- Enlever autant de surnageant de milieu que possible sans enlever d’organoïdes; puis, faites tourner à nouveau les tubes pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
- Retirer le milieu restant et ressuspender les organoïdes dans un tampon de lyse de 350 μL + β-mercaptoéthanol (βME) (10 μL βME par tampon de lyse de 1 mL). Placer les échantillons sur de la glace pour une extraction immédiate de l’ARN ou les conserver à -80 °C.
- Analyse quantitative RT-PCR
- Mesurer la quantité d’ARN via un spectrophotomètre. Transcrire l’ARN à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
- Mélanger l’ADNc équivalent à 5 ng d’ARN avec 200 nM d’amorces avant et arrière pré-validées(Tableau 1)et un mélange maître de PCR fluorescent. Exécutez la réaction qRT-PCR pendant 40 cycles à : 95 °C pendant 15 s, puis 60 °C pendant 60 s.
6. Immunohistochimie
- Prélèvement et fixation des organoïdes
- Placez la plaque de 48 puits sur la glace pendant 30 minutes pour desserrer le gel matriciel.
- Retirez le milieu organoïde et ajoutez 400 μL de PBS glacé à chaque puits. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 400 μL de solution de récupération cellulaire glacée à chaque puits. Basculez doucement à 4 °C pendant 30 min.
- Enduisez une pointe de pipet de 1 mL avec 1% de BSA dans du PBS, et pipetez doucement le contenu du puits de haut en bas pour briser le gel de matrice. Transférer les organoïdes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL placé sur de la glace.
- Rincez chaque puits avec 300 μL PBS + 1% BSA et transférez les organoïdes restants dans les tubes correspondants. Retirez la solution de récupération cellulaire / PBS + BSA de chaque tube. Ajouter 400 μL de PBS glacé, puis répéter avec un autre rinçage PBS glacé.
- Retirez le PBS et fixez les organoïdes avec 300 μL de PFA glacé à 4 % (dans 0,1 M PB) pendant 20 min, en incubant à température ambiante. Retirez le PFA et rincez les organoïdes avec du PBS glacé de 400 μL.
- Supprimer PBS; ensuite, ajoutez 400 μL PBS + 1% BSA. Conserver à 4 °C.
- Coloration par immunofluorescence
- Rincer les organoïdes dans 500 μL PBS + 1% BSA. Ensuite, incuber les organoïdes dans une solution bloquante (5% de sérum normal de chèvre ou d’âne, 1% d’albumine sérique bovine, 0,3% de Triton X 100 dans 1x PBS pH 7,3) pendant 2 h, en se balançant doucement à température ambiante.
- Ajouter la solution d’anticorps primaires (anticorps primaires dilués dans une solution bloquante) et faire basculer doucement pendant 3 nuits à 4 °C.
- Laver les organoïdes 4x pendant 1 h avec 500 μL PBS + 0,2% Triton, en berçant doucement à température ambiante. Ajouter la solution d’anticorps secondaires (anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante) et les organoïdes de roche pendant la nuit, à l’abri de la lumière, à 4 °C.
- Laver les organoïdes 3x pendant 1 h avec 500 μL PBS + 0,2% Triton, à l’abri de la lumière et en se balançant doucement à température ambiante. Incuber avec du DAPI dilué 1:10 000 dans 0,1 M PB pendant 20 min, berçant et recouvert à température ambiante.
- Laver les organoïdes 3x pendant 20 min avec 0,1 M PB, en les berçant doucement et en les recouvrant à température ambiante.
- Montage sur glissière d’organoïdes pour la microscopie confocale inversée.
REMARQUE : des images étape par étape du processus de montage des diapositives sont illustrées à la figure 7.- Créez un périmètre carré d’environ 1 mm d’épaisseur 22 x 22 mm de pâte à modeler non toxique sur une lame de microscope.
- Retirer 0,1 M PB du tube de microcentrifugation et ressuspender doucement les organoïdes dans le milieu de montage de 100 μL de votre choix; puis, transfert au centre du carré d’argile.
- Remplissez le carré d’argile jusqu’à ce que le support de montage soit presque au sommet. Ensuite, placez un couvercle carré de 22 x 22 mm sur de l’argile et appuyez fermement sur les côtés du couvercle pour sceller. Laissez-le durcir selon les instructions du fabricant (ici, température ambiante pendant 1-2 jours) et conserver à 4 ° C.
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Representative Results
Les souris ont un CVP, situé postérieurement sur la langue, à partir duquel les cellules souches LGR5+ peuvent être isolées (Figure 1A, boîte noire). L’injection d’une solution enzymatique sous et autour du CVP(Figure 1B)entraîne un léger gonflement de l’épithélium et la digestion du tissu conjonctif. Une digestion suffisante est obtenue après une incubation de 33 minutes, ce qui permet de séparer facilement l’épithélium CVP du tissu sous-jacent. Lorsque vous tentez de peler l’épithélium du CVP, les coupures doivent être effectuées à une distance suffisante du CVP pour s’assurer que les tranchées ne sont pas perturbées ou endommagées(Figure 1C). Cela permet également de saisir l’épithélium à l’aide de pinces sans endommager le CVP. La coupe de l’épithélium entourant le CVP élimine les cellules non ciblées et augmente l’efficacité des étapes suivantes en diminuant la masse tissulaire manipulée (Figure 1D). Il est important de vérifier que les deux tranchées(Figure 1C,flèches noires)sont présentes avant d’ajouter de l’épithélium CVP au tube de microcentrifugation; Le pelage réussi du CVP comprend une partie des glandes et des conduits de Von Ebner(Figure 1D,flèches noires). Si l’épithélium pelé ne contient pas ces deux structures opaques, l’épithélium de tranchée est très probablement rompu en raison d’une digestion incomplète du tissu conjonctif.
Pour établir des paramètres FACS appropriés pour collecter des cellules Lgr5-EGFP, les cellules des CV dissociées sont obtenues séparément à partir de souris de type sauvage et de souris Lgr5-EGFP. Les cellules CVP de type sauvage sont d’abord analysées pour établir des paramètres de contrôle, un processus dans lequel les populations de cellules sont classées dans la sortie du nuage de points par caractéristiques d’intérêt24. Ici, quatre paramètres ont été utilisés pour finalement identifier les cellules à plaquer. Le premier paramètre, la dispersion vers l’avant, filtre les particules et les débris en fonction de la surface détectée. Ce paramètre supprime environ 70 % de tous les événements détectés pendant le tri (Figure 3). Le paramètre width filtre en outre les événements en fonction de la taille pour garantir la sélection de cellules uniques (singlets). Environ 90 % des événements sont des singlets (Figure 3). Le marqueur nucléaire DAPI est repris par des cellules mortes mais pas vivantes et permet ainsi de trier les cellules mortes25. Ce protocole optimise la viabilité des cellules, car plus de 90 % des événements sont des cellules vivantes(Figure 3). Enfin, les paramètres de contrôle GFP sont définis au-dessus du niveau d’autofluorescence des cellules de type sauvage. Les cellules de type sauvage ne sont pas collectées; ils sont utilisés uniquement comme contrôle de contrôle pour la fluorescence GFP. Avec les paramètres de contrôle déterminés à partir de l’échantillon de type sauvage, les cellules de l’échantillon Lgr5-EGFP sont ensuite passées à travers le cytomètre en flux pour être triées pour la collecte. Les portes peuvent être ajustées au début du tri Lgr5-EGFP pour s’adapter au regroupement clair de certaines populations cellulaires, mais ne doivent pas être modifiées de manière significative à mi-parcours. Il a été constaté que la dissociation de trois CVP Lgr5-EGFP regroupés donne environ 500 000 cellules, dont une moyenne de 10 000 cellules GFP+.
Des milieux et des conditions de culture appropriés sont essentiels pour une croissance et une différenciation optimales des organoïdes. Des études antérieures utilisant des organoïdes linguaux ont modélisé leurs composants médiatiques sur ceux du champ organoïde intestinal, y compris Wnt3a, EGF, Noggin et R-spondin17,18,19,20,21,22. Cependant, lorsque des organoïdes linguaux sont cultivés à l’aide d’une méthode similaire (milieu WENR), les organoïdes ne se développent pas efficacement(Figure 5A). Dans les organoïdes intestinaux humains, les médicaments A8301 (un inhibiteur de signalisation TGFß) et SB202190 (un inhibiteur de signalisation MAPKinase p38) sont utilisés pour favoriser la croissance organoïde26. En effet, l’ajout de ces inhibiteurs (MILIEUX WENRAS) induit une croissance robuste des organoïdes linguaux(Figure 5A). Fait intéressant, l’élimination de ces inhibiteurs du milieu après 6 jours entraîne une expression plus élevée du marqueur général de LAR Kcnq1,ce qui suggère que A8301 et SB202190 entravent la différenciation des cellulesgustatives (Figure 5B). Ainsi, une croissance et une différenciation optimales sont obtenues en cultivant des organoïdes dans des milieux WENRAS à partir de jours 0-6 et des milieux WENR à partir de jours 6-12 (Figure 4, Figure 5), respectivement.
La composition de type cellule organoïde peut être caractérisée par qRT-PCR ou immunohistochimie. Les organoïdes matures contiennent à la fois des cellules gustatives, marquées par Kcnq1 et KRT8, et des cellules épithéliales non gustatives, marquées par Krt13/ KRT13 (Figure 6, 8A). Cela suggère que les cellules LGR5+ isolées ont une puissance in vitro similaire à celle in vivo puisque, dans la langue adulte, les cellules Lgr5-GFP+ produisent à la fois des lignées gustatives et non gustatives5. De plus, Krt13 est exprimé à des niveaux plus élevés que les 3 marqueurs TRC(Figure 6),ce qui suggère que les organoïdes sont principalement composés de cellules épithéliales sans goût. En fait, la quantification relative de l’expressiongénique 27 indique que Krt13 est exprimé 50 fois plus haut que le marqueur TRC général Kcnq1 (test tde Student, p = 0,0004). Ceci est attendu, car la langue a une proportion similaire de goût par rapport à l’épithélium non gustatif1. Les organoïdes expriment les trois types de CVR (Figure 6, 8B, C). Les cellules de type I (marquées par Entpd2)et les cellules amères de type II (marquées par Gnat3)sont fortement exprimées dans les organoïdes du goût, tandis que les cellules de type III à détection aigre (marquées par Car4)sont moins fréquentes(Figure 6). Les CTS sont répartis aléatoirement dans les organoïdes(Figure 8)plutôt que dans des structures discrètes des papilles gustatives observées in vivo.
Figure 1: Langue disséquée et épithélium CVP pelé. (A) La langue est disséquée et la langue antérieure est enlevée en coupant juste avant l’éminence intermolaire (ligne pointillée), laissant la langue postérieure, qui comprend la CVP (boîte noire) (B) Une aiguille est insérée juste avant l’éminence intermolaire (flèche noire), et un mélange enzymatique est injecté en dessous et sur les bords latéraux de la CVP (boîte noire). (C) Épithélium pelé non taillé entourant les tranchées CVP (flèches noires) et (D) épithélium CVP pelé coupé. Les glandes et les conduits de Von Ebner(D,flèches noires) sont visibles après un épluchage réussi des tranchées. Barre d’échelle: 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Flux de travail de génération d’organoïdes linguaux. La langue est retirée des souris Lgr5-EGFP. Les épithéliums de la tranchée CVP (boîte rouge) sont pelés du tissu conjonctif sous-jacent et dissociés en cellules uniques. Les cellules GFP+ sont isolées et plaquées dans un gel matriciel à une densité de 200 cellules par puits dans une plaque de 48 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Grille pour le tri des cellules activées par fluorescence. (A) L’exécution du contrôle (cellules CVP de type sauvage) détermine les portes FACS qui éliminent les débris et les cellules cassées par diffusion vers l’avant, identifie les singlets via la largeur de diffusion latérale, sépare DAPIneg live de DAPI+ cellules mortes et établit le niveau d’autofluorescence des cellules de type sauvage. (B) Des portes préalablement déterminées sont appliquées à l’essai expérimental (cellules Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP) pour isoler les cellules Lgr5-EGFP+ sans débris, simples, vivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Chronologie de la culture organoïde linguale et milieux requis. L’inhibiteur de ROCK Y27632 est ajouté au milieu pendant les 48 premières heures de culture pour favoriser la survie cellulaire. Pendant la phase de prolifération, les organoïdes sont alimentés en milieu conditionné contenant de l’A8301 et du SB202190 (WENRAS) pour optimiser la croissance. Ces médicaments sont retenus dans les médias (WENR) à partir du jour 6 pour favoriser la différenciation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Les médicaments A8301 et SB202190 affectent la croissance et la différenciation des organoïdes. (A) Images en champ clair d’organoïdes cultivés dans des milieux WENR (jour 0-12), WENRAS (jour 0-12) ou WENRAS (jour 0-6), puis WENR (jour 6-12). Les images ont été capturées au jour 2, au jour 6 et au jour 12 de la culture à l’aide d’un logiciel d’imagerie en direct. Barre d’échelle: 400 μm (B) L’expression génique relative d’un marqueur TRC global Kcnq1 est significativement réduite lorsque les médicaments A8301 et SB202190 sont présents lors de la différenciation organoïde. Chaque point représente une réplique biologique, qui comprenait trois puits mis en commun. Le changement moyen de l’expression relative des gènes (ligne horizontale) a été calculé en faisant la moyenne de trois répliques biologiques. Barres d’erreur : ±SD. Veuillez cliquer ici pour l’agrandir.
Figure 6: Les organoïdes linguals expriment des marqueurs de cellules gustatives canoniques. Variation de la valeur du seuil de cycle (Ct) du marqueur global de la CVR Kcnq1,du marqueur épithélial non gustatif cytokératine 13 (Krt13), du marqueur TRC de type I Entpd2, du marqueur TRC amer de type II Gnat3et du marqueur TRC aigre de type III Car4, par rapport au gène d’entretien Rpl19. Chaque point représente une réplique biologique, qui comprenait trois puits mis en commun à partir d’une plaque de 48 puits. La variation moyenne de la valeur Ct (ligne horizontale) pour chaque marqueur a été calculée en faisant la moyenne de trois répliquants biologiques. Test tde Student non appaire, *p < 0,05. Barres d’erreur : ± SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Montage d’organoïdes linguaux pour la microscopie confocale inversée. (A) Une chaîne d’environ 1 mm d’épaisseur de pâte à modeler non toxique est créée. (B) L’argile est sculptée comme un carré ~ 20 mm x 20 mm au centre d’une lame de microscope de 24 mm x 75 mm. (C) Un couvercle carré de 22 mm x 22 mm joint les organoïdes suspendus dans un support de montage. Barre d’échelle: 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8: Immunomarquage d’organoïdes linguaux intacts. Images confocales d’organoïdes fixes et immunocolorés. (A) Section optique d’un organoïde coloré pour le marqueur épithélial non gustatif KRT13 (vert) et le marqueur TRC général KRT8 (magenta). (B) Projection maximale d’une pile z confocale d’un organoïde coloré pour le marqueur cellulaire de type I de type I NTPDase2 (vert) et KRT8 (magenta). (C) Projection maximale d’une pile z confocale de deux organoïdes partiellement représentés (contours en pointillés blancs) et d’un organoïde complet coloré pour le marqueur cellulaire de détection aigre de type III CAR4 (vert) et le marqueur cellulaire de détection amère de type II GUSTDUCIN (magenta). Barre d’échelle : 100 μm pour A, B et C. Marqueur nucléaire DAPI (bleu, colonne de droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom du gène | Amorce avant (5'-3') | Amorce inversée (5'-3') | Numéro d’assession | ||||||
| Voiture4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tableau 1 : Séquences d’amorce utilisées pour la RT-PCR quantitative.
Tableau supplémentaire 1 : Comparaison des composants des milieux de culture organoïdes linguaux publiés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Il est rapporté ici une méthode efficace et facilement reproductible pour la culture, le maintien et le traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches de goût de souris adultes. Il a été constaté que l’utilisation de trois CV de souris Lgr5-EGFP âgées de 8 à 20 semaines est suffisante pour obtenir environ 10 000 cellules GFP+ à usage expérimental, ce qui donne 50 puits plaqués à une densité de 200 cellules par puits dans des plaques de 48 puits. L’élimination de l’épithélium de tranchée CVP est optimisée en injectant l’épithélium lingual avec une solution de Dispase II et de collagénase de type I fraîchement préparée, suivie d’une incubation de 33 minutes. Cependant, un temps d’incubation plus court, de vieilles aliquotes d’enzymes, des lots différents ou l’utilisation d’enzymes de différents fabricants peuvent entraîner un enlèvement incomplet des tranchées. Inversement, un temps d’incubation plus long provoque une digestion excessive du tissu, entraînant une perte d’intégrité du tissu gustatif. Après le pelage, un enrichissement supplémentaire des tranchées CVP a été effectué en coupant l’épithélium entourant le CVP.
Il est essentiel que tous les tubes de microcentrifugation utilisés pendant le processus de dissociation et de collecte soient recouverts de FBS pour empêcher les tissus et les cellules de coller aux parois en plastique des tubes, ce qui réduit considérablement la récupération des cellules isolées (données non présentées). L’utilisation d’une légère couche de FBS et l’élimination de l’excès de liquide des tubes avant utilisation minimisent les effets inhibiteurs possibles sur la trypsine ou d’autres enzymes.
Des organoïdes linguaux ont été cultivés avec succès à partir de tissu CVP dissocié sans tri préalable des cellules LGR5+ 17. Bien que cette méthode entraîne la formation d’organoïdes, nous avons constaté qu’une plus petite proportion de ces organoïdes contiennent des cellules gustatives par rapport à celles cultivées à partir de progéniteurs isolés (données non présentées). Le tri en flux pour les cellules Lgr5-EGFP+ enrichit les progéniteurs compétents en matière de goût, ce qui entraîne une proportion plus élevée d’organoïdes remplis de goût. Actuellement, nous recueillons toutes les cellules au-dessus du seuil d’autofluorescence GFP (Figure 3); cependant, il est possible que les niveaux de luminosité GFP soient associés à une efficacité de formation organoïde variable ou à une compétence gustative. Cette hypothèse n’a pas encore été testée mais constitue une piste prometteuse pour les travaux futurs car elle pourrait permettre un enrichissement supplémentaire des organoïdes contenant des cellules gustatives.
Il est bien connu que la densité de placage affecte l’efficacité de la différenciation organoïde, et nous recommandons que la densité de placage optimale soit déterminée avant l’expérimentation28. La taille et la profondeur des puits, ainsi que le volume de gel de la matrice, doivent être pris en compte lors de l’établissement de la densité de placage. Sur la base de nos travaux préliminaires (données non présentées), nous constatons que dans une plaque de 48 puits, 15 μL de gel matriciel et une densité de placage de 200 cellules par puits permettent une expansion et une différenciation organoïdes efficaces des trois types de TRC. Nous avons constaté que les organoïdes linguaux peuvent être cultivés avec succès et de manière reproductible dans l’extrait de membrane basale à facteur de croissance réduit (RGF BME), une alternative synthétique et moins coûteuse au gel matriciel. D’autres matrices alternatives peuvent également prendre en charge la culture organoïde linguale, mais des tests supplémentaires sont nécessaires pour étudier cette possibilité.
Pendant le placage, les cellules collectées doivent être soigneusement mais doucement ressuspendées dans un gel matriciel en pipetant fréquemment de haut en bas pour maintenir la suspension cellulaire homogène. Le tube contenant le mélange de gel à matrice cellulaire doit également être conservé sur de la glace pendant tout le processus de placage pour empêcher le gel matriciel de geler sur les côtés du tube. Ces mesures assurent une distribution uniforme des cellules entre les puits, donnant des résultats plus reproductibles lors du placage des cellules à la main. Notamment, les développements récents dans les technologies microfluidiques offrent des options à haut débit pour la distribution de cellules et constituent un outil prometteur pour les travaux futurs29.
Pour évaluer l’expression des gènes dans les organoïdes cultivés, il s’est avéré nécessaire de regrouper au moins trois puits pour chaque réplique biologique afin d’obtenir suffisamment d’ARN et de cohérence entre les réplidés (Figure 6). Il a également été déterminé que la lysation immédiate des organoïdes prélevés selon les instructions spécifiques du fabricant optimise la qualité et la quantité de l’ARN extrait. Bien qu’elles ne soient pas testées ici, d’autres options de stockage telles que la congélation éclair ou la mise en service dans les réactifs de stockage peuvent également préserver le rendement et la qualité de l’ARN.
Effectuer l’immunohistochimie sur les organoïdes peut être difficile, car les anticorps primaires et secondaires doivent pénétrer dans tout gel de matrice résiduelle et dans l’ensemble de l’épithélium organoïde. Dans des rapports précédents, les organoïdes ont été fixés alors qu’ils étaient encore en suspension dans un gel matriciel, ce qui a ensuite nécessité des concentrations extrêmement élevées de solution d’anticorps primaires pour révéler l’expression des protéines17,18. Semblable à d’autres rapports, l’élimination des organoïdes du gel matriciel à l’aide de la solution de récupération cellulaire avant la fixation s’est avérée augmenter l’efficacité de la coloration sans avoir besoin d’une concentration élevéed’anticorps30,31; cependant, la détection de certains marqueurs cellulaires du goût, par exemple CAR4, nécessite une concentration plus élevée d’anticorps. De plus, l’incubation d’organoïdes dans des antiséras primaires pendant 3 nuits augmente la probabilité de liaison aux anticorps. Cependant, cette méthode peut également augmenter la fluorescence de fond si les organoïdes sont insuffisamment lavés après l’immunocoloration. Il est important de noter que la solution d’anticorps primaires dilués peut être sauvegardée et réutilisée avec succès une ou plusieurs fois si elle est stockée pendant moins d’une semaine (données non présentées). Pour une imagerie optimale, les organoïdes sont montés en plaçant un couvercle sur un périmètre d’argile de pâte à modeler pour préserver leur structure 3D. Placer le verre de couverture directement sur la glissière comprime et brise les organoïdes, empêchant une analyse correcte.
La culture organoïde est une technique très applicable et rentable. Certaines applications comprennent, sans toutefois s’y limiter, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments et l’étude des cellules souches et de la biologie du développement32. Par conséquent, il est crucial de normaliser les modèles organoïdes pour permettre la reproductibilité dans tous les laboratoires. À l’avenir, il serait utile de développer une méthode normalisée de passage des organoïdes linguaux qui garantisse que la puissance des cellules souches gustatives peut être propagée sur des passages en série, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires pour générer plus d’organoïdes. Il est important de savoir que, bien que les organoïdes linguaux soient composés à la fois de cellules épithéliales gustatives et non gustatives, l’organisation de ces cellules diffère de celle du système gustatif in vivo. Les écarts entre les organoïdes et l’épithélium gustatif in vivo peuvent être dus aux milieux utilisés pour la culture organoïde et/ou parce que les organoïdes manquent d’interaction avec le microenvironnement des papilles gustatives, y compris les signaux importants des nerfs gustatifs et de la lamina propria qui sont nécessaires à la formation et au maintien des papilles gustatives22,33,34,35. Les travaux futurs visant à incorporer des nerfs ou des vascularisations dans la culture organoïde linguale, une stratégie actuellement adoptée dans d’autres systèmes organoïdes, pourraient permettre une modélisation plus précise de l’épithélium gustatif in vivo 36,37.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Peter Dempsey et Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) pour avoir fourni des médias conditionnés WNR et des discussions précieuses. Nous remercions également le Centre de cancérologie de l’Université du Colorado Cell Technologies et Flow Cytometry Shared Resources, en particulier Dmitry Baturin, pour son expertise en tri cellulaire. Ce travail a été financé par : NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, et NIH/NCI R21 CA236480 à LAB, et R21DC016131 et R21DC016131-02S1 à DG, et F32 DC015958 à EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
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