Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Overvågning af protein-ligandinteraktioner i humane celler ved hjælp af kvantitativ in-cell NMR i realtid ved hjælp af en bioreaktor med høj celletæthed

Published: March 9, 2021 doi: 10.3791/62323
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Magnetic Resonance Center − CERM, University of Florence, 2Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metalloproteine − CIRMMP, 3Neurofarba Department, University of Florence

Summary

Denne protokol beskriver opsætningen af en NMR-bioreaktor til at holde indkapslede humane celler levedygtige i op til 72 timer efterfulgt af tidsopløst NMR-dataindsamling og -analyse i cellen. Metoden anvendes til at overvåge intracellulære protein-ligandinteraktioner i realtid.

Abstract

In-cell NMR er en unik tilgang til at observere de strukturelle og dynamiske egenskaber af biologiske makromolekyler ved atomopløsning direkte i levende celler. Proteinfoldning, kemiske modifikationer og konformationsændringer induceret af ligandbinding kan observeres. Derfor har denne metode et stort potentiale i forbindelse med lægemiddeludvikling. Den korte levetid for humane celler, der er begrænset i NMR-spektrometeret, begrænser imidlertid anvendelsesområdet for NMR i cellen. For at løse dette problem anvendes NMR-bioreaktorer, der i høj grad kan forbedre celleprøvens stabilitet over tid og vigtigst af alt muliggøre realtidsregistrering af NMR-spektre i cellen. På denne måde kan udviklingen af processer såsom ligandindtrængning og binding til det intracellulære proteinmål overvåges i realtid. Bioreaktorer er ofte begrænset af lav cellelevedygtighed ved høje celletal, hvilket resulterer i en afvejning mellem eksperimentets samlede følsomhed og cellelevedygtighed. Vi rapporterede for nylig om en NMR-bioreaktor, der opretholder et stort antal humane celler metabolisk aktive i længere perioder, op til 72 timer. Denne opsætning blev anvendt til at overvåge protein-ligandinteraktioner og proteinkemisk modifikation. Vi introducerede også en arbejdsgang til kvantitativ analyse af NMR-data i realtid baseret på multivariat kurveopløsning. Metoden tilvejebringer koncentrationsprofiler af de kemiske arter, der er til stede i cellerne som funktion af tiden, som kan analyseres yderligere for at opnå relevante kinetiske parametre. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af NMR-bioreaktoropsætningen og dens anvendelse til overvågning af protein-ligand-interaktioner i humane celler.

Introduction

In-cell Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi har for nylig vist sig som en stærk tilgang til at undersøge strukturelle og dynamiske egenskaber af makromolekyler inden for det cellulære miljø1,2,3,4,5,6. Nmr i celler lykkedes med undersøgelsen af funktionelt relevante processer såsom proteinfoldning/fejlfoldning7,8,9, metalbinding7,10, disulfidbindingsdannelse11,12 og protein-proteininteraktion13, protein-ligand-interaktion14,15,16 og nukleinsyre-ligand-interaktion17 ,18 i levende menneskelige celler. En af de begrænsende faktorer ved NMR-applikationer i cellen er cellernes korte levetid under eksperimentet. Løsningen på dette problem indebærer brug af NMR-bioreaktorer. I disse anordninger påføres en konstant strøm af vækstmedium på cellerne, som holdes begrænset inden for NMR-spektrometeret for at tilvejebringe ilt og næringsstoffer og fjerne giftige biprodukter. Efter fremkomsten af NMR i cellen er der udviklet flere NMR-bioreaktordesign for at forbedre cellernes levedygtighed i længere perioder, hvor enten bakterier eller pattedyrceller indkapsles i en hydrogel19,20,21,22 eller holdes i suspension og perfuseres ved brug af en mikrodialysemembran23 . Sådanne bioreaktorer har gjort det muligt at erhverve længere NMR-eksperimenter med øget signal-støj-forhold (S/N)5 og, endnu vigtigere, kunne anvendes til at undersøge cellulære processer i realtid22,23,24. Takket være NMR's høje kemiske og konformationsmæssige følsomhed kan sidstnævnte applikation give dyrebar indsigt i kinetikken af funktionelle processer i levende celler ved atomopløsning.

I denne protokol viser vi, hvordan man opretter og driver en forbedret bioreaktor, der for nylig blev rapporteret25, som blev opnået ved at kombinere et eksisterende modulært bioreaktordesign23 med den tilgang, der er afhængig af celleindkapsling i hydrogel, der blev banebrydende af andre grupper19,20,21,22,26,27 . Vi beskriver anvendelsen af bioreaktoren til real-time in-cell NMR-undersøgelser af intracellulært protein-observere ligandbinding i HEK293T-celler. I bioreaktoren indkapsles celler ved høj densitet i agarosegeltråde og opretholdes meget levedygtige og metabolisk aktive i op til 72 timer, hvor der registreres NMR-eksperimenter i realtid i cellen. Bioreaktoren består af et glasrør, der passer til standard 5 mm NMR-sonder, der er vandtætte og forbundet til en rørholder, så det interne prøvekammer har 4,2 mm indvendig diameter, 38 mm højde og et volumen på 526 μL. Indløbet er en 7 meter lang PEEK-kapillær (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) indsat i prøvekammeret ned til ~6 mm fra bunden, mens udløbet er en 7 meter lang PTFE-kapillær (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm), der er fastgjort øverst på rørholderen (figur 1). Slangen indsættes koaksialt i en temperaturstyret linje forbundet til et vandbad. Indløbet og udløbet er forbundet via PEEK-slangen til en 4-vejs 2-positionsventil, der er fastgjort til en FPLC-pumpe til styring af mediumstrømmen og en affaldsbeholder.

Bioreaktoren anvendes til at studere kinetikken af interaktionen, tidligere rapporteret14,25, mellem to lægemidler, acetazolamid (AAZ) og methazolamid (MZA), i humane celler med den anden isoform af human carbonanhydrase (CA II), et farmakologisk relevant mål28,29,30, og kinetikken i dannelsen af den intramolekylære disulfidbinding, fremmet af det lille molekyle ebselen25, 31, af den kobberfrie, zinkbundne form af humant kobber, zinksuperoxiddimutase (SOD1), et antioxidantenzym impliceret i begyndelsen af amyotrofisk lateral sklerose7,8,32. Endelig udføres kvantitativ analyse af NMR-data i realtid i MATLAB ved hjælp af multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) algoritme33, hvorigennem de rene spektrale komponenter og koncentrationsprofilerne som funktion af tiden opnås for de observerede arter, der kan analyseres yderligere for at opnå relevante kinetiske parametre.

Protokollen starter fra en T75-kolbe af HEK293T-celler (~ 3 x 107 celler pr. Kolbe), der forbigående overudtrykker enten human CA II (umærket) eller human SOD1 (15N-mærket). Cellerne blev dyrket og vedligeholdt i T75-kolber med DMEM-høj glucose med 1:10 passager hver 3-4 dag og transfekteret med cDNA'et, der koder for proteinet af interesse 48 timer før eksperimentet. De trin, der er involveret i denne fase, er beskrevet detaljeret andetsteds34.

Protocol

1. Opsætning af reagens og opløsning

  1. For at forberede komplet DMEM tilsættes 5 ml L-glutamin 200 mM, 5 ml penicillin-streptomycin 100x og 50 ml føtalt kvægserum (FBS, 10% vol/ vol endelig koncentration) til 440 ml DMEM.
    BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
  2. Agaroseopløsningen fremstilles ved at opløse 150 mg lavgelerende agarose i 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS) ved 85 °C for at opnå en opløsning på 1,5 % (w/v). Steriliser ved filtrering med et 0,22 μm filter. Der fremstilles 1 ml alikvoter agaroseopløsning i rør med 1,5 ml låg, og opbevares ved 4 °C.
  3. Forbered bioreaktormediet.
    1. 13,4 g DMEM-pulver opløses i 1 liter ultrarent H2O.
      BEMÆRK: Afhængigt af applikationen kan det krævede endelige volumen variere (f.eks. for 500 ml medium opløses 6,7 g pulver i 500 ml H2O).
    2. Tilsæt 2 % FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penicillin-streptomycin (100x) og 2 % D2O (f.eks. til 500 ml medium tilsættes 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 ml penicillin-streptomycin 100x og 10 ml D2O).
    3. PH-værdien måles ved hjælp af en pH-meter, og om nødvendigt justeres den til 7,4 ved at tilsætte HCl.
      BEMÆRK: Typisk er den oprindelige pH meget tæt på 7,4.
    4. Filtrer bioreaktormediet med et vakuumdrevet sterilt filter i en steril 250 ml eller 500 ml glasflaske.
    5. I den laminære strømningshætte forsegles flasken med et sterilt stålhovedstykke med to slangedyser og tilsluttes en FEP-slange (o.d. = 1/8", dvs. = 1,6 mm), der tilsluttes pumpen og til et 0,22 μm PTFE-sprøjtefilter til luftindtag.

2. Opsætning af bioreaktor

  1. Saml flowenheden ved hjælp af et andet flowenhed NMR-rør, som senere vil blive erstattet med det, der indeholder cellerne. Se betjeningsvejledningen til flowenheden for at få den korrekte montering.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt skal flowenheden allerede være rengjort (hvis ikke, udfør trin 4.2).
  2. Indstil det vandbad, der er tilsluttet flowenhedens temperaturregulering, til 37 °C. Anbring reservoirflasken i vandbadet.
  3. Tilslut FEP-slangen på reservoirflasken til pumpen.
  4. Drej bioreaktorventilen for at "omgå" og forfyld pumpen med medium.
  5. Drej bioreaktorventilen til "flow", og forfyld bioreaktoren med medium ved 0,1 ml/min.

3. Forberedelse af celleprøven

  1. Saml cellerne fra CO2-inkubatoren.
    1. Tag en T75-kolbe med transfekterede HEK293T-celler fra CO2-inkubatoren og fjern det brugte medium.
    2. Cellerne vaskes to gange med 7 ml (hver) PBS ved stuetemperatur (~20 °C).
    3. Brug 2 ml trypsin / EDTA til at løsne celler. Efter tilsætning af opløsningen inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur for at løsne cellerne.
      BEMÆRK: Transfekterede celler kan tage lidt længere tid at løsne sig. Om nødvendigt inkuberes cellerne ved 37 °C.
    4. Inaktiver trypsin med 20 ml komplet DMEM; resuspend cellerne grundigt ved at pipettere op og ned og overføre dem i et 50 ml centrifugerør.
    5. Centrifuger cellerne ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
    6. Vask cellerne med 10 ml PBS ved stuetemperatur for at fjerne restmediet.
    7. Centrifuger cellerne ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
    8. Overfør cellepillen til et 1,5 ml lukket mikrocentrifugerør.
  2. Integrer celler i agarosetråde.
    1. En alikvot størknet agarose smeltes ved 85 °C i et vandbad, og den opbevares derefter i opløsning ved 37 °C i en blokvarmer.
    2. Med en Pasteur-pipette fyldes bunden af flowenheden NMR-røret med 60-70 μL 1,5% agarosegel og anbrings i is. Dette vil skabe et ~ 5 mm højt bundstik, der gør det muligt at placere celleprøven inden for det aktive volumen af 1H NMR-spolen.
    3. Opvarm pelleten af celler opnået i trin 3.1.8 ved 37 °C i 15-20 s i termoblokken.
    4. Resuspend celler i 450 μL agaroseopløsning. Pas på at undgå dannelse af bobler.
    5. Aspirer celle-agarosesuspensionen i en ~ 30 cm lang kromatografi PEEK-slange (i.d. = 0,75 mm) forbundet til en 1 ml sprøjte.
      BEMÆRK: Før aspiration skal slangen og sprøjtens døde volumen fyldes med PBS ved stuetemperatur for at undgå dannelse af bobler. Slangens længde er ikke kritisk.
    6. Lad slangen køle af ved stuetemperatur i 2 min.
    7. Forfyld flowenhedens NMR-rør med 100 μL PBS ved stuetemperatur.
    8. Støbte tråde af celler indlejret i agarose i flowenheden NMR-rør ved forsigtigt at skubbe sprøjten.
      BEMÆRK: For at fylde NMR-røret homogent skal du starte med at placere enden af PEEK-slangen i bunden af NMR-røret og fortsætte mod toppen, mens du langsomt svinger til venstre-højre.
    9. Gentag trin 3.2.5, 3.2.6 og 3.2.8, indtil al celle-agarose-suspensionen er støbt.
  3. Indsæt celler i bioreaktoren.
    1. Fjern det tomme NMR-rør fra flowenheden, og øg strømningshastigheden til 2 ml/min i et par minutter for at fjerne resterende gasbobler i indløbsslangen.
    2. Indstil strømningshastigheden til 0,2 ml/min, og indsæt NMR-røret, der indeholder cellerne, ved at skubbe det langsomt, men støt opad.
      BEMÆRK: Den aktive strøm af medium undgår tilbagestrømning af rørindhold gennem indløbet, som ellers ville forekomme under indsættelsen.

4. Bioreaktor drift og rengøring

  1. Bioreaktordrift under NMR-eksperimentet.
    1. Indstil temperaturen i NMR-spektrometeret til 310 K.
    2. Indsæt flowenheden i spektrometeret.
    3. Tilfør bioreaktormediet med en strømningshastighed på 0,1 ml/min i hele varigheden af NMR-forsøgene i cellen.
    4. På det ønskede tidspunkt under eksperimentet injiceres en koncentreret opløsning af eksternt molekyle til mediumreservoirflasken ved at gennembore silikoneslangen med en steril langnålsprøjte.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af molekylet i mediet bør vælges på grundlag af tidligere viden om celletoksicitet og, hvis en sådan foreligger, på grundlag af den forudsagte/estimerede diffusionshastighed gennem cellemembranen.
    5. Ved afslutningen af NMR-eksperimentet skal du udskifte røret, der indeholder cellerne, med et tomt rør og skylle flowenheden med vand.
  2. Bioreaktor ren-på-stedet.
    1. Flowenheden rengøres ved at strømme følgende opløsninger ved 1 ml/min: 0,2 M natriumhydroxid (NaOH); 3 M citronsyre; 0,2 M NaOH, i mindst 30 minutter hver, efterfulgt af sterilt filtreret ultrarent vand i >2 timer.
    2. Rengør og autoklave beholderflasken og slangesamlingen efter hver kørsel.

5. NMR-eksperimenter

  1. Opsætning af NMR-eksperimenterne.
    BEMÆRK: Udfør disse trin på forhånd, inden forberedelsen af NMR-prøven i cellen, for at undgå forsinkelser mellem celleindsamling og dataindsamling.
    1. Opret et nyt datasæt på NMR-spektrometeret, og indstil parametrene for de ønskede NMR-eksperimenter.
    2. Indstil parametre for 1D 1H NMR-eksperimenter.
    3. Centrer 1H-bærerfrekvensen ved 4,7 ppm på vandsignalet.
    4. Vælg zgesgp-pulsprogrammet, indstil spektralbredden til 20 ppm og en 1.000-μs 180 ° kvadratisk puls til vandundertrykkelse. Indstil en inter-scan forsinkelse på 1 s. Erhverv spektret med 32 scanninger.
    5. For celler, der udtrykker umærket CA II: Vælg p3919gp-pulsprogrammet, indstil spektralbredden til 30 ppm for at dække iminoområdet i spektret, og juster forsinkelsen for binomial vandundertrykkelse, så den maksimale excitation er centreret ved de kemiske skift af signalerne af interesse (d7 = 20 μs ved 950 MHz). Indstil en interscanningsforsinkelse på ≥ 1 s. Erhverv med 512 scanninger.
    6. For celler, der udtrykker 15N-mærket SOD1: Vælg sfhmqf3gpph-pulsprogrammet, indstil spektralbredderne 1H og 15N til henholdsvis 16 og 50 ppm, den formede pulsforskydning og excitationsbåndbredde til henholdsvis 8,5 og 6 ppm og en 350 μs puls til afkoblingsskema (garp4 eller andet afhængigt af instrumentet). Indstil en inter-scan forsinkelse på 0,3 s. Erhverv med 16 scanninger og 128 trin i 15N-dimensionen.
  2. Erhvervelse af NMR-spektre i realtid.
    1. Når bioreaktoren er indsat i NMR-spektrometeret, skal du vente et par minutter for at tillade udveksling af mediet.
      BEMÆRK: Denne proces overvåges let fra udseendet af låsesignalet, da PBS udskiftes med medium, der indeholder 2% D2O.
    2. Juster matchningen og tuningen af 1H-kanalen, shim magneten, og beregn 1H 90 ° hård pulslængde.
    3. Juster 1H effektniveauerne i hver pulssekvens i henhold til 1H hård puls.
    4. Optag et første zgesgp 1H-spektrum for at kontrollere prøveindholdet og felthomogeniteten.
    5. Kopier zgesgp- og p3919gp/sfhmqcf3gpph-eksperimenterne til det ønskede nummer, og sæt dem i kø i anskaffelsesspooleren.
      BEMÆRK: Zgesgp-spektrene bruges kun til at kontrollere prøvens tilstand og felthomogeniteten; derfor kan de enten springes over eller optages sjældnere.
    6. For celler, der udtrykker umærket CA II: Behandl p3919gp-spektrene ved at anvende nulfyldning og eksponentiel linjeudvidningsvinduesfunktion (LB = 20 Hz).
    7. For celler, der udtrykker 15N-mærket SOD1: Behandl sfhmqcf3gpph-spektrene ved at anvende nulfyldning og kvadreret sinusklokkevinduesfunktion (SSB = 2) i begge dimensioner.
      BEMÆRK: Størrelsen på de behandlede spektre kan reduceres yderligere ved at fjerne områder fri for signaler (i Topspin gøres dette ved at indstille de ønskede STSR- og STSI-værdier).

6. MCR-ALS-analyse

  1. Til analyse af CA II-spektre importeres 1D-spektralregioner i MATLAB R2019b.
    1. I softwaren skal du oprette en liste over eksperimenter, der skal eksporteres, i menuen Liste over procesdatasæt .
    2. Ved hjælp af en modificeret version af au-programmet convbin2asc eksporteres spektralområdet af interesse i ASCII-format for hvert spektrum.
      BEMÆRK: Dette opretter en tekstfil med navnet ascii-spec.txt i hver spektrumundermappe.
    3. I MATLAB skal du importere spektralområderne ved hjælp af det brugerdefinerede script Load_ascii_spectra.
      BEMÆRK: Dette script kræver datasætmappen som input og producerer et 2D-array-spektre, der indeholder de stablede 1D-spektre og et 1D-array cs, der indeholder de kemiske skift.
    4. Kør scriptet Load_acqus for at udtrække tidsstemplerne fra 1D-spektrene.
      BEMÆRK: Dette script producerer et 1D-array times_hours, der indeholder tidsforøgelsen for hvert spektrum udtrykt i timer, med det indledende spektrum på tid = 0.
  2. Til analyse af SOD1-spektre importeres 2D-spektre i MATLAB R2020b.
    1. I Topspin skal du oprette en liste over eksperimenter, der skal eksporteres, i menuen Liste over procesdatasæt .
    2. I MATLAB skal du importere 2D-spektrene ved hjælp af det brugerdefinerede script Load_2D_spectra.
      BEMÆRK: Dette script kræver datasætmappen som input og producerer et 3D-array Spectra, der indeholder de stablede 2D-spektre og et 1D-array cs, der indeholder de kemiske skift.
    3. Kør scriptet Load_acqus for at udtrække tidsstemplerne fra 2D-spektrene.
    4. Angiv de spektrale områder af interesse i det brugerdefinerede script Cut_2D_spectra og kør scriptet for at skære 3D-underarrays [(1H x 15N) spektralintensiteter) x tid]; omform dem som 2D-arrays (tidspunkter x spektrale intensiteter) og sammenføj dem sammen.
      BEMÆRK: Dette producerer et 2D-array JoinSpec_flat, der indeholder de omformede og sammenføjede spektrale regioner.
  3. Kør MCR-ALS 2.0 i GUI-tilstand.
    1. Åbn MCR-ALS 2.0 GUI ved at køre mcr_main scriptet.
    2. Under fanen Datavalg skal du indlæse spektrene eller matrixen JoinSpec_flat. Dataene kan plotes til kontrol.
    3. Evaluer antallet af komponenter enten ved hjælp af SVD (Singular Value Decomposition) eller manuelt.
      BEMÆRK: Antallet af komponenter skal svare til antallet af forskellige arter, der er til stede i forsøget. I dette tilfælde n = 2, svarende til det frie og bundne protein.
    4. Vælg en metode til den indledende estimering af de rene spektre. Enten reneste variabeldetektion eller Evolving Factor Analysis (EFA) kan bruges.
    5. Vælg Fortsæt i vinduet Valg af datasæt.
    6. Angiv begrænsningerne for koncentrationerne i vinduet Begrænsninger: Rækketilstand . Anvend en ikke-negativitetsbegrænsning, vælg fnnls (Hurtige ikke-negativitetsbegrænsede mindste kvadrater) som "implementering og 2 arter". Anvend 1 lukningsbegrænsning, indstil begrænsningen til 1, lukningsbetingelsen som "lig med" og gælder for alle arter.
      BEMÆRK: Dette tvinger summen af hver artskoncentration til at være lig med 1, således at de opnåede profiler for hver art normaliseres med hensyn til den samlede proteinkoncentration.
    7. Angiv begrænsningerne for spektrene i vinduet Begrænsninger: Kolonnetilstand . Anvend en ikke-negativitetsbegrænsning, vælg fnnls som "implementering og 2 arter".
      BEMÆRK: Denne begrænsning bør ikke anvendes, hvis der er negative signaler i NMR-spektrene.
    8. I det sidste vindue fastsættes 50 iterationer og 0,01 konvergenskriteriet. Angiv outputnavnene for Koncentrationer, Spektre og Std.-afvigelse. Klik på Fortsæt for at køre MCR-ALS-beslaget.
      BEMÆRK: Et grafisk vindue viser resultatet af tilpasningen med afbildninger af koncentrationsprofilerne og spektrene af de rene komponenter.
    9. For SOD1-datasættet: Brug det brugerdefinerede script Rebuild_2D_spectra til at rekonstruere 2D-spektralområderne fra 1D-outputtet fra MCR-ALS og plotte dem.

7. Trypan blå test

  1. Genvind NMR-rørindholdet med en Pasteur-pipet, og overfør agarosetrådene til et 1,5 ml lukket rør.
  2. Fjern restmediet ved at skylle agarosetrådene med 600 μL PBS og centrifugere dem ved 4.000 x g i 1 min ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
  3. Tilsæt 250 μL PBS og 50 μL 0,4% Trypan blå opløsning.
  4. Inkuber i 2 minutter med kontinuerlig pipettering.
  5. Vask to gange med 600 μL PBS, der kasserer supernatanten.
  6. Læg et par agarosetråde på et mikroskop dias og hak dem med barberblade for at skabe små skiver gel. Vælg de tyndeste skiver (tykkelse < 0,4 mm, ideelt ~ 0,2 mm) til analysen.
  7. Overfør gelskiverne til et selvfremstillet celletællekammer bestående af to glasrutschebaner fordelt på tre lag paraffinfilm (~ 0,4 mm total tykkelse) på hver side.
    BEMÆRK: Et kammerdias kan også bruges; gelskiverne tykkere end kammerhøjden (0,1 mm) ville imidlertid blive presset og briste de indlejrede celler.
  8. Erhverv billeder af celler inde i agarose og tæl hvide og blå celler.
  9. Beregn cellelevedygtighed som (samlede celler - blå celler) / samlede celler.

Representative Results

Ovenstående protokol tillader indkapsling af celler i tråde af hydrogel for at maksimere cellelevedygtigheden i lange perioder, hvilket er nødvendigt for at undersøge intracellulære processer i realtid. I bioreaktoren holdes cellerne levende og metabolisk aktive op til 72 timer, som bekræftet af Trypan blå test (figur 2a-c). I princippet kan denne protokol anvendes til at observere et intracellulært protein af interesse, der gennemgår konformationelle eller kemiske ændringer. I den første ansøgning, der er beskrevet ovenfor, påføres bioreaktoren til i realtid at overvåge bindingen af to hæmmere, AAZ og MZA, til CA II, der er overudtrykt i cytosolen af HEK293T-celler. Det første 1H excitationsskulpturspektrum (zgesgp), der registreres, bruges til at vurdere den samlede signalintensitet (som er proportional med antallet af celler), tilstedeværelsen af signaler fra det overudtrykte protein og felthomogeniteten (figur 2d). I tilfælde af CA II kan den intracellulære binding af de to hæmmere overvåges af WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR-spektre (p3919gp) ved at observere 1H-signaler i området mellem 11 og 16 ppm. Disse signaler stammer fra de zinkkoordinerende histidiner og andre aromatiske rester af CA II36 og forstyrres ved ligandbinding14,15. Ligandkoncentrationer kan vælges ud fra diffusionshastigheden eller, hvis de foreligger, ud fra tidligere bestemte permeabilitetsværdier14. Vellykket binding bekræftes visuelt ved udseendet af et yderligere sæt signaler i det spektrale område af interesse, der gradvist erstatter de originale signaler (figur 3). Tidsafhængige bindingskurver opnås ved MCR-ALS-analyse, som adskiller de to sæt NMR-signaler, der stammer fra fri og bundet CA II (figur 4a) og samtidig angiver de to arters relative koncentrationsprofiler (figur 4b). I den anden ansøgning påføres bioreaktoren til overvågning af dannelsen af zinkbundet SOD1 intramolekylær disulfidbinding fremmet af ebselen, en glutathionperoxidasemimetisk, i humane celler. Denne proces overvåges ved at observere ændringer i 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 spektre (som giver et fingeraftryk af proteinrygradskonformationen) forårsaget af forstyrrelser af proteinstrukturen induceret af disulfidbindingsdannelsen. Yderligere signaler som følge af disulfidoxideret SOD1 vises i 1H-15N-spektret og erstatter gradvist dem fra disulfidreduceret SOD1. MCR-ALS-analyse på udvalgte områder af 2D-spektret adskiller signalerne fra de to arter (figur 5a) og angiver deres relative koncentrationsprofiler (figur 5b). De opnåede koncentrationskurver kan analyseres yderligere ved ikke-lineær tilpasning for at give information om kinetikken i de undersøgte processer25.

Figure 1
Figur 1: Bioreaktorens skema. Til venstre: tværsnitsvisning af den tomme flowenhed. Til højre: skema for bioreaktoropsætningen. PEEK indløbsslangen er vist i grønt; PTFE-udløbsslangen er vist med blåt. Det venstre panel er gengivet med tilladelse fra Luchinat et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Trypan Blue Test på indkapslede celler og prøvekontrol ved 1H NMR. Repræsentative skiver af agarose indeholdende indlejrede celler og farvet med Trypan-blå (a) umiddelbart efter støbning og (b) efter 72 timer i bioreaktoren; c) cellelevedygtighed som funktion af tiden i NMR-bioreaktoren under aktivt flow (sort) og under statiske forhold (rød) målt ved Trypan Blue Test. d) zgesgp 1H NMR-spektre registreret på agaroseindlejrede celler, der overudtrykker CA II i fravær (sort) og i nærvær (rød) af gasbobler i bioreaktoren. I sidstnævnte tilfælde forårsager nedsat felthomogenitet linjeforlængelse og udseendet af opløsningsmiddelundertrykkelsesartefakter. Interessante spektrale træk er mærket. Paneler (a-c) gengives med tilladelse fra Luchinat et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative realtidsdata i celle 1H NMR opnået på agaroseindkapslede celler i bioreaktoren. Vandfaldsplotter af 1D 1H NMR-spektre (område mellem 15,6 og 11,1 ppm) af HEK293T-celler, der overudtrykker CA II og efterfølgende behandles med (a) 25 μM AAZ og (b) 10 μM MZA, registreret som funktion af tiden i NMR-bioreaktoren. Tidspunktet for ligandbehandling er vist med en pil. Spektralintensitet (a.u.) er farvekodet fra blå (laveste) til gul (højeste). Denne figur er gengivet med tilladelse fra Luchinat et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ MCR-ALS-udgang fra 1D NMR-spektre. (a) 1H NMR-spektre af de rene komponenter rekonstrueret af MCR-ALS: CA II i fravær af ligander (sort) og i komplekset med AAZ (rød) eller MZA (magenta); b) relative koncentrationsprofiler af fri (sort) og bundet CA II som funktion af tiden ved tilsætning af AAZ (rød) eller MZA (magenta) opnået ved MCR-ALS. Tidspunkter for ligandbehandling er markeret med pile. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Luchinat et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentativ MCR-ALS-udgang fra 2D NMR-spektre. (a) 1H-15N spektrale regioner (mærket I-IV) af de rene komponenter rekonstrueret af MCR-ALS: disulfidreduceret SOD1 (sort) og disulfidoxideret SOD1 (rød); b) den relative koncentrationsprofil for de rene bestanddele som funktion af tiden ved tilsætning af ebselen (markeret med en pil) opnået ved MCR-ALS. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Luchinat et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Formålet med at bruge en bioreaktor til NMR-forsøg i cellen er at holde cellerne i live og metabolisk aktive i en længere periode. Der skal tages hensyn til en række kritiske aspekter for at nå dette mål. For det første er det altafgørende at undgå bakteriel kontaminering ved fremstilling af celleprøven og under NMR-dataindsamlingen. Hvis stammer af E. coli eller andre bakterier, der almindeligvis anvendes til genkloning og rekombinant proteinekspression, anvendes i laboratoriet, kan de forurene cellerne under prøveforberedelsen. Når de først er i bioreaktoren, vil bakterierne vokse hurtigt ved at udnytte det friske vækstmedium og vil forårsage celledød på grund af produktionen af endotoksiner. Bakteriel forurening ses kun på et avanceret stadium, når det gør vækstmediet gult og uklart. Desuden kan ufuldstændig rengøring af bioreaktoren forårsage forurening af pumpen eller slangen med bakterier, gær eller almindelige forme.

Et krav for eksperimentets succes er undgåelsen af dannelse af gasbobler. Gasbobler fanget mellem agarosetrådene i NMR-spolens aktive volumen ville indføre store magnetfeltinhomogeniteter, hvilket forårsager ufuldstændig undertrykkelse af H2O-signalet og alvorligt tab af spektralkvalitet (figur 2d). Bobler kan være forårsaget af luft fanget i systemet eller af dannelsen af gasformig CO2. Førstnævnte kan let undgås ved at skylle systemet med medium, inden celleprøven indsættes, mens det for at undgå sidstnævnte anbefales at reducere koncentrationen af NaHCO3 i vækstmediet og holde alle dele af systemet ved en konstant temperatur for at minimere forskelle i CO2-opløseligheden . Cellulær aerob metabolisme kan også forårsage dannelse af gasformig CO2, som kan forhindres ved at øge strømningshastigheden.

Cellelevedygtighed bør kontrolleres efter hver kørsel af Trypan Blue Test. Det giver dog ikke indsigt i den metaboliske aktivitet. For at få et mere fuldstændigt billede af cellernes metaboliske tilstand under bioreaktoroperationen kan der udføres 31P NMR-spektre for at vurdere produktionen af ATP som funktion af tiden23,25. En dedikeret sonde er dog ofte nødvendig til denne måling, hvilket kan muliggøre samtidig optagelse med 1H NMR.

I tilfælde af CA II letter tilstedeværelsen af velopløste indberettersignaler i et usædvanligt område af 1H-spektret analysen fra simple 1D NMR-spektre og kræver ikke isotopberigelse under proteinekspression. Generelt kan andre proteiner give anledning til 1H-signaler, der er nyttige til overvågning af spektrale ændringer i andre regioner, såsom den, der er typisk for proteinhydrofob kerne mellem 0 og -1 ppm11; disse regioner har dog en tendens til at være overfyldte for foldede proteiner større end ~ 10 kDa. I dette tilfælde, som vist for SOD1, foretrækkes det at berige proteinet med 15N ved at tilvejebringe ensartet 15N-beriget vækstmedium under proteinekspression og at overvåge ændringer i realtid i 2D 1H-15N NMR-spektre. 2D-spektre importeres som 2D-arrays i MATLAB, omarrangeres til 1D-arrays og stables inden MCR-ALS-analyse. Sidstnævnte fremgangsmåde gælder generelt for ethvert intracellulært protein, der giver anledning til påviselige signaler og giver oplysninger om proteinkonformationsændringer på niveauet for en enkelt restkoncentration. I princippet kan sidstnævnte tilgang generaliseres til nD-spektre og til andre isotopmærkningsordninger.

Med hensyn til anvendelsen på forskellige typer celler bør protokollen let kunne tilpasses forskellige cellelinjer og kræver ikke, at proteinet af interesse udtrykkes direkte i cellerne. Derfor kan andre tilgange til NMR i cellen kombineres med denne protokol, hvor det makromolekyle, der er af interesse, fremstilles rekombinant eller syntetiseres og efterfølgende indsættes i cellerne ved elektroporation eller ved andre leveringsmetoder1,9,38. Når man arbejder med forskellige cellelinjer eller prøveforberedelsesprotokoller, kan det være nødvendigt at optimere parametre som agarosekoncentrationen, trådtykkelsen og den endelige celletæthed i agarosetrådene empirisk. Desuden er anvendeligheden af den protokol, der er beskrevet her, begrænset til celler, der tåler indkapsling af agarose. Andre celletyper kan kræve forskellige hydrogelformuleringer, mens en anden opsætning anbefales, når man analyserer celler, der oprindeligt vokser i suspension, for eksempel ved hjælp af en koaksial mikrodialysemembran for at sikre næringsdiffusion, samtidig med at suspenderede celler holdes begrænset i NMR-røret23.

Sammenlignet med andre NMR-bioreaktordesign19,20,21,22 er den her beskrevne enhed afhængig af en kommercielt tilgængelig flowenhed, der er tilpasset med mindre ændringer. Derfor kan enheden let replikeres i forskellige laboratorier med høj reproducerbarhed. Desuden tillader det standardiseret drift og fuld overholdelse af strenge laboratoriesikkerhedsbestemmelser, hvis det er nødvendigt. Samlet set bør bioreaktorens fleksibilitet og brugervenlighed muliggøre mange andre anvendelser af opløsning NMR, både i celler og in vitro, ud over dem, der allerede er rapporteret23,25. Til sidst kan det samme bioreaktordesign anvendes på prøver, der ligner mere af det fysiologiske miljø i et væv, såsom sfæroider eller organoider, forudsat at der findes passende stilladser til at holde sådanne prøver i live - eller endda opretholde deres vækst - i NMR-spektrometeret.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af iNEXT-Discovery, tilskudsnummer 871037, finansieret af Europa-Kommissionens Horisont 2020-program, af Instruct-ULTRA, tilskudsnummer 731005, et EU-Projekt under Horisont 2020 til videreudvikling af Instruct-ERIC's tjenester og af Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN-tilskud 20177XJCHX. Forfatterne anerkender støtten fra Instruct-ERIC, et Landmark ESFRI-projekt, gennem JRA Award nummer 815 og brugen af ressourcer fra CERM/CIRMMP Italy Centre. Vi takker Matteo Pennestri (Bruker, UK) for at yde støtte til InsightMR-flowenhedens drift.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
D2O Sigma-Aldrich 453366
DMEM, high glucose Life Technologies 10313-021
DMEM, high glucose, powder Sigma-Aldrich D5648
FBS Life Technologies 10270
HCl Sigma-Aldrich 30721
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030
Low-gelling agarose, powder Sigma-Aldrich A4018
NaHCO3, powder Carlo Erba 478537
PBS Life Technologies 10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
NaOH, pellets Sigma-Aldrich 30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) Sigma-Aldrich T8154 Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) Life Technologies 25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe Bruker n/a All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit Bruker n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC GE Healthcare n/a Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
  2. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).
  3. Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
  4. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
  5. Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
  6. Siegal, G., Selenko, P. Cells, drugs and NMR. Journal of Magnetic Resonance. 306, San Diego, Calif. 202-212 (1997).
  7. Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
  8. Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
  9. Theillet, F. -X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
  10. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
  11. Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
  12. Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
  13. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
  14. Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
  15. Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
  16. DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
  17. Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
  18. Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  19. Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).
  20. Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
  21. Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).
  22. Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).
  23. Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
  24. Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
  25. Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
  26. Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
  27. Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
  28. Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
  29. Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
  30. Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
  31. Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
  32. Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  33. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  34. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
  35. Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
  36. Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
  37. Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
  38. Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).

Tags

Kemi udgave 169 NMR i cellen realtid bioreaktor multivariatkurveopløsning ligandbinding carbonanhydrase II acetazolamid methazolamid proteinoxidation superoxiddismutase 1 ebselen
Overvågning af protein-ligandinteraktioner i humane celler ved hjælp af kvantitativ in-cell NMR i realtid ved hjælp af en bioreaktor med høj celletæthed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barbieri, L., Luchinat, E.… More

Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor. J. Vis. Exp. (169), e62323, doi:10.3791/62323 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter