Summary
De differentiële radiale capillaire werking van Ligand Assay (DRaCALA) kan worden gebruikt om kleine ligandbindende eiwitten van een organisme te identificeren met behulp van een ORFeome-bibliotheek.
Abstract
Het afgelopen decennium heeft enorme vooruitgang geboekt in het begrijpen van kleine signaalmoleculen in de bacteriële fysiologie. Met name de doeleiwitten van verschillende nucleotide-afgeleide secundaire boodschappers (NSM's) zijn systematisch geïdentificeerd en bestudeerd in modelorganismen. Deze prestaties zijn voornamelijk te danken aan de ontwikkeling van verschillende nieuwe technieken, waaronder de capture compound-techniek en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA), die werden gebruikt om systematisch doeleiwitten van deze kleine moleculen te identificeren. Dit artikel beschrijft het gebruik van de NSM's, guanosine penta- en tetrafosfaten (p)ppGpp, als voorbeeld en videodemonstratie van de DRaCALA-techniek. Met behulp van DRaCALA werden 9 van de 20 bekende en 12 nieuwe doeleiwitten van (p)ppGpp geïdentificeerd in het modelorganisme Escherichia coli K-12, wat de kracht van deze test aantoont. In principe kan DRaCALA worden gebruikt voor het bestuderen van kleine liganden die kunnen worden geëtiketteerd door radioactieve isotopen of fluorescerende kleurstoffen. De kritische stappen, voor- en nadelen van DRaCALA worden hier besproken voor verdere toepassing van deze techniek.
Introduction
Bacteriën gebruiken verschillende kleine signaalmoleculen om zich aan te passen aan constant veranderende omgevingen1,2. Bijvoorbeeld, de auto-inducers, N-acylhomoserine lactones en hun gemodificeerde oligopeptiden, bemiddelen de intercellulaire communicatie tussen bacteriën om populatiegedrag te coördineren, een fenomeen dat bekend staat als quorum sensing2. Een andere groep kleine signaalmoleculen zijn de NSM's, waaronder het veel bestudeerde cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP), cyclisch di-AMP, cyclisch di-guanosinemonofosfaat (cyclisch di-GMP) en guanosine penta- en tetrafosfaat (p)ppGpp1. Bacteriën produceren deze NSM's als reactie op verschillende stressomstandigheden. Eenmaal geproduceerd, binden deze moleculen zich aan hun doeleiwitten en reguleren ze verschillende fysiologische en metabolische routes om de ondervonden stress aan te kunnen en de bacteriële overleving te verbeteren. Daarom is identificatie van de doeleiwitten een onvermijdelijke voorwaarde voor het ontcijferen van de moleculaire functies van deze kleine moleculen.
Het afgelopen decennium is getuige geweest van een hausse aan kennis van deze kleine signaalmoleculen, voornamelijk als gevolg van verschillende technische innovaties die de doeleiwitten van deze kleine moleculen onthulden. Deze omvatten de afvangverbindingstechniek3,4,5, en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)6 die in dit artikel moet worden besproken.
Uitgevonden door Vincent Lee en collega's in 20116, DRaCALA zet het vermogen van een nitrocellulosemembraan in om differentieel vrije en eiwitgebonden liganden vast te zetten. Moleculen zoals eiwitten kunnen zich niet verspreiden op een nitrocellulosemembraan, terwijl kleine liganden, zoals de NSM's, dat wel kunnen. Door het NSM (bijv.ppGpp ) te mengen met het te testen eiwit en deze op het membraan te spotten, kunnen twee scenario's worden verwacht(figuur 1):Als (p)ppGpp zich aan het eiwit bindt, wordt het radiolabel (p)ppGpp in het midden van de vlek door het eiwit behouden en zal het niet naar buiten diffuus zijn, wat een intens klein puntje geeft (d.w.z. sterk radioactief signaal) onder een fosforimager. Als (p)ppGpp zich echter niet aan het eiwit bindt, zal het vrij naar buiten diffuus zijn om een grote vlek met een uniform radioactief achtergrondsignaal te produceren.
Bovendien kan DRaCALA de interactie tussen een klein molecuul en een ongezuiverd eiwit in een hele cellysaat detecteren als het eiwit in voldoende hoeveelheid aanwezig is. Deze eenvoud maakt het gebruik van DRaCALA mogelijk bij het snel identificeren van eiwitdoelen met behulp van een ORFeome-expressiebibliotheek. Doeleiwitten van cAMP7, cyclische di-AMP8, cyclische di-GMP9,10en (p)ppGpp 11,12,13 zijn systematisch geïdentificeerd met behulp van DRaCALA. Dit videoartikel gebruikt (p)ppGpp als voorbeeld om de kritische stappen en overwegingen bij het uitvoeren van een succesvolle DRaCALA-screening te demonstreren en te beschrijven. Een meer grondige beschrijving van DRaCALA14 wordt ten zeerste aanbevolen om te lezen in combinatie met dit artikel voordat U DRaCALA uitvoert.
Figuur 1: Het principe van DRaCALA. (A) Schematisch van de DRaCALA-test. Zie de tekst voor meer informatie. B) Kwantificering en berekening van de bindende fractie. Zie de tekst voor meer informatie. Kortom, de DRaCALA-vlekken worden geanalyseerd door twee cirkels te tekenen die de hele vlek en de binnenste donkere stip omringen(d.w.z.de behouden (p)ppGpp vanwege de binding van het geteste eiwit). Het specifieke bindingssignaal is het radioactieve signaal van de binnenste cirkel (S1) na aftrek van het niet-specifieke achtergrondsignaal (berekend door A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). De bindingsfractie is het specifieke bindingssignaal gedeeld door het totale radioactieve signaal (S2). Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van hele cellysaten
- Ent de E. coli K-12 ASKA ORFeome collectie stammen15 in 1,5 ml Lysogeney bouillon (LB) met 25 μg/ml chlooramfenicol in 96-put diepe putplaten. Laat 's nachts (O/N) groeien gedurende 18 uur bij 30 °C met schudden bij 160 tpm. Voeg de volgende dag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (laatste 0,5 mM) toe aan de O/N-culturen om gedurende 6 uur eiwitexpressie bij 30 °C te induceren.
- Pelletcellen bij 500 x g gedurende 10 min. Vries de pellets in bij -80 °C tot gebruik. Om de cellen te lyseren, voegt u 150 μL lysisbuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, aangevuld met 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 40 μg/ml DNase 1 en 0,5 mg/ml lysozym) toe.
- Vries de cellen gedurende 30 minuten in bij -80 °C en ontdooi vervolgens bij 37 °C gedurende 20 minuten. Herhaal deze cyclus drie keer om de cellen te lyseren. Bewaar de lysaten voor gebruik bij -80 °C.
2. Zuivering van Relseq en GppA
OPMERKING: De recombinante eiwitten Relseq van Streptococcus equisimilis en GppA van E. coli K-12 worden gebruikt om respectievelijk het radiolabel pppGpp en ppGpp te synthetiseren.
- Groei en verzamel cellen die elk eiwit overexpresseren.
- Kweek de E. coli BL21 DE3 stam tot exponentiële fase (optische dichtheid (OD) ~0,3-0,4) in LB bouillon, en draai 1 ml cultuur naar beneden bij 6000 x g gedurende 5 min. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen met 100 μL ijskoude TSB-bouillon (LB-bouillon aangevuld met 0,1 g/ml PEG3350, 0,05 ml/ml dimethylsulfoxide, 20 mM MgCl2).
- Meng de plasmiden met de histidine-gelabelde relseq en gppA, elk 100 ng, met de bovenstaande celsuspensingen in TSB en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Schok de cellen bij 42 °C gedurende 40 s. Leg het mengsel gedurende 2 minuten op ijs en voeg 1 ml LB bouillon toe bij kamertemperatuur, zodat de cellen zich gedurende 1 uur bij 37 °C kunnen herstellen met agitatie bij 160 tpm.
- Plaat de teruggewonnen cellen op LB-agarplaten aangevuld met de bijbehorende antibiotica (Relseq: 100 μg/ml ampicilline; GppA: 30 μg/ml kanamycine). Inenteer de volgende dag de kolonies in LB bouillon om O/N preculturen van beide stammen bij 37 °C te starten.
- Na 18 uur 500 ml LB-medium enten met 10 ml O/N-culturen en de bijbehorende antibiotica. Kweek de culturen door te schudden bij 160 tpm bij 37 °C. Wanneer de OD600nm 0,5-0,7 bereikt, induceer dan eiwitexpressie door 0,5 mM IPTG toe te voegen en 3 uur te groeien bij 30 °C met schudden bij 160 tpm.
- Verzamel de cellen door 10 minuten bij 4 °C op 6084 x g te draaien. Resuspendeer de pellet in 20 ml ijskoude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer opnieuw bij 1912 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant en vries de pellets voor gebruik in bij -20 °C.
- Nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affiniteit zuivering
OPMERKING: Controleer vanaf dit punt of de monsters koud zijn.- Voeg 40 ml ijskoude lysisbuffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoethanol aangevuld met proteaseremmers (EDTA-vrije tablet; zie de materialentabel)toe om de pellet opnieuw te gebruiken. Lyse de cellen via sonicatie (60% amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF gedurende 8 min ON). Ontruim het lysaat door 40 minuten bij 4 °C op 23.426 x g te draaien en ga verder met het supernatant voor de zuivering.
- Bereid tijdens de bovenstaande centrifugeren de Ni-NTA-hars voor.
- Breng 500 μL gehomogeniseerde Ni-NTA-hars over in een staande polypropyleenchromatografiekolom en laat het 15 minuten bezinken en de opslagoplossing wordt afgevoerd. Was de hars tweemaal met 15 ml ultrapure water en was vervolgens de kolom met 15 ml van de lysisbuffer L2.
- Laad de gewiste supernatant van cellysaat vanaf stap 1 op de kolom en laat deze doorstromen. Was de kolom met 30 ml wasbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol).
- Elute de eiwitten met 400 μL van de elutiebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) driemaal. Herhaal vervolgens elutie met nog eens 300 μL van de elutiebuffer. Combineer de geëuteerde eiwitten tot een eindvolume van 700 μL.
- Gelfiltratie
- Bereid gelfiltratiebuffer voor (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glycerol). Was de kolom met uitsluiting van de grootte met één kolomvolume (25 ml) van de gelfiltratiebuffer.
- Laad het bovenstaande monster van 700 μL met behulp van een lus van 500 μL, loop op 0,5 ml/min en verzamel 2-3 fracties, elk met een volume van 0,5 ml, die de respectieve eiwitten bevatten.
- Combineer en concentreer de fracties die elk van de eiwitten bevatten met behulp van een spinkolom en meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.
3. Synthese van 32P-gelabelde pppGpp en ppGpp
- Monteer een kleinschalige Relseq-reactie in een schroefdopbuis (zie tabel 1).
OPMERKING: Werk alleen met radioactieve reagentia op een gelicentieerde plaats en met persoonlijke beschermingsmiddelen.
| Volume (μL) | ||
| Kleinschaligheid | Grootschalige | |
| Ultrapure water | ||
| 10x Relseq buffer* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM finale) | ||
| Relseq (4 μM finale) | ||
| 32 P-α-Guanosinetrifosfaat (GTP) (laatste 120 nM) (LET OP) | 0.2 | 5 |
| totaal | 20 | 500 |
Tabel 1: Samenstellen van informatie voor de kleinschalige en grootschalige synthesereacties van 32P-gelabeld pppGpp. *10x Relseq buffer bevat 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Afkorting: pppGpp = guanosine pentafosfaat.
- Incubeer de buis op 37 °C in een thermomixer gedurende 1 uur, vervolgens bij 95 °C gedurende 5 minuten en leg deze gedurende 5 minuten op ijs. Draai het neergeslagen eiwit gedurende 5 minuten op 15.700 x g en breng het supernatant (gesynthetiseerd 32P-pppGpp) over naar een nieuwe schroefdopbuis.
- Om 32P-ppGpp van 32P-pppGpp te synthetiseren, breng je de helft van het 32p-pppGpp-product over naar een nieuwe schroefdopbuis en voeg je 1 μM GppA toe. Incubeer de buis gedurende 10 minuten op 37 °C, gedurende 5 minuten op 95 °C en leg deze vervolgens 5 minuten op ijs.
- Draai het neergeslagen eiwit gedurende 5 minuten op 15.700 x g en breng het supernatant (gesynthetiseerd 32P-ppGpp) over naar een nieuwe schroefdopbuis.
- Analyseer de 32P-pppGpp en 32P-ppGpp door 1 μL van de monsters uit te voeren op een dunnelaagchromatografie (TLC) plaat (polyethyleenimine gemodificeerde cellulose TLC platen) met behulp van de 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, als mobiele fase.
OPMERKING: Gebruik de α-32P-gelabeld guanosine 5'-trifosfaat(32P-α-GTP) als controle. - Droog de TLC-plaat volledig, plaats deze tussen een transparante plastic map en stel deze gedurende 5 minuten bloot aan een fosforscherm. Visualiseer en kwantificeer de signalen met behulp van een fosforbeeld.
OPMERKING: Wanneer de verhoudingen van 32P-pppGpp en 32P-ppGpp hoger zijn dan 85%, kan een grootschalige reactie (500 μL, voldoende voor het screenen van 20 96-putplaten) worden geassembleerd en gesynthetiseerd met behulp van tabel 1.
4. DRaCALA screening van de doeleiwitten van (p)ppGpp
- Ontdooi en breng 20 μL hele cellysaten over naar een 96-put V-bodem microtiterplaat. Voeg 2,5 U/put endonuclease van Serratia marcescenstoe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om de viscositeit van lysaat te verminderen. Leg de lysaten 20 minuten op ijs.
- Meng de 32P-pppGpp en 32P-ppGpp in een 1:1 verhouding en voeg 1x lysis buffer L1 toe om de uiteindelijke concentratie van (p)ppGpp gelijk te maken aan 4 nM.
OPMERKING: Gezien de chemische gelijkenis tussen pppGpp en ppGpp, zal een mix van beide chemicaliën het screeningsproces vereenvoudigen. - Gebruik een meerkanaals pipet en gefilterde pipettips om 10 μL van het (p)ppGpp-mengsel toe te voegen en te mengen met het cellysaat. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Was het gereedschap van 96 x pin door 30 s in 0,01% oplossing van niet-ionisch reinigingsmiddel te plaatsen en droog gedurende 30 s op een tissuepapier. Herhaal het wassen van het speldgereedschap 3x.
- Plaats het pengereedschap in de bovenstaande monsterplaten met 96 put en wacht 30 s. Til het pengereedschap recht omhoog en plaats het gedurende 30 s recht naar beneden op een nitrocellulosemembraan.
OPMERKING: Als er een vlek ontbreekt, moet u 2 μL van de overeenkomstige monsters met een pipet en gefilterde uiteinden plaatsen. Het is raadzaam om een dubbele vlek van hetzelfde monster te maken zoals hieronder aangegeven. - Droog het membraan 5 minuten bij RT. Plaats het membraan tussen een transparante plastic map en stel het gedurende 5 minuten bloot aan een fosforscherm. Visualiseer met behulp van een fosforvisser.
5. Kwantificering en identificatie van potentiële doeleiwitten
- Gebruik de analysesoftware die is gekoppeld aan de fosforvisualisatie om het .gel-bestand van de gevisualiseerde platen te openen. Gebruik de functie Array-analyse om de 96 spots te definiëren door een raster van 12 kolommen x 8 rijen in te stellen.
- Definieer grote cirkels om de buitenrand van de hele vlekken te omgrenzen (zie figuur 1B). Exporteer de Volumn+Background en Area van de gedefinieerde grote cirkels en sla op in een spreadsheet.
OPMERKING: Verplaats indien nodig elke afzonderlijke cirkel om perfect te overlappen met de vlekken en pas het formaat van elke afzonderlijke cirkel aan om deze iets groter te maken dan de werkelijke plek. - Verklein de gedefinieerde cirkels om de kleine binnenste stippen te omringen. Exporteer de Volumn+Backgrounden het gebied van de gedefinieerde kleine cirkels en sla op in een spreadsheet.
- Bereken de bindingsfracties in het werkblad met behulp van de vergelijking in figuur 1Ben plot de gegevens. Identificeer de potentiële bindende eiwitten in de putten die hoge bindingsfracties vertonen in vergelijking met de meeste andere putten.
Figuur 2: Algemene workflow van het DRaCALA-screeningsproces. Eiwitproductie uit een Escherichia coli ASKA-collectie wordt geïnduceerd en de cellen worden gelyseerd. Ondertussen worden de recombinante eiwitten Relseq-His en GppA-His gezuiverd en gebruikt om 32P-gelabelde pppGpp en ppGpp van 32P-α-GTP te synthetiseren. De radioactief gelabelde (p)ppGpp-moleculen worden vervolgens gemengd met de lysaten en een 96-pins tool wordt gebruikt om de mengsels op een nitrocellulosemembraan te herkennen voor latere blootstelling aan een fosforopslagscherm, beeldvorming en kwantificering van de radioactieve signalen. Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosine 5'-trifosfaat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese ; TLC = dunne laagchromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het volgen van het hierboven beschreven protocol levert doorgaans twee soorten resultaten op (figuur 3).
Figuur 3A toont een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen (bindingsfracties < 0,025) uit de meeste putten. Het positieve bindingssignaal van de put H3 geeft een bindende fractie van ~0,35 die veel hoger is dan die waargenomen voor de andere putten. Zelfs zonder kwantificering is goed H3 opmerkelijk, wat suggereert dat een doeleiwit uitgedrukt in goed H3 zich bindt aan pppGpp, ppGpp of beide. Inderdaad, het eiwit overexpressed in put H3 is de hypoxanthine fosforibosyltransferase Hpt, waarvan bekend is dat het bindt (p)ppGpp12,16.
Figuur 3: Representatieve DRaCALA zeefplaten (links) en kwantificering (rechts). (A) DRaCALA vlekken van de ASKA Plaat-50. De enige positieve treffer, Hpt, gaf een sterk bindingssignaal dat opviel in zowel de plek als het kwantificeringsdiagram. (B,C) Twee repliceren DRaCALA vlekken van de herschikte plaat 31. Zwarte gebroken cirkels en pijlen geven de echte doeleiwitten van (p)ppGpp aan, terwijl de rode gebroken cirkels de valse positieven aangeven. Zie de tekst voor meer informatie. Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosine 5'-trifosfaat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese ; TLC = dunne laagchromatografie; Hpt = hypoxanthinefosforibosyltransferase; PrfC = peptideketen release factor RF3; NadR = NMN adenylyltransferase; HflX = translationele GTPase. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Het andere typische resultaat van de screening is weergegeven in figuur 3B, C. In deze plaat vertoonden verschillende putten relatief hogere achtergrondbindingssignalen dan die in figuur 3A. Dit is duidelijk zichtbaar aan de relatief sterke binnenpunten voor veel putten. Kwantificering toonde ook aan dat veel putten bindende breuken hebben in het bereik van 0,02-0,04. Een hogere achtergrond van het bindingssignaal wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat het hele cellysaat stroperig is, ondanks de behandelingen met zowel DNase I als het endonuclease van S. marcescens, die het vrijgegeven chromosomale DNA afbreken. Voor platen zoals deze is het belangrijk om de twee repliceervlekken van de plaat te vergelijken (stap 4.5; Figuur 3B,C). Kwantificering van beide platen toont aan dat de authentieke positieve doelen (zwarte cirkels, putten A10 PrfC, B11 NadR) de neiging hebben om consistent hoge bindingsfracties te geven.
Sommige echte doelen kunnen met name ook variabele bindingsfracties (Well D5, HflX12) geven, zoals de false positives (rode cirkels). De reden voor deze variabiliteit ligt in het feit dat niet alle eiwitten in een bibliotheek worden uitgedrukt in oplosbare vorm en in vereiste hoeveelheden. Als de concentratie van een eiwit dicht bij of net onder de Kd-waarde ligt, kunnen variabele bindingsresultaten worden verwacht, zelfs voor de werkelijke doelen. Uit de ASKA-stam12werden namelijk geen grote hoeveelheden oplosbaar HflX-eiwit verkregen. Om te bepalen of deze eiwitten al dan niet echte bindmiddelen zijn, moeten de potentiële eiwitten worden gezuiverd tot homogeniteit en moet de binding worden bevestigd door een hogere concentratie (50-100 μM) van de eiwitten te gebruiken.
Via deze screening werden 9 van de 20 bekende doeleiwitten van (p)ppGpp12 geïdentificeerd (zie de discussiesectie), wat het nut van DRaCALA voor deze taak valideert. Daarnaast werden 12 nieuwe doelen van (p)ppGpp ontdekt en bevestigd, wat aantoont dat DRaCALA een krachtige techniek is om nieuwe doeleiwitten van (p)ppGpp te ontdekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de cruciale stappen bij het uitvoeren van DRaCALA-screening is het verkrijgen van goede hele cellysaten. Ten eerste moeten de geteste eiwitten in grote hoeveelheden en in oplosbare vormen worden geproduceerd. Ten tweede moet de lysis van cellen volledig zijn en moet de viscositeit van het lysaat minimaal zijn. De opname van lysozym en het gebruik van drie cycli van vries-dooi zijn vaak genoeg om cellen volledig te lyseren. Het vrijgegeven chromosomale DNA maakt het lysaat echter stroperig en genereert een hoog achtergrondbindingssignaal, wat resulteert in valse positieven zoals weergegeven in figuur 3B, C. Om dit te beperken, kan DNase 1 en/of endonuclease van S. marcescens worden gebruikt en kunnen de monsters langer worden geïncubeerd om het DNA af te voeren.
Zowel negatieve (lege plasmidevector) als positieve (bekende doeleiwit) controles moeten worden gebruikt om de omstandigheden voor het bereiden van hele cellenlysaat te optimaliseren en de DRaCALA-bindingstest voordat een grootschalige screening wordt uitgevoerd. Wanneer een dergelijke optimale conditie wordt gevonden, wordt het niet nodig om de bedieningselementen op te nemen in de daadwerkelijke screening van elke plaat. Dit komt omdat de screeningsprocedure erg kort is en omdat de meerderheid van de eiwitten in een plaat naar verwachting niet bindt aan (p)ppGpp. Daarom dienen deze eiwitten als negatieve controles bij het kwantificeren van de bindingsfracties (figuur 3).
De productie van zuiverdere 32P-gelabelde pppGpp en ppGpp is ook essentieel voor DRaCALA-screening. De conversieratio van GTP naar pppGpp kan bijvoorbeeld variëren. Het is dus belangrijk om de pH, de concentraties magnesium en enzymen die worden gebruikt en de reactietijd te optimaliseren. Kleinschalige reacties zijn daarom belangrijk om de beste conditie te bepalen voordat een grootschalige reactie wordt ingesteld.
DRaCALA heeft duidelijk enkele voor- en nadelen (zie Roelofs et al.9 voor meer discussie) in vergelijking met andere technieken zoals de capture compound techniek. Ten eerste gebruikt DRaCALA de 32P-gelabelde (p)ppGpp, die geen invloed heeft op de chemische structuur van (p)ppGpp, waardoor de interactie met potentiële doeleiwitten behouden blijft. Ten tweede, zodra de 32p-(p)ppGpp en cellysaten zijn bereid, duurt het slechts een week om ~ 60 platen van de E. coli ORFeome-bibliotheek te screenen met behulp van DRaCALA. De korte experimentele procedure (deel 4) maakte het inderdaad mogelijk om zelfs de eiwitten te identificeren die de (p)ppGpp (MutT, NudG)12,17afbreken , die de vangverbindingstechniek miste18.
Het gebruik van DRaCALA vereist echter een ORFeome-expressiebibliotheek, die alleen beschikbaar is voor een beperkt aantal modelorganismen. Bovendien beïnvloeden de affiniteitszuiveringstags, die zijn ontworpen om eiwitzuivering in de ORFeome-bibliotheek te vergemakkelijken, soms de expressie of het correct vouwen van de eiwitten, waardoor enkele valse negatieven worden produceren. Een nieuwe ORFeome-bibliotheek vereist idealiter de bepaling of de meerderheid (>80%) van de eiwitten in oplosbare vorm en in voldoende hoeveelheden wordt uitgedrukt. Een dergelijke test stelt de onderzoekers ook in staat om de dekking en effectiviteit van de DRaCALA-screeningsresultaten te evalueren.
Ondanks deze beperkingen is DRaCALA een krachtige techniek om met succes nieuwe doeleiwitten van verschillende nucleotide secundaire boodschappers te ontdekken. In principe zou DRaCALA kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van kleine ligand als het kan worden geëtiketteerd met behulp van radioactieve isotopen of zelfs fluorescerende kleurstoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.
Acknowledgments
Het werk wordt ondersteund door een NNF-projectsubsidie (NNF19OC0058331) aan YEZ en het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst (Nº 801199) aan MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
