Summary
Her præsenterer vi en metode til at udvide perifert blod naturlig dræber (PBNK), NK-celler fra levervæv og kimære antigenreceptor (CAR) -NK-celler afledt af perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) eller navlestrengsblod (CB). Denne protokol demonstrerer udvidelsen af NK- og CAR-NK-celler ved hjælp af 221-mIL-21 feederceller ud over den optimerede renhed af ekspanderede NK-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR) -modificeret immuncelleterapi er blevet en ny behandling for kræft og infektionssygdomme. NK-baseret immunterapi, især CAR-NK-celle, er en af de mest lovende 'off-the-shelf' udvikling uden alvorlig livstruende toksicitet. Flaskehalsen for udvikling af en vellykket CAR-NK-terapi er imidlertid at opnå et tilstrækkeligt antal ikke-udtømmende, langlivede, "off-the-shelf" CAR-NK-celler fra en tredjepart. Her udviklede vi en ny CAR-NK-ekspansionsmetode ved hjælp af en Epstein-Barr-virus- (EBV) transformeret B-cellelinje, der udtrykker en genetisk modificeret membranform af interleukin-21 (IL-21). I denne protokol tilvejebringes trinvise procedurer for at udvide NK- og CAR-NK-celler fra navlestrengsblod og perifert blod samt fast organvæv. Dette arbejde vil forbedre den kliniske udvikling af CAR-NK immunterapi betydeligt.
Introduction
Naturlige dræberceller (NK) er en vigtig delmængde af lymfocytter, der udtrykker CD56 og mangler ekspression af T-cellemarkøren, CD3 1,2. Konventionelle NK-celler klassificeres som medfødte immunceller, der er ansvarlige for immunovervågning af viralt inficerede celler og kræftceller. I modsætning til T-celler genkender NK-celler inficerede eller ondartede celler ved hjælp af CD16 eller andre aktiverende receptorer og kræver ikke dannelse af et kompleks mellem antigenpeptider og større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I-molekyler 3,4. Nylige kliniske undersøgelser ved hjælp af kimære antigenreceptor (CAR)-NK-celler til behandling af recidiverende eller ildfaste CD19-positive kræftformer (ikke-Hodgkins lymfom eller kronisk lymfatisk leukæmi [CLL]) viste de fremragende sikkerhedsfordele ved CAR-NK-celler5. For eksempel er CAR-NK-celleinfusion forbundet med minimal eller ubetydelig graft versus værtssygdom (GVHD), neurotoksicitet, kardiotoksicitet og cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) 6,7,8,9,10. Imidlertid viste konventionelle metoder til udvidelse af humane NK-celler udtømmende fænotyper med stærk brodermorderisk drab og telomermangel, hvilket udgør en stor udfordring med at opnå et tilstrækkeligt antal funktionelle NK-celler til adoptiv immunterapi11.
For at overvinde disse udfordringer blev der udviklet en metode til at udvide primære NK-celler direkte fra ikke-fraktionerede mononukleære blodceller (PBMC'er) eller navlestrengsblod (CB) ved hjælp af en bestrålet og genetisk manipuleret 721.221 (i det følgende 221) cellelinje, en human B-lymfoblastoid cellelinje med lav ekspression af MHC klasse I-molekyler3. Tidligere undersøgelser viste betydningen af IL-21 i NK-celleudvidelse; derfor blev en genetisk manipuleret membranbundet IL-21, der udtrykker en version af 721.221 cellelinjen (startende nu, 221-mIL-21) udviklet 11,12,13,14,15. Resultaterne viste, at 221-mIL-21 feeder-celle-ekspanderede primære NK-celler blev udvidet til et gennemsnit på >40.000 gange med vedvarende høj NK-cellerenhed i ca. 2-3 uger. Yderligere oplysninger om anvendelsen af denne protokol findes i Yang et al.16.
Denne protokol har til formål at demonstrere den trinvise procedure for den nye udvidelse af PBNK-, CBNK-, vævsafledte NK- og CAR-NK-celler ex vivo.
Protocol
Humant væv og blodrelateret arbejde i denne protokol følger retningslinjerne fra Rutgers University Institutional Review Board (IRB)
1. NK-celleudvidelse fra levervæv (dag 0), som vist i figur 1.
BEMÆRK: Indledende celleantal og levedygtighed er stærkt korreleret med tiden siden organfjernelse og den oprindelige vævsprøvemængde. Men hvis væv placeres i 30 ml af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) og opbevares på is eller i køleskabet ved 4 ° C natten over, kan NK-celler stadig udvides ved høj renhed og levedygtighed op til 24 timer senere.
- Identificer levedygtige vævsområder for at opnå lymfocytter fra væv og sektioner ved hjælp af sterilt kirurgisk udstyr.
- Anbring væv i 30 ml HBSS (uden calcium eller magnesium) og hold på is, indtil du er klar til at forberede sig på isolering.
- Hak vævet i <0,5 cm terninger ved hjælp af sterile barberblade eller saks og tang inde i et biosikkerhedsskab.
- Der fremstilles en 1x collagenase IV-opløsning (1 mg/ml) ved at fortynde en 10x bestand i HBSS (10x Collagenase IV: 10 mg/ml eller ~200 E/ml).
- Placer de hakkede vævsstykker i vævsdissociatorrørene. Fyld rørene med højst 4 g væv og nedsænk vævsstykkerne i ~ 10 ml 1x collagenase IV.
BEMÆRK: Brug af DNase I anbefales ikke, da det kan reducere NK levedygtighed og udbytte lidt. Der henvises til materialetabellen for de specifikke vævsdissociatorrør, der anvendes. - Vævsdissociatorrørene anbringes i en vævsdissociator, og blandes ved 37 °C for at hakke vævet grundigt.
BEMÆRK: For levervæv kan dette tage over 30 minutter. For mere sprødt væv kan omkring 15 minutter være tilstrækkeligt. Der henvises til materialeoversigten for specifikke vævsdissociatorrør og den anvendte vævsdissociator. - Fjern vævsdissociatorrørene og triturere gennem 40 μm nyloncellesi ved hjælp af backend på en 5 ml sprøjte. Saml eluenten og kassér de store ufordøjede fragmenter.
- Drej eluenten ned ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten.
- Resuspender cellepillerne i 30% polyvinylpyrrolidon (PVP)-belagt silica for at fjerne fedtceller, der ellers vil forurene den endelige lymfocytfraktion.
- For at forberede 1x PVP-belagt silica skal du bruge 9: 1 fortynding af PVP-belagt silica i 10x PBS.
BEMÆRK: Se materialetabellen for den specifikke PVP-belagte silica, der anvendes. - For at forberede 30% PVP-belagt silica fortyndes 1x PVP-belagt silica med PBS / HBSS.
- For at forberede 1x PVP-belagt silica skal du bruge 9: 1 fortynding af PVP-belagt silica i 10x PBS.
- Drej cellepillen ned ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 9 ml R-10 medier.
BEMÆRK: Se materialetabellen for sammensætningen af R-10-medier - Læg forsigtigt cellesuspensionen over 4 ml Ficoll- eller lymfocytseparationsmedier for at adskille lymfocytter fra røde blodlegemer og polymorfonukleære celler.
- Lagene adskilles ved centrifugering ved 400 x g i 23 minutter ved stuetemperatur med acceleration og bremser slukket eller ved laveste indstilling. Dekantér forsigtigt det øverste mellemlag og høst interfasen indeholdende vævsinfiltrerende lymfocytter.
- Skyl cellerne med 10 ml medier og fortsæt til celletælling, flowcytometri, aliquoting og frysning af celler eller primær NK-ekspansionsprotokol.
2. Primær NK-celleudvidelse fra PBMC'er (eller CB- eller organvæv) (dag 0), som vist i figur 2.
- Optø den frosne PBMC og de frosne, bestrålede fødeceller i et vandbad på 37 °C.
- PBMC- og 100 gammabestrålede (gybestrålede) 221-mIL-21-celler vaskes ved centrifugering ved 400 x g i 5 minutter med 10 ml R-10-medier separat.
- Gem 1 x 106 celler PBMC til flowcytometri.
BEMÆRK: Den oprindelige NK-cellerenhed er en vigtig faktor ved beregning af NK-celleudvidelseshastighed. - Resuspender cellerne i 1 ml R-10 medier. Tæl cellerne ved hjælp af Trypan Blue.
- Bland 5x 10 6 celler PBMC med 10 x 10 6 celler af 100 Gy-bestrålede 221-mIL-21 celler i en speciel6-brønds plade (se Materialetabel).
- Der tilsættes 30 ml R-10-medier suppleret med human IL-2 (200 U/ml) og human IL-15 (5 ng/ml) (se materialetabel).
- Den specielle 6-brøndsplade inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2.
- Udskift mediet med R-10-medier suppleret med human IL-2 (200 U / ml) og human IL-15 (5 ng / ml) for at opretholde NK-celler hver 3-4 dage.
BEMÆRK: Vedligehold mindre end 20 x 106 celler pr. brønd for yderligere ekspansion ved hvert medieskift. For at opnå den bedste levedygtighed skal du sikre dig, at det samlede celleantal i hver brønd ikke overstiger 100 x 106 celler. - Registrer det samlede celleantal, levedygtighed og udfør flowcytometri hver 3-4 dage for at beregne NK-celleudvidelseshastigheden.
3. Fastgørelse af 293T-celler (dag 2), som vist i figur 2.
- Opdel 1,8 x 106 293T-celler i 11 ml D-10-medier pr. behandlet 100 mm plade.
BEMÆRK: Se materialetabellen for sammensætningen af D-10-medier - Inkubere 293T-celler ved 37 °C med 5 % CO2.
4. Retrovirustransfektion (dag 3)
- I et 1,7 ml rør blandes 470 μL reduceret serummedie med 30 μL transfektionsharpagens.
BEMÆRK: Se materialetabellen for det specifikke reducerede serummedie og transfektionsreagens, der anvendes. - I et separat 1,7 ml rør tilsættes 2,5 μg pRDF-plasmid, 3,75 μg Pegpam3-plasmid og 2,5 μg CAR-konstruktion i SFG-vektor i det reducerede serummedie, så det endelige volumen er 500 μL.
- Bland opløsningerne i trin 4.1 og 4.2 dråbevis.
- Inkuber røret ved stuetemperatur i 15 min.
- Tilsæt 1 ml af blandingen fra trin 4.4 til 293T celleplade på dag 1 på en dråbevis måde.
- Pladen/pladerne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 48-72 timer.
5. Retronectin pladebelægning (dag 3)
- Fortynd retronectinprotein med phosphatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 50-100 μg/ml.
- Der tilsættes 500 μL fortyndet retronectin i hver brønd på en ubehandlet 24-brønds plade (5 brønde pr. CAR-konstruktion). Pladen forsegles ved hjælp af parafilm, og pladen inkuberes ved 4 °C natten over.
6. Transduktion (dag 4)
- Centrifuger retronectinpladen ved 2103 x g i 30 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Bloker hver brønd på 24-brøndpladen med 1 ml R-10 medium.
- Pladen inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 1 time.
- Forvarm centrifugen til 32 °C, mens retronectinpladen blokeres.
- Opsamling retrovirussupernatanten ved at filtrere de transinficerede 293T-celler ved hjælp af et 0,45 μm-filter.
- Aliquot 2 ml af den filtrerede retrovirus supernatant i hver brønd.
- Centrifuge 24-brøndspladen ved 2103 x g i 2 timer ved 32 °C.
- Under pladecentrifugering samles de udvidede PBNK-celler fra dag 0 og tæller cellerne ved hjælp af Trypan Blue.
BEMÆRK: Fortsæt med at udvide PBNK-celler ved at tilføje R-10-medier suppleret med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml). - Fortynd de ekspanderede PBNK-celler med R-10-medier suppleret med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml) til 2,5 x 10 5-5 x 10 5 celler / ml (0,5 x 10 6-1 x 106 celler pr. Brønd).
BEMÆRK: Registrer det samlede celleantal, levedygtighed og gem 5 x 105 udvidede PBNK-celler til flowcytometri, da disse værdier er vigtige for at bestemme NK-celleudvidelseshastigheden. - Efter centrifugering skal du delvist aspirere retrovirussupernatanten fra hver brønd.
BEMÆRK: Opsæt ikke helt, dvs. efterlad ca. 100 μL retrovirus supernatant pr. Brønd, da dette vil reducere transduktionseffektiviteten. - Aliquot 2 ml af de fortyndede ekspanderede PBNK-celler fra trin 6,8 til hver brønd.
- Pladen centrifugeres ved 600 x g i 10 minutter ved 32 °C. Pladen inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 48-72 timer.
BEMÆRK: Du må ikke parafilme pladen.
7. CAR-NK-celleindsamling (dag 6 eller 7), som vist i figur 2.
- Saml forsigtigt cellerne fra 24-brøndspladen og overfør cellerne til et 50 ml centrifugerør
BEMÆRK: Prøv ikke at generere bobler, da dette vil resultere i et fald i cellens levedygtighed. - Centrifuger røret ved 400 x g i 5 min.
- Resuspender pelleten med 1 ml R-10-medie, og tæl cellerne ved hjælp af Trypan Blue.
BEMÆRK: Gem 5 x 105 celler til flowcytometri for at bestemme transduktionseffektiviteten. - Overfør de resuspenderede celler til en speciel 6-brønds plade indeholdende 30 ml R-10-medier suppleret med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml).
- Den specielle 6-brøndsplade inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2.
- Udskift R-10-medier suppleret med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml) for at opretholde NK-celler hver 3. - 4. dag.
BEMÆRK: Vedligehold mindre end 20 x 106 celler pr. brønd for yderligere ekspansion ved hver ændring. For at opnå den bedste levedygtighed skal du sikre dig, at det samlede celleantal i hver brønd ikke overstiger 100 x 106 celler. - Registrer det samlede celleantal, levedygtighed, og udfør flowcytometri hver 3-4 dage for at beregne NK-celleudvidelseshastigheden.
- Brug cellerne til passende in vitro- eller in vivo-assays.
BEMÆRK: Den ex vivo ekspanderede PBNK og CAR-NK-celler kan dyrkes i en 37 °C inkubator i ca. 4 uger. - Undersøg NK-cellenummeret og renheden på dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 og dag 21 ved flowcytometri.
Representative Results
En skematisk arbejdsgang med vævsinfiltrerende NK-celleisolering og PBNK-celleudvidelse ved hjælp af 221-mIL-21-feedercellemetoden er vist i figur 1 og figur 2. Udvidede PBNK-celler blev indsamlet hver 3. eller 4. dag til flowcytometri for at bestemme NK-cellerenheden ved at farve celler med anti-human CD56 og anti-human CD3. Eksperimentet blev gentaget ved hjælp af to forskellige donorer for at vise reproducerbarheden af ekspansionssystemet (figur 3). PBNK-celler udvidet med 221-mIL-21 viste sig at udvide næsten 5 × 104 gange (figur 3A). Desuden blev NK-cellerenheden stærkt opretholdt, omkring 85% i løbet af 21-dages ekspansion (figur 3B). Ved hjælp af 221-mIL-21 feedercelleudvidelsessystemet varierede NK-cellerenheden konsekvent mellem 85% -95%, uafhængigt af donorerne (data ikke vist). For at demonstrere robustheden af 221-mIL-21-ekspansionssystemet blev PBMC'er farvet for anti-CD56 og anti-CD3 før ekspansionen, hvilket viste en cellerenhed på 7,09% for NK-celler og en høj procentdel af T-celler (figur 4A). PBMC'er blev samdyrket med 221-mIL-21 for at udvide NK-celler; NK-renheden blev kontrolleret før CAR-NK-transduktion på dag 4 (figur 4A). CAR-NK-celler blev indsamlet og farvet til anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG (H + L) F (ab')2, som viste en høj NK-cellepopulation (86,9 % på dag 7) og en høj CAR-transduktionseffektivitet på ca. 70% (figur 4). Der blev også observeret højere transduktionseffektivitet (op til 95 %) ved hjælp af retrovirusemballagesystemet. Alt i alt viser disse data, at 221-mIL-21 feedercellerne med succes kunne udvide NK-celler og bevare NK-cellens renhed ex vivo.
Figur 1: Diagram over NK-celleudvidelse fra faste humane organprøver. Kort fortalt hakkes de opnåede humane leverprøver i små terninger til mekanisk fordøjelse. Dissocierede celler isoleres derefter ved hjælp af PVP-belagt silica og lymfocytseparationsmedier. Endvidere udvides NK-cellerne ved hjælp af udvidelsesprotokollen beskrevet i figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk arbejdsgang for CAR-NK-cellegenerering fra PBMC'er. Kort fortalt blev 221-mIL21 fødeceller bestrålet ved 100 Gy før cokulturering med PBMC'er suppleret med IL-2 og IL-15 på dag 0. Parallelt blev 293T-celler transficeret med retrovirusemballagesystemet til fremstilling af CAR-retrovirus, der derefter blev transduceret til de ekspanderede PBNK-celler i nærværelse af IL-2 og IL-15. Primære CAR-NK-celler blev høstet på dag 7 og fortsatte ekspansion i 21 dage. Dette tal er blevet ændret fra Yang et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dynamisk tidsforskudt udvidelse af PBNK-celler. (A) Fold udvidelse af PBNK i løbet af et 22-dages tidsforløb. Celler blev farvet med anti-CD56 og anti-CD3 på angivne dage for flowcytometri. Det samlede antal NK-celler blev bestemt ved at gange NK-cellerenhed med det samlede antal celler. Ekspansionshastighed blev genereret som følger: (Antal NK-celler)Tn/(Antal NK-celler)T0, hvor Antal NK-celler = (procentdel af NK-cellerenhed) × (samlet antal celler), T 0 er antallet af NK-celler på tidspunktet dag0, og Tn er antallet af NK-celler på tidspunktet dag n. (B) NK-cellerenhed i løbet af et 22-dages tidsforløb. NK-celleudvidelsen blev gentaget to gange med to forskellige donorer. Fejllinjer repræsenterer ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ flowcytometrisk analyse af CAR-NK-celler. (A) Repræsentative prikdiagrammer, der viser den dynamiske time-lapse af NK-cellerenheden af CAR-NK-cellerne i løbet af et 18-dages forløb. Flowcytometrianalyse blev vurderet ved farvning af cellerne med anti-CD56 og anti-CD3 på angivne tidspunkter. Dag 0 angiver præudvidelse af PBNK. Dag 4 indikerer post-ekspansion af PBNK og prætransduktion af CAR-NK-celler. Dag 7 angiver post-transduktion af CAR-NK-celler. (B) Repræsentative prikdiagrammer, der viser transduktionseffektiviteten af CAR-NK-celler ved hjælp af retrovirusemballagesystemet. Celler blev farvet med anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG (H + L) F (ab')2 til flowcytometri. (C) Repræsentative prikdiagrammer, der viser CAR-udtrykket i forskellige delmængder, herunder CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ og CD56-CD3- på dag 18. Celler blev farvet med anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG (H + L) F (ab')2 (indikerer CAR-ekspression) til flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
De fleste af de nuværende CAR-NK-produkter i kliniske forsøg bruger NK-cellelinjer17, såsom NK-92, en cellelinje isoleret fra en ikke-Hodgkins lymfompatient18, NK-92MI, IL-2 uafhængig NK-92 cellelinje19 og NKL, isoleret fra en stor granulær lymfocytpatient20, da disse cellelinjer let er proliferative for 'off-the-shelf' produkter. Imidlertid har disse cellelinjer, f.eks. NK-92-celler, marginale kliniske virkninger og in vivo-ekspansion, da de kræver bestråling før infusion, hvilket begrænser deres proliferation og cytotoksicitet in vivo21. I betragtning af disse grunde undersøges i øjeblikket forskellige strategier for at udvide primære NK-celler fra flere kilder, herunder perifert blod, CB, knoglemarv (BM), humane embryonale stamceller (HSC'er), inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og tumorvæv21,22,23. For eksempel kan NK-celler udvides ex vivo ved hjælp af interleukiner, herunder IL-15, IL-18 og IL-21. Lymfoblastoidcellelinjer såsom K562-celler eller Epstein-Barr-virustransformerede lymfoblastoidcellelinjer såsom 721.221-celler bruges også til NK-celleudvidelse16. Imidlertid genererer de ovennævnte strategier ofte utilstrækkeligt antal NK-celler til en adoptiv overførsel af CAR-NK immunterapi22,24. For at hjælpe med at løse problemet viser undersøgelsen her en protokol for en ex vivo NK-celleudvidelse ved hjælp af en genetisk modificeret EBV-transformeret cellelinje, 221-mIL-21 fødeceller.
Ekspansionsmetoden ved hjælp af 221-mIL-21 feederceller vist i denne protokol er optimeret til at udvide NK-celler med en ekspansionshastighed på mindst 10 til 100 gange højere end andre leukæmicellelinjer, herunder HL-60 og OCl-AML3, der udtrykker membran IL-21, K562 og K652-mIL21, der udtrykker OX40 ligand22,24,25. CAR-udtrykket evalueres også i ca. 2 uger ex vivo. Mere markant kan 221-mIL-21 feedercelleudvidelsesstrategien anvendes til at udvide NK-celler fra forskellige kilder, herunder PBMC'er, CB og faste organer såsom leveren uden et indledende NK-berigelsestrin. Selvom 221-mIL-21 feeder-systemet ikke er så donorafhængigt som de førnævnte feedercellelinjer, er det ikke helt uafhængigt af donorer. I gennemsnit kan 221-mIL-21-ekspansionssystemet opnå 90% af NK-cellerenhed med et højt NK-celletal med ca. <5% T-celleforurening på dag 14 efter ekspansion. For at eliminere mulighederne for T-cellekontaminering er det derfor nødvendigt at isolere NK-celler fra opnåede prøver forud for ex vivo-udvidelsen eller anvende et CD3+ udvælgelsessystem til at eliminere T-celler efter en ex vivo-ekspansion.
Et af kritikpunkterne ved at bruge et NK-celleudvidelsessystem er, at fødecellerne muligvis ikke er blevet udryddet fuldt ud efter udvidelsen eller før en transfusion, hvilket kan have betydelige lovgivningsmæssige bekymringer; Derfor er fuldstændig udryddelse af fødeceller før en transfusion afgørende. Nylige kliniske CAR-NK-forsøg, hvor K562-mIL21-4-1BBL feederceller blev anvendt til ex vivo CBNK-celleudvidelsen24,25, viste imidlertid ingen bekymrende komplikationer. Desuden viste vores foreløbige data et gradvist fald i den bestrålede 221-mIL-21-population, efterhånden som udvidelsen skred frem (data ikke vist). Der kræves dog mere omfattende undersøgelser for at denne ekspansionsmetode kan implementeres i en klinisk indstilling. Samlet set hjælper 221-mIL-21-udvidelsessystemet med at løse udfordringen med at udvide primære CAR-NK-celler og vil derfor bidrage væsentligt til den bredere anvendelse af CAR-NK cellebaseret immunterapi i den nærmeste fremtid.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Liu-laboratoriet (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang og Dr. Chih-Hsiung Chen) for deres kommentarer til manuskripterne. Vi vil gerne takke Dr. Gianpietro Dotti for SFG-vektorerne og Dr. Eric Long for 721.221-cellerne. Dette arbejde blev delvist støttet fra HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) og Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH-program), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti og R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) og Rutgers University-New Jersey Medical School Startup finansiering til D. Liu Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A.
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
