Summary
Дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA) может быть использовано для идентификации малых лигандсвязывающих белков организма с помощью библиотеки ORFeome.
Abstract
За последнее десятилетие был достигнут огромный прогресс в понимании малых сигнальных молекул в бактериальной физиологии. В частности, целевые белки нескольких вторичных мессенджеров (NSM), полученных из нуклеотидов, были систематически идентифицированы и изучены в модельных организмах. Эти достижения в основном связаны с разработкой нескольких новых методов, включая метод захвата соединений и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA), которые использовались для систематической идентификации целевых белков этих малых молекул. В данной работе описывается использование NSM, гуанозин пента- и тетрафосфатов (p)ppGpp, в качестве примера и видеодемонстрации метода DRaCALA. Используя DRaCALA, 9 из 20 известных и 12 новых целевых белков (p)ppGpp были идентифицированы в модельном организме Escherichia coli K-12, демонстрируя силу этого анализа. В принципе, DRaCALA может быть использован для изучения небольших лигандов, которые могут быть помечены радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями. Здесь обсуждаются критические шаги, плюсы и минусы DRaCALA для дальнейшего применения этой техники.
Introduction
Бактерии используют несколько небольших сигнальных молекул для адаптации к постоянно меняющимся средам1,2. Например, аутоиндукруторы, N-ацилгомосериновые лактоны и их модифицированные олигопептиды, опосредовывают межклеточную связь между бактериями для координации поведения популяции, явление, известное как ощущение кворума2. Другой группой малых сигнальных молекул является NSM, включая широко изученный циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), циклический ди-АМФ, циклический ди-гуанозинмонофосфат (циклический ди-GMP) и гуанозин пента- и тетрафосфаты (p)ppGpp1. Бактерии производят эти NSM в ответ на множество различных стрессовых состояний. После производства эти молекулы связываются со своими белками-мишенями и регулируют несколько различных физиологических и метаболических путей, чтобы справиться с возникающими стрессами и повысить выживаемость бактерий. Поэтому идентификация белков-мишеней является неизбежной предпосылкой для расшифровки молекулярных функций этих малых молекул.
Последнее десятилетие стало свидетелем бума знаний об этих небольших сигнальных молекулах, в основном благодаря нескольким техническим инновациям, которые раскрыли целевые белки этих малых молекул. К ним относятся метод захвата соединения3,4,5и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA)6, которые будут обсуждаться в этой статье.
Изобретенный Винсентом Ли и его коллегами в 2011году 6,DRaCALA использует способность нитроцеллюлозной мембраны дифференциально секвестрировать свободные и связанные с белком лиганды. Молекулы, такие как белки, не могут диффундировать на нитроцеллюлозной мембране, в то время как небольшие лиганды, такие как NSM, способны. Смешивая NSM(например,ppGpp) с тестируемым белком и обличивая их на мембране, можно ожидать двух сценариев(рисунок 1):Если (p)ppGpp связывается с белком, радиомаркированный (p)ppGpp будет удерживаться в центре пятна белком и не будет диффундировать наружу, давая интенсивную маленькую точку(т.е., сильный радиоактивный сигнал) под фосфоритатором. Однако, если (p)ppGpp не связывается с белком, он будет свободно диффундировать наружу, производя большое пятно с однородным фоновым радиоактивным сигналом.
Кроме того, DRaCALA может обнаружить взаимодействие между небольшой молекулой и неочищенным белком в цельном клеточном лизате, если белок присутствует в достаточном количестве. Эта простота позволяет использовать DRaCALA для быстрой идентификации белковых мишеней с помощью библиотеки экспрессии ORFeome. Действительно, целевые белки цАМФ7,циклический ди-АМФ8,циклический ди-GMP9,10и (p)ppGpp11,12,13 были систематически идентифицированы с помощью DRaCALA. В этой видеостатье используется (p)ppGpp в качестве примера для демонстрации и описания критических шагов и соображений при успешном проведении скрининга DRaCALA. Следует отметить, что более подробное описание DRaCALA14 настоятельно рекомендуется прочитать в сочетании с этой статьей перед выполнением DRaCALA.
Рисунок 1:Принцип DRaCALA. (A) Схема анализа DRaCALA. Подробности см. в тексте. (B)Количественная оценка и расчет фракции связывания. Подробности см. в тексте. Вкратце, пятна DRaCALA будут проанализированы путем рисования двух кругов, которые ограничивают все пятно и внутреннюю темную точку(т. Е.Сохраненный (p)ppGpp из-за связывания тестируемого белка). Специфическим связывающим сигналом является радиоактивный сигнал внутреннего круга (S1) после вычитания неспецифического фонового сигнала (вычисляется по A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Фракция связывания представляет специфический сигнал связывания, деленный на общий радиоактивный сигнал (S2). Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление цельноклеточных лизатов
- Инокулируют E. coli K-12 ASKA ORFeome сборные штаммы15 в 1,5 мл лизогенезного бульона (LB), содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола, в 96-скважинных глубоких скважинных пластинах. Расти в течение ночи (O/N) в течение 18 ч при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин. На следующий день добавляют изопропил β-d-1-тиогалакопиранозид (IPTG) (конечные 0,5 мМ) в культуры O/N, чтобы индуцировать экспрессию белка при 30 °C в течение 6 ч.
- Грануляционные ячейки по 500 х г в течение 10 мин. Заморозьте гранулы при -80 °C до использования. Чтобы лизировать клетки, добавляют 150 мкл лизисного буфера L1 (40 мМ Tris pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2,дополненного 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 40 мкг/мл ДНКазы 1 и 0,5 мг/мл лизоцима) для повторного суспендирования гранулы.
- Заморозьте ячейки при -80 °C в течение 30 мин, а затем разморозьте при 37 °C в течение 20 мин. Повторите этот цикл три раза, чтобы лизеть клетки. Перед использованием храните лизаты при -80 °C.
2. Очистка Relseq и GppA
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки Relseq из Streptococcus equisimilis и GppA из E. coli K-12 используются для синтеза радиомаркированных pppGpp и ppGpp соответственно.
- Выращивайте и собирайте клетки, сверхэкспрессиивируя каждый белок.
- Вырастите штамм E. coli BL21 DE3 до экспоненциальной фазы (оптическая плотность (OD) ~ 0,3-0,4) в бульоне LB и открутите 1 мл культуры при 6000 х г в течение 5 мин. Декантирует супернатант и повторно суспендирует клетки 100 мкл ледяного бульона TSB (бульон LB, дополненный 0,1 г/мл PEG3350, 0,05 мл/мл диметилсульфоксида, 20 мМMgCl2).
- Смешайте плазмиды, несущие помеченные гистидином relseq и gppA,каждые по 100 нг, с вышеуказанными клеточными суспензиями в TSB, и инкубировать на льду в течение 30 мин. Тепловой удар по ячейкам при 42 °C в течение 40 с. Поместите смесь на лед на 2 мин и добавьте 1 мл бульона LB при комнатной температуре, чтобы ячейки могли восстановиться в течение 1 ч при 37 °C с перемешиванием при 160 об/мин.
- Пластинчатые восстановленные клетки на пластинах агара LB, дополненные соответствующими антибиотиками (Relseq:100 мкг / мл ампициллина; GppA: 30 мкг/мл канамицина). На следующий день прививайте колонии в бульоне LB, чтобы начать O/N прекультуры обоих штаммов при 37 °C.
- Через 18 ч прививать 500 мл LB-среды 10 мл O/N культур и соответствующими антибиотиками. Выращивайте культуры, встряхивая при 160 об/мин при 37 °C. Когда OD600 нм достигает 0,5-0,7, индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мМ IPTG и растут в течение 3 ч при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
- Соберите клетки, вращаясь при 6084 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в 20 мл ледяного холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и повторно центрифугировать при 1912 х г в течение 20 мин при 4 °C. Перед использованием наложить на него попувержитель и заморозить гранулы при -20 °C.
- Никель-нитрилотриацетиновая кислота (Ni-NTA) аффинная очистка
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента убедитесь, что образцы холодные.- Добавьте 40 мл ледяного лизисного буфера L2 (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, имидазола 10 мМ, 10 мМ β-меркаптоэтанола, дополненного ингибиторами протеазы (таблетка без ЭДТА; см. Таблицу материалов)для повторного суспендирования гранулы. Различают клетки с помощью ультразвука (амплитуда 60%, 2 с ON / 4 s OFF в течение 8 мин ON). Очистите лисат, вращая при 23 426 х г в течение 40 мин при 4 °C, и продолжайте с супернатантом для очистки.
- Во время вышеуказанной центрифугирования приготовьте смолу Ni-NTA.
- Переложите 500 мкл гомогенизированной Смолы Ni-NTA в стоячую полипропиленовую хроматографическую колонку и дайте ей осесть в течение 15 минут, а раствор для хранения просеет. Дважды промыть смолу 15 мл сверхчистой воды, а затем промыть столб 15 мл лизисного буфера L2.
- Загрузите очищенный супернатант клеточного лисата с шага 1 на столбец и дайте ему течь. Промыть колонну 30 мл промывочного буфера (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 20 мМ имидазол).
- Элюируют белки с помощью 400 мкл буфера элюдения (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 500 мМ имидазола) трижды. Затем повторите элюнение еще 300 мкл буфера элюции. Соедините элюированные белки до конечного объема 700 мкл.
- Гелевая фильтрация
- Готовят гель-фильтрационный буфер (50 мМ Tris, рН 7,5; 200 мМ NaCl; 5% глицерин). Промыть колонку исключения размеров одним объемом колонки (25 мл) гелевого фильтрующего буфера.
- Загрузите образец объемом 700 мкл с помощью петли объемом 500 мкл, выполните со скоростью 0,5 мл / мин и соберите 2-3 фракции, каждая объемом 0,5 мл, содержащую соответствующие белки.
- Объедините и сконцентрируйте фракции, содержащие каждый из белков, используя спиновую колонку, и измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
3. Синтез 32P-меченых pppGpp и ppGpp
- Соберите мелкомасштабную реакцию Relseq в трубку с винтовой крышкой (см. Таблицу 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с радиоактивными реагентами только в лицензированном месте и со средствами индивидуальной защиты.
| Объем (мкл) | ||
| Малый масштаб | Крупномасштабных | |
| Сверхчистая вода | ||
| 10x Relseq буфер* | 2 | 50 |
| ATP (финал 8 мМ) | ||
| Relseq (4 μM финал) | ||
| 32 32 P-α-гуанозинтрифосфат (GTP) (конечный 120 нМ) (ОСТОРОЖНО) | 0.2 | 5 |
| итог | 20 | 500 |
Таблица 1: Сбор информации для мелко- и крупномасштабных реакций синтеза 32P-меченых pppGpp. *10x Relseq буфер содержит 250 мМ Tris-HCl, pH 8,6; 1М НаКл; 80 мМ MgCl2. Аббревиатура: pppGpp = гуанозинпентафосфат.
- Инкубировать пробирку при 37 °С в термомиксе в течение 1 ч, затем при 95 °С в течение 5 мин, и поместить на лед на 5 мин. Раскрутите осажденный белок при 15 700 х г в течение 5 мин и перенесите супернатант (синтезированный 32P-pppGpp) в новую трубку с винтовой крышкой.
- Чтобы синтезировать 32P-ppGpp из 32P-pppGpp, перенесите половину продукта 32p-pppGpp в новую трубку с винтовой крышкой и добавьте 1 мкМ GppA. Инкубировать пробирку при 37 °C в течение 10 мин, при 95 °C в течение 5 мин, а затем поместить на лед на 5 мин.
- Раскрутите осажденный белок при 15 700 х г в течение 5 мин и перенесите супернатант (синтезированный 32P-ppGpp) в новую трубку с винтовой крышкой.
- Проанализируйте 32P-pppGpp и 32P-ppGpp, запустив 1 мкл образцов на тонкослойной хроматографической пластине (TLC) (полиэтиленимин-модифицированные целлюлозные TLC пластины) с использованием 1,5 M KH2PO4,pH 3,4 в качестве подвижной фазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйтеα-32P-меченый гуанозин 5'-трифосфат(32P-α-GTP) в качестве контроля. - Полностью высушите пластину TLC, поместите ее между прозрачной пластиковой папкой и подвергайте ее люминофорной ширме в течение 5 минут. Визуализируйте и количественно оцените сигналы с помощью фосфоритатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда соотношения 32P-pppGpp и 32P-ppGpp превышают 85%, крупномасштабная реакция (500 мкл, достаточная для скрининга 20 пластин 96 скважин) может быть собрана и синтезирована с использованием таблицы 1.
4. Скрининг DRaCALA белков-мишеней (p)ppGpp
- Оттаить и перенести 20 мкл лизатов целых клеток на 96-скважинную V-донную микротитерную пластину. Добавьте 2,5 ЕД/гольцо эндонуклеазы из Serratia marcescensи инкубируют при 37 °C в течение 15 мин для снижения вязкости лизата. Поместите лизаты на лед на 20 минут.
- Смешайте 32P-pppGpp и 32P-ppGpp в соотношении 1:1 и добавьте 1x лизисный буфер L1, чтобы конечная концентрация (p)ppGpp была равна 4 нМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая химическое сходство между pppGpp и ppGpp, сочетание обоих химических веществ упростит процесс скрининга. - Используйте многоканальную пипетку и фильтрованные наконечники пипеток, чтобы добавить и смешать 10 мкл смеси (p)ppGpp с клеточным лизатом. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Промыть инструмент 96 x pin, поместив в 0,01% раствор неионного моющего средства на 30 с, и высушить на папиросной бумаге в течение 30 с. Повторите промывку штифтового инструмента 3x.
- Поместите штифтовый инструмент в вышеуказанные 96-скважинные пробные пластины и подождите 30 с. Поднимите штифт инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану на 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пятно отсутствует, спотыкайте 2 мкл соответствующих образцов с помощью пипетки и отфильтрованных наконечников. Желательно сделать дублирование места того же образца, как указано ниже. - Высушите мембрану в течение 5 мин на RT. Поместите мембрану между прозрачной пластиковой папкой и подвергайте ее люминофорной ширме в течение 5 мин. Визуализация с помощью люминофорифровывателя.
5. Количественная оценка и идентификация потенциальных белков-мишеней
- Используйте программное обеспечение для анализа, связанное с фосфоригателем, чтобы открыть файл .gel визуализированных пластин. Используйте функцию анализа массива для определения 96 мест, настроив сетку из 12 столбцов x 8 строк.
- Определите большие круги, чтобы ограничить внешний край целых пятен (см. Рисунок 1B). Экспортируйте Объем+Фон и Область определенных больших кругов и сохраните в электронной таблице.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости переставьте каждый отдельный круг, чтобы он идеально перекрывался с пятнами, и изместите размер каждого отдельного круга, чтобы сделать его немного больше, чем фактическое пятно. - Размер определенных кругов, чтобы ограничить маленькие внутренние точки. Экспортируйте Объем+Фони Область определенных маленьких кругов и сохраните в электронной таблице.
- Рассчитайте связующие дроби в электронной таблице, используя уравнение на рисунке 1B,и постройте график данных. Определите потенциальные связывающие белки в скважинах, которые показывают высокие фракции связывания по сравнению с большинством других скважин.
Рисунок 2:Общий рабочий процесс процесса скрининга DRaCALA. Производство белка из коллекции Escherichia coli ASKA индуцируется, и клетки лизируются. Между тем, рекомбинантные белки Relseq-His и GppA-His очищаются и используются для синтеза 32P-меченых pppGpp и ppGpp из 32P-α-GTP. Затем радиоактивно меченые молекулы (p)ppGpp смешивают с лизатами, и 96-контактный инструмент используется для обнаружения смесей на нитроцеллюлозной мембране для последующего воздействия на экран хранения люминофора, визуализации и количественной оценки радиоактивных сигналов. Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура; IPTG = изопропил β-d-1-тиогалакопиранозид; ГТФ = гуанозин 5'-трифосфат; SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; TLC = тонкослойная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следование описанному выше протоколу обычно дает два типа результатов(рисунок 3).
На фиг.3А показана пластина с относительно низкими фоновыми сигналами связывания (фракции связывания < 0,025) из большинства скважин. Положительный сигнал связывания от скважины H3 дает фракцию связывания ~0,35, что намного выше, чем наблюдаемая для других скважин. Даже без количественной оценки, скважина H3 примечательна, предполагая, что целевой белок, экспрессируемый в скважине H3, связывается либо с pppGpp, ppGpp, либо с обоими. Действительно, белок, сверхэкспрессируемый в скважине H3, представляет собой гипоксантинфосфорибозилтрансферазу Hpt, которая, как известно, связывает (p)ppGpp12,16.
Рисунок 3:Репрезентативные экранировочные пластины DRaCALA (слева) и количественная оценка (справа). (A)Пятна DRaCALA пластины ASKA-50. Единственный положительный удар, Hpt, дал сильный сигнал связывания, выделяющийся как в пятне, так и на диаграмме количественного определения. (В,В) Два дублируют пятна DRaCALA перестроеной пластины 31. Черные разорванные круги и стрелки указывают на истинные целевые белки (p)ppGpp, в то время как красные разорванные круги указывают на ложные срабатывания. Подробности см. в тексте. Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура; IPTG = изопропил β-d-1-тиогалакопиранозид; ГТФ = гуанозин 5'-трифосфат; SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; TLC = тонкослойная хроматография; Hpt = гипоксантинфосфорибозилтрансфераза; PrfC = фактор высвобождения пептидной цепи RF3; NadR = NMN аденилтрансфераза; HflX = трансляционная GTPase. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Другой типичный результат скрининга показан на рисунке 3B, C. На этой пластине несколько скважин показали относительно более высокие сигналы фонового связывания, чем на рисунке 3А. Это хорошо видно из относительно сильных внутренних точек для многих скважин. Количественная оценка также показала, что многие скважины имеют фракции связывания в диапазоне 0,02-0,04. Более высокий фон связывающего сигнала, вероятно, вызван тем, что весь клеточный лизат является вязким, несмотря на лечение как ДНКазой I, так и эндонуклеазой из S. marcescens,которые разлагают высвобождаемую хромосомную ДНК. Для пластин, подобных этой, важно сравнить два реплицированных пятна пластины (шаг 4.5; Рисунок 3B,C). Количественная оценка обеих пластин показывает, что аутентичные положительные мишени (черные круги, скважины A10 PrfC, B11 NadR), как правило, дают стабильно высокие фракции связывания.
Примечательно, что некоторые истинные цели могут также давать переменные фракции связывания (Well D5, HflX12),такие как ложные срабатывания (красные круги). Причина такой изменчивости кроется в том, что не все белки в библиотеке экспрессируются в растворимой форме и в необходимых количествах. Если концентрация белка близка или чуть ниже значения Kd, можно ожидать переменных результатов связывания даже для истинных целей. Действительно, большое количество растворимого белка HflX не было получено из штамма ASKA12. Чтобы определить, являются ли эти белки истинными связующими или нет, потенциальные белки должны быть очищены до однородности, а связывание подтверждено с использованием более высокой концентрации (50-100 мкМ) белков.
С помощью этого скрининга были идентифицированы 9 из 20 известных целевых белков (p)ppGpp12 (см. раздел обсуждения), что подтверждает полезность DRaCALA для этой задачи. Кроме того, было обнаружено и подтверждено 12 новых мишеней (p)ppGpp, демонстрирующих, что DRaCALA является мощным методом для обнаружения новых целевых белков (p)ppGpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важнейших шагов в выполнении скрининга DRaCALA является получение хороших целоклеточных лизатов. Во-первых, испытуемые белки должны вырабатываться в больших количествах и в растворимых формах. Во-вторых, лизис клеток должен быть полным, а вязкость лизата должна быть минимальной. Включения лизоцима и использования трех циклов замораживания-оттаивания часто бывает достаточно, чтобы полностью лизировать клетки. Однако высвобождаемая хромосомная ДНК делает лизат вязким и генерирует высокий фоновый сигнал связывания, что приводит к ложным срабатываниям, как показано на рисунке 3B,C. Чтобы смягчить это, можно использовать ДНКазу 1 и / или эндонуклеазу из S. marcescens, и образцы могут быть инкубированы в течение более длительного времени для деградации ДНК.
Как отрицательный (пустой плазмидный вектор), так и положительный (известный целевой белок) контроль должны использоваться для оптимизации условий получения лизата цельной клеткой и анализа связывания DRaCALA перед выполнением крупномасштабного скрининга. Когда такое оптимальное состояние найдено, становится ненужным включать элементы управления в фактический экран каждой пластины. Это связано с тем, что процедура скрининга очень короткая и потому, что большинство белков в пластине, как ожидается, не будут связываться с (p)ppGpp. Поэтому эти белки служат отрицательным контролем при количественной оценке связывающих фракций(рисунок 3).
Производство более чистых pppGpp и ppGpp с маркировкой 32P также имеет важное значение для скрининга DRaCALA. Например, коэффициент преобразования из GTP в pppGpp может варьироваться. Таким образом, важно оптимизировать рН, концентрации магния и используемых ферментов, а также время реакции. Поэтому мелкомасштабные реакции важны для определения наилучшего состояния перед созданием крупномасштабной реакции.
DRaCALA явно имеет некоторые преимущества и недостатки (см. Roelofs et al.9 для более подробного обсуждения) по сравнению с другими методами, такими как метод захвата соединения. Во-первых, DRaCALA использует 32P-меченые (p)ppGpp, которые не влияют на химическую структуру (p)ppGpp, тем самым сохраняя его взаимодействие с потенциальными белками-мишенями. Во-вторых, после того, как 32p-(p)ppGpp и клеточные лизаты приготовлены, требуется всего неделя, чтобы отсеять ~ 60 пластин библиотеки E. coli ORFeome с использованием DRaCALA. Действительно, короткая экспериментальная процедура (раздел 4) позволила идентифицировать даже белки, которые разлагают (p)ppGpp (MutT, NudG)12,17,которые метод захвата соединения пропустил18.
Однако для использования DRaCALA требуется библиотека выражений ORFeome, которая доступна только для ограниченного числа модельных организмов. Кроме того, метки аффинной очистки, которые предназначены для облегчения очистки белка в библиотеке ORFeome, иногда влияют на экспрессию или правильное сворачивание белков, производя некоторые ложноотрицательные результаты. Новая библиотека ORFeome в идеале потребует определения того, экспрессируется ли большинство (>80%) белков в растворимой форме и в достаточных количествах. Такой тест также позволяет исследователям оценить охват и эффективность результатов скрининга DRaCALA.
Несмотря на эти ограничения, DRaCALA является мощным методом для успешного обнаружения новых целевых белков нескольких нуклеотидных вторичных мессенджеров. В принципе, DRaCALA может быть использован для изучения любого небольшого лиганда, если его можно будет маркировать с помощью радиоактивных изотопов или даже флуоресцентных красителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Работа поддерживается грантом проекта NNF (NNF19OC0058331) для YEZ и исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри (Nº 801199) для MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
