Summary
Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.
Introduction
Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80'ini oluşturur1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir4.
Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezyonlarından periferik dolaşıma girmesinden kaynaklanan bakteriyemi ile başlar, ardından kan-beyin bariyerinden (BBB) beyne nüfuz ederek menenjlerin iltihaplanmasına neden olur4. Bakteriseminin başlangıcı, nötrofiller ve makrofajlar vb. Beyaz kan hücrelerinin ~ 50-70% 'ini oluşturan nötrofiller, bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır5,6. Bakterilerin istilası sırasında, aktif nötrofiller enfeksiyöz bölgelere alınır ve süperoksit anion, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve singlet oksijen7dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır. ROS hücre zarı, nükleik asit molekülleri ve bakteri proteinleri ile redoks reaksiyonlarına maruz kalan ve istilacı bakterilerin yaralanmasına ve ölümüne neden olan8. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde ROS üretiminin ana alanıdır ve çeşitli oksidazlar (örneğin, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz kompleksi, lipoksijenaz sistemi, protein kinaz C ve siklooksijenaz sistemi) ROS9,10üretimine aracılık eder. Nötrofillerdeki birincil antimikrobiyal mekanizmayı temsil eden ROS üretiminin gerçek zamanlı ölçümü, bakteri-konak etkileşimi sırasında konak savunmasını incelemek için yararlı bir yöntemdir.
Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ros probu DHE ile ölçüldü. Bu yöntem, patojen-konak etkileşimi sırasında diğer memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırmada uygulanan gönüllülerden alınan periferik kan, ilk Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (#2020-2020-237-2).
1. Reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması
- Kırmızı kan hücresi liziz tamponunu 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO 3 ,37,2mg Na2EDTA'yı 1 L çift damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın ve pH'ı 7,2-7,4'e ayarlayın. 0,22 μm filtreler kullanarak bakteriyi filtrasyonla çıkarın.
- RPMI 1640 ortamına %5 fetal sığır serumu ekleyerek nötrofiller için deneysel kültür ortamı hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeyi kullanın.
NOT: RPMI 1640 ortamını fenol kırmızısı olmadan kullanın. - 1 L cam şişeye 1 L çift damıtılmış suya 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4·2H 2O ve 0,2 g KH2PO4 ekleyerek fosfat tampon salin (PBS) hazırlayın. pH'ı 7.2-7.4 olarak ayarlayın. 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlav.
- 50 mg/mL rifampicin çözeltisi elde etmek için 10 mL dimetil sülfit (DMSO) içinde 0,5 g rifampicin tozunu eriterek rifampicin çözeltisi hazırlayın.
- 1 L çift damıtılmış suya 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g maya özü ve 15 g agar tozu ekleyerek LB agar çözeltisi hazırlayın ve karışımı otoklavlayın. Petri tabaklarını 100 μg/mL rifampicin içeren sıcak LB agar çözeltisini dökerek hacmin yarısına doldurun. Soğutulmuş katı plakayı 4 °C'de saklayın.
- 37 g BHI tozunu 1 L çift damıtılmış suya eriterek bakteriyel suşlara uygun beyin kalbi infüzyonu (BHI) suyu hazırlayın. pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve otomatik olarak örtün.
- 10 mM stok çözeltisi elde etmek için floresan prob dihidroethidium'un (DHE) DMSO çözücüsünü çözün. Kullanmadan önce hafifçe karıştırın.
NOT: Stok çözeltisini hemen ışığa dayanıklı şişelere aliquot. Stok çözeltisinin raf ömrü -20 °C'de 6 aydır.
2. E44 bakteri suşunun hazırlanması
NOT: E44, rifampicin direncine sahip meningitik E. coli'nin mutant bir suşudur.
- Kriyoprezer korunmuş E44 kolonisini steril bir pipet ucuyla batırın, 100 μg/mL rifampicin içeren LB agar plakasındaki E44 suşunu çizgiler çizerek aşılayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de inkübatöre baş aşağı koyun.
- Deneyden bir gün önce, steril pipet ucu ile plakadan bir E44 kolonisi seçin ve 50 mL'lik bir şişede 100 μg / mL rifampicin içeren 5 mL BHI suyuna koyun. Bakteri kültürünü 37 °C'de kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 rpm ile kuluçkaya yatırın.
3. Nötrofillerin insan periferik kanından izolasyonu
- Antikoagülasyon için EDTA içeren vakumlu kan alma tüpüne gönüllülerden intravenöz olarak 5 mL kan örneği çekin.
- Periferik kan örneklerini 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Kan örnekleri, aşağıdan yukarıya kırmızı kan hücresi (RBC) tabakası, beyaz kan hücresi (WBC) tabakası ve plazma tabakası olan santrifüjleme ile üç katmana ayrılır.
- Beyaz kan hücresi tabakasını pipetle 3x RBC lizis tamponlu yeni bir tüpe epire edin. Karışımı iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika yerleştirin.
- Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın.
- Lizis prosedürünü RBC lizis tamponu ile 1-2 kez, çökeltme beyaza dönene kadar tekrarlayın.
- Çökeltiyi 2 mL PBS ile yeniden oluşturarak hücreleri yıkayın. Daha sonra hücrelerin tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
- Tortuyu 50 μL önceden solumuş manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden yağlayarak nötrofilleri CD16 mikrobeadlarla etiketleyin. Daha sonra 50 μL insan CD16 mikropları ile iyice karıştırın. Karışımı 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücre yüzeyindeki antikorların kaplanmasını ve spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için çözeltiler önceden soğutulmalıdır. Çoğu yetişkinin mikroliter kan başına yaklaşık 4.000 ila 10.000 beyaz kan hücresi vardır ve bunların arasında nötrofiller yaklaşık% 50-70'ini oluşturur. Tahmine göre, 5 mL insan periferik kanında toplam beyaz kan hücrelerinin sayısı genellikle 2-5 x 107'ye kadardır. - 10 dakika boyunca 4 °C, 300 x g'da 2 mL manyetik hücre sıralama tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Süpernatantı tamamen atın ve çökeltme kısmını 500 μL sıralama tamponu ile yeniden sunun.
- Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Ayırıcıyı manyetik sütunla rafa taşıyın ve sütunu 3 mL sıralama arabelleği ile durulayın.
- Manyetik boncuklar tarafından etiketlenen nötrofillerin manyetik sütuna bağlanmasına izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna bırakın.
- Etiketlenmemiş hücreleri 3 mL manyetik hücre sıralama tamponu ekleyerek 3 kez yıkayın ve sütun rezervuarının her seferinde boş olduğundan emin olun.
- Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe koyun. Sütuna 5 mL manyetik hücre sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin.
NOT: Nötrofillerin saflığını artırmak için sıralama adımları yeni bir sütun kullanılarak yinelenebilir. - Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, süpernatantı tamamen atın ve çökeltmeyi 1 mL kültür ortamı ile yeniden atın. Hücre sayacıyla hücre numarasını belirleyin ve hücreleri daha fazla deneme için hazırlayın.
4. ROS ölçümü
- İzole nötrofilleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, çökeltiyi yeniden sövün ve hücre konsantrasyonu 5 μM DHE floresan probu içeren kültür ortamı ile 2 x 106/mL'ye ayarlayın.
- DHE probunu yüklemek için nötrofilleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hücre süspansiyonunu kuyu başına 200 μL ile 96 kuyulu siyah bir polistiren mikro plakaya tahsis edin.
- Mikro plaka okuyucuyu açın ve algılama yazılımını açın. Opak 96 kuyu plaka biçimini seçin ve okuma alanını belirleyin.
- Floresan (Ex/Em = 518/605 nm) 37 °C'de 60 dakika boyunca her 5 dakikada bir kinetik modda ayarlayın. Her okumadan önce tabağı 3 s sallayın.
- Mikro plakayı inkübatörden çıkar, 3 çoğaltmalı önceden yüklenmiş nötrofiller içeren her kuyuya kültürlü E44 (MOI=100) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) (100 ng/mL) ekleyin. PMA'yı pozitif kontrol olarak kullanın.
- Plakayı mikro plaka okuyucuya yerleştirin ve tahlilleri hemen başlatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede özetlenen protokol kullanılarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve E44 enfeksiyonuna yanıt olarak ROS seviyelerinin değişikliklerini tespit etmek için floresan probu DHE ile yüklendi. Burada, bir mikro plaka okuyucu tarafından gerçek zamanlı olarak belirlenen E44 suşu tarafından uyandırılan ROS üretimini gösteren temsili veriler sunuyoruz. 100 MOI'de E44 suşları eklenerek, ROS seviyeleri hemen arttı ve zamana bağlı bir şekilde sürekli bir yükseliş eğilimi gösterdi (Şekil 1). Nötrofillerde hücre içi ROS'un tanınmış bir ROS indükleyicisi olan PMA'yı ekleyerek, ilk aşamada düz bir eğri sunan ve ardından 20 dakikadan 40 dakikaya kadar önemli bir artış gösteren ve son olarak 60 dk'da zirve yapan S şeklinde bir eğri gözlemledik (Şekil 1).
Şekil 1. Meningitik E. coliile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi. İnsan periferik kanından izole edilen nötrofillere DHE boyası yüklendi, bir E44 suşu (MOI=100) eklendi ve mikro plaka okuyucu ile ortalama floresan yoğunluğu (MFI) hemen belirlendi. PMA (100 ng/mL) ile tedavi edilen nötrofiller pozitif kontrol olarak kullanıldı. Tüm veriler göreli DHE yoğunluğunu elde etmek için başlangıç değerine normalleştirildi ve ortalama ± SEM (n = 3) olarak sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir11. ROS'un üretimi, fagositoz11'itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net benzeri bir yapının bakteri öldürme işlemi6,11,12'dede rol aldığını göstermiştir.
Patojenik mikroorganizmaların uyarılmasıyla indüklenen nötrofiller tarafından üretilen ROS'un esas olarak iki membran bağlayıcı alt birimi (gp91 phox ve p22phox) ve üç sitosolik alt birliğinden (p47phox, p67phoxve p40phox) oluşan NADPHoksidazınaktivasyonundan kaynaklandığı bildirilmiştir. Yutulan bakteriler nötrofillerin içinde protein kinaz C (PKC), protein kinaz A (PKA) ve mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) gibi bir dizi kinazı aktive eder ve bu da NADPH oksidazın sitosolik alt ünlemlerini p47phox'u fosforilite eder. Daha sonra p47phox, p67 phox ve p40phox'dan oluşan bir sitosolik trimer, tam NADPH oksidaz kompleksini oluşturan membran bağlayıcı alt ünül gp91phox ve p22phoxile birleştirmek için membrana yerleşir. Monte edilen NADPH oksidaz kompleksi, NADPH türevi elektronları moleküler O2'yeaktarır, süperoksit anaonları üretir ve bakterisidal fonksiyonları13,14,15aktive eder. Ayrıca nötrofiller tarafından üretilen ROS'un nötrofillerin NET oluşumu ile de ilişkili olabileceği bildirilmektedir16,17. Bu nedenle, ROS üretiminin tespiti nötrofillerin bakterisidal mekanizmasının daha fazla incelenmesine katkıda bulunacaktır.
Bu protokolde, periferik kandan izole edilen nötrofiller floresan probu DHE ile önceden yüklenir ve 96 kuyulu siyah polistiren mikro plakaya tahsis edilir. ROS yoğunluğu, meningitik Escherichia coli eklendikten sonra mikro plaka okuyucusu tarafından gerçek zamanlı olarak tespit edilir.
Toplanan kan, nötrofillerin kompleman18ile aktivasyonunu önlemek için EDTA veya sitrat kullanılarak pıhtılaşmayı önler. Nötrofiller ölümcül olarak farklılaştığından ve dolaşımdaki kanda kısa bir yaşam süresine (yaklaşık 4-8 saat) sahip olduğundan, izolasyon adımları kan alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır19. Ficoll-Hypaque ve Percoll gibi birçok izole reaktif, nötrofilleri periferik kan11 , 19,20'denizole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde nötrofiller periferik kandan eritrosit lizizinden sonra CD16 mikrobead seçimi ile izole edilir. Hız, basitlik ve saflıkta önemli iyileştirmeler sunar. Daha saf nötrofiller elde etmek için, CD16 manyetik boncuklarla izolasyondan önce bir yoğunluk gradyan santrifüjasyonu uygulanabilir.
Dihidroethidyum (DHE), 2', Hücre zarından serbestçe geçen 7'-diklorodihydrofluorescein diasetat (H2DCF-DA) ve dihidrorhodamin 123 (DHR), hücre içi ROS'un akış sitometrisi, konfokal mikroskopi veya mikro plakaokuyucusu 21, 22,23,24ile belirlenmesi için kullanılabilir. Mikro plaka okuyuculu DHE floresan probunun tespitine ek olarak, nötrofillerde ROS üretimini ölçmek için belirtilen zaman noktalarında DHE floresan yoğunluğunun değişikliklerini tespit etmek için akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi de kullanılabilir.
Bu protokol, ROS üretiminin gerçek zamanlı olarak tespiti için daha kolay bir yol sağlar ve patojenik mikroorganizmalarla enfekte olmuş konak memeli hücrelerinde ROS neslini tespit etmek için çeşitli senaryolarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31670845, 31870832, 32000811) ve Liaoning Eyaleti Seçkin Profesör Programı (LJH2018-35) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
