Summary
Ligand Assays (DRaCALA) differentialradiella kapillärverkan (DRaCALA) kan användas för att identifiera små ligandbindande proteiner från en organism med hjälp av ett ORFeome-bibliotek.
Abstract
Under det senaste decenniet har man sett enorma framsteg i förståelsen av små signalmolekyler i bakteriefysiologi. I synnerhet har målproteinerna hos flera nukleotidbaserade sekundära budbärare (NSMs) systematiskt identifierats och studerats i modellorganismer. Dessa prestationer beror främst på utvecklingen av flera nya tekniker inklusive fångst compound teknik och differential radiell kapillär verkan av ligand assay (DRaCALA), som användes för att systematiskt identifiera målproteiner av dessa små molekyler. Detta dokument beskriver användningen av NSMs, guanosin penta- och tetrafosfater (p)ppGpp, som ett exempel och video demonstration av DRaCALA tekniken. Med hjälp av DRaCALA identifierades 9 av 20 kända och 12 nya målproteiner av (p)ppGpp i modellorganismen, Escherichia coli K-12, vilket visar kraften i denna analys. I princip kan DRaCALA användas för att studera små ligands som kan märkas med radioaktiva isotoper eller fluorescerande färgämnen. De kritiska stegen, fördelarna och nackdelarna med DRaCALA diskuteras här för vidare tillämpning av denna teknik.
Introduction
Bakterier använder flera små signalmolekyler för att anpassa sig till ständigt föränderligamiljöer 1,2. Till exempel förmedlar autoinducerarna, N-aylhomoserine lactones och deras modifierade oligopeptider, den intercellulära kommunikationen mellan bakterier för att samordna befolkningsbeteendet, ett fenomen som kallas kvorumavkänning2. En annan grupp små signalmolekyler är NSMs, inklusive det allmänt studerade cykliska adenosinmonofoforfat (cAMP), cykliska di-AMP, cykliska di-guanosinmonofosfat (cyklisk di-GMP) och guanosinpenta- och tetrafosfater (p)ppGpp1. Bakterier producerar dessa NSMs som ett svar på en mängd olika stressförhållanden. När dessa molekyler har producerats binder de till sina målproteiner och reglerar flera olika fysiologiska och metaboliska vägar för att hantera de påträffade påfrestningarna och förbättra bakteriell överlevnad. Därför är identifiering av målproteinerna en oundviklig förutsättning för dechiffrering av de molekylära funktionerna hos dessa små molekyler.
Det senaste decenniet har bevittnat en boom av kunskap om dessa små signalmolekyler, främst på grund av flera tekniska innovationer som avslöjade målproteinerna i dessa små molekyler. Dessa inkluderar fångst sammansatt teknik3,4,5, och differential radiell kapillär åtgärd av ligand assay (DRaCALA)6 som ska diskuteras i detta dokument.
DRaCALA uppfanns av Vincent Lee och medarbetare 20116och använder förmågan hos ett nitrocellulosamembran att differentiellt binda fria och proteinbundna ligander. Molekyler som proteiner kan inte spridas på ett nitrocellulosamembran, medan små ligander, såsom NSMs, kan. Genom att blanda NSM(t.ex.ppGpp) med det protein som ska testas och upptäcka dem på membranet kan två scenarier förväntas (Figur 1): Om (p)ppGpp binder till proteinet, kommer den radiomärkta (p)ppGpp att behållas i mitten av platsen av proteinet och kommer inte att spridas utåt, vilket ger en intensiv liten prick (dvs. stark radioaktiv signal) under en fosforimager. Men om (p)ppGpp inte binder till proteinet, kommer det att sprida sig fritt utåt för att producera en stor plats med enhetlig bakgrunds radioaktiv signal.
Dessutom kan DRaCALA upptäcka interaktionen mellan en liten molekyl och ett opurifierat protein i ett helt celllyat om proteinet finns i tillräcklig mängd. Denna enkelhet gör det möjligt att använda DRaCALA för att snabbt identifiera proteinmål med hjälp av ett ORFeome-uttrycksbibliotek. Målproteiner i cAMP7,cykliska di-AMP8,cykliska di-GMP9,10och (p)ppGpp11,12,13 harsystematiskt identifierats med hjälp av DRaCALA. Den här videoartikeln använder (p)ppGpp som ett exempel för att demonstrera och beskriva de kritiska stegen och övervägandena vid en framgångsrik DRaCALA-screening. Observera att en mer grundlig beskrivning av DRaCALA14 rekommenderas starkt att läsa i kombination med den här artikeln innan du utför DRaCALA.
Figur 1: Principen om DRaCALA. (A) Schematisk av DRaCALA-analysen. Mer information finns i texten. B)Kvantifiering och beräkning av den bindande fraktionen. Mer information finns i texten. Kortfattat kommer DRaCALA-fläckarna att analyseras genom att rita två cirklar som omskär hela punkten och den inre mörka punkten (dvs. denbibehållna (p)ppGpp på grund av bindningen av det testade proteinet). Den specifika bindningssignalen är den radioaktiva signalen i den inre cirkeln (S1) efter subtrahering av den icke-specifika bakgrundssignalen (beräknadmed A 1 × ((S 2 -S 1)/(A 2 -A 1)).The specific binding signal is the radioactive signal of the inner circle (S1) after subtracting the non-specific background signal (calculated by A 1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindningsfraktionen är den specifika bindningssignalen dividerad med den totala radioaktiva signalen (S2). Förkortningar: DRaCALA = Ligand Assays differentiella radiella kapillärverk; p)ppGpp = guanosinpenta- och tetrafosfater. RT = rumstemperatur. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av hela celllyssen
- Inokulera E. coli K-12 ASKA ORFeomesamlingsstammar 15 till 1,5 mL Lysogeny buljong (LB) som innehåller 25 μg/mL kloramfenikol i 96-brunn djupa brunnsplattor. Odla över natten (O/N) i 18 timmar vid 30 °C med skakningar vid 160 varv/min. Nästa dag, tillsätt isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (slutlig 0,5 mM) till O/N-kulturerna för att inducera proteinuttryck vid 30 °C i 6 timmar.
- Pelletsceller på 500 x g i 10 min. Frys pelletsen vid -80 °C tills den används. För att lysa cellerna, tillsätt 150 μL lysbuffert L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, kompletterad med 2 mM fenylmetylmetylfluorid (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 och 0,5 mg/mL lysozyme) för att återanvända pelleten.
- Frys cellerna vid -80 °C i 30 min och tina sedan vid 37 °C i 20 min. Upprepa denna cykel tre gånger för att lysa cellerna. Förvara lyset vid -80 °C före användning.
2. Rening av Relseq och GppA
OBS: De rekombinanta proteinerna Relseq från Streptococcus equisimilis och GppA från E. coli K-12 används för att syntetisera den radiomärkta pppGpp respektive ppGpp.
- Odla och samla celler som överuttrycker varje protein.
- Odla E. coli BL21 DE3-stammen upp till exponentiell fas (optisk densitet (OD) ~ 0,3-0,4) i LB-buljong och snurra ner 1 ml kultur vid 6000 x g i 5 min. Dekantera supernatanten och återanvänd cellerna med 100 μL iskall TSB-buljong (LB-buljong kompletterad med 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 ml/ml dimetylsulfoxid, 20 mM MgCl2).
- Blanda plasmiderna som bär den histidinmärkta relseq och gppA, varje 100 ng, med ovanstående cellfjädring i TSB och inkubera på is i 30 minuter. Värmechocka cellerna vid 42 °C i 40 s. Placera blandningen på is i 2 min och tillsätt 1 ml LB-buljong vid rumstemperatur så att cellerna kan återhämta sig i 1 timme vid 37 °C med omrörning vid 160 varv/min.
- Plätera de återvunna cellerna på LB agarplattor kompletterade med motsvarande antibiotika (Rel seq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). Nästa dag inokulera kolonierna i LB-buljong för att starta O/N-prekulturer av båda stammarna vid 37 °C.
- Efter 18 h inokulera 500 ml LB-medium med 10 ml O/N-kulturer och motsvarande antibiotika. Odla kulturerna genom att skaka vid 160 varv/min vid 37 °C. När OD600nm når 0,5-0,7, inducera proteinuttryck genom att tillsätta 0,5 mM IPTG och växa i 3 h vid 30 °C med skakningar vid 160 varv/min.
- Samla cellerna genom att snurra vid 6084 x g i 10 min vid 4 °C. Återanvänd pelleten i 20 ml iskallt 1x fosfatbuffrat saltlösning (PBS) och återcentrifug vid 1912 x g i 20 min vid 4 °C. Dekanta supernaten och frys pelletsen vid -20 °C före användning.
- Nickelnitrilotriacetisk syra (Ni-NTA) affinitetsrening
OBS: Se från och med nu till att proverna är kalla.- Tillsätt 40 ml iskall lysbuffert L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-merkaptoethanol kompletterad med proteashämmare (EDTA-fri tablett; se materialförteckningen)för att återanvända pelleten. Lysa cellerna via ultraljudsbehandling (60% amplitud, 2 s ON/ 4 s OFF i 8 min ON). Rensa lyset genom att snurra vid 23 426 x g i 40 min vid 4 °C och fortsätt med supernatanten för reningen.
- Under ovanstående centrifugation, förbered Ni-NTA harts.
- Överför 500 μL homogeniserat Ni-NTA-harts till en stående kromatografikolonn av polypropylen och låt den nöja sig i 15 minuter och lagringslösningen rinner igenom. Tvätta hartset med 15 ml ultrapurvatten två gånger och tvätta sedan kolonnen med 15 ml lysbuffert L2.
- Ladda den rensade supernaten av celllysat från steg 1 till kolumnen och låt den flöda igenom. Tvätta kolonnen med 30 ml tvättbuffert (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol).
- Eluera proteinerna med 400 μL av elueringsbufferten (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) tre gånger. Upprepa sedan eluering med ytterligare 300 μL av elueringsbufferten. Kombinera de eluterade proteinerna till en slutlig volym på 700 μL.
- Gelfiltrering
- Förbered gelfiltreringsbuffert (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glycerol). Tvätta storleksuteslutningskolonnen med en kolumnvolym (25 ml) av gelfiltreringsbufferten.
- Ladda ovanstående 700 μL-prov med hjälp av en 500 μL-slinga, kör på 0,5 ml/min och samla upp 2-3 fraktioner, var och en av 0,5 ml-volym, som innehåller respektive proteiner.
- Kombinera och koncentrera fraktionerna som innehåller vart och ett av proteinerna med hjälp av en spinnkolonn och mät proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-analysen.
3. Syntes av 32P-märkt pppGpp och ppGpp
- Montera en småskalig Relseq-reaktion i ett skruvlocksrör (se tabell 1).
OBS: Arbeta med radioaktiva reagenser endast på en licensierad plats och med personlig skyddsutrustning.
| Volym (μL) | ||
| Småskaligt | Storskaliga | |
| Ultrapure vatten | ||
| 10x Relseq buffert* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM slutlig) | ||
| Relseq (4 μM final) | ||
| 32 (på 32) P-α-Guanosin triphosphate (GTP) (final 120 nM) (VARNING) | 0.2 | 5 |
| total | 20 | 500 |
Tabell 1: Montering av information för små och storskaliga syntesreaktioner på 32P-märkt pppGpp. *10x Relseq-buffert innehåller 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Förkortning: pppGpp = guanosinpentafosfat.
- Inkubera röret vid 37 °C i en termomixer i 1 timme, sedan vid 95 °C i 5 minuter och lägg det på is i 5 minuter. Snurra ner det fällda proteinet vid 15 700 x g i 5 min och överför supernatanten (syntetiserad 32P-pppGpp) till ett nytt skruvlocksrör.
- För att syntetisera 32P-ppGpp från 32P-pppGpp, överför hälften av 32p-pppGpp-produkten till ett nytt skruvlocksrör och tillsätt 1 μM GppA. Inkubera röret vid 37 °C i 10 min, vid 95 °C i 5 min och lägg sedan på is i 5 minuter.
- Snurra ner det fällda proteinet vid 15 700 x g i 5 min och överför supernatanten (syntetiserad 32P-ppGpp) till ett nytt skruvlocksrör.
- Analysera 32P-pppGpp och 32P-ppGpp genom att köra 1 μL av proverna på en TLC-platta (thin layerhromatography) (polyetyleniminemodifierad cellulosa TLC-plattor) med hjälp av 1,5 M KH2PO4, pH 3.4, som mobil fas.
OBS: Använd α-32P-märkt guanosin 5'-tripfosfat(32P-α-GTP) som kontroll. - Torka TLC-plattan helt, placera den mellan en genomskinlig plastmapp och exponera den för en lagringsfosforskärm i 5 minuter. Visualisera och kvantifiera signalerna med hjälp av en fosforimager.
OBS: När förhållandet mellan 32P-pppGpp och 32P-ppGpp är högre än 85%, kan en storskalig reaktion (500 μL, tillräcklig för screening av 20 96-brunnsplattor) monteras och syntetiseras med hjälp av tabell 1.
4. DRaCALA-screening av målproteinerna i (p)ppGpp
- Tina och överför 20 μL hela celllysen till en 96-brunns V-botten mikrotiterplatta. Tillsätt 2,5 U/brunn endonukleas från Serratia marcescensoch inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att minska lysatviskositeten. Lägg lysena på is i 20 minuter.
- Blanda 32P-pppGpp och 32P-ppGpp i ett 1:1-förhållande och tillsätt 1x lysbuffert L1 för att göra den slutliga koncentrationen av (p)ppGpp lika med 4 nM.
OBS: Med tanke på den kemiska likheten mellan pppGpp och ppGpp kommer en blandning av båda kemikalierna att förenkla screeningprocessen. - Använd en flerkanalspipett och filtrerade pipettspetsar för att tillsätta och blanda 10 μL av (p)ppGpp-blandningen med celllysatet. Inkubera i rumstemperatur (RT) i 5 min.
- Tvätta 96 x stiftverktyget genom att placera i 0,01% lösning av icke-joniskt rengöringsmedel i 30 s och torka på ett vävnadspapper i 30 s. Upprepa tvättningen av stiftverktyget 3x.
- Placera stiftverktyget i ovanstående 96-brunnsprovplattor och vänta i 30 s. Lyft stiftverktyget rakt upp och placera det rakt ner på ett nitrocellulosamembran i 30 s.
OBS: Om en fläck saknas, punkt 2 μL av motsvarande prov med en pipett och filtrerade spetsar. Det är lämpligt att göra en duplicerad plats av samma prov som anges nedan. - Torka membranet i 5 minuter på RT. Placera membranet mellan en genomskinlig plastmapp och exponera det för en lagringsfosforskärm i 5 minuter. Visualisera med hjälp av en fosforimager.
5. Kvantifiering och identifiering av potentiella målproteiner
- Använd analysprogramvaran som är associerad med fosforimagern för att öppna .gel-filen på de visualiserade plattorna. Använd funktionen Matrisanalys för att definiera de 96 platserna genom att ställa in ett rutnät med 12 kolumner x 8 rader.
- Definiera stora cirklar för att begränsa hela fläckarnas ytterkant (se figur 1B). Exportera Volumn+Bakgrund och område i de definierade stora cirklarna och spara i ett kalkylblad.
OBS: Om det behövs, flytta varje enskild cirkel för att perfekt överlappa fläckarna och ändra storlek på varje enskild cirkel för att göra den något större än den faktiska platsen. - Storlek ner de definierade cirklarna för att begränsa de små inre prickarna. Exportera Volumn+Bakgrund ochOmråde i de definierade små cirklarna och spara i ett kalkylblad.
- Beräkna bindningsfraktionerna i kalkylbladet med hjälp av ekvationen i figur 1Boch rita data. Identifiera de potentiella bindningsproteinerna i brunnarna som visar höga bindande fraktioner i jämförelse med de flesta andra brunnar.
Figur 2: Det övergripande arbetsflödet för DRaCALA-screeningprocessen. Proteinproduktion från en Escherichia coli ASKA-samling induceras och cellerna lysas. Under tiden renas och används de rekombinanta proteinerna Relseq-His och GppA-His för att syntetisera 32P-märkta pppGpp och ppGpp från 32P-α-GTP. De radioaktivt märkta (p)ppGpp-molekylerna blandas sedan med lysaterna, och ett 96-stiftsverktyg används för att upptäcka blandningarna på ett nitrocellulosamembran för efterföljande exponering för en fosforlagringsskärm, avbildning och kvantifiering av de radioaktiva signalerna. Förkortningar: DRaCALA = Ligand Assays differentiella radiella kapillärverk; p)ppGpp = guanosinpenta- och tetrafosfater. RT = rumstemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-tripfosfat; SDS-PAGE = natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores; TLC = tunn lagerkromatografi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt ovannämnda protokoll kommer vanligtvis att ge två typer av resultat (figur 3).
Figur 3A visar en platta med relativt låga bakgrundsbindningssignaler (bindningsfraktioner < 0,025) från de flesta brunnar. Den positiva bindningssignalen från brunnen H3 ger en bindande fraktion på ~ 0,35 som är mycket högre än den som observerats för de andra brunnarna. Även utan kvantifiering är H3 anmärkningsvärt, vilket tyder på att ett målprotein uttryckt i väl H3 binder till antingen pppGpp, ppGpp eller båda. Faktum är att proteinet som överuttrycks i brunn H3 är hypoxanthine fosforibosyltransferas hpt, som är känd för att binda (p)ppGpp12,16.
Figur 3: Representativa DRaCALA-säkerhetsskyltar (till vänster) och kvantifiering (till höger). Den enda positiva träffen, Hpt, gav en stark bindningssignal som sticker ut i både spot- och kvantifieringsdiagrammet. B,C) Två replikerade DRaCALA-fläckar på den omorganiserade plattan 31. Svarta brutna cirklar och pilar indikerar de sanna målproteinerna i (p)ppGpp, medan de röda trasiga cirklarna indikerar de falska positiva. Mer information finns i texten. Förkortningar: DRaCALA = Ligand Assays differentiella radiella kapillärverk; p)ppGpp = guanosinpenta- och tetrafosfater. RT = rumstemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-tripfosfat; SDS-PAGE = natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores; TLC = tunnskiktskromatografi; Hpt = hypoxanthine fosforibosyltransferas; Kina = peptidkedjefrisättningsfaktor RF3; NadR = NMN adenylyltransferas; HflX = translationell GTPase. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Det andra typiska resultatet av screeningen visas i figur 3B, C. I denna platta uppvisade flera brunnar relativt högre bakgrundsbindningssignaler än de i figur 3A. Detta framgår tydligt av de relativt starka inre prickarna för många brunnar. Kvantifiering visade också att många brunnar har bindande fraktioner i intervallet 0,02-0,04. En högre bakgrund av bindningssignalen orsakas sannolikt av att hela celllystin är trögflytande trots behandlingarna med både DNase I och endonukleasen från S. marcescens, som försämrar det utsläppta kromosomala DNA. För plattor som den här är det viktigt att jämföra de två replikerade fläckarna på plattan (steg 4.5; Figur 3B, C). Kvantifiering av båda plattorna visar att de autentiska positiva målen (svarta cirklar, brunnar A10 PrfC, B11 NadR) tenderar att ge konsekvent höga bindningsfraktioner.
I synnerhet kan vissa verkliga mål också ge variabla bindande fraktioner (Well D5, HflX12) såsom falska positiva (röda cirklar). Anledningen till denna variabilitet ligger i det faktum att inte alla proteiner i ett bibliotek uttrycks i löslig form och i erforderliga mängder. Om koncentrationen av ett protein ligger nära eller strax under Kd-värdet kan rörliga bindande resultat förväntas, även för de verkliga målen. Stora mängder lösligt HflX-protein erhölls inte från ASKA-stammen12. För att avgöra om dessa proteiner är riktiga bindemedel eller inte måste de potentiella proteinerna renas till homogenitet och bindningen bekräftas med hjälp av en högre koncentration (50-100 μM) av proteinerna.
Genom denna screening identifierades 9 av 20 kända målproteiner av (p)ppGpp12 (se diskussionsavsnittet), vilket validerar nyttan av DRaCALA för denna uppgift. Dessutom upptäcktes och bekräftades 12 nya mål för (p)ppGpp, vilket visar att DRaCALA är en kraftfull teknik för att avslöja nya målproteiner av (p)ppGpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett av de kritiska stegen för att utföra DRaCALA-screening är att få bra hela celllyssningar. För det första bör de testade proteinerna produceras i stora mängder och i lösliga former. För det andra bör lyset av celler vara komplett, och lysatets viskositet måste vara minimal. Införandet av lysozyme och användningen av tre cykler av frys-tina är ofta tillräckligt för att lysa celler helt. Det frisläppta kromosomala DNA:t gör dock lysatet trögflytande och genererar hög bakgrundsbindningssignal, vilket resulterar i falska positiva identifieringar som visas i figur 3B, C. För att mildra detta kan DNase 1 och/eller endonuclease från S. marcescens användas, och proverna kan inkuberas under en längre tid för att försämra DNA.
Både negativa (tom plasmidvektor) och positiva (känt målprotein) kontroller bör användas för att optimera villkoren för hela cell lysatpreparatet och DRaCALA bindande analys innan en storskalig screening. När ett sådant optimalt tillstånd hittas blir det onödigt att inkludera kontrollerna i den faktiska screeningen av varje platta. Detta beror på att screeningförfarandet är mycket kort och beror på att majoriteten av proteinerna i en tallrik inte förväntas binda till (p)ppGpp. Dessa proteiner fungerar därför som negativa kontroller vid kvantifiering av de bindande fraktionerna (figur 3).
Produktionen av renare 32P-märkt pppGpp och ppGpp är också avgörande för DRaCALA screening. Till exempel kan konverteringsförhållandet från GTP till pppGpp variera. Således är det viktigt att optimera pH, koncentrationerna av magnesium och enzymer som används och reaktionstiden. Småskaliga reaktioner är därför viktiga för att identifiera det bästa tillståndet innan du ställer in en storskalig reaktion.
DRaCALA har helt klart vissa fördelar och nackdelar (se Roelofs et al.9 för mer diskussion) jämfört med andra tekniker som capture compound-tekniken. För det första använder DRaCALA den 32P-märkta (p)ppGpp, vilket inte påverkar den kemiska strukturen hos (p)ppGpp, vilket bevarar dess interaktion med potentiella målproteiner. För det andra, när 32p-(p)ppGpp och celllyates är beredda, tar det bara en vecka att screena ~ 60 tallrikar i E. coli ORFeome-biblioteket med DRaCALA. Faktum är att det korta experimentella förfarandet (avsnitt 4) tillät identifiering av även de proteiner som försämrar (p)ppGpp (MutT, NudG)12,17, som fångstblandningstekniken missade18.
Användningen av DRaCALA kräver dock ett ORFeome-uttrycksbibliotek, som endast är tillgängligt för ett begränsat antal modellorganismer. Dessutom påverkar affinitetsreningstaggar, som är utformade för att underlätta proteinrening i ORFeome-biblioteket, ibland proteinets uttryck eller korrekt vikning, vilket ger några falska negativ. Ett nytt ORFeome-bibliotek kommer helst att kräva bestämning av om majoriteten (>80%) av proteinerna uttrycks i löslig form och i tillräckliga mängder. Ett sådant test gör det också möjligt för forskarna att utvärdera täckningen och effektiviteten av DRaCALA-screeningresultaten.
Trots dessa begränsningar är DRaCALA en kraftfull teknik för att framgångsrikt avslöja nya målproteiner hos flera nukleotid sekundära budbärare. I princip skulle DRaCALA kunna användas för att studera vilken liten ligand som helst om den kunde märkas med hjälp av antingen radioaktiva isotoper eller till och med fluorescerande färgämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöds av ett NNF-projektbidrag (NNF19OC0058331) till YEZ och Europaparlamentets forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet (Nº 801199) till MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
