Summary
כאן אנו מציגים שיטה להרחבת ההרג הטבעי של הדם ההיקפי (PBNK), תאי NK מרקמות הכבד, ותאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-NK שמקורם בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) או דם טבורי (CB). פרוטוקול זה מדגים את התרחבותם של תאי NK ו-CAR-NK באמצעות תאי הזנה של 221-mIL-21 בנוסף לטוהר הממוטב של תאי NK מורחבים.
Abstract
טיפול בתאי חיסון שעברו שינוי בקולטן אנטיגן כימרי (CAR) הפך לטיפול מתפתח בסרטן ובמחלות זיהומיות. אימונותרפיה מבוססת NK, במיוחד תאי CAR-NK, היא אחד מפיתוחי ה"מדף" המבטיחים ביותר ללא רעילות מסכנת חיים חמורה. עם זאת, צוואר הבקבוק לפיתוח טיפול מוצלח ב-CAR-NK הוא השגת מספר מספיק של תאי CAR-NK לא ממצים, בעלי תוחלת חיים ארוכה, 'מהמדף' מצד שלישי. כאן, פיתחנו שיטת הרחבה חדשה של CAR-NK באמצעות קו תאי B שעבר טרנספורמציה של נגיף אפשטיין-בר (EBV) המבטא צורת קרום מהונדסת גנטית של אינטרלוקין-21 (IL-21). בפרוטוקול זה ניתנים נהלים שלב אחר שלב להרחבת תאי NK ו- CAR-NK מדם טבורי ודם היקפי, כמו גם מרקמות איברים מוצקות. עבודה זו תשפר באופן משמעותי את הפיתוח הקליני של אימונותרפיה CAR-NK.
Introduction
תאי הרג טבעי (NK) הם תת-קבוצה חשובה של לימפוציטים המבטאים CD56 וחסרים ביטוי של סמן תאי T, CD3 1,2. תאי NK קונבנציונליים מסווגים כתאי חיסון מולדים האחראים על חיסוניות של תאים נגועים ויראליים ותאים סרטניים. שלא כמו תאי T, תאי NK מזהים תאים נגועים או ממאירים באמצעות CD16 או קולטנים מפעילים אחרים ואינם דורשים היווצרות של קומפלקס בין פפטידי אנטיגן לבין מולקולות קומפלקס היסטו-תאימות גדולות (MHC) מסוג I 3,4. מחקרים קליניים אחרונים שהשתמשו בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-NK לטיפול בסרטן חיובי ל-CD19 חוזר או עקשן (לימפומה שאינה הודג'קין או לוקמיה לימפוציטית כרונית [CLL]) הראו את יתרונות הבטיחות יוצאי הדופן של תאי CAR-NK5. לדוגמה, עירוי תאי CAR-NK קשור להשתלה מינימלית או זניחה לעומת מחלת מארח (GVHD), רעילות עצבית, קרדיוטוקסיות ותסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)6,7,8,9,10. עם זאת, שיטות קונבנציונליות להרחבת תאי NK אנושיים הראו פנוטיפים ממצים עם הרג אחווה חזק ומחסור בטלומרים, מה שמציב אתגר גדול בהשגת מספר מספיק של תאי NK פונקציונליים לאימונותרפיה מאמצת11.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פותחה שיטה להרחבת תאי NK ראשוניים ישירות מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי לא מופרד (PBMCs) או דם טבורי (CB) באמצעות קו תאים מוקרן ומהונדס גנטית 721.221 (להלן, 221), קו תאי B-לימפובלסטואיד אנושי עם ביטוי נמוך של מולקולות MHC מסוג I3. מחקרים קודמים הראו את החשיבות של IL-21 בהרחבת תאי NK; לפיכך, IL-21 מהונדס גנטית המבטא גרסה של קו התאים 721.221 (החל מעכשיו, 221-mIL-21) פותח 11,12,13,14,15. התוצאות הראו כי 221-mIL-21 תאי NK ראשוניים מורחבים הורחבו לממוצע של >פי 40,000 עם טוהר תאי NK גבוה מתמשך במשך כ-2-3 שבועות. מידע נוסף לגבי היישום של פרוטוקול זה ניתן למצוא ב Yang et al.16.
פרוטוקול זה נועד להדגים את ההליך שלב אחר שלב של ההרחבה החדשנית של PBNK, CBNK, NK שמקורו ברקמות, ותאי CAR-NK ex vivo.
Protocol
רקמות אנושיות ועבודה הקשורה לדם בפרוטוקול זה עוקבות אחר ההנחיות של מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ראטגרס (IRB)
1. התפשטות תאי NK מרקמות הכבד (יום 0), כפי שניתן לראות באיור 1.
הערה: מספר התא הראשוני והכדאיות נמצאים בקורלציה חזקה עם הזמן שחלף מאז הסרת האיברים ועם כמות דגימת הרקמה הראשונית. עם זאת, אם הרקמות ממוקמות ב-30 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ונשמרות על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עדיין ניתן להרחיב את תאי ה-NK בטוהר גבוה ובחיוניות גבוהה עד 24 שעות מאוחר יותר.
- זהה אזורי רקמה קיימא כדי להשיג לימפוציטים מרקמות ומקטעים באמצעות ציוד כירורגי סטרילי.
- יש להניח רקמות ב-30 מ"ל של HBSS (ללא סידן או מגנזיום) ולשמור על הקרח עד שיהיה מוכן להתכונן לבידוד.
- טחנו את הרקמה לקוביות של <0.5 ס"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים או מספריים ומלקחיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- הכינו תמיסת קולגן IV 1x (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול מלאי של 10x ב-HBSS (10x Collagenase IV: 10 מ"ג/מ"ל או ~200 U/mL).
- מניחים את חתיכות הרקמה הטחונה בצינורות הדיסוציאציה של הרקמה. מלא את הצינורות עם לא יותר מ 4 גרם של רקמה לטבול את חתיכות הרקמה ~ 10 מ"ל של 1x collagenase IV.
הערה: שימוש ב- DNase I אינו מומלץ מכיוון שהוא עשוי להפחית מעט את הכדאיות והתפוקה של NK. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות הדיסוציאציה הספציפיים לרקמות שבהן נעשה שימוש. - הכניסו את צינורות הדיסוציאציה של הרקמה לתוך דיסוציאטור של רקמה וערבבו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לטחון את הרקמה ביסודיות.
הערה: עבור רקמת כבד, פעולה זו עשויה להימשך יותר מ-30 דקות. עבור רקמות פריכות יותר, כ-15 דקות עשויות להספיק. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות דיסוציאציה ספציפיים לרקמות ודיסוציאטור הרקמות שבו נעשה שימוש. - הסירו את צינורות הדיסוציאציה של הרקמה וטרטורט דרך מסננת תאי ניילון בקוטר 40 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של מזרק 5 מ"ל. לאסוף את eluent ולהשליך את השברים הגדולים מעוכלים.
- סובבו את ה-eluent ב-400 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נטנט.
- החזירו את כדוריות התאים בסיליקה מצופה 30% פוליוויניל פירולידון (PVP) כדי להסיר תאי שומן שאחרת יזהמו את חלק הלימפוציטים הסופי.
- כדי להכין סיליקה אחת מצופה PVP, השתמש בדילול 9:1 של סיליקה מצופה PVP ב-10x PBS.
הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הסיליקה המצופה PVP הספציפית שבה נעשה שימוש. - כדי להכין 30% סיליקה מצופה PVP, יש לדלל סיליקה אחת בציפוי PVP עם PBS/HBSS.
- כדי להכין סיליקה אחת מצופה PVP, השתמש בדילול 9:1 של סיליקה מצופה PVP ב-10x PBS.
- סובבו את כדור התא ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נטנט.
- השהה את כדור התא ב 9 מ"ל של מדיה R-10.
הערה: עיין בטבלת החומרים להרכבת מדיית R-10 - שכבה בזהירות את תרחיף התאים מעל 4 מ"ל של פיקול או מדיה הפרדת לימפוציטים כדי להפריד לימפוציטים מתאי דם אדומים ותאים פולימורפונוקליאריים.
- הפרד את השכבות על ידי צנטריפוגה בגודל 400 x גרם למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר כאשר התאוצה והבלמים כבויים או בהגדרה הנמוכה ביותר. בזהירות decant את השכבה העליונה-בינונית ולקצור את interphase המכיל לימפוציטים חודרים רקמות.
- שטפו את התאים ב-10 מ"ל של מדיה והמשיכו לספירת תאים, ציטומטריה זורמת, אליציטוט והקפאה של תאים, או פרוטוקול הרחבת NK ראשוני.
2. התפשטות ראשונית של תאי NK מ-PBMCs (או CB או רקמות איברים) (יום 0), כפי שמוצג באיור 2.
- הפשירו את ה-PBMC הקפוא ואת תאי ההזנה הקפואים המוקרנים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את PBMC ו-100 תאים מוקרנים בגמא (Gy-מוקרן) 221-mIL-21 על-ידי צנטריפוגה ברזולוציה של 400 x g למשך 5 דקות עם 10 מ"ל של מדיית R-10 בנפרד.
- שמור 1 x 106 תאים של PBMC עבור ציטומטריה זרימה.
הערה: טוהר תאי ה-NK הראשוני הוא גורם חשוב בחישוב קצב ההתרחבות של תאי NK. - יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של מדיית R-10. ספרו את התאים באמצעות Trypan Blue.
- ערבבו 5x 106 תאים של PBMC עם 10 x 10 6 תאים של 100 תאים מוקרנים Gy 221-mIL-21 בלוח מיוחדשל 6 בארות (ראו טבלת חומרים).
- הוסף 30 מ"ל של מדיית R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ננוגרם/מ"ל) (ראה טבלת חומרים).
- דגרו את צלחת 6 הבארות המיוחדת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- החלף את המדיה במדיית R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ננוגרם/מ"ל) כדי לשמור על תאי NK כל 3-4 ימים.
הערה: שמור על פחות מ- 20 x 106 תאים לכל באר להרחבה נוספת בכל שינוי מדיה. לקבלת הכדאיות הטובה ביותר, ודא שמספר התא הכולל בכל באר אינו עולה על 100 x 106 תאים . - תעד את מספר התא הכולל, את הכדאיות ובצע ציטומטריה של זרימה כל 3-4 ימים כדי לחשב את קצב ההתרחבות של תא NK.
3. חיבור של 293T תאים (יום 2), כפי שמוצג באיור 2.
- פיצול 1.8 x 106 תאי 293T ב-11 מ"ל של מדיית D-10 לכל צלחת 100 מ"מ מטופלת.
הערה: עיין בטבלת החומרים להרכבת מדיית D-10 - דגירה של 293T תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
4. טרנספקציה רטרו-וירוס (יום 3)
- בצינור של 1.7 מ"ל, יש לערבב 470 μL של מדיית סרום מופחתת עם 30 μL של מגיב טרנספקציה.
הערה: עיין בטבלת החומרים עבור המדיה המופחתת הספציפית של הסרום ומגיב הטרנספקציה שבהם נעשה שימוש. - בצינור נפרד של 1.7 מ"ל, הוסף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד pRDF, 3.75 מיקרוגרם של פלסמיד Pegpam3, ו-2.5 מיקרוגרם של מבנה CAR בווקטור SFG לתוך מדיית הסרום המופחתת, כך שהנפח הסופי הוא 500 μL.
- ערבבו את הפתרונות בשלבים 4.1 ו-4.2.
- לדגור את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- הוסיפו 1 מ"ל מהתערובת משלב 4.4 עד 293T צלחת תאים ביום הראשון בצורה טיפתית.
- דגרו את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48-72 שעות.
5. ציפוי צלחת רטרונקטין (יום 3)
- דילול חלבון רטרונקטין עם פוספט תמיסת מלח (PBS) לריכוז סופי של 50-100 מיקרוגרם למ"ל.
- הוסף 500 μL של retronectin מדולל לתוך כל באר של צלחת 24 באר לא מטופלת (5 בארות לכל מבנה CAR). אוטמים את הצלחת באמצעות פרפילם ודוגרים את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
6. התמרה (יום 4)
- צנטריפוגה צלחת retronectin ב 2103 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט.
- חסום כל באר של צלחת 24 באר עם 1 מ"ל של R-10 בינוני.
- לדגור את הצלחת ב 37 °C עם 5% CO2 במשך 1 שעות.
- מחממים מראש את הצנטריפוגה ל-32 מעלות צלזיוס בזמן שצלחת הרטרונקטין נחסמת.
- אסוף את הרטרו-וירוס על-ידי סינון תאי 293T שעברו טרנספקציה באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר.
- Aliquot 2 מ"ל של supernatant רטרווירוס מסונן לתוך כל באר.
- צנטריפוגה צלחת 24 באר ב 2103 x גרם במשך 2 שעות ב 32 מעלות צלזיוס.
- במהלך צנטריפוגה של צלחת, אספו את תאי ה-PBNK המורחבים מיום 0 וספרו את התאים באמצעות Trypan Blue.
הערה: המשך להרחיב את תאי ה-PBNK על-ידי הוספת מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ננוגרם/מ"ל). - דלל את תאי ה-PBNK המורחבים עם מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ng/mL) ל-2.5 x 10 5-5 x 10 5 תאים/מ"ל (0.5x 10 6-10 6 תאים לכל באר).
הערה: רשום את מספר התא הכולל, את הכדאיות ושמור 5 x 10 5 תאי PBNKמורחבים עבור ציטומטריה של זרימה מכיוון שערכים אלה חשובים בקביעת קצב התפשטות תאי NK. - לאחר צנטריפוגה, שאפו באופן חלקי את הרטרו-וירוס סופרנאטנט מכל באר.
הערה: אל תשאף לחלוטין, כלומר, להשאיר כ 100 μL של supernatant retrovirus לכל באר, כמו זה יקטין את יעילות ההתמרת. - Aliquot 2 מ"ל של תאי PBNK מורחבים מדוללים משלב 6.8 לכל באר.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 600 x גרם במשך 10 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך 48-72 שעות.
הערה: אין להשתמש בצלחת.
7. איסוף תאי CAR-NK (יום 6 או 7), כפי שמוצג באיור 2.
- לאסוף בעדינות את התאים מצלחת 24 באר ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל
הערה: נסה לא ליצור בועות, מכיוון שהדבר יביא לירידה בכדאיות התא. - צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות.
- השהה את הכדור עם 1 מ"ל של מדיה R-10 וספור את התאים באמצעות Trypan Blue.
הערה: שמור 5 x 105 תאים עבור ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את יעילות ההתמרות. - העבירו את התאים שעברו החייאה לצלחת מיוחדת בעלת 6 בארות המכילה 30 מ"ל של מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ננוגרם/מ"ל).
- דגרו את צלחת 6 הבארות המיוחדת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- החלף את מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו- IL-15 (5 ננוגרם/מ"ל) כדי לשמור על תאי NK כל 3-4 ימים.
הערה: שמור על פחות מ- 20 x 106 תאים לכל באר להרחבה נוספת בכל שינוי. לקבלת הכדאיות הטובה ביותר, ודא שמספר התא הכולל בכל באר אינו עולה על 100 x 106 תאים . - רשום את מספר התא הכולל, את הכדאיות ובצע ציטומטריה של זרימה כל 3-4 ימים כדי לחשב את קצב ההתרחבות של תא NK.
- השתמש בתאים למבחני in vitro או in vivo מתאימים.
הערה: ה- ex vivo הרחיב את ה- PBNK, ותאי CAR-NK ניתנים לתרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 4 שבועות. - בדוק את מספר תא ה-NK ואת טוהר היום 7, יום 11, יום 14, יום 18 ויום 21 על ידי ציטומטריה של זרימה.
Representative Results
תהליך עבודה סכמטי של בידוד תאי NK החודרים לרקמות והרחבת תאי PBNK באמצעות מתודולוגיית תאי ההזנה 221-mIL-21 מוצגת באיור 1 ובאיור 2. תאי PBNK מורחבים נאספו כל 3 או 4 ימים עבור ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את טוהר תאי ה-NK על ידי צביעת תאים עם CD56 אנטי-אנושי ו-CD3 אנטי-אנושי. הניסוי חזר על עצמו באמצעות שני תורמים שונים כדי להראות את יכולת השכפול של מערכת ההרחבה (איור 3). הודגם כי תאי PBNK שהורחבו ב-221-mIL-21 מתרחבים כמעט פי 5 × 104 (איור 3A). יתר על כן, טוהר תאי ה-NK נשמר היטב, כ-85% במהלך ההתרחבות בת 21 הימים (איור 3B). באמצעות מערכת הרחבת תאי ההזנה 221-mIL-21, טוהר תאי ה-NK נע באופן עקבי בין 85%-95%, ללא תלות בתורמים (הנתונים לא מוצגים). כדי להדגים את החוסן של מערכת ההתפשטות 221-mIL-21, PBMCs הוכתמו עבור אנטי-CD56 ואנטי-CD3 לפני ההתפשטות, שהראו טוהר תאים של 7.09% עבור תאי NK ואחוז גבוה של תאי T (איור 4A). PBMCs עברו בחקלאות משותפת עם 221-mIL-21 להרחבת תאי NK; טוהר ה-NK נבדק לפני התמרת CAR-NK ביום 4 (איור 4A). תאי CAR-NK נאספו והוכתמו עבור אנטי-CD56, אנטי-CD3 ואנטי-hIgG(H+L) F(ab')2, שהראו אוכלוסיית תאי NK גבוהה (86.9% ביום 7) ויעילות התמרת CAR גבוהה של כ-70% (איור 4). יעילות התמרה גבוהה יותר (עד 95%) נצפתה גם באמצעות מערכת האריזה רטרו-וירוס. בסך הכל, נתונים אלה מראים כי תאי ההזנה של 221-mIL-21 יכולים להרחיב בהצלחה את תאי ה-NK ולשמר את טוהר תאי ה-NK ex vivo.
איור 1: דיאגרמה של התפשטות תאי NK מדגימות איברים אנושיים מוצקים. בקצרה, דגימות הכבד האנושי המתקבלות נטחנו לקוביות קטנות לעיכול מכני. לאחר מכן מבודדים תאים מנותקים באמצעות סיליקה מצופה PVP ומדיה להפרדת לימפוציטים. יתר על כן, תאי ה-NK מורחבים באמצעות פרוטוקול ההרחבה המתואר באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זרימת עבודה סכמטית של ייצור תאי CAR-NK מ-PBMCs. בקצרה, תאי הזנה של 221-mIL21 הוקרנו ב-100 Gy לפני ההתרבות עם PBMCs בתוספת IL-2 ו-IL-15 ביום 0. במקביל, תאי 293T עברו טרנספקציה עם מערכת האריזה של רטרו-וירוס כדי לייצר רטרו-וירוס CAR שהומר לאחר מכן לתאי ה-PBNK המורחבים בנוכחות IL-2 ו-IL-15. תאי CAR-NK ראשוניים נקטפו ביום 7 והמשיכו להתרחב במשך 21 יום. נתון זה שונה מ- Yang et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: התרחבות דינמית בהילוך מהיר של תאי PBNK. (A) קיפול הרחבה של PBNK במהלך קורס של 22 יום. התאים הוכתמו באנטי-CD56 ובאנטי-CD3 בימים שצוינו עבור ציטומטריה של זרימה. המספר הכולל של תאי NK נקבע על ידי הכפלת טוהר תאי NK למספר התאים הכולל. קצב ההתפשטות נוצר באופן הבא: (מספר תאי NK)Tn/(מספר תאי NK)T0, כאשר מספר תאי NK = (אחוז טוהר תאי NK) × (מספר התאים הכולל), T 0 הוא מספר תאי ה-NK ביום0, ו-Tn הוא מספר תאי ה-NK ביום הזמן n. (B) טוהר תאי ה-NK במהלך קורס של 22 יום. הרחבת תא ה-NK חזרה על עצמה פעמיים עם שני תורמים שונים. קווי שגיאה מייצגים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח ציטומטרי מייצג של זרימה של תאי CAR-NK. (A) חלקות נקודה מייצגות המציגות את קיטועי הזמן הדינמיים של טוהר תאי NK של תאי CAR-NK במהלך קורס של 18 יום. ניתוח ציטומטריה של זרימה הוערך על ידי צביעת התאים באנטי-CD56 ואנטי-CD3 בנקודות הזמן שצוינו. יום 0 מציין התרחבות מוקדמת של PBNK. יום 4 מציין לאחר התרחבות של PBNK וטרום התמרה של תאי CAR-NK. יום 7 מציין את ההתמרות שלאחר ההמרה של תאי CAR-NK. (B) חלקות נקודה מייצגות המציגות את יעילות ההתמרה של תאי CAR-NK באמצעות מערכת האריזה רטרו-וירוס. התאים הוכתמו באנטי-CD56, אנטי-CD3 ואנטי-hIgG(H+L) F(ab')2 עבור ציטומטריה של זרימה. (C) עלילות נקודה מייצגות המציגות את ביטוי ה-CAR בתת-קבוצות שונות, כולל CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ ו-CD56-CD3 ביום ה-18. התאים הוכתמו באנטי-CD56, אנטי-CD3 ואנטי-hIgG(H+L) F(ab')2 (המציין ביטוי CAR) עבור ציטומטריה של זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
רוב מוצרי CAR-NK הנוכחיים בניסויים קליניים משתמשים בקווי תאי NK 17, כגון NK-92, קו תאים שבודד מחולה לימפומה שאינו הודג'קין18, NK-92MI, IL-2 עצמאי NK-92 קו תאים19, ו- NKL, מבודד מחולה לימפוציטים גרעיניים גדול20, מכיוון שקווי תאים אלה מתרבים בקלות עבור מוצרי 'מדף'. עם זאת, קווי תאים אלה, למשל תאי NK-92, הם בעלי יעילות קלינית שולית והתרחבות in vivo, מכיוון שהם דורשים הקרנה לפני העירוי, ובכך מגבילים את התפשטותם ואת ציטוטוקסיותם in vivo21. בהתחשב בסיבות אלה, אסטרטגיות שונות נבחנות כיום להרחבת תאי NK ראשוניים ממספר מקורות, כולל דם היקפי, CB, מח עצם (BM), תאי גזע עובריים אנושיים (HSCs), תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ורקמות גידול 21,22,23. לדוגמה, ניתן להרחיב את תאי ה-NK באמצעות אינטרלוקינים הכוללים IL-15, IL-18 ו-IL-21. קווי תאים לימפובלסטואידיים כגון תאי K562 או קווי תאי לימפובלסטואיד שעברו טרנספורמציה של וירוס אפשטיין-בר כגון 721.221 תאים, משמשים גם להרחבת תאי NK16. עם זאת, האסטרטגיות הנ"ל יוצרות לעתים קרובות מספר לא מספיק של תאי NK להעברה מאמצת של אימונותרפיה CAR-NK22,24. כדי לסייע בפתרון הבעיה, המחקר כאן מראה פרוטוקול להרחבת תא ex vivo NK באמצעות קו תאים מותמר EBV מהונדס גנטית, 221-mIL-21 תאים מזינים.
מתודולוגיית ההרחבה באמצעות תאי הזנה 221-mIL-21 המוצגת בפרוטוקול זה ממוטבת להרחבת תאי NK עם קצב התפשטות של לפחות פי 10 עד פי 100 מקווי תאי לוקמיה אחרים, כולל HL-60 ו- OCl-AML3 המבטאים ממברנה IL-21, K562 ו- K652-mIL21 המבטאים ליגנדOX40 22,24,25. ביטוי CAR מוערך גם במשך כשבועיים ex vivo. באופן משמעותי יותר, ניתן ליישם את אסטרטגיית הרחבת תאי ההזנה של 221-mIL-21 כדי להרחיב תאי NK ממקורות שונים, כולל PBMCs, CB ואיברים מוצקים כגון הכבד, ללא שלב העשרת NK ראשוני. למרות שמערכת ההזנה 221-mIL-21 אינה תלויה בתורמים כמו קווי תאי ההזנה שהוזכרו לעיל, היא אינה עצמאית לחלוטין מתורמים. בממוצע, מערכת ההרחבה של 221-mIL-21 יכולה להשיג 90% מטוהר תאי NK עם מספר תאי NK גבוה, עם כ-<5% מזיהום תאי T ביום 14 לאחר ההתרחבות. לכן, כדי למנוע את האפשרויות של זיהום תאי T, יש צורך לבודד תאי NK מדגימות שהתקבלו לפני הרחבת ex vivo או להשתמש במערכת בחירה CD3+ כדי לחסל תאי T לאחר הרחבת ex vivo.
אחת הביקורות בשימוש במערכת הרחבת תאי NK היא שייתכן שתאי ההזנה לא חוסלו לחלוטין לאחר ההרחבה או לפני עירוי, מה שעשוי להיות בעל חששות רגולטוריים משמעותיים; לכן, חיסול מוחלט של תאים מזינים לפני עירוי הוא חיוני. עם זאת, ניסויים קליניים אחרונים של CAR-NK בהם נעשה שימוש בתאי הזנה K562-mIL21-4-1BBL להרחבת תאי ex vivo CBNK24,25 לא הראו סיבוכים מדאיגים. יתר על כן, הנתונים הראשוניים שלנו הראו ירידה הדרגתית של אוכלוסיית 221-mIL-21 המוקרנת ככל שההתרחבות התקדמה (נתונים לא מוצגים). עם זאת, נדרשים מחקרים מקיפים יותר כדי ששיטת הרחבה זו תיושם במסגרת קלינית. באופן קולקטיבי, מערכת ההרחבה 221-mIL-21 מסייעת לפתור את האתגר של הרחבת תאי CAR-NK ראשוניים, ולכן תתרום באופן משמעותי לשימוש נרחב יותר באימונותרפיה מבוססת תאי CAR-NK בעתיד הקרוב.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי מעבדת ליו (ד"ר הסיאנג-צ'י טסנג, ד"ר שונינג וואנג וד"ר צ'יה-הסיונג צ'ן) על הערותיהם על כתבי היד. ברצוננו להודות לד"ר ג'אנפיטרו דוטי על וקטורי ה-SFG ולד"ר אריק לונג על 721.221 התאים. עבודה זו נתמכה בחלקה מ- HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) ו- Rutgers-Health Advance Funding (תוכנית NIH REACH), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti ו- R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu), ומימון סטארט-אפ של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ראטגרס-ניו ג'רזי עבור מעבדת D. Liu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A.
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
