Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Overvåking av protein-ligand interaksjoner i menneskelige celler ved sanntid kvantitativ in-cell NMR ved hjelp av en høy celletetthet bioreaktor

Published: March 9, 2021 doi: 10.3791/62323
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Magnetic Resonance Center − CERM, University of Florence, 2Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metalloproteine − CIRMMP, 3Neurofarba Department, University of Florence

Summary

Denne protokollen beskriver oppsettet av en NMR bioreaktor for å holde innkapslede menneskelige celler levedyktige i opptil 72 timer, etterfulgt av tids løst in-cell NMR datainnsamling og analyse. Metodikken brukes til å overvåke intracellulære protein-ligand interaksjoner i sanntid.

Abstract

In-cell NMR er en unik tilnærming for å observere de strukturelle og dynamiske egenskapene til biologiske makromolekyler ved atomoppløsning direkte i levende celler. Proteinfolding, kjemiske modifikasjoner og konformasjonsendringer forårsaket av ligandbinding kan observeres. Derfor har denne metoden et stort potensial i forbindelse med narkotikautvikling. Den korte levetiden til menneskelige celler som er begrenset i NMR-spektrometeret begrenser imidlertid applikasjonsområdet til in-cell NMR. For å løse dette problemet brukes NMR bioreaktorer som i stor grad kan forbedre celleprøvestabiliteten over tid, og viktigst av alt, muliggjøre sanntidsregistrering av IN-CELL NMR-spektra. På denne måten kan utviklingen av prosesser som ligand penetrasjon og binding til det intracellulære proteinmålet overvåkes i sanntid. Bioreaktorer er ofte begrenset av lav celle levedyktighet ved høye celletall, noe som resulterer i en avveining mellom den generelle følsomheten til eksperimentet og celle levedyktighet. Vi rapporterte nylig en NMR bioreaktor som opprettholder et høyt antall humane celler metabolsk aktive i lengre perioder, opptil 72 timer. Dette oppsettet ble brukt til å overvåke protein-ligand interaksjoner og protein kjemisk modifikasjon. Vi introduserte også en arbeidsflyt for kvantitativ analyse av NMR-dataene i sanntid, basert på multivariat kurveoppløsning. Metoden gir konsentrasjonsprofiler av de kjemiske artene som finnes i cellene som en funksjon av tid, som kan analyseres videre for å oppnå relevante kinetiske parametere. Her gir vi en detaljert beskrivelse av NMR bioreaktoroppsettet og dets anvendelse for overvåking av protein-ligand interaksjoner i menneskelige celler.

Introduction

In-cell Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi har nylig dukket opp som en kraftig tilnærming for å undersøke strukturelle og dynamiske egenskaper av makromolekyler i det cellulære miljøet1,2,3,4,5,6. In-cell NMR lyktes i utredning av funksjonelt relevante prosesser som proteinfolding/feilfolding7,8,9, metallbinding7,10, disulfidbindingsdannelse11,12 og proteinproteininteraksjon13, proteinligandinteraksjon14,15,16 og nukleinsyre-ligand interaksjon17 18 i levende menneskeceller. En av de begrensende faktorene for in-cell NMR-applikasjoner er den korte levetiden til cellene under eksperimentet. Løsningen på dette problemet innebærer bruk av NMR bioreaktorer. I disse enhetene påføres en konstant strøm av vekstmedium på cellene, som holdes begrenset innenfor NMR-spektrometeret, for å gi oksygen og næringsstoffer og for å fjerne giftige biprodukter. Etter ankomsten av in-cell NMR er flere NMR bioreaktorer design utviklet for å forbedre celle levedyktigheten i lengre perioder, der enten bakterier eller pattedyrceller er innkapslet i en hydrogel19,20,21,22 eller holdes i suspensjon og perfundert ved bruk av en mikrodialysemembran23 . Slike bioreaktorer har tillatt oppkjøp av lengre NMR-eksperimenter med økt signal-til-støy-forhold (S / N) 5 og enda viktigere, kan brukes til å undersøke cellulære prosesser i sanntid22,23,24. Takket være den høye kjemiske og konformasjonsfølsomheten til NMR, kan sistnevnte applikasjon gi dyrebar innsikt i kinetikken til funksjonelle prosesser i levende celler ved atomoppløsning.

I denne protokollen viser vi hvordan du setter opp og driver en forbedret bioreaktor som nylig ble rapportert25, som ble oppnådd ved å kombinere en eksisterende modulær bioreaktordesign23 med tilnærmingen som er avhengig av celleinnkapsling i hydrogel som ble pionerer av andre grupper19,20,21,22,26,27 . Vi beskriver anvendelsen av bioreaktoren til sanntids in-cell NMR-studier av intracellulær protein-observere ligandbinding i HEK293T-celler. I bioreaktoren er celler innkapslet ved høy tetthet i agarose geltråder og opprettholdes svært levedyktige og metabolsk aktive i opptil 72 timer, hvor sanntids IN-cell NMR-eksperimenter registreres. Bioreaktoren består av et glassrør som passer til standard 5 mm NMR-sonder som er vanntette og koblet til en rørholder slik at det indre prøvekammeret har 4,2 mm innvendig diameter, 38 mm høyde og et volum på 526 μL. Innløpet er en 7 meter lang PEEK-kapillær (o.d. = 1/32", dvs. = 0,5 mm) satt inn i prøvekammeret ned til ~6 mm fra bunnen, mens uttaket er en 7 meter lang PTFE-kapillær (o.d. = 1/32", dvs. = 0,5 mm) festet øverst på rørholderen (figur 1). Slangen er koaksialt satt inn i en temperaturkontrollert linje koblet til et vannbad. Innløpet og uttaket er koblet gjennom PEEK-rør til en 4-veis 2-posisjonsventil festet til en FPLC-pumpe for å kontrollere middels strømning og en avfallsbeholder.

Bioreaktoren brukes til å studere kinetikken i interaksjonen, tidligere rapportert14,25, mellom to legemidler, acetazolamid (AAZ) og metazolamid (MZA), i humane celler med den andre isoformen av human karbonanhydrase (CA II), et farmakologisk relevant mål28,29,30, og kinetikken i dannelsen av den intramolekylære disulfidbindingen, fremmet av det lille molekylet ebselen25, 31, av den kobberfrie, sinkbundne formen av menneskelig kobber, sink superoksid dismutase (SOD1), et antioksidantenzym implisert i utbruddet av amyotrofisk lateral sklerose7,8,32. Til slutt utføres kvantitativ analyse av sanntids NMR-data i MATLAB ved hjelp av Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) algoritme33, hvorved de rene spektralkomponentene og konsentrasjonsprofilene som en funksjon av tid oppnås for de observerte artene, som kan analyseres nærmere for å oppnå relevante kinetiske parametere.

Protokollen starter fra en T75-kolbe med HEK293T-celler (~3 x 107 celler per kolbe) som midlertidig overtrykker enten human CA II (uten etikett) eller menneskelig SOD1 (15N-merket). Cellene ble dyrket og vedlikeholdt i T75-kolber med DMEM høy glukose med 1:10 passasjer hver 3-4 dager og transfektert med cDNA som koder proteinet av interesse 48 timer før eksperimentet. Trinnene som er involvert i denne fasen rapporteres i detalj andre steder34.

Protocol

1. Reagens og løsningsoppsett

  1. For å forberede fullstendig DMEM, tilsett 5 ml L-glutamin 200 mM, 5 ml penicillin-streptomycin 100x og 50 ml foster bovint serum (FBS, 10% vol / vol sluttkonsentrasjon) til 440 ml DMEM.
    MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned.
  2. Forbered agaroseoppløsning ved å oppløse 150 mg lav-gelling agarose i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ved 85 °C for å oppnå en 1,5 % (w/v) oppløsning. Steriliser ved filtrering med et filter på 0,22 μm. Forbered 1 ml aliquots av agaroseoppløsning i 1,5 ml kappede rør og oppbevar ved 4 °C.
  3. Forbered bioreaktormediet.
    1. Løs opp 13,4 g DMEM pulver i 1 L ultrapure H2O.
      MERK: Avhengig av bruksområdet kan det nødvendige sluttvolumet variere (f.eks. for 500 ml medium, oppløs 6,7 g pulver i 500 ml H2O).
    2. Legg til 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penicillin-streptomycin (100x) og 2% D2O (f.eks. for 500 ml medium, tilsett 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 ml penicillin-streptomycin 100x og 10 ml D2O).
    3. Mål pH ved hjelp av en pH-måler og juster om nødvendig til 7,4 ved å legge til HCl.
      MERK: Vanligvis er den første pH svært nær 7,4.
    4. Filtrer bioreaktormediet med et vakuumdrevet sterilt filter i en steril glassflaske på 250 ml eller 500 ml.
    5. I laminær strømningshette forsegler du flasken med et sterilt hodestykke i stål med to slangedyser og kobler dem til en FEP-slange (o.d. = 1/8", dvs. = 1,6 mm) som skal kobles til pumpen og til et 0,22 μm PTFE sprøytefilter for luftinntak.

2. Oppsett av bioreaktor

  1. Monter strømningsenheten ved hjelp av en annen strømningsenhet NMR-rør, som senere vil bli erstattet med den som inneholder cellene. Se bruksanvisningen for strømningsenheten for riktig montering.
    MERK: På dette tidspunktet skal strømningsenheten allerede være rengjort (hvis ikke, utfør trinn 4.2).
  2. Sett vannbadet som er koblet til strømningsenhetens temperaturkontroll til 37 °C. Plasser reservoarflasken i vannbadet.
  3. Koble FEP-slangen på reservoarflasken til pumpen.
  4. Vri bioreaktorventilen for å "omgå" og forfyll pumpen med medium.
  5. Vri bioreaktorventilen for å "strømme" og forfyll bioreaktoren med medium ved 0,1 ml/min.

3. Forberedelse av celleprøven

  1. Samle cellene fra CO2-inkubatoren .
    1. Ta en T75-kolbe av transfekterte HEK293T-celler fra CO2-inkubatoren og fjern det brukte mediet.
    2. Vask cellene to ganger med 7 ml (hver) PBS ved romtemperatur (~20 °C).
    3. Bruk 2 ml trypsin/EDTA for å løsne celler. Etter å ha tilsatt løsningen, inkuber i 5 min ved romtemperatur for å løsne cellene.
      MERK: Transfected celler kan ta litt lengre tid å bli løsrevet. Inkuber om nødvendig cellene ved 37 °C.
    4. Deaktiver trypsin med 20 ml fullstendig DMEM; resuspenderer cellene grundig ved å pipettere opp og ned og overføre dem i et 50 ml sentrifugerør.
    5. Sentrifuger cellene ved 800 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
    6. Vask cellene med 10 ml PBS ved romtemperatur for å fjerne restmediet.
    7. Sentrifuger cellene ved 800 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
    8. Overfør cellepelleten til et 1,5 ml avkortet mikrosenterrør.
  2. Bygg inn celler i agarosetråder.
    1. Smelt en aliquot av størknet agarose ved 85 °C i et vannbad og oppbevar det deretter i oppløsning ved 37 °C i en blokkvarmer.
    2. Med en Pasteur pipette fyll bunnen av strømningsenheten NMR-rør med 60-70 μL 1,5% agarose gel og legg den i is. Dette vil skape en ~ 5 mm høy bunnplugg som gjør det mulig å plassere celleprøven innenfor det aktive volumet av 1H NMR-spolen.
    3. Varm opp pelletsen av celler oppnådd i trinn 3.1.8 ved 37 °C i 15-20 s i termoblokken.
    4. Resuspend celler i 450 μL agarose løsning. Pass på å unngå dannelse av bobler.
    5. Aspirer celle-agarose suspensjonen til en ~30 cm lang kromatografi PEEK-rør (dvs. = 0,75 mm) koblet til en 1 ml sprøyte.
      MERK: Før aspirasjon skal slangen og det døde volumet av sprøyten forhåndsfylles med PBS ved romtemperatur for å unngå dannelse av bobler. Lengden på slangen er ikke kritisk.
    6. La slangen avkjøles ved romtemperatur i 2 min.
    7. Forfyll strømningsenhetens NMR-rør med 100 μL PBS ved romtemperatur.
    8. Støpte tråder av celler innebygd i agarose i strømningsenheten NMR-rør ved å skyve sprøyten forsiktig.
      MERK: For å fylle NMR-røret homogent, start med å plassere enden av PEEK-slangen nederst på NMR-røret og fortsett mot toppen mens du svinger sakte mot venstre-høyre.
    9. Gjenta trinn 3.2.5, 3.2.6 og 3.2.8 til all celle-agarose suspensjon er kastet.
  3. Sett inn celler i bioreaktoren.
    1. Fjern det tomme NMR-røret fra strømningsenheten og øk strømningshastigheten til 2 ml/min i noen minutter for å fjerne gjenværende gassbobler i innløpsslangen.
    2. Sett strømningshastigheten på 0,2 ml/min og sett inn NMR-røret som inneholder cellene, ved å skyve det sakte, men jevnt oppover.
      MERK: Den aktive flyten av medium unngår tilbakestrømningen av rørinnhold gjennom innløpet, som ellers ville oppstå under innsettingen.

4. Drift og rengjøring av bioreaktor

  1. Bioreaktordrift under NMR-eksperimentet.
    1. Still inn temperaturen i NMR-spektrometeret til 310 K.
    2. Sett strømningsenheten inn i spektrometeret.
    3. Tilfør bioreaktormediet med en strømningshastighet på 0,1 ml/min i hele varigheten av NMR-eksperimentene i cellen.
    4. På ønsket tidspunkt under eksperimentet injiserer du en konsentrert løsning av eksternt molekyl til den mellomstore reservoarflasken ved å piercing silikonslangen med en steril langnålsprøyte.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av molekyl i mediet bør velges basert på tidligere kunnskap om celletoksisitet og, hvis tilgjengelig, på den anslåtte / estimerte diffusjonshastigheten gjennom cellemembranen.
    5. På slutten av NMR-eksperimentet erstatter du røret som inneholder cellene, med et tomt rør og skyll strømningsenheten med vann.
  2. Bioreaktor ren på plass.
    1. Rengjør strømningsenheten ved å strømme følgende løsninger ved 1 ml/min: 0,2 M natriumhydroksid (NaOH); 3 M sitronsyre; 0,2 M NaOH, i minst 30 minutter hver, etterfulgt av sterilt filtrert ultrarent vann i >2 t.
    2. Rengjør og autoklaver reservoarflasken og slangeenheten etter hver kjøring.

5. NMR eksperimenter

  1. Oppsett av NMR-eksperimentene.
    MERK: Utfør disse trinnene på forhånd, før forberedelsen av NMR-prøven i cellen, for å unngå forsinkelser mellom celleinnsamling og datainnsamling.
    1. Opprett et nytt datasett på NMR-spektrometeret og angi parametrene for de ønskede NMR-eksperimentene.
    2. Angi parametere for 1D 1H NMR-eksperimenter.
    3. Sentrer 1H-bærefrekvensen ved 16:7 ppm på vannsignalet.
    4. Velg zgesgp-pulsprogrammet, sett spektralbredden til 20 ppm, og en 1000-μs 180° kvadratpuls for vannundertrykking. Angi en forsinkelse mellom skanninger på 1 s. Skaff deg spekteret med 32 skanninger.
    5. For celler som uttrykker umerket CA II: Velg p3919gp pulsprogram, sett spektralbredden til 30 ppm for å dekke iminoområdet i spekteret, og juster forsinkelsen for binomisk vannundertrykking slik at maksimal eksitasjon er sentrert ved de kjemiske skiftene av interessesignalene (d7 = 20 μs ved 950 MHz). Angi en forsinkelse mellom skanninger på ≥1 s. Skaff deg 512 skanninger.
    6. For celler som uttrykker 15N-merket SOD1: velg sfhmqf3gpph pulsprogram, sett 1H- og 15N-spektralbreddene til henholdsvis 16 og 50 ppm, den formede pulsforskyvningen og eksitasjonsbåndbredden til henholdsvis 8,5 og 6 ppm, og en 350 μs puls for frakoblingsskjema (garp4 eller annen avhengig av instrumentet). Angi en forsinkelse mellom skanninger på 0,3 s. Skaff deg 16 skanninger og 128 trinn i 15N-dimensjonen.
  2. NMR-spektraanskaffelse i sanntid.
    1. Når bioreaktoren er satt inn i NMR-spektrometeret, vent noen minutter for å tillate utveksling av mediet.
      MERK: Denne prosessen overvåkes enkelt fra låsesignalets utseende, da PBS erstattes med medium som inneholder 2% D2O.
    2. Juster 1H-kanalens matching og innstilling, shim magneten, og beregn 1H 90° hard pulslengde.
    3. Juster 1H-effektnivåene i hver pulssekvens i henhold til 1H hardpuls.
    4. Registrer et første zgesgp 1H-spektrum for å sjekke prøveinnholdet og felthomogeniteten.
    5. Kopier zgesgp og p3919gp/sfhmqcf3gpph eksperimenter til ønsket nummer og legg dem i kø i oppkjøpskøen.
      MERK: Zgesgp-spektraet brukes bare til å kontrollere tilstanden til prøven og felthomogeniteten; Derfor kan de enten hoppes over eller registreres sjeldnere.
    6. For celler som uttrykker umerket CA II: Behandle p3919gp-spektraet ved å bruke null fyllings- og eksponentiell linjeforsterkende vindusfunksjon (LB = 20 Hz).
    7. For celler som uttrykker 15N-merket SOD1: behandle sfhmqcf3gpph-spektra ved å bruke null fylling og kvadrert sinusklokkevindufunksjon (SSB = 2) i begge dimensjoner.
      MERK: Størrelsen på det bearbeidede spektraet kan reduseres ytterligere ved å fjerne regioner uten signaler (i Topspin gjøres dette ved å angi de ønskede STSR- og STSI-verdiene).

6. MCR-ALS-analyse

  1. For analyse av CA II spektra, import 1D spektral regioner i MATLAB R2019b.
    1. I programvaren oppretter du en liste over eksperimenter som skal eksporteres i menyen Prosessdatasettliste .
    2. Bruk en modifisert versjon av au-programmet convbin2asc, eksporter spektralområdet av interesse i ASCII-format for hvert spektrum.
      MERK: Dette oppretter en tekstfil med navnet ascii-spec.txt i hver spektrumunderkatalog.
    3. I MATLAB importerer du spektralområdene ved hjelp av det egendefinerte skriptet Load_ascii_spectra.
      MERK: Dette skriptet krever datasettkatalogen som en inngang og produserer et 2D-matrisespektra som inneholder det stablede 1D-spektraet og en 1D-matrise cs som inneholder de kjemiske skiftene.
    4. Kjør skriptet Load_acqus for å trekke ut tidsstemplene fra 1D-spektraet.
      MERK: Dette skriptet produserer en 1D-matrise times_hours som inneholder tidsintervallet for hvert spektrum uttrykt i timer, med det første spekteret om gangen = 0.
  2. For analyse av SOD1 spektra, import 2D spektra i MATLAB R2020b.
    1. I Topspin oppretter du en liste over eksperimenter som skal eksporteres, på menyen Prosessdatasettliste .
    2. I MATLAB importerer du 2D-spektraet ved hjelp av det egendefinerte skriptet Load_2D_spectra.
      MERK: Dette skriptet krever datasettkatalogen som en inngang og produserer en 3D-matrise Spectra som inneholder det stablede 2D-spektraet og en 1D-matrise cs som inneholder de kjemiske skiftene.
    3. Kjør skriptet Load_acqus for å trekke ut tidsstemplene fra 2D-spektraet.
    4. Angi de spektrale områdene av interesse for det egendefinerte skriptet Cut_2D_spectra og kjør skriptet for å kutte 3D-undermatriser [(1H x 15N) spektralintensiteter) x tid]; endre formen på dem som 2D-matriser (tidspunkter x spektralintensiteter) og slå dem sammen.
      MERK: Dette gir en 2D-matrise JoinSpec_flat som inneholder de omformede og sammenføyde spektralområdene.
  3. Kjør MCR-ALS 2.0 i GUI-modus.
    1. Åpne MCR-ALS 2.0 GUI ved å kjøre mcr_main skript.
    2. I kategorien Datavalg laster du inn spektraet eller JoinSpec_flat matrise. Dataene kan tegnes inn for kontroll.
    3. Evaluer antall komponenter enten etter SVD (Singular Value Decomposition) eller manuelt.
      MERK: Antall komponenter skal samsvare med antall forskjellige arter som er tilstede i eksperimentet. I dette tilfellet n = 2, som tilsvarer det frie og bundne proteinet.
    4. Velg en metode for den første beregningen av det rene spektraet. Enten ren variabel deteksjon eller Evolving Factor Analysis (EFA) kan brukes.
    5. Velg Fortsett i vinduet Valg av datasett.
    6. Angi begrensningene for konsentrasjonene i vinduet Begrensninger: Radmodus . Bruk en ikke-negativitetsbetingelse, velg fnnls (Fast nonnegativity-constrained least-squares) som "implementering og 2 arter". Bruk 1 lukkebetingelse, sett betingelsen til 1, lukkebetingelsen som "lik" og bruk på alle arter.
      MERK: Dette tvinger summen av hver artskonsentrasjon til å være lik 1, slik at de oppnådde profilene til hver art normaliseres med hensyn til den totale proteinkonsentrasjonen.
    7. Angi begrensningene for spektraet i vinduet Begrensninger: Kolonnemodus . Bruk en ikke-negativitetsbetingelse, velg fnnls som "implementering og 2 arter".
      MERK: Denne begrensningen bør ikke brukes hvis det finnes negative signaler i NMR-spektraet.
    8. I det siste vinduet angir du 50 gjentakelser og 0,01 konvergenskriterium. Angi utdatanavnene for konsentrasjoner, spektra og std.avvik. Klikk fortsett for å kjøre MCR-ALS-armaturen.
      MERK: Et grafisk vindu vil vise resultatet av armaturen med tomter av konsentrasjonsprofilene og spektra av de rene komponentene.
    9. For SOD1-datasettet: Bruk det egendefinerte skriptet Rebuild_2D_spectra til å rekonstruere 2D-spektralområdene fra 1D-utdataene fra MCR-ALS og plotte dem inn.

7. Trypan blå test

  1. Gjenopprett NMR-rørinnholdet med en Pasteur-pipet, og overfør de agarose trådene til et 1,5 ml kappet rør.
  2. Fjern restmediet ved å skylle agarosetrådene med 600 μL PBS og sentrifuger dem ved 4000 x g i 1 min ved romtemperatur. Kast supernatanten.
  3. Tilsett 250 μL PBS og 50 μL 0,4% Trypan blå oppløsning.
  4. Inkuber i 2 min med kontinuerlig pipettering.
  5. Vask to ganger med 600 μL PBS som kaster supernatanten.
  6. Legg noen agarose tråder på et mikroskop lysbilde og hogge dem med barberblader for å lage små skiver gel. Velg de tynneste skivene (tykkelse < 0,4 mm, ideelt ~ 0,2 mm) for analysen.
  7. Overfør gelskivene til et selvfremstillet celletellingskammer som består av to glasssklier fordelt på tre lag med parafinfilm (~ 0,4 mm total tykkelse) på hver side.
    MERK: En kammersklie kan også brukes; Gelskivene som er tykkere enn kammerhøyden (0,1 mm), vil imidlertid klemmes, og de innebygde cellene blir rupturert.
  8. Skaff bilder av celler inne i agarose og telle hvite og blå celler.
  9. Beregn celle levedyktighet som (totalceller - blå celler) / totalceller.

Representative Results

Ovennevnte protokoll gjør det mulig å innkapsle celler i tråder av hydrogel for å maksimere cellens levedyktighet i lange perioder, som er nødvendig for å undersøke i sanntid intracellulære prosesser. I bioreaktoren opprettholdes cellene levende og metabolsk aktive opptil 72 timer, som bekreftet av Trypan blå test (figur 2a-c). I prinsippet kan denne protokollen brukes til å observere et intracellulært protein av interesse som gjennomgår eventuelle konformasjons- eller kjemiske endringer. I den første applikasjonen som er beskrevet ovenfor, brukes bioreaktoren til å overvåke i sanntid bindingen av to inhibitorer, AAZ og MZA, til CA II overekspressert i cytosolen til HEK293T-celler. Det første 1H-eksitasjonsskulpturspekteret (zgesgp) som er registrert, brukes til å vurdere den totale signalintensiteten (som er proporsjonal med antall celler), tilstedeværelsen av signaler fra det overekspresserte proteinet og felthomogeniteten (figur 2d). Når det gjelder CA II, kan den intracellulære bindingen av de to inhibitorene overvåkes av WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR-spektra (p3919gp), ved å observere 1H-signaler i regionen mellom 11 og 16 ppm. Disse signalene oppstår fra sink-koordinerende histidiner og andre aromatiske rester av CA II36 og blir forstyrret ved ligandbinding14,15. Ligandkonsentrasjoner kan velges basert på diffusjonshastigheten eller, hvis tilgjengelig, fra tidligere bestemte permeabilitetsverdier14. Vellykket binding bekreftes visuelt ved utseendet av et ekstra sett med signaler i interesseområdet, som gradvis erstatter de opprinnelige signalene (figur 3). Tidsavhengige bindingskurver oppnås ved MCR-ALS-analyse, som skiller de to settene med NMR-signaler som oppstår fra fri og bundet CA II (figur 4a) og samtidig gir de relative konsentrasjonsprofilene til de to artene (figur 4b). I den andre applikasjonen brukes bioreaktoren til å overvåke dannelsen av sinkbundet SOD1 intramolekylær disulfidbinding fremmet av ebselen, en glutathione peroksidosid mimetisk, i menneskelige celler. Denne prosessen overvåkes ved å observere endringer i 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 spektra (som gir et fingeravtrykk av protein ryggraden konformasjon) forårsaket av perturbasjoner av proteinstrukturen indusert av disulfidbindingsdannelsen. Ytterligere signaler som oppstår fra disulfidokidisert SOD1 vises i 1H-15N-spekteret og erstatter gradvis de fra disulfid-redusert SOD1. MCR-ALS-analyse på utvalgte regioner i 2D-spekteret skiller signalene som oppstår fra de to artene (figur 5a) og gir sine relative konsentrasjonsprofiler (figur 5b). De oppnådde konsentrasjonskurvene kan analyseres videre ved ikke-lineær tilpasning for å gi informasjon om kinetikken til prosessene under studie25.

Figure 1
Figur 1: Bioreaktorordningen. Venstre: tverrsnittvisning av den tomme strømningsenheten. Høyre: ordningen med bioreaktoroppsettet. PEEK-innløpsslangen vises i grønt. PTFE-utløpsslangen er vist i blått. Det venstre panelet er gjengitt med tillatelse fra Luchinat et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Trypan Blue Test på innkapslede celler og prøvekontroll med 1H NMR. Representative skiver av agarose som inneholder innebygde celler og farget med Trypan blå (a) umiddelbart etter støping og (b) etter 72 timer i bioreaktoren; (c) celle levedyktighet som en funksjon av tid i NMR bioreaktor under aktiv strømning (svart) og under statiske forhold (rød), målt ved Trypan Blue Test. (d) zgesgp 1H NMR spektra registrert på agarose-innebygde celler overekspresserende CA II i fravær (svart) og i nærvær (rød) av gassbobler i bioreaktoren. I sistnevnte tilfelle forårsaker redusert felthomogenitet linjeforsterking og utseendet av løsningsmiddelundertrykkelsesartefakter. Interessante spektralfunksjoner er merket. Paneler (a-c) reproduseres med tillatelse fra Luchinat et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative sanntidsdata for IN-celle 1H NMR innhentet på agarose-innkapslede celler i bioreaktoren. Foss tomter av 1D 1H NMR spektra (region mellom 15.6 og 11.1 ppm) av HEK293T celler overekspresserende CA II og deretter behandlet med (a) 25 μM AAZ og (b) 10 μM MZA, registrert som en funksjon av tid i NMR bioreaktor. Tidspunktet for ligandbehandling vises med en pil. Spektralintensitet (a.u.) er fargekodet fra blått (laveste) til gult (høyest). Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Luchinat et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ MCR-ALS-utgang fra 1D NMR-spektra. (a) 1H NMR-spektra av de rene komponentene rekonstruert av MCR-ALS: CA II i fravær av ligander (svart) og i komplekset med AAZ (rød) eller MZA (magenta); (b) relative konsentrasjonsprofiler av fri (svart) og bundet CA II som en funksjon av tid ved tilsetning av AAZ (rød) eller MZA (magenta) oppnådd av MCR-ALS. Tider med ligandbehandling er merket med piler. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Luchinat et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ MCR-ALS-utgang fra 2D NMR-spektra. (a) 1H-15N spektralområder (merket I-IV) av de rene komponentene rekonstruert av MCR-ALS: disulfid-redusert SOD1 (svart) og deulfidoksidert SOD1 (rød); (b) relativ konsentrasjonsprofil for de rene komponentene som en funksjon av tid ved tilsetning av ebselen (merket med en pil) oppnådd av MCR-ALS. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Luchinat et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Målet med å bruke en bioreaktor for in-cell NMR-eksperiment er å holde cellene levende og metabolsk aktive i en lengre periode. Det må tas hensyn til en rekke kritiske aspekter for å nå dette målet. For det første er det viktig å unngå bakteriell forurensning når du forbereder celleprøven og under NMR-datainnsamlingen. Hvis stammer av E. coli eller andre bakterier som vanligvis brukes til genkloning og rekombinant proteinuttrykk brukes i laboratoriet, kan de forurense cellene under prøvepreparering. En gang i bioreaktoren vil bakteriene vokse raskt og utnytte det friske vekstmediet og vil forårsake celledød på grunn av produksjon av endotoksiner. Bakteriell forurensning oppdages bare på et avansert stadium, når det blir vekstmediet gult og uklart. Videre kan ufullstendig rengjøring av bioreaktoren forårsake forurensning av pumpen eller slangen med bakterier, gjær eller vanlige former.

Et krav for å lykkes med eksperimentet er unngåelse av gassbobledannelse. Gassbobler fanget mellom agarosetrådene i det aktive volumet av NMR-spolen ville introdusere store magnetiske feltinhomogeniteter, noe som forårsaker ufullstendig undertrykkelse av H2O-signalet og alvorlig tap av spektral kvalitet (figur 2d). Bobler kan være forårsaket av luft fanget i systemet eller ved dannelse av gassformig CO2. Førstnevnte kan lett unngås ved å skylle systemet med medium før du setter inn celleprøven, mens for å unngå sistnevnte anbefales det å redusere konsentrasjonen av NaHCO3 i vekstmediet, og å holde alle deler av systemet ved konstant temperatur for å minimere forskjeller i CO2-løseligheten. Cellulær aerob metabolisme kan også forårsake dannelse av gassformige CO2, noe som kan forhindres ved å øke strømningshastigheten.

Celle levedyktighet bør kontrolleres etter hver kjøring av Trypan Blue Test. Det gir imidlertid ikke innsikt i den metabolske aktiviteten. For å få et mer komplett bilde av cellenes metabolske tilstand under bioreaktoroperasjonen, kan 31P NMR spektra utføres for å vurdere produksjonen av ATP som en funksjon av tid23,25. Imidlertid er en dedikert sonde ofte nødvendig for denne målingen, noe som kan tillate samtidig opptak med 1H NMR.

Når det gjelder CA II, letter tilstedeværelsen av velavklarte reportersignaler i en uvanlig region i 1H-spekteret analysen fra enkel 1D NMR-spektra og krever ikke isotopberikelse under proteinuttrykk. Generelt kan andre proteiner gi opphav til 1H-signaler som er nyttige for overvåking av spektralendringer i andre regioner, for eksempel det som er typisk for proteinhydrofob kjerne mellom 0 og -1 ppm11; Imidlertid har disse regionene en tendens til å være overfylt for brettede proteiner større enn ~ 10 kDa. I dette tilfellet, som vist for SOD1, er det å foretrekke å berike proteinet med 15N, ved å gi jevnt 15N-beriket vekstmedium under proteinuttrykk, og å overvåke sanntidsendringer i 2D 1H-15N NMR-spektra. 2D-spektra importeres som 2D-matriser i MATLAB, omorganiseres til 1D-matriser og stables før MCR-ALS-analyse. Sistnevnte tilnærming gjelder generelt for ethvert intracellulært protein som gir opphav til påvisbare signaler, og gir informasjon om proteinkonformasjonsendringer på enkeltresternivå. I prinsippet kan sistnevnte tilnærming generaliseres til nD-spektra og til andre isotopmerkingsordninger.

Når det gjelder anvendelsen på ulike typer celler, bør protokollen enkelt tilpasses ulike cellelinjer og krever ikke at proteinet av interesse uttrykkes direkte i cellene. Derfor kan andre tilnærminger til in-cell NMR kombineres med denne protokollen, der makromolekylet av interesse produseres rekombinant eller syntetisert, og deretter settes inn i cellene ved elektroporasjon eller ved andre leveringsmetoder1,9,38. Når du arbeider med forskjellige cellelinjer eller prøveprepareringsprotokoller, kan det hende at parametere som agarosekonsentrasjonen, trådtykkelsen og den endelige celletettheten i agarosetrådene må optimaliseres empirisk. Videre er anvendelsen av protokollen som er beskrevet her begrenset til celler som tolererer agarose innkapsling. Andre celletyper kan kreve forskjellige hydrogelformuleringer, mens et annet oppsett anbefales når du analyserer celler som vokser i suspensjon, for eksempel å bruke en koaksial mikrodialysemembran for å sikre næringsdiffusjon mens du holder suspenderte celler begrenset i NMR-røret23.

Sammenlignet med andre NMR bioreactor design19,20,21,22, er enheten beskrevet her avhengig av en kommersielt tilgjengelig strømningsenhet, tilpasset med mindre modifikasjoner. Derfor kan enheten enkelt replikeres i forskjellige laboratorier med høy reproduserbarhet. Videre tillater det standardisert drift og full overholdelse av strenge laboratoriesikkerhetsforskrifter, om nødvendig. Samlet sett bør bioreaktorens fleksibilitet og brukervennlighet tillate mange andre anvendelser av løsning NMR, både i celler og in vitro, i tillegg til de som allerede er rapportert23,25. Etter hvert kan den samme bioreaktordesignen brukes på prøver som ligner mer av det fysiologiske miljøet i et vev, for eksempel sfæroider eller organoider, forutsatt at passende stillaser finnes for å holde slike prøver levende - eller til og med opprettholde veksten i NMR-spektrometeret.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet har blitt støttet av iNEXT-Discovery, tilskuddsnummer 871037, finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen, av Instruct-ULTRA, tilskuddsnummer 731005, et EU H2020-prosjekt for å videreutvikle tjenestene til Instruct-ERIC, og av Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX. Forfatterne anerkjenner støtten fra Instruct-ERIC, et Landmark ESFRI-prosjekt, gjennom JRA Award nummer 815 og bruk av ressurser fra CERM/CIRMMP Italy Centre. Vi takker Matteo Pennestri (Bruker, Uk) for å ha gitt støtte for InsightMR-strømningsenhetsoperasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
D2O Sigma-Aldrich 453366
DMEM, high glucose Life Technologies 10313-021
DMEM, high glucose, powder Sigma-Aldrich D5648
FBS Life Technologies 10270
HCl Sigma-Aldrich 30721
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030
Low-gelling agarose, powder Sigma-Aldrich A4018
NaHCO3, powder Carlo Erba 478537
PBS Life Technologies 10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
NaOH, pellets Sigma-Aldrich 30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) Sigma-Aldrich T8154 Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) Life Technologies 25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe Bruker n/a All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit Bruker n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC GE Healthcare n/a Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
  2. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).
  3. Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
  4. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
  5. Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
  6. Siegal, G., Selenko, P. Cells, drugs and NMR. Journal of Magnetic Resonance. 306, San Diego, Calif. 202-212 (1997).
  7. Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
  8. Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
  9. Theillet, F. -X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
  10. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
  11. Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
  12. Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
  13. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
  14. Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
  15. Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
  16. DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
  17. Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
  18. Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  19. Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).
  20. Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
  21. Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).
  22. Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).
  23. Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
  24. Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
  25. Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
  26. Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
  27. Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
  28. Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
  29. Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
  30. Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
  31. Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
  32. Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  33. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  34. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
  35. Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
  36. Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
  37. Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
  38. Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).

Tags

Kjemi utgave 169 in-cell NMR sanntid bioreaktor multivariat kurveoppløsning ligandbinding karbonanhydrase II acetazolamid metazolamid proteinoksidasjon superoksiddismutase 1 ebselen
Overvåking av protein-ligand interaksjoner i menneskelige celler ved sanntid kvantitativ in-cell NMR ved hjelp av en høy celletetthet bioreaktor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barbieri, L., Luchinat, E.… More

Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor. J. Vis. Exp. (169), e62323, doi:10.3791/62323 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter