Summary
Escherichia coli er den ledende årsaken til neonatal Gram-negativ bakteriell meningitt. Under bakterieinfeksjonen spiller reaktive oksygenarter produsert av nøytrofiler en stor bakteriedrepende rolle. Her introduserer vi en metode for å oppdage de reaktive oksygenarter i nøytrofiler som svar på meningitt E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) er de vanligste Gram-negative bakteriene som forårsaker neonatal meningitt. Forekomsten av bakterieemi og bakteriell penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren er uunnværlige trinn for utvikling av E. coli meningitt. Reaktive oksygenarter (ROS) representerer de viktigste bakteriedrepende mekanismene til nøytrofiler for å ødelegge de invaderte patogenene. I denne protokollen ble den tidsavhengige intracellulære ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert ved hjelp av fluorescerende ROS-sonder oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i pattedyrceller under patogen-vert interaksjoner.
Introduction
Neonatal bakteriell meningitt er en vanlig pediatrisk smittsom sykdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1 kapsel er det vanligste Gram-negative patogenet som forårsaker neonatal bakteriell meningitt, som står for ca 80% av den totale forekomsten1,2,3. Til tross for fremskrittene i antimikrobiell kjemoterapi og støttende omsorg, er bakteriell meningitt fortsatt en av de mest ødeleggende forholdene med høy sykelighet ogdødelighet 4.
Forekomsten av neonatal bakteriell meningitt begynner vanligvis med bakterieemi forårsaket av innføring av patogene bakterier i perifer sirkulasjon fra de nyfødtes lokale lesjoner, etterfulgt av penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren (BBB) inn i hjernen, noe som resulterer i betennelse i meningene4. Utbruddet av bakterier avhenger av samspillet mellom bakterier og vert av immunceller, inkludert nøytrofiler og makrofager, etc. Nøytrofiler, som står for ~ 50-70% av hvite blodlegemer, er den første forsvarslinjen mot bakterielle infeksjoner5,6. Under invasjonen av bakterier rekrutteres de aktiverte nøytrofiler til de smittsomme stedene og frigjør reaktive oksygenarter (ROS) inkludert superoksidanion, hydrogenperoksid, hydroksylradikaler og singlet oksygen7. ROS gjennomgår redoksreaksjoner med cellemembranen, nukleinsyremolekyler og proteiner av bakteriene, noe som resulterer i skade og død av de invaderende bakteriene8. Mitokondriene er hovedstedet for ROS-produksjon i eukaryote celler, og ulike oksider (f.eks. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oksidasekompleks, lipoksygenasesystem, proteinkinase C og cyclooxygenase system) formidler produksjonen av ROS9,10. Sanntidsmålingen av produksjonen av ROS, som representerer den primære antimikrobielle mekanismen i nøytrofiler, er en nyttig metode for å studere vertsforsvar under bakterievertens interaksjon.
I denne protokollen ble den tidsavhengige ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert med en fluorescerende ROS-sonde DHE, oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i andre pattedyrceller under patogenvertsinteraksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod fra frivillige som ble anvendt i denne forskningen ble godkjent av Institutional Review Board ved det første Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Utarbeidelse av reagenser og kulturmedium
- Forbered den røde blodcellelysbufferen ved å tilsette 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA i 1 L dobbelt destillert vann og juster pH til 7,2-7,4. Fjern bakteriene ved filtrering ved hjelp av 0,22 μm filtre.
- Forbered eksperimentelt kulturmedium for nøytrofiler ved å legge til 5% foster bovint serum til RPMI 1640 medium og lagre ved 4 °C. Likevekt til romtemperatur før bruk.
MERK: Bruk RPMI 1640-mediet uten fenolrød. - Forbered fosfatbuffersallin (PBS) ved å tilsette 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4·2H2O og 0,2 g KH2PO4 i 1 L dobbelt destillert vann i en 1 L glassflaske. Juster pH til 7,2-7,4. Autoklaver den i 15 min ved 121 °C.
- Forbered rifampicinoppløsning ved å oppløse 0,5 g rifampicinpulver i 10 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å gi en 50 mg/ ml rifampicinoppløsning.
- Forbered LB agaroppløsning ved å tilsette 10 g NaCl, 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt og 15 g agarpulver i 1 L dobbelt destillert vann og autoklaver blandingen. Fyll Petri-rettene til halvparten av volumet ved å helle varm LB agaroppløsning som inneholder 100 μg / ml rifampicin. Oppbevar den avkjølte faste platen ved 4 °C.
- Forbered hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong egnet for bakteriestammer ved å oppløse 37 g BHI pulver i 1 L dobbelt destillert vann. Juster pH til 7.2 og autoklaver den.
- Løs opp fluorescerende sondedihydroethidium (DHE) i DMSO-løsningsmiddel for å gi en 10 mM lagerløsning. Bland forsiktig før bruk.
MERK: Legg lagerløsningen umiddelbart inn i lyssikre hetteglass. Holdbarheten til lagerløsningen er 6 måneder ved -20 °C.
2. Fremstilling av E44 bakteriestamme
MERK: E44 er en mutant stamme av meningittisk E. coli med rifampicinmotstand.
- Dypp den kryopreserverte E44-kolonien med en steril pipettespiss, inokuler E44-stammen på LB-agarplaten som inneholder 100 μg/ml rifampicin ved å tegne linjer. Sett platen opp ned i inkubatoren ved 37 °C over natten.
- En dag før eksperimentet velger du en E44-koloni fra platen med en steril pipettespiss og legger den i 5 ml BHI-buljong som inneholder 100 μg/ml rifampicin i en 50 ml kolbe. Inkuber bakteriekulturen ved 37 °C med 90 o/min i 17 timer i en inkubasjons shaker.
3. Isolering av nøytrofiler fra humant perifert blod
- Trekk 5 ml blodprøve fra frivillige intravenøst til vakuumblodoppsamlingsrøret som inneholder EDTA for antikoagulasjon.
- Sentrifuger de perifere blodprøvene ved 500 x g i 5 minutter. Blodprøvene er delt inn i tre lag etter sentrifugering, som fra bunn til topp er det røde blodlegemelaget (RBC), det hvite blodlegemelaget (WBC) og plasmalaget, sekvensielt.
- Aspirer det hvite blodcellelaget med en pipet til et nytt rør med 3x RBC lysisbuffer. Bland blandingen grundig og plasser ved romtemperatur i 5 min.
- Sentrifuger røret på 500 x g i 5 min. Aspirer supernatanten helt og kast den.
- Gjenta lysisprosedyren med RBC lysisbuffer 1-2 ganger, til bunnfallet blir hvitt.
- Vask cellene ved å resuspendere bunnfallet med 2 ml PBS. Sentrifuger deretter på 300 x g i 5 min for å la cellene slå seg ned til bunnen av røret.
- Merk nøytrofiler med CD16 mikrober ved å resuspendere sedimentet med 50 μL for forhåndskjølt magnetisk cellesorteringsbuffer. Bland deretter med 50 μL menneskelige CD16 mikrober grundig. Inkuber blandingen ved 4 °C i 30 min.
MERK: Løsninger bør forhåndskjøles for å forhindre lokking av antistoffer på celleoverflaten og ikke-spesifikk merking. De fleste voksne har ca 4000 til 10.000 hvite blodlegemer per mikroliter blod, blant annet utgjør nøytrofiler ca. 50-70%. Ved estimat er tellingen av totale hvite blodlegemer i 5 ml humant perifert blod vanligvis opptil 2-5 x 107. - Vask cellene ved å legge til 2 ml magnetisk cellesorteringsbuffer og sentrifuge ved 4 °C, 300 x g i 10 minutter. Kast supernatanten helt og resuspender utfellingen med 500 μL sorteringsbuffer.
- Monter den magnetiske kolonnen og skillehyllen. Flytt separatoren til hyllen med den magnetiske kolonnen og skyll kolonnen med 3 ml sorteringsbuffer.
- Slipp celleopphenget i kolonnen for å la nøytrofiler merket av de magnetiske perlene festes til den magnetiske kolonnen.
- Vask av de ikke-merkede cellene ved å legge til 3 ml magnetisk cellesorteringsbuffer 3 ganger, og sørg for at kolonnereservoaret er tomt hver gang.
- Fjern kolonnen fra magnetseparatoren og legg den på et 15 ml rør. Legg til 5 ml magnetisk cellesorteringsbuffer i kolonnen. Skyv ut de magnetiske merkede cellene ved hjelp av et stempel.
MERK: For å forbedre renheten til nøytrofiler, kan sorteringstrinnene gjentas ved hjelp av en ny kolonne. - Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter, kast supernatanten helt og resuspend bunnfallet med 1 ml kulturmedium. Bestem cellenummeret med en celleteller, og klargjør cellene for videre eksperimenter.
4. Måling av ROS
- Sentrifuger de isolerte nøytrofiler ved 300 x g i 5 min, resuspendere bunnfallet og juster cellekonsentrasjonen til 2 x 106/ ml med kulturmedium som inneholder 5 μM DHE fluorescenssonde.
- Inkuber nøytrofiler ved 37 °C i 30 minutter for å laste INN DHE-sonden, og tildel deretter celleopphenget til en 96-brønns svart polystyrenmikroplate med 200 μL per brønn.
- Slå på mikroplateleseren, og åpne søkeprogramvaren. Velg ugjennomsiktig 96-brønns plateformat og bestem leseområdet.
- Still inn fluorescensen (Ex/Em = 518/605 nm) i kinetisk modus hver 5 min i 60 min ved 37 °C. Sørg for å riste platen i 3 s før hver avlesning.
- Ta ut mikroplaten fra inkubatoren, tilsett den kultiverte E44 (MOI = 100) eller phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) (100 ng / ml) til hver brønn som inneholder forhåndslastede nøytrofiler med 3 repliker. Bruk PMA som en positiv kontroll.
- Plasser platen i mikroplateleseren og start analysen umiddelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er skissert i denne artikkelen, ble nøytrofiler isolert fra humant perifert blod og lastet med fluorescenssonde DHE for å oppdage endringene i ROS-nivåer som svar på E44-infeksjon. Her gir vi representative data som demonstrerer ROS-produksjonen fremkalt av E44-stammen bestemt av en mikroplateleser i sanntid. Ved å legge til E44-stammer ved en MOI på 100 økte ROS-nivåene umiddelbart og viste en kontinuerlig oppadgående trend med en tidsavhengig måte (figur 1). Ved å legge til PMA, en velkjent ROS-induser av intracellulær ROS i nøytrofiler, observerte vi en S-formet kurve som presenterer en flat kurve i begynnelsen etterfulgt av en betydelig økning fra 20 min til 40 min og til slutt topper på 60 min (Figur 1).
Figur 1. Tidsavhengig ROS-produksjon i nøytrofiler smittet med meningittisk E. coli. Nøytrofiler isolert fra humant perifert blod ble lastet med DHE-fargestoff, en E44-stamme (MOI = 100) ble tilsatt, og gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) ble bestemt umiddelbart med en mikroplateleser. Nøytrofiler behandlet med PMA (100 ng/ml) ble brukt som en positiv kontroll. Alle dataene ble normalisert til startverdien for å oppnå den relative DHE-intensiteten og presentert som gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøytrofiler fungerer som den mest tallrike komponenten av hvite blodlegemer i menneskelig blodsirkulasjon. De er viktige effektorceller i det medfødte menneskelige immunsystemet, som bygger den første forsvarslinjen mot invasjonen av patogener11. Genereringen av ROS representerer en av de viktigste bakteriedrepende mekanismene for nøytrofiler etter fagocytose11. Nyere studier har vist at en nettlignende struktur utgitt av en nøytrofil kalt nøytrofil ekstracellulær felle (NET) også er involvert i bakteriedrepende prosess6,11,12.
Det har blitt rapportert at ROS produsert av nøytrofiler indusert av stimulering av patogene mikroorganismer hovedsakelig skyldes aktivering av NADPH oksidase, som består av to membranbindende underenheter (gp91phox og p22phox) og tre cytosoliske underenheter (p47phox, p67phoxog p40phox)5. De oppslukte bakteriene aktiverer en rekke kinaser inne i nøytrofiler, som proteinkinase C (PKC), proteinkinase A (PKA) og mitogenaktivert proteinkinase (MAPK), som fosforylerer de cytooliske subenhetene p47fostre av NADPH oxidase. Deretter en cytosolic trimer sammensatt av p47phox, p67phox, og p40phox translocates til membranen for å kombinere med membranen bindende subenhet gp91phox og p22phox, danner hele NADPH oxidase komplekset. Det monterte NADPH oksidasekomplekset overfører NADPH-avledede elektroner til molekylær O2, genererer superoksidioner og aktiverer bakteriedrepende funksjoner13,14,15. Det rapporteres også at ROS produsert av nøytrofiler også kan være forbundet med NET-dannelsen av nøytrofiler16,17. Derfor vil påvisning av ROS-produksjon bidra til videre studie av bakteriedrepende mekanisme for nøytrofiler.
I denne protokollen er nøytrofiler isolert fra perifert blod forhåndslastet med fluorescenssonde DHE og allokert til en 96-brønns svart polystyrenmikroplate. ROS-intensiteten oppdages av en mikroplateleser i sanntid etter at meningittisk Escherichia coli er tilsatt.
Det oppsamlede blodet er antikoagulert ved hjelp av EDTA eller sitrat for å unngå aktivering av nøytrofiler ved komplement18. Siden nøytrofiler er terminalt differensiert og har kort levetid (ca. 4-8 timer) i det sirkulerende blodet, bør isolasjonstrinnene gjøres så snart som mulig etter blodinnsamling19. Mange isolerende reagenser, som Ficoll-Hypaque og Percoll, har blitt brukt til å isolere nøytrofiler fra perifert blod11,19,20. I denne protokollen er nøytrofiler isolert av CD16 mikrobeadvalg etter erytrocyttlysis fra perifert blod. Det gir betydelige forbedringer i hastighet, enkelhet og renhet. For å oppnå renere nøytrofiler, kan en tetthet gradient sentrifugering påføres før isolasjonen med CD16 magnetiske perler.
En rekke anerkjente fluorescerende sonder, som dihydroethidium (DHE), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF-DA) og dihydrorhodamin 123 (DHR) som passerer gjennom cellemembranen fritt, kan brukes til bestemmelse av intracellulær ROS ved strømningscytometri, konfokal mikroskopi eller mikroplateleser21,22,23,24. I tillegg til påvisning av DHE fluorescenssonde med mikroplateleser, kan strømningscytometri og konfokalmikroskopi også brukes til å oppdage endringene av fluorescensintensiteten til DHE på de angitte tidspunktene for å måle ROS-produksjonen i nøytrofiler.
Denne protokollen gir en enklere måte for påvisning av ROS-produksjon i sanntid og kan brukes i en rekke scenarier for å oppdage ROS-generasjonen i vertspattedyrceller infisert med patogene mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) og program for fremragende professor i Liaoning-provinsen (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
