Summary
В протоколе представлен метод культивирования и обработки лингвальных органоидов, полученных из вкусовых стволовых клеток, выделенных из заднего вкусового сосочка взрослых мышей.
Abstract
Чувство вкуса опосредовано вкусовыми рецепторами на языке, которые состоят из быстро обновляющихся вкусовых рецепторных клеток (TTC). Этот непрерывный оборот питается местными клетками-прародителем и делает вкусовую функцию склонной к нарушению множеством медицинских процедур, что, в свою очередь, серьезно влияет на качество жизни. Таким образом, изучение этого процесса в контексте медикаментозного лечения имеет жизненно важное значение для понимания того, влияют ли и как влияют функции прародителя вкуса и производство КИП. Учитывая этические проблемы и ограниченную доступность человеческой вкусовой ткани, обычно используются мышиные модели, которые имеют вкусовую систему, похожую на человеческую. По сравнению с методами in vivo, которые являются трудоемкими, дорогостоящими и не поддаются исследованиям с высокой пропускной способностью, мышиные лингвальные органоиды могут позволить быстро проводить эксперименты со многими репликами и меньшим количеством мышей. Здесь были адаптированы ранее опубликованные протоколы и представлен стандартизированный метод генерации вкусовых органоидов из клеток-прародителя вкуса, выделенных из циркумваллятного сосочки (CVP) взрослых мышей. Вкусовые клетки-прародителя в CVP экспрессируют LGR5 и могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки EGFP (FACS) у мышей, несущих аллель Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Отсортированные клетки накладываются на систему 3D-культур на основе матричного геля и культивируются в течение 12 дней. Органоиды расширяются в течение первых 6 дней периода культивирования путем пролиферации, а затем вступают в фазу дифференцировки, в течение которой они генерируют все три типа вкусовых клеток вместе с невкусными эпителиальными клетками. Органоиды могут быть извлечены после созревания на 12-й день или в любое время в процессе роста для экспрессии РНК и иммуногистохимического анализа. Стандартизация методов культивирования для производства лингвальных органоидов из взрослых стволовых клеток улучшит воспроизводимость и продвинет лингвальные органоиды в качестве мощного инструмента скрининга лекарств в борьбе, чтобы помочь пациентам, испытывающим вкусовую дисфункцию.
Introduction
У грызунов лингвальные вкусовые рецепторы размещены в грибовидных сосочках, распределенных спереди, двусторонних листовых сосочков спереди, а также в один циркумваллятный сосочек (CVP) на заднеродоральной средней линии языка1. Каждая вкусовая рецепторная клетка состоит из 50-100 короткоживущих, быстро обновляющихся вкусовых рецепторных клеток (TTC), которые включают глиально-подобные поддерживающие клетки типа I, клетки типа II, которые обнаруживают сладкие, горькие и умами, и клетки типа III, которые обнаруживают кислые2,3,4. В CVP мышиныестволовые клетки LGR5 + вдоль базальной пластинки продуцируют все типы TRC, а также невкусные эпителиальные клетки5. При обновлении вкусовой линии дочерние клетки LGR5 сначала указываются как постмитотические вкусовые клетки-предшественники (клетки IV типа), которые входят в вкусовую рецептор и способны дифференцироваться в любой из трех типов TRC6. Быстрый оборот TLC делает вкусовую систему восприимчивой к нарушениям в результате медицинских процедур, включая лучевую и некоторые лекарственныепрепараты 7,8,9,10,11,12,13. Таким образом, изучение вкусовой системы в контексте регуляции вкусовых стволовых клеток и дифференцировки TRC имеет жизненно важное значение для понимания того, как смягчить или предотвратить вкусовую дисфункцию.
Мыши являются традиционной моделью для исследований in vivo в науке о вкусе, поскольку у них есть вкусовая система, организованная аналогично людям14,15,16. Тем не менее, мыши не идеальны для исследований с высокой пропускной способностью, так как они дороги в обслуживании и отнимают много времени для работы. Чтобы преодолеть это, в последние годы были разработаны методы культурирования органоидов in vitro. Вкусовые органоиды могут быть получены из нативной ткани CVP, процесса, в котором органоиды отталкиваются от изолированного эпителия CVP мыши, культивируемого ex vivo17. Эти органоиды демонстрируют многослойный эпителий, соответствующий вкусовой системе in vivo. Более эффективный способ генерации органоидов, не требующий культуры ex vivo CVP, был разработан Ren etal. в 2014 году18. Адаптируя методы и культуральные среды, впервые разработанные для выращивания кишечных органоидов, они выделили одиночные lgr5-GFP+ клетки-прародителя из cvP мыши и покрыли их матричнымгелем 19. Эти одиночные клетки генерируют лингвальные органоиды, которые размножаются в течение первых 6 дней культуры, начинают дифференцироваться примерно на 8-й день, а к концу периода культивации содержат невкусные эпителиальные клетки и все три типа TRC18,20. На сегодняшний день опубликовано несколько исследований с использованием лингвальной органоидной модельной системы17,18,20,21,22; однако методы и условия культивирования, используемые для получения этих органоидов, варьируются в зависимости от публикации(Дополнительная таблица 1). Таким образом, эти методы были скорректированы и оптимизированы здесь, чтобы представить подробный стандартизированный протокол для культуры лингвальных органоидов, полученных из LGR5+ прародителей CVP взрослой мыши.
Лингвальные органоиды обеспечивают уникальную модель для изучения клеточных биологических процессов, стимулирующих развитие и обновление вкусовых клеток. Поскольку применение лингвальных органоидов расширяется, и все больше лабораторий движутся к использованию моделей органоидов in vitro, важно, чтобы область стремилась разработать и принять стандартизированные протоколы для улучшения воспроизводимости. Создание лингвальных органоидов в качестве стандартного инструмента в науке о вкусе позволит проводить исследования с высокой пропускной способностью, которые разбирают, как отдельные стволовые клетки генерируют дифференцированные клетки взрослой вкусовой системы. Кроме того, лингвальные органоиды могут быть использованы для быстрого скрининга лекарств на потенциальное воздействие на вкусовой гомеостаз, который затем может быть более тщательно исследован на животных моделях. Этот подход в конечном итоге активирует усилия по разработке методов лечения, которые улучшают качество жизни будущих получателей лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены в аккредитованном AAALAC учреждении в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, Законом о благополучии животных и Политикой службы общественного здравоохранения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском кампусе Университета Колорадо Аншутц. Мыши Lgr5EGFP-IRES-CreERT2, используемые в этом протоколе, из Лаборатории Джексона, сток No 008875.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы следует выполнить следующие шаги, чтобы обеспечить плавное и своевременное продвижение протокола: установить водяную баню на 37 °C, установить центрифугу на 4 °C, сделать инъекции и диссоциационные ферментные растворы из 10 мг / мл растворов диспазы, коллагеназы и эластазы (см. Таблицу материалов),удалить матричный гель из морозильной камеры -20 ° C (~ 750 мкл, необходимых для 48-луночного листа) и оттаять, погружая флакон в лед для at не менее 3-4 ч, предварительно покрывая микроцентрифугные трубки в неразбавленном FBS путем мягкого раскачивания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин (две трубки 2 мл для сбора тканей, две трубки 1,5 мл для диссоциированных клеток и одна трубка 1,5 мл для сбора одиночных клеток из клеточного сортировщика; удалите избыток FBS перед использованием).
1. Выделение эпителия CVP
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество ячеек LGR5+ для полной 48-скважинной пластины, соберите три LGR5-EGFP CVP в одну трубу и обрабатывайте одновременно. Важно отметить, что заготавливайте и обрабатывайте CVP по меньшей мере одного дикого типа littermate параллельно в отдельной трубе и используйте его в качестве элемента управления решеткой для установки параметров FACS (см. Репрезентативные результаты).
- Усыпляйте мышей с удушьемCO2 в соответствии с правилами IACUC, с последующим одобренным вторичным методом, таким как двусторонняя торакотомия, вывих шейки матки, обезглавливание или экссангинация.
- Используйте большие стерильные ножницы для рассечения, чтобы разрезать щеки и сломать челюсть. Поднимите язык и отрежьте язычную уздечку, чтобы отделить язык от дна ротовой полости. Вырежьте язык и соберите его в стерильный ледяной фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (dPBS) с Ca2+ и Mg2+.
- Удалите и отбросьте передний язык, разрезав только переднюю часть межмолярной возместия лезвием бритвы(рисунок 1А,пунктирная линия). Используйте деликатную салфетку для удаления волос и лишней жидкости с заднего языка.
- Заполните шприц 1 мл 200-300 мкл инъекционного ферментного раствора (конечная концентрация: 2 мг/мл коллагеназы I типа и 5 мг/мл диспазы II в Ca2+/Mg2+-содержащихdPBS, разбавленных из стоковых растворов 10 мг/мл) и вставьте иглу 30 G x 1/2 чуть выше межмолярного возвышения(рисунок 1B,черная стрелка)до переднего ряда CVP(рисунок 1B, черный ящик). Вводят раствор фермента под и по боковым краям CVP между эпителием и подлежащими тканями (lamina propria, мышцы). Медленно и непрерывно вынимайте шприц из языка во время инъекции.
- Инкубируют язык в стерильном Ca2+/ Mg2+-свободном dPBS при комнатной температуре в течение ровно 33 мин.
- Сделайте небольшие надрезы в эпителии двусторонне и просто перед CVP, используя дополнительные тонкие ножницы для рассечения, и аккуратно очистите эпителий, подняв его тонкими щипцами. Как только траншейный эпителий освободится от подлежащей соединительной ткани, поместите его в пустую микроцентрифужную трубку 2 мл, предварительно покрытую FBS. Делают эпителиальную обрезку до или после отсоединения эпителия CVP(рисунок 1C,D).
2. Диссоциация эпителия CVP
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация эпителия CVP и покрытие графически представлены на рисунке 2.
- Добавьте коктейль ферментов диссоциации (конечная концентрация: 2 мг/мл коллагеназы типа I, 2 мг/мл эластазы и 5 мг/мл диспазы II в Ca2+/Mg2+-содержащихdPBS, разбавленные из стоковых растворов 10 мг/мл) в пробирки, содержащие очищенный эпителий CVP (200 мкл на CVP). Инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 45 мин. Вихрь ненадолго каждые 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: До новотепления 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане при 37 °C в течение последних 15 минут инкубации ферментного коктейля. - После инкубации вихрь (три импульса) затем тритурируют стеклянной пипеткой Пастера в течение 1 мин. После того, как кусочки ткани оседают, пипетку супернатанта, содержащего первую коллекцию диссоциированных клеток, в новые микроцентрифужные трубки с покрытием FBS 1,5 мл, соответствующие генотипу. Обработайте оставшиеся кусочки ткани дополнительно, как описано на этапе 2.3. ниже.
- Раскрутите супернатант в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до гранулированных клеток.
- Удалите полученный супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в буфере флуоресцентной активации сортировки клеток (FACS) (1 мМ ЭДТА, 25 мМ HEPES (рН 7,0) и 1% FBS в Ca2+/ Mg2+-свободный PBS (50 мкл на CVP)). Хранить на льду.
- При выполнении этапов 2.2.1 и 2.2.2 диссоциируют оставшиеся кусочки ткани со ступени 2.2 путем добавления предварительно нагретого 0,25% трипсина-ЭДТА (200 мкл на CVP) к исходным микроцентрифужным трубкам 2 мл и инкубируют на водяной бане с 37 °C в течение 30 мин. Вихрь ненадолго каждые 10 мин.
- После инкубации вихрь трубки, содержащей кусочки ткани (три импульса), затем тритурируют стеклянной пипеткой Пастера в течение 1 мин. После того, как кусочки ткани осядет, пипетка супернатанта в микроцентрифужные трубки 1,5 мл, содержащие клетки из этапа 2.2.2. Выбросьте трубки, содержащие оставшиеся кусочки ткани.
- Раскрутите трубки с диссоциированными клетками в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до гранулированных клеток.
- Удалите супернатант и повторно суспендированные гранулы клеток в буфере FACS (100 мкл на CVP). Хранить на льду.
- Пропустите ячейки через 30-мкм нейлоновый сетчатый фильтр и добавьте DAPI(λ излучение = 450 нм) в смеси ячеек перед FACS. Изолируют Lgr5-GFP+ клетки через FACS с помощью зеленого флуоресцентного белкового канала (λвозбуждение = 488 нм; λ излучение = 530 нм). Отсортируйте ячейки с помощью 100-мкм-сопла в свежую микроцентрифужную трубку с покрытием FBS объемом 1,5 мл, содержащую 300 мкл свободного dPBS Ca2 +/ Mg2 +. Поместите ячейки на лед до нанесения покрытия.
3. Покрытие ячеек Lgr5-EGFP
- Определите объемLGR5+ клеточной суспензии, полученной от протоочного цитометра.
- Исходя из количества ячеек, полученных от сортировщика, рассчитайте количество ячеек на мкл. Затем определите объем, необходимый для получения желаемого количества ячеек для покрытия (мы используем 200 ячеек на скважину 48-скважинной пластины) и перенесите этот общий объем взвешенных клеток в новую микроцентрифужную трубку.
- Вращайте трубку в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до грануляционных ячеек (гранулы могут быть не видны). Удалите супернатант и поместите трубку на лед.
- Осторожно повторно суспендируют ячейку гранулы в соответствующем количестве матричного геля (15 мкл на скважину на 48-ю пластины); пипетку вверх и вниз аккуратно распределить клетками в матричном геле. Поместите 15 мкл матричного геля/клеточной смеси в центр каждой скважины. Держите трубку микроцентрифуги на льду в конической трубке 50 мл во время покрытия, чтобы предотвратить гелеобразование матричного геля. Продолжайте смешивать матричную смесь геля и ячеек на протяжении всего покрытия путем пипетки вверх и вниз каждые три скважины, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по скважинам.
- Поместите пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2, ~95%влажности) на 10 мин, чтобы обеспечить гелеобразие матричного геля. Затем добавляют 300 мкл среды WENRAS + Y27632 комнатной температуры в каждую скважину и возвращают пластину в инкубатор.
4. Органоидное поддержание
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды выращивают в обычных органоидных средах (WENR), содержащих рекомбинантные EGF и 50% кондиционированные среды, содержащие Wnt3a, Noggin и R-спондин23. Препараты A8301 и SB202190 добавляют в течение первых 6 дней периода культивации для оптимизации роста (среда WENRAS)(рисунок 5),затем удаляют для содействия дифференциации (weNR media)20. Y27632 добавляется в течение первых 2 дней культуры, чтобы способствовать выживанию. Условия среды относительно временной шкалы культуры представлены на рисунке 4.
- Через два дня после нанесения покрытия удалите жи WENRAS + Y27632 из каждой скважины с помощью пипетки 1 мл, обеспечивая отсутствие перекрестного загрязнения. Добавьте 300 мкл среды WENRAS вниз по боковой стороне скважины, чтобы не нарушить матричный гель. Верните тарелку в инкубатор.
- Меняйте носитель каждые 2 дня, используя соответствующие носители для стадии культуры(рисунок 4). Поддерживайте органоиды до 12-го дня, когда органоиды будут готовы к сбору.
5. Обработка РНК
- Извлечение органоидов для РНК
- Поместите 48-скважинную пластину на лед на 30 мин для деполимеризации матричного геля.
- Используя пипетку 1 мл, подтяните органоидную жиму; затем, когда среда возвращается в колодец, используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать и еще больше разбить матричный гель. Перенесите содержимое в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, объединив содержимое трех скважин в одну трубу. Центрифугировать пробирки в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
- Удалить как можно больше супернатанта среды без удаления каких-либо органоидов; затем снова открутите трубки в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
- Удалить оставшуюся мудрую музию и повторно суспендировали органоиды в буфере лизиса 350 мкл + β-меркаптоэтанола (βME) (10 мкл βME на 1 мл лизисного буфера). Поместите образцы на лед для немедленного извлечения РНК или храните при -80 °C.
- Количественный анализ ОТ-ПЦР
- Измерьте количество РНК с помощью спектрофотометра. Реверс-транскрибировать РНК с помощью набора синтеза кДНК.
- Смешайте кДНК, эквивалентную 5 нг РНК, с предварительно проверенными 200 нМ прямой и обратной праймерами(таблица 1)и флуоресцентной ПЦР Master Mix. Запустите реакцию qRT-PCR в течение 40 циклов при: 95 °C в течение 15 с, затем 60 °C в течение 60 с.
6. Иммуногистохимия
- Извлечение и фиксация органоидов
- Поместите 48-щетинную пластину на лед на 30 мин, чтобы ослабить матричный гель.
- Удалите органоидную мудрую муля и добавьте 400 мкл ледяного PBS в каждую скважину. Затем удалите PBS и добавьте 400 мкл ледяного раствора для восстановления клеток в каждую скважину. Качать осторожно при 4 °C в течение 30 мин.
- Покрыть наконечник пипетки объемом 1 мл 1% BSA в PBS и аккуратно пипетировать содержимое скважины вверх и вниз, чтобы разбить матричный гель. Перенесите органоиды в микроцентрифужную трубку размером 1,5 мл, помещенную на лед.
- Промыть каждую скважину 300 мкл PBS + 1% BSA и перенести все оставшиеся органоиды в соответствующие трубки. Удалите раствор для восстановления клеток / PBS + BSA из каждой трубки. Добавьте 400 мкл ледяного PBS, затем повторите с другим ледяным ОПОЛАСКИВАТЕЛЬ PBS.
- Удалить PBS и зафиксировать органоиды с 300 мкл ледяного 4% PFA (в 0,1 М PB) в течение 20 мин, инкубируя при комнатной температуре. Удалите PFA и промойте органоиды с 400 мкл ледяного PBS.
- Удалить PBS; затем добавьте 400 мкл PBS + 1% BSA. Хранить при 4 °C.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Промыть органоиды в 500 мкл PBS + 1% BSA. Затем инкубируют органоиды в блокирующем растворе (5% нормальная козья или ослиная сыворотка, 1% бычий сывороточный альбумин, 0,3% Тритон Х 100 в 1x PBS pH 7,3) в течение 2 ч, мягко раскачиваясь при комнатной температуре.
- Добавляют раствор первичного антитела (первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе) и осторожно качают в течение 3 ночей при 4 °C.
- Органоиды промыть 4x в течение 1 ч с 500 мкл PBS + 0,2% тритона, мягко раскачивая при комнатной температуре. Добавляют раствор вторичных антител (вторичные антитела, разведенные в блокирующем растворе) и органоиды горных пород на ночь, защищенные от света, при 4 °C.
- Органоиды промыть 3х в течение 1 ч с 500 мкл PBS + 0,2% тритона, защищенные от света и мягко раскачивающиеся при комнатной температуре. Инкубировать с DAPI разбавляют 1:10 000 в 0,1 М ПБ в течение 20 мин, раскачивая и накрывая комнатной температурой.
- Органоиды промыть 3x в течение 20 мин с 0,1 М ПБ, осторожно раскачивая и накрывая комнатной температурой.
- Скользящее крепление органоидов для инвертированной конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговые изображения процесса монтажа слайдов показаны на рисунке 7.- Создайте ~1 мм толщиной 22 x 22 мм квадратного периметра нетоксичного моделя из глины на слайде микроскопа.
- Извлеките 0,1 М ПБ из микроцентрифужной трубки и осторожно повторно суспендируйте органоиды в монтажной среде 100 мкл по выбору; затем перенесите в центр глиняного квадрата.
- Заполните глиняный квадрат до тех пор, пока монтажная среда не будет почти доверху. Затем поместите квадратную крышку 22 x 22 мм поверх глины и плотно прижмите по бокам крышки, чтобы запечатать. Дайте отверждаться согласно инструкции производителя (здесь комнатная температура в течение 1-2 дней) и хранить при 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мыши имеют один CVP, расположенный с задней стороны на языке, из которого можно выделить LGR5+ стволовые клетки(Рисунок 1А,черный ящик). Инъекция раствора фермента под и вокруг CVP(Рисунок 1B)приводит к незначительному отеку эпителия и перевариванию соединительной ткани. Достаточное пищеварение достигается после 33-минутной инкубации, что позволяет легко отделить эпителий CVP от подлежащей ткани. При попытке очистить эпителий CVP, разрезы должны быть сделаны на достаточном расстоянии от CVP, чтобы гарантировать, что траншеи не будут разрушены или повреждены(рисунок 1C). Это также позволяет захватывать эпителий с помощью щипцов, не повреждая CVP. Обрезка эпителия, окружающего CVP, удаляет нецелевые клетки и повышает эффективность следующих шагов за счет уменьшения массы ткани, с помощью которого манипулируют(рисунок 1D). Важно проверить, что две траншеи(рисунок 1С,черные стрелки)присутствуют перед добавлением эпителия CVP в трубку микроцентрифуги; успешное отслаивание CVP включает в себя часть желез и протоков фон Эбнера(рисунок 1D,черные стрелки). Если шелушающийся эпителий не содержит этих двух непрозрачных структур, то траншейный эпителий, скорее всего, разрывается из-за неполного переваривания соединительной ткани.
Чтобы установить надлежащие настройки FACS для сбора клеток Lgr5-EGFP, клетки из диссоциированных CVP отдельно получают от мышей дикого типа и Lgr5-EGFP. Клетки CVP дикого типа анализируются сначала для установления параметров гастика, процесса, в котором популяции клеток классифицируются в пределах выхода диаграммы рассеяния по характеристикам, представляющим интерес24. Здесь четыре параметра были использованы для окончательной идентификации ячеек для покрытия. Первый параметр, прямое рассеяние, отфильтровывает частицы и мусор на основе обнаруженной площади поверхности. Этот параметр удаляет ~70% всех обнаруженных событий во время сортировки(рисунок 3). Параметр width дополнительно фильтрует события на основе размера, чтобы обеспечить выделение отдельных ячеек (синглетов). Приблизительно 90% событий являются синглетами(рисунок 3). Ядерный маркер DAPI поглощёвается мертвыми, но не живыми клетками и, таким образом, позволяет отсортировать мертвые клетки25. Этот протокол оптимизирует жизнеспособность клеток, так как более 90% событий являются живыми клетками(рисунок 3). Наконец, параметры GFP gating устанавливаются выше уровня автофлуоресценции клеток дикого типа. Клетки дикого типа не собираются; они используются исключительно в качестве гатного контроля для флуоресценции GFP. С параметрами гастика, определенными из образца дикого типа, клетки из образца Lgr5-EGFP затем проходят через проточный цитометр для сортировки для сбора. Затворы могут быть отрегулированы в начале сортировки Lgr5-EGFP для размещения четкой кластеризации определенных клеточных популяций, но не должны быть значительно изменены в середине сортировки. Было обнаружено, что диссоциация трех объединенных LGr5-EGFP CVP дает ~ 500 000 клеток, в том числе в среднем 10 000 GFP+ клеток.
Правильные условия среды и культуры жизненно важны для оптимального роста и дифференцировки органоидов. Предыдущие исследования с использованием лингвальных органоидов моделировали их медиа-компоненты после компонентов из кишечного органоидного поля, включая Wnt3a, EGF, Noggin и R-спондин17,18,19,20,21,22. Однако, когда лингвальные органоиды культивируются с использованием аналогичного метода (среды WENR), органоиды не растут эффективно(рисунок 5A). В кишечных органоидах человека для стимулирования роста органоидов26используются препараты A8301 (сигнальный ингибитор TGFß) и SB202190 (сигнальный ингибитор p38 MAPKinase). Действительно, добавление этих ингибиторов (weNRAS media) вызывает устойчивый рост лингвальных органоидов(рисунок 5A). Интересно, что удаление этих ингибиторов из среды через 6 дней приводит к более высокой экспрессии общего TRC-маркера Kcnq1,предполагая, что A8301 и SB202190 препятствуют дифференцировке вкусовых клеток(рисунок 5B). Таким образом, оптимальный рост и дифференциация получаются путем культивирования органоидов в средах WENRAS с 0-6 дней и средах WENR с 6-12 дней(Рис. 4, Фиг.5)соответственно.
Органоидный клеточный тип композиции может характеризоваться qRT-ПЦР или иммуногистохимией. Зрелые органоиды содержат как вкусовые клетки, отмеченные Kcnq1 и KRT8, так и невкусные эпителиальные клетки, отмеченные Krt13/KRT13(Рисунок 6,8A). Это говорит о том, чтоизолированные клетки LGR5 + имеют аналогичную потенцию in vitro, как и in vivo, поскольку на взрослом языке клетки Lgr5-GFP+ производят как вкусовые, так и невкусовые линии5. Кроме того, Krt13 экспрессируется на более высоких уровнях, чем все 3 маркера TRC(рисунок 6),предполагая, что органоиды преимущественно состоят из невкусных эпителиальных клеток. Фактически, относительная количественная оценка экспрессии генов27 указывает на то, что Krt13 экспрессируется в 50 раз выше, чем общий маркер TRC Kcnq1 (тест Стьюдента t,p = 0,0004). Это ожидаемо, так как язык имеет аналогичную пропорцию вкуса по сравнению с невкусным эпителием1. Органоиды экспрессируют все три типа TRC(Рисунок 6,8B, C). Клетки типа I (отмеченные Entpd2)и горькие клетки типа II (отмеченные Gnat3)высоко экспрессируются во вкусовых органоидах, в то время как кислые чувствительные клетки типа III (отмеченные Car4)встречаютсяреже (рисунок 6). TTC случайным образом распределены в органоидах(рисунок 8),а не в дискретных структурах вкусовых рецепторов, наблюдаемых in vivo.
Рисунок 1:Рассеченный язык и шелушащийся эпителий CVP. (A) Язык рассечен, а передний язык удаляется путем разрезания только переднего межмолярного возмещения (пунктирная линия), оставляя задний язык, который включает CVP (черный ящик)(B)Игла вводится только перед межполярным возмещением (черная стрелка), а ферментная смесь вводится ниже и к боковым краям CVP (черный ящик). (C) Необрезанный шелушаный эпителий, окружающий траншеи CVP (черные стрелки) и(D)обрезанный эпителий CVP. Железы и протоки фон Эбнера(D,черные стрелки) видны после успешного шелушения траншей. Шкала: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Рабочий процесс генерации лингвальных органоидов. Язык удаляется у мышей Lgr5-EGFP. Эпителий траншеи CVP (красная коробка) отслаивается от подлежащей соединительной ткани и диссоциируется на отдельные клетки. КлеткиGFP+ выделяют и помещают матричным гелем при плотности 200 клеток на скважину в 48-скважинной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Наворот для флуоресцентно-активированной сортировки клеток. (A)Контрольный (клетки CVP дикого типа) определяет затворы FACS, которые устраняют мусор и сломанные клетки через прямое рассеяние, идентифицирует синглеты через ширину бокового рассеяния, отделяет DAPIneg live от DAPI+ мертвых клеток и устанавливает уровень автофлуоресценции клеток дикого типа. (B) Ранее определенные затворы применяются к экспериментальному запуску (клетки Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP) для изоляции клеток Lgr5-EGFP+, свободных от мусора, одиночных, живых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Временная шкала лингвальной органоидной культуры и необходимые носители. Ингибитор ROCK Y27632 добавляют в жим в течение первых 48 ч культуры для повышения выживаемости клеток. Во время фазы пролиферации органоиды получают кондиционированную среду, содержащую A8301 и SB202190 (WENRAS), для оптимизации роста. Эти препараты удерживаются из средств массовой информации (WENR), начиная с 6-го дня, чтобы способствовать дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Препараты A8301 и SB202190 влияют на рост и дифференцировку органоидов. (A)Изображения органоидов Brightfield, выращенных в средах WENR (день 0-12), среде WENRAS (день 0-12), или WENRAS (день 0-6), затем WENR (день 6-12). Изображения были сделаны на 2-й, 6-й и 12-й день культуры с использованием программного обеспечения для обработки изображений в реальном времени. Шкала бара: 400 мкм(B)Относительная экспрессия гена глобального TRC-маркера Kcnq1 значительно снижается, когда препараты A8301 и SB202190 присутствуют во время дифференцировки органоидов. Каждая точка представляет собой одну биологическую реплику, которая включала в себя три объединенные скважины. Среднее изменение относительной экспрессии генов (горизонтальная линия) было рассчитано путем усреднения трех биологических реплик. Панели ошибок: ±SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Лингвальные органоиды экспрессируют канонические маркеры вкусовых клеток. Изменение порогового значения цикла (Ct) глобального маркера TRC Kcnq1,невкусного эпителиального маркера цитокератина 13(Krt13),маркера TRC типа I Entpd2,горького маркера TRC типа II Gnat3и кисломУ TRC-маркера Car4типа III по сравнению с геном ведения хозяйства Rpl19. Каждая точка представляет собой одну биологическую реплику, которая включала в себя три объединенные скважины из плиты из 48 скважин. Среднее изменение значения Ct (горизонтальной линии) для каждого маркера было рассчитано путем усреднения трех биологических реплик. Непарный t-тестстудента, *p < 0,05. Панели ошибок: ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Монтаж лингвальных органоидов для инвертированной конфокальной микроскопии. (A) Создана цепочка нетоксичной моделяторной глины толщиной ~1 мм. (B) Глина вылеплена в виде квадрата ~20 мм х 20 мм в центре слайда микроскопа 24 мм х 75 мм. (C) Квадратный обтекатель 22 мм x 22 мм герметизирует органоиды, подвешенные в монтажной среде. Шкала: 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Иммуномаркировка интактных лингвальных органоидов. Конфокальные изображения фиксированных, иммуноокраженных органоидов. (A) Оптический участок органоида, окрашенный для невкусного эпителиального маркера KRT13 (зеленый) и общего маркера TRC KRT8 (пурпурный). (B)Максимальная проекция конфокального z-стека одного органоида, окрашенного для глиальноподобного клеточного маркера типа I NTPDase2 (зеленый) и KRT8 (пурпурный). (C)Максимальная проекция конфокального z-стека из двух частично показанных органоидов (белые черты) и одного полного органоида, окрашенного для типа III кислого клеточного маркера CAR4 (зеленый) и горького детектирования клеточного маркера типа II GUSTDUCIN (пурпурный). Шкала: 100 мкм для A, B и C. Ядерный маркер DAPI (синий, правый столбец). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя гена | Грунтовка передняя (5'-3') | Обратная грунтовка (5'-3') | Оценочная цифра | ||||||
| Автомобиль4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Энтпд2 | ГАКААГГААААТГАКАКАГГТТКТГГГГГГ | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Гнат3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Крт13 | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Рпл19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Таблица 1: Последовательности праймеров, используемые для количественной ОТ-ПЦР.
Дополнительная таблица 1: Сравнение опубликованных лингвальных органоидных компонентов культуральных сред. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен эффективный и легко воспроизводимый метод культивирования, поддержания и обработки лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослых мышей. Было установлено, что использование трех CSP от 8 до 20-недельных мышей Lgr5-EGFP достаточно для получения ~10 000GFP+ клеток для экспериментального использования, в результате чего 50 скважин покрыты плотностью 200 клеток на скважину в 48-скважинных пластинах. Удаление эпителия траншеи CVP оптимизируется путем введения в лингвальный эпителий свежеприготовленного раствора Dispase II и коллагеназы типа I с последующей 33-минутной инкубацией. Однако более короткое время инкубации, старые аликвоты ферментов, разные партии или использование ферментов разных производителей могут привести к неполному удалению траншеи. И наоборот, более длительное время инкубации вызывает переваривание ткани, что приводит к потере целостности вкусовой ткани. После пилинга дальнейшее обогащение для траншей CVP было сделано путем обрезки эпителия, окружающего CVP.
Крайне важно, чтобы все микроцентрифужные трубки, используемые в процессе диссоциации и сбора, были покрыты FBS для предотвращения прилипания тканей и клеток к пластиковым стенкам трубок, что значительно снижает восстановление изолированных клеток (данные не показаны). Использование легкого слоя FBS и удаление лишней жидкости из пробирок перед использованием сводит к минимуму возможное ингибирующее воздействие на трипсин или другие ферменты.
Лингвальные органоиды были успешно выращены из диссоциированной CVP-ткани без предварительной сортировки LGR5+ клеток17. Хотя этот метод приводит к образованию органоидов, мы обнаружили, что меньшая доля этих органоидов содержит вкусовые клетки по сравнению с теми, которые выращены из изолированных прародителей (данные не показаны). Проточная сортировка для клеток Lgr5-EGFP+ обогащает вкусообразующих прародителей, что приводит к увеличению доли органоидов, изобилующих вкусом. В настоящее время мы собираем все ячейки выше порога автофлуоресценции GFP(рисунок 3); однако возможно, что уровни яркости GFP связаны с эффективностью формирования переменных органоидов или вкусовой компетентностью. Эта гипотеза еще не была проверена, но является многообещающим направлением для будущей работы, поскольку она может позволить дальнейшее обогащение органоидов, содержащих вкусовые клетки.
Хорошо известно, что плотность покрытия влияет на эффективность дифференцировки органоидов, и мы рекомендуем определить оптимальную плотность покрытия до экспериментов28. Размер и глубину скважин, а также объем матричного геля следует учитывать при установлении плотности гальванических покрытий. Основываясь на нашей предварительной работе (данные не показаны), мы находим, что в 48-скважинной пластине 15 мкл матричного геля и плотность покрытия 200 клеток на скважину позволяют эффективно расширять органоиды и дифференцировать все три типа TRC. Мы обнаружили, что лингвальные органоиды могут быть успешно и воспроизводимо культивированы в экстракте базальной мембраны с пониженным фактором роста (RGF BME), синтетической и менее дорогой альтернативе матричному гелю. Другие альтернативные матрицы могут также поддерживать лингвальную органоидную культуру, но для изучения этой возможности требуется дальнейшее тестирование.
Во время покрытия собранные клетки должны быть тщательно, но осторожно повторно суспендированы в матричном геле путем частого пипетирования вверх и вниз, чтобы сохранить клеточную суспензию однородной. Трубка, содержащая смесь гелевых с клеточной матрицей, также должна храниться на льду в течение всего процесса покрытия, чтобы предотвратить гелеобразование матричного геля по бокам трубки. Эти меры обеспечивают равномерное распределение клеток по скважинам, давая более воспроизводимые результаты при ручном покрытии клеток. Примечательно, что последние разработки в области микрофлюидных технологий обеспечивают высокую пропускную способность для дозирования клеток и является многообещающим инструментом для будущей работы29.
Для оценки экспрессии генов в культивируемых органоидах было обнаружено, что необходимо объединить по крайней мере три скважины для каждой биологической репликации для получения достаточной РНК и согласованности между репликациями(рисунок 6). Также было определено, что немедленное лизирование извлеченных органоидов в соответствии с конкретными инструкциями производителя оптимизирует качество и количество экстрагируемой РНК. Хотя здесь они не тестируются, другие варианты хранения, такие как флэш-замораживание или повторное суспендение в реагентах хранения, также могут сохранять выход и качество РНК.
Выполнение иммуногистохимии на органоидах может быть сложной задачей, так как первичные и вторичные антитела должны проникать в любой остаточный матричный гель и весь органоидный эпителий. В предыдущих отчетах органоиды были зафиксированы, будучи еще взвешенными в матричном гелевом, что впоследствии потребовало чрезвычайно высоких концентраций раствора первичных антител для выявления экспрессии белка17,18. Как и в других отчетах, было обнаружено, что удаление органоидов из матричного геля с использованием Cell Recovery Solution до фиксации повышает эффективность окрашивания без необходимости высокой концентрации антител30,31; однако обнаружение некоторых маркеров вкусовых клеток, например, CAR4, требует более высокой концентрации антител. Кроме того, инкубирование органоидов в первичных антисферах в течение 3 ночей повышает вероятность связывания антител. Однако этот метод может также увеличить фоновую флуоресценцию, если органоиды недостаточно промыты после иммуноокрашивания. Важно отметить, что разбавленный раствор первичных антител может быть сохранен и успешно повторно использован один или несколько раз, если храниться менее недели (данные не показаны). Для оптимальной визуализации органоиды монтируются путем размещения крышки поверх глиняного периметра моделируемой глины, чтобы сохранить их 3D-структуру. Размещение покровного стекла непосредственно на слайде сжимает и разрушает органоиды, препятствуя правильному анализу.
Органоидная культура является очень применимым, экономически эффективным методом. Некоторые приложения включают, но не ограничиваются ими, моделирование заболеваний и скрининг лекарств, а также изучение стволовых клеток и биологии развития32. Поэтому крайне важно стандартизировать органоидные модели, чтобы обеспечить воспроизводимость в лабораториях. В будущем было бы полезно разработать стандартизированный метод пропускания лингвальных органоидов, который гарантирует, что потенция вкусовых стволовых клеток может распространяться по последовательным проходам, тем самым уменьшая потребность в дополнительных животных для генерации большего количества органоидов. Важно отметить, что, хотя лингвальные органоиды состоят как из вкусовых, так и из невкусных эпителиальных клеток, организация этих клеток отличается по сравнению со вкусовой системой in vivo. Расхождения между органоидами и вкусовым эпителием in vivo могут быть обусловлены средой, используемой для культуры органоидов, и/или тем, что органоиды не взаимодействуют с микроокружением вкусовых рецепторов, включая важные сигналы от вкусовых нервов и lamina propria, которые необходимы для формирования и поддержания вкусовых рецепторов22,33,34,35. Будущая работа по включению нервов или сосудистой системы в лингвальную органоидную культуру, стратегия, которая в настоящее время принимается в других органоидных системах, может позволить более точно смоделировать эпителий вкуса in vivo 36,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Питера Демпси и Монику Браун (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) за предоставление WNR условных медиа и ценных дискуссий. Мы также благодарим Центр клеточных технологий и Проточной цитометрии Университета Колорадо, особенно Дмитрия Батурина, за опыт сортировки клеток. Эта работа финансировалась: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 и NIH/NCI R21 CA236480 для LAB, и R21DC016131 и R21DC016131-02S1 для DG, и F32 DC015958 для EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Finger, T. E., Silver, W. L. The neurobiology of taste and smell. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M.
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D.
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. Immunophenotyping: Methods and Protocols. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
