Summary
该协议描述了NMR生物反应器的设置,以保持封装的人类细胞存活长达72小时,然后进行时间分辨的细胞内NMR数据采集和分析。该方法用于实时监测细胞内蛋白质 - 配体相互作用。
Abstract
细胞内核磁共振是一种独特的方法,用于直接在活细胞中以原子分辨率观察生物大分子的结构和动态特性。可以观察到配体结合诱导的蛋白质折叠,化学修饰和构象变化。因此,这种方法在药物开发的背景下具有巨大的潜力。然而,限制在NMR光谱仪中的人类细胞的短寿命限制了细胞内NMR的应用范围。为了克服这个问题,采用了NMR生物反应器,可以随着时间的推移大大提高细胞样品的稳定性,重要的是,能够实时记录细胞内NMR光谱。通过这种方式,可以实时监测配体渗透和与细胞内蛋白质靶标结合等过程的演变。生物反应器通常受到高细胞数下低细胞活力的限制,这导致实验的整体灵敏度和细胞活力之间的权衡。我们最近报道了一种NMR生物反应器,它可以长时间保持大量人类细胞的代谢活性,长达72小时。该装置用于监测蛋白质 - 配体相互作用和蛋白质化学修饰。我们还引入了基于多变量曲线分辨率的实时 NMR 数据定量分析工作流程。该方法提供了细胞中存在的化学物质的浓度曲线作为时间的函数,可以进一步分析以获得相关的动力学参数。在这里,我们详细介绍了 NMR 生物反应器设置及其在监测人细胞中蛋白质-配体相互作用方面的应用。
Introduction
细胞内核磁共振(NMR)光谱最近成为研究细胞环境中大分子结构和动力学特性的有力方法1,2,3,4,5,6。细胞内 NMR 成功地研究了功能相关过程,如蛋白质折叠/错误折叠7、8、9、金属结合7、10、二硫键形成11、12 和蛋白质-蛋白质相互作用13、蛋白质-配体相互作用14、15、16 和核酸-配体相互作用17,18在活人细胞中。细胞内 NMR 应用的限制因素之一是实验过程中细胞的使用寿命短。这个问题的解决方案涉及使用NMR生物反应器。在这些装置中,将恒定流动的生长培养基施加到细胞上,这些细胞被限制在NMR光谱仪内,以提供氧气和营养物质并去除有毒副产物。随着细胞内NMR的出现,已经开发了几种NMR生物反应器设计,以提高细胞在更长的时间内的活力,其中细菌或哺乳动物细胞被封装在水凝胶中19,20,21,22或保持悬浮液并通过使用微透析膜灌注23.这种生物反应器允许获得更长的NMR实验,具有更高的信噪比(S / N)5,更重要的是,可用于实时研究细胞过程22,23,24。由于 NMR 具有高化学和构象灵敏度,后一种应用可以对原子分辨率下活细胞内功能过程的动力学提供宝贵的见解。
在该协议中,我们展示了如何设置和操作最近报道的改进的生物反应器25,这是通过将现有的模块化生物反应器设计23 与其他小组开创的依赖于水凝胶中细胞封装的方法相结合而获得的19,20,21,22,26,27.我们描述了生物反应器在HEK293T细胞中细胞内蛋白质观察配体结合的实时细胞内NMR研究中的应用。在生物反应器中,细胞以高密度封装在琼脂糖凝胶线中,并保持高度活力和代谢活性长达72小时,在此期间记录实时细胞内NMR实验。生物反应器由一个玻璃管组成,该玻璃管适合标准的5 mm NMR探头,该探头是防水的,并连接到管座,因此内部样品室具有4.2 mm的内径,38 mm的高度和526μL的体积。入口是一个7米长的PEEK毛细管(o.d. = 1/32“,i.d. = 0.5 mm),插入样品室中,从底部向下~6 mm,而出口是一个7米长的PTFE毛细管(o.d. = 1/32”,i.d. = 0.5 mm),连接到管架的顶部(图1)。管道同轴插入连接到水浴的温度控制管路中。入口和出口通过PEEK管连接到连接到FPLC泵的4通2位阀,用于控制介质流量和废物容器。
该生物反应器用于研究先前报道的两种药物乙酰唑胺(AAZ)和甲唑胺(MZA)之间相互作用的动力学,在人细胞中具有人碳酸酐酶(CA II)的第二亚型,药理学相关的靶标28,29,30,以及由小分子ebselen25促进的分子内二硫键形成的动力学,如图31所示,人铜的无铜、锌结合形式,超氧化物锌歧化酶(SOD1),一种与肌萎缩性侧索硬化症发病有关的抗氧化酶7,8,32。最后,使用多变量曲线分辨率 - 交替最小二乘法(MCR-ALS)算法33在MATLAB中对实时NMR数据进行定量分析,通过该算法可以获得所观察到的物种的纯光谱分量和浓度曲线作为时间的函数,可以进一步分析以获得相关的动力学参数。
该协议从HEK293T细胞的T75烧瓶(每个烧瓶约3×10 7 个细胞)开始,短暂地过度表达人CA II(未标记)或人SOD1(15N标记)。将细胞在具有DMEM高葡萄糖的T75烧瓶中生长并保持,每3-4天传代1:10,并在实验前48小时转染编码目的蛋白的cDNA。此阶段涉及的步骤将在其他位置详细报告34。
Protocol
1. 试剂和溶液设置
- 为了制备完整的DMEM,将5 mL L-谷氨酰胺200mM,5mL青霉素链霉素100x和50mL胎牛血清(FBS,10%vol /vol终浓度)加入440mL DMEM。
注意:该溶液可以在4°C下储存1个月。 - 通过将150mg低凝胶琼脂糖溶解在85°C的10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以获得1.5%(w / v)溶液来制备琼脂糖溶液。通过用0.22μm过滤器过滤灭菌。在1.5mL封盖管中制备1mL等分试样的琼脂糖溶液,并储存在4°C。
- 准备生物反应器培养基。
- 将13.4克DMEM粉末溶解在1升超纯H2O中。
注意:根据应用的不同,所需的最终体积可能会有所不同(例如,对于500 mL培养基,将6.7 g粉末溶解在500 mL H 2 O中)。 - 加入 2% FBS、10 mM NaHCO3、1x 青霉素-链霉素 (100x) 和 2% D2O(例如,对于 500 mL 培养基,加入 10 mL FBS、0.4 g NaHCO3、5 mL 青霉素-链霉素 100x 和 10 mL D2O)。
- 使用pH计测量pH值,如果需要,通过添加HCl调节至7.4。
注意:通常,初始pH值非常接近7.4。 - 在无菌的250 mL或500 mL玻璃瓶中,用真空驱动的无菌过滤器过滤生物反应器介质。
- 在层流罩中,用带有两个软管喷嘴的无菌钢头密封瓶子,并将它们连接到FEP管(o.d. = 1/8“,i.d. = 1.6 mm),该管将连接到泵和0.22μm PTFE注射器过滤器用于进气。
- 将13.4克DMEM粉末溶解在1升超纯H2O中。
2. 生物反应器设置
- 使用第二个流动单元 NMR 管组装流动单元,该流动单元稍后将被包含细胞的 NMR 管替换。有关正确的装配,请参阅流量单元操作说明。
注意:此时应已清洁流动装置(如果没有,请执行步骤 4.2)。 - 将连接到流量单元的水浴温度控制设置为37°C。 将储液瓶放入水浴中。
- 将储液瓶的 FEP 管连接到泵。
- 转动生物反应器阀以“旁路”并用介质预填充泵。
- 转动生物反应器阀“流动”,并用0.1 mL / min的培养基预填充生物反应器。
3. 细胞样品的制备
- 从CO2 培养箱中收集细胞。
- 从CO2 培养箱中取出转染HEK293T细胞的T75瓶,并取出用过的培养基。
- 在室温(〜20°C)下用7mL(每个)PBS洗涤细胞两次。
- 使用2毫升胰蛋白酶/ EDTA分离细胞。加入溶液后,在室温下孵育5分钟以分离细胞。
注意:转染的细胞可能需要稍长的时间才能脱离。如有必要,将细胞在37°C孵育。 - 用20 mL完全DMEM灭活胰蛋白酶;通过上下移液彻底重悬细胞,并将其转移到50mL离心管中。
- 在室温下以800× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。
- 在室温下用10mLPBS洗涤细胞以除去残留培养基。
- 在室温下以800× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。
- 将细胞沉淀转移到1.5mL封盖的微量离心管中。
- 将细胞嵌入琼脂糖线中。
- 在水浴中在85°C下熔化一等分试样的凝固琼脂糖,然后将其保持在块加热器中以37°C的溶液中。
- 使用巴斯德移液器,用60-70μL的1.5%琼脂糖凝胶填充流动单元NMR管的底部,并将其置于冰中。这将产生一个~5 mm高的底部插头,允许将细胞样品放置在 1H NMR线圈的活性体积内。
- 在37°C下加热步骤3.1.8中获得的细胞沉淀,在热块中加热15-20秒。
- 将细胞重悬于450μL琼脂糖溶液中。小心避免形成气泡。
- 将细胞琼脂糖悬浮液吸入~30厘米长的色谱PEEK管(i.d. = 0.75 mm)中,连接到1mL注射器。
注意:在抽吸之前,管子和注射器的死体积应在室温下预先填充PBS,以避免形成气泡。卡套管的长度并不重要。 - 让管道在室温下冷却2分钟。
- 在室温下用100μLPBS预填充流动单元NMR管。
- 通过轻轻推动注射器,将嵌入琼脂糖中的细胞线投射到流动单元NMR管中。
注意:要均匀地填充 NMR 管,首先将 PEEK 管的末端放在 NMR 管的底部,然后向顶部缓慢左右摆动。 - 重复步骤3.2.5,3.2.6和3.2.8,直到所有细胞琼脂糖悬浮液都已投出。
- 将细胞插入生物反应器中。
- 从流动装置中取出空的NMR管,并将流速增加到2 mL / min几分钟,以除去进气管中的残留气泡。
- 将流速设置为0.2 mL / min,并通过缓慢但稳定地向上推动它来插入含有细胞的NMR管。
注意:介质的主动流动避免了管内物品通过入口的回流,否则在插入过程中会发生这种情况。
4. 生物反应器操作和清洁
- 核磁共振实验期间的生物反应器操作。
- 将 NMR 光谱仪中的温度设置为 310 K。
- 将流量单元插入光谱仪。
- 在整个细胞内 NMR 实验期间,以 0.1 mL/min 的流速供应生物反应器培养基。
- 在实验过程中的所需时间,通过用无菌长针注射器刺穿硅胶管,将外部分子的浓缩溶液注入介质储液瓶中。
注意:培养基中分子的最终浓度应根据先前对细胞毒性的了解以及预测/估计的通过细胞膜的扩散速率(如果有的话)来选择。 - 在NMR实验结束时,用空管替换含有细胞的管,并用水冲洗流动单元。
- 生物反应器原位清洁。
- 通过以1 mL / min流动以下溶液来清洁流动单元:0.2M氢氧化钠(NaOH);3M柠檬酸;0.2 M NaOH,每次至少30分钟,然后用无菌过滤的超纯水>2小时。
- 每次运行后清洁并高压灭菌储液瓶和管道组件。
5. 核磁共振实验
- 核磁共振实验的设置。
注意:在制备细胞内NMR样品之前,请事先执行这些步骤,以避免细胞收集和数据采集之间的任何延迟。- 在 NMR 光谱仪上创建新数据集,并为所需的 NMR 实验设置参数。
- 设置一维 1H NMR 实验的参数。
- 将 1H 载波频率在水信号上以 4.7 ppm 居中。
- 选择 zgesgp 脉冲程序,将光谱宽度设置为 20 ppm,以及一个 1,000μs 180° 平方脉冲以抑制水。将扫描间延迟设置为 1 秒。通过 32 次扫描获取光谱。
- 对于表达未标记CA II的细胞:选择p3919gp脉冲程序,将光谱宽度设置为30 ppm以覆盖光谱的亚胺子区域,并调整二项式水抑制的延迟,使最大激发集中在目标信号的化学位移(d7 = 20 μs,950 MHz时)。将扫描间延迟设置为 ≥1 秒。通过 512 次扫描采集。
- 对于表达 15N标记SOD1的细胞:选择sfhmqf3gpph脉冲程序,将 1H和 15N光谱宽度分别设置为16和50 ppm,形状脉冲偏移和激励带宽分别设置为8.5和6 ppm,以及用于去耦方案的350 μs脉冲(garp4或其他,具体取决于仪器)。将扫描间延迟设置为 0.3 秒。在 15N 维度上以 16 次扫描和 128 次增量进行采集。
- 实时核磁共振波谱采集。
- 将生物反应器插入NMR光谱仪后,等待几分钟以允许介质的交换。
注:当PBS被含有2%D2O的介质取代时,从锁定信号的外观可以很容易地监控此过程。 - 调整 1H通道的匹配和调谐,填充磁铁,并计算 1H 90°硬脉冲长度。
- 根据 1H硬脉冲调整每个脉冲序列中的 1H功率水平。
- 记录第一个zgesgp 1H光谱,以检查样品含量和现场均匀性。
- 将 zgesgp 和 p3919gp/sfhmqcf3gpph 实验复制到所需数量,并在采集后台处理程序中将它们排队。
注:zgesgp光谱仅用于控制样品的状态和场均一性;因此,可以跳过它们或降低记录频率。 - 对于表达未标记CA II的细胞:通过应用零填充和指数线展宽窗口函数(LB = 20 Hz)来处理p3919gp光谱。
- 对于表达 15N标记的SOD1的细胞:通过在两个维度上应用零填充和平方正弦钟窗口函数(SSB = 2)来处理sfhmqcf3gpph光谱。
注意:通过去除没有信号的区域,可以进一步减小处理光谱的大小(在Topspin中,这是通过设置所需的STSR和STSI值来完成的)。
- 将生物反应器插入NMR光谱仪后,等待几分钟以允许介质的交换。
6. 微细胞沉降系统分析
- 对于 CA II 光谱的分析,请在 MATLAB R2019b 中导入一维光谱区域。
- 在软件中,在 “处理数据集 列表”菜单中创建要导出的试验列表。
- 使用 au 程序 convbin2asc 的修改版本,以 ASCII 格式导出每个频谱的感兴趣光谱区域。
注意:这将在每个频谱子目录中创建一个名为 ascii-spec.txt 的文本文件。 - 在 MATLAB 中,使用自定义脚本导入光谱区域Load_ascii_spectra。
注意:此脚本需要数据集目录作为输入,并生成包含堆叠 1D 光谱的 2D 阵列光谱和包含化学位移的 1D 数组 cs。 - 运行Load_acqus脚本以从一维光谱中提取时间戳。
注意:此脚本生成一个 1D 数组times_hours,其中包含每个频谱的时间增量(以小时为单位),初始频谱时间为 0。
- 要分析 SOD1 光谱,请在 MATLAB R2020b 中导入 2D 光谱。
- 在 Topspin 中,创建要在 “处理数据集列表 ”菜单中导出的试验列表。
- 在 MATLAB 中,使用自定义脚本导入 2D 光谱Load_2D_spectra。
注意:此脚本需要数据集目录作为输入,并生成包含堆叠 2D 光谱的 3D 数组 Spectra 和包含化学位移的 1D 数组 cs。 - 运行Load_acqus脚本以从 2D 光谱中提取时间戳。
- 在自定义脚本Cut_2D_spectra中指定感兴趣的光谱区域,并运行脚本以剪切3D子阵列[(1H x 15N)光谱强度)x时间];将它们重塑为 2D 阵列(时间点 x 光谱强度)并将它们连接在一起。
注:这将生成一个包含重塑和连接光谱区域的 2D 阵列JoinSpec_flat。
- 在 GUI 模式下运行 MCR-ALS 2.0。
- 通过运行mcr_main脚本打开 MCR-ALS 2.0 GUI。
- 在 “数据选择 ”选项卡中,加载光谱或JoinSpec_flat矩阵。可以绘制数据以进行检查。
- 通过奇异值分解 (SVD) 或手动评估组件的数量。
注意:组分的数量应与实验中存在的不同物种的数量相对应。在这种情况下n = 2,对应于游离和结合的蛋白质。 - 选择一种初始估计纯光谱的方法。可以使用最纯粹的变量检测或演化因子分析(EFA)。
- 在 “数据集的选择” 窗口中,选择“ 继续”。
- 在“ 约束: 行模式 ”窗口中设置浓度的约束。应用非负性约束,选择fnnls(快速非负性约束最小二乘法)作为“实现和2种”。应用 1 个闭合约束,将约束设置为 1,将闭合条件设置为“等于”并应用于所有物种。
注意:这强制每个物种浓度的总和等于1,以便每个物种获得的轮廓相对于总蛋白质浓度进行归一化。 - 在“ 约束: 列模式 ”窗口中设置光谱的约束。应用非负性约束,选择fnnls作为“实现和2种”。
注:如果 NMR 光谱中存在负信号,则不应应用此约束。 - 在最后一个窗口中,设置 50 次迭代和 0.01 收敛标准。指定“浓度”、“光谱”和“标准偏差”的输出名称。单击 继续 运行 MCR-ALS 管接头。
注:图形窗口将显示拟合结果,并附有浓度剖面图和纯组分光谱图。 - 对于 SOD1 数据集:使用自定义脚本Rebuild_2D_spectra从 MCR-ALS 的 1D 输出重建 2D 光谱区域并绘制它们。
7. 台盼蓝测试
- 用巴斯德移液管回收 NMR 管含量,并将琼脂糖线转移到 1.5 mL 封盖管中。
- 通过用600μLPBS冲洗琼脂糖线并将其在室温下以4,000× g 离心1分钟来除去残留培养基。丢弃上清液。
- 加入250μLPBS和50μL0.4%台盼蓝溶液。
- 用连续移液孵育2分钟。
- 用600μLPBS洗涤两次,丢弃上清液。
- 将几根琼脂糖线放在显微镜载玻片上,用剃须刀片切碎它们以形成小片凝胶。选择最薄的切片(厚度<0.4 mm,理想情况下约为0.2 mm)进行分析。
- 将凝胶切片转移到自制细胞计数室中,该计数室由两个载玻片组成,每侧间隔三层石蜡膜(总厚度约为0.4mm)。
注意:也可以使用腔室滑轨;然而,比腔室高度(0.1 mm)更厚的凝胶切片将被挤压,使嵌入的细胞破裂。 - 获取琼脂糖内部细胞的图像并计数白色和蓝色细胞。
- 计算细胞活力为(总细胞 - 蓝细胞)/总细胞。
Representative Results
上述方案允许将细胞封装在水凝胶线中,以长时间最大化细胞活力,这是实时研究细胞内过程所必需的。在生物反应器中,细胞保持存活和代谢活性长达72小时,正如台盼蓝测试所证实的那样(图2a-c)。原则上,该协议可用于观察目标细胞内蛋白质经历任何构象或化学变化。在上面描述的第一个应用中,生物反应器用于实时监测两种抑制剂AAZ和MZA与HEK293T细胞细胞质基质中过表达的CA II的结合。记录的第一个1H激发雕刻光谱(zgesgp)用于评估整体信号强度(与细胞数量成正比),来自过表达蛋白质的信号的存在和场均一性(图2d)。在CA II的情况下,可以通过WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR谱(p3919gp)监测两种抑制剂的细胞内结合,方法是观察11至16 ppm区域中的1H信号。这些信号来自CA II36的锌配位组氨酸和其他芳香残基,并在配体结合时受到干扰14,15。配体浓度可以根据扩散速率或(如果可用)从先前确定的渗透率值中选择14。通过在感兴趣的频谱区域中出现一组额外的信号,逐渐取代原始信号,视觉上证实了成功的结合(图3)。通过MCR-ALS分析获得瞬态结合曲线,该分析将自由和结合的CA II产生的两组NMR信号分开(图4a),并同时提供两种物质的相对浓度分布(图4b)。在第二种应用中,生物反应器用于监测由ebselen(谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)在人细胞中促进的锌结合SOD1分子内二硫键的形成。通过观察由二硫键形成诱导的蛋白质结构扰动引起的1H-15N 2D SOFAST-HMQC37光谱(提供蛋白质骨架构象的指纹)的变化来监测该过程。由二硫化物氧化SOD1产生的其他信号出现在1H-15N光谱中,并逐渐取代来自二硫化物还原SOD1的信号。对2D光谱选定区域的MCR-ALS分析将两种物质产生的信号分开(图5a),并提供它们的相对浓度分布(图5b)。通过非线性拟合可以进一步分析获得的浓度曲线,以提供有关所研究过程的动力学信息25。
图1:生物反应器的方案。 左:空流单元的横截面视图。右图:生物反应器设置方案。PEEK进气管以绿色显示;PTFE 出口管以蓝色显示。左图经Luchinat等人25许可转载。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:通过1H NMR对封装细胞进行台盼蓝测试和样品检查。 含有嵌入细胞的琼脂糖的代表性切片,并在铸造后立即用台盼蓝染色,(b)在生物反应器中72小时后用台盼蓝染色;(c)细胞活力作为时间函数在活化流动(黑色)和静态条件下(红色)下,通过台盼蓝测试测量。在后一种情况下,场均匀性降低会导致生产线拓宽和出现溶剂抑制伪影。标记了有趣的光谱特征。面板(a-c)经Luchinat等人许可转载25。请点击此处查看此图的放大版本。
图3:在生物反应器中琼脂糖包封细胞上获得的具有代表性的实时细胞内1H NMR数据。 HEK293T细胞的1D 1H NMR光谱(区域在15.6和11.1 ppm之间)的瀑布图过度表达CA II,随后用(a)25μM AAZ和(b)10μM MZA处理,记录为NMR生物反应器中的时间函数。配体处理的时间用箭头显示。光谱强度(a.u.)的颜色编码从蓝色(最低)到黄色(最高)。该图经Luchinat等人许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。
图4:一维核磁共振波谱的代表性MCR-ALS输出(a)由MCR-ALS重建的纯组分的1H核磁共振波谱:CA II在没有配体(黑色)的情况下,在具有AAZ(红色)或MZA(洋红色)的复合物中;(b) 游离(黑色)和结合CA II的相对浓度曲线,作为添加由MCR-ALS获得的AAZ(红色)或MZA(洋红色)的时间函数。配体治疗的时间用箭头标记。该图经Luchinat等人许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。
图5:2D NMR光谱的代表性MCR-ALS输出(a)MCR-ALS重建的纯组分的1H-15N光谱区域(标记为I-IV):二硫还原SOD1(黑色)和二硫氧化SOD1(红色); (b)纯组分的相对浓度曲线,作为添加MCR-ALS获得的ebselen(用箭头标记)的时间函数。该图经Luchinat等人许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
使用生物反应器进行细胞内核磁共振实验的目的是使细胞长时间保持活力和代谢活性。为了实现这一目标,必须考虑到一些关键方面。首先,在制备细胞样品和NMR数据采集期间避免细菌污染至关重要。如果在实验室中使用 大肠杆菌 菌株或其他通常用于基因克隆和重组蛋白表达的细菌,则它们可能会在样品制备过程中污染细胞。一旦进入生物反应器,细菌将利用新鲜的生长培养基迅速生长,并且由于内毒素的产生而导致细胞死亡。细菌污染仅在晚期阶段被发现,当它变成生长培养基变黄和浑浊时。此外,生物反应器的清洁不完整可能导致泵或管道被细菌、酵母或常见霉菌污染。
实验成功的一个要求是避免气泡的形成。在NMR线圈的有效体积中,被困在琼脂糖线之间的气泡会引入大磁场不均匀性,导致H2O信号的抑制不完全和频谱质量的严重损失(图2d)。气泡可能是由系统中的空气或气态CO2的形成引起的。在插入细胞样品之前,通过用培养基冲洗系统可以很容易地避免前者,而为了避免后者,建议降低生长培养基中NaHCO3的浓度,并将系统的所有部分保持在恒定的温度下,以尽量减少CO2溶解度的差异。细胞有氧代谢还可能导致气态CO2的形成,这可以通过增加流速来防止。
每次通过台盼蓝测试运行后,应检查细胞活力。然而,这并不能提供有关代谢活动的见解。为了在生物反应器操作期间获得细胞代谢状态的更完整图像,可以执行 31P NMR光谱来评估ATP作为时间函数的产生23,25。但是,这种测量通常需要专用探头,这可能允许同时使用 1H NMR进行记录。
在CA II的情况下,在1H光谱的不寻常区域中存在解析良好的报告信号有助于从简单的1D NMR光谱进行分析,并且在蛋白质表达过程中不需要同位素富集。一般来说,其他蛋白质可以产生1H信号,可用于监测其他区域的光谱变化,例如0至-1 ppm11之间的蛋白质疏水核心的典型信号;然而,这些区域往往挤满了大于约10 kDa的折叠蛋白质。在这种情况下,如SOD1所示,优选通过在蛋白质表达过程中提供均匀的15N富集生长培养基来富集蛋白质,并监测2D 1H-15N NMR光谱中的实时变化。2D 光谱在 MATLAB 中作为 2D 阵列导入,重新排列为 1D 阵列,并在 MCR-ALS 分析之前堆叠。后一种方法通常适用于产生可检测信号的任何细胞内蛋白质,并在单个残基水平上提供有关蛋白质构象变化的信息。原则上,后一种方法可以推广到ndD光谱和其他同位素标记方案。
关于对不同类型细胞的应用,方案应易于适应不同的细胞系,并且不需要将目的蛋白直接表达在细胞中。因此,细胞内NMR的其他方法可以与该协议结合使用,其中感兴趣的大分子被重组生产或合成,然后通过电穿孔或其他递送方法插入细胞1,9,38。当使用不同的细胞系或样品制备方案时,琼脂糖线中的琼脂糖浓度、线厚度和最终细胞密度等参数可能需要根据经验进行优化。此外,这里描述的方案的适用性仅限于耐受琼脂糖包封的细胞。其他细胞类型可能需要不同的水凝胶配方,而在分析在悬浮液中原生生长的细胞时,建议使用不同的设置,例如,利用同轴微透析膜来确保营养扩散,同时保持悬浮细胞限制在NMR管中23。
与其他 NMR 生物反应器设计相比19,20,21,22,此处描述的装置依赖于市售的流动装置,该装置经过微小修改。因此,该设备可以在不同的实验室中轻松复制,具有很高的可重复性。此外,如果需要,它允许标准化操作并完全符合严格的实验室安全法规。总体而言,生物反应器的灵活性和易操作性应该允许溶液NMR的许多其他应用,无论是在细胞中还是在体外,除了已经报道的那些23,25。最终,相同的生物反应器设计可以应用于更类似于组织生理环境的样品,例如球状体或类器官,前提是找到适当的支架来保持这些样品的存活 - 甚至维持其生长 - 在NMR光谱仪中。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了iNEXT-Discovery的支持,该资助编号为871037,由欧盟委员会的Horizon 2020计划资助,由Instruction-ULTRA资助,授权号为731005,欧盟H2020项目,以进一步发展Instruction-ERIC的服务,以及Ministero dell'Istruzione,dell'Università e della Ricerca PRIN赠款20177XJCHX。作者感谢Instruction-ERIC的支持,这是一个具有里程碑意义的ESFRI项目,通过JRA奖编号815和使用CERM / CIRMMP意大利中心的资源。我们感谢Matteo Pennestri(英国布鲁克)为InsightMR流量单元操作提供支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
D2O | Sigma-Aldrich | 453366 | |
DMEM, high glucose | Life Technologies | 10313-021 | |
DMEM, high glucose, powder | Sigma-Aldrich | D5648 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | |
L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030 | |
Low-gelling agarose, powder | Sigma-Aldrich | A4018 | |
NaHCO3, powder | Carlo Erba | 478537 | |
PBS | Life Technologies | 10010 | |
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
NaOH, pellets | Sigma-Aldrich | 30620 | |
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hazard statement(s): H350 may cause cancer. |
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) | Life Technologies | 25300-054 | |
Equipment | |||
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe | Bruker | n/a | All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible. |
InsightMR flow unit | Bruker | n/a | |
P-920 pump module from ÄKTA FPLC | GE Healthcare | n/a | Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit. |
References
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