Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تجميع درجة الحرارة التي تسيطر عليها وتوصيف ثنائي واجهة قطرة

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

يفصل هذا البروتوكول استخدام نظام تسخين يتم التحكم في درجة حرارته لتعزيز تجميع الطبقة الأحادية الدهنية وتشكيل طبقة ثنائية واجهة القطيرات للدهون ذات درجات حرارة ذوبان مرتفعة ، وقياسات السعة لتوصيف التغيرات التي تحركها درجة الحرارة في الغشاء.

Abstract

طريقة ثنائية الطبقة واجهة القطيرات (DIB) لتجميع الطبقات ثنائية الدهون (أي DIBs) بين قطرات مائي مطلي بالدهون في النفط يوفر فوائد رئيسية مقابل أساليب أخرى: DIBs مستقرة وطويلة الأمد في كثير من الأحيان ، يمكن ضبطها بشكل عكسي ، ويمكن التحكم بسهولة في عدم تناسق المنشورات عبر التراكيب القطيرة ، ويمكن الحصول على شبكات تشبه الأنسجة من الطبقات الثنائية عن طريق العديد من القطرات المجاورة. تشكيل DIBs يتطلب التجميع التلقائي من الدهون في monolayers الدهون عالية الكثافة على أسطح قطرات. في حين أن هذا يحدث بسهولة في درجة حرارة الغرفة للدهون الاصطناعية الشائعة ، فإن طبقة أحادية كافية أو طبقة ثنائية مستقرة تفشل في التشكل في ظروف مماثلة للدهون مع نقاط انصهار فوق درجة حرارة الغرفة ، بما في ذلك بعض مقتطفات الدهون الخلوية. وقد حد هذا السلوك على الأرجح من تكوينات - وربما الصلة البيولوجية - ل DIBs في دراسات الأغشية النموذجية. لمعالجة هذه المشكلة ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي لتسخين خزان النفط الذي يستضيف قطرات DIB بعناية وتوصيف آثار درجة الحرارة على غشاء الدهون. على وجه التحديد، يظهر هذا البروتوكول كيفية استخدام لاعبا اساسيا الألومنيوم موصل حراريا وعناصر التدفئة المقاومة التي تسيطر عليها حلقة التغذية المرتدة لوصف درجات حرارة مرتفعة، مما يحسن تجميع أحادي الطبقة وتشكيل طبقة ثنائية لمجموعة أوسع من أنواع الدهون. يتم قياس الخصائص الهيكلية للغشاء ، وكذلك انتقالات المرحلة الحرارية من الدهون التي تتألف من الطبقة الثنائية ، من خلال قياس التغيرات في السعة الكهربائية للبنك. معا، يمكن أن يساعد هذا الإجراء في تقييم الظواهر الفيزيائية الحيوية في الأغشية النموذجية على درجات حرارة مختلفة، بما في ذلك تحديد درجة حرارة ذوبان فعالة(TM)لخليط الدهون متعدد المكونات. وبالتالي فإن هذه القدرة ستسمح بتكرار أقرب لتحولات المرحلة الطبيعية في أغشية النموذج وتشجع على تكوين واستخدام أغشية نموذجية من رقعة أوسع من مكونات الأغشية، بما في ذلك تلك التي تلتقط بشكل أفضل عدم تجانس نظيراتها الخلوية.

Introduction

الأغشية الخلوية هي حواجز نفاذية بشكل انتقائي تتألف من الآلاف من أنواع الدهون1والبروتينات والكربوهيدرات والستريول التي تغلف وتقسم جميع الخلايا الحية. فهم كيفية تأثير تكويناتها على وظائفها والكشف عن كيفية تفاعل الجزيئات الطبيعية والاصطناعية مع الأغشية الخلوية والتمسك بها وتعطيلها ونقلها هي ، لذلك ، مجالات مهمة من الأبحاث ذات الآثار واسعة النطاق في البيولوجيا والطب والكيمياء والفيزياء وهندسة المواد.

هذه الأهداف لاكتشاف تستفيد مباشرة من تقنيات ثبت لتجميع والتلاعب، ودراسة الأغشية النموذجية - بما في ذلك الطبقات ثنائية الدهون تجميعها من الدهون الاصطناعية أو التي تحدث بشكل طبيعي - التي تحاكي تكوين وهيكل وخصائص النقل من نظرائهم الخلوية. في السنوات الأخيرة، وقد تلقى ثنائي الطبقة واجهة قطرة (DIB) طريقة2،3،4 لبناء ثنائي الطبقة الدهنية بلانار بين قطرات الماء المغلفة بالدهون في النفط اهتماما كبيرا5،6،7،8،9،10،11،2 12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23، وقد أظهرت مزايا عملية على النهج الأخرى لتشكيل غشاء النموذج: طريقة DIB بسيطة الأداء ، لا يتطلب أي تصنيع أو إعداد متطور (على سبيل المثال، "اللوحة") من الركيزة لدعم الغشاء، تسفر باستمرار الأغشية مع متفوقة طول العمر، ويسمح لقياسات الكهربية القياسية، ويبسط تشكيل الأغشية النموذجية مع التراكيب منشور غير المتماثلة3. لأن ثنائي الطبقات أشكال عفويا بين قطرات ويمكن تصميم كل قطرة في الموقف والماكياج، وقد اجتذبت تقنية بنك الاستثمار الإسلامي أيضا اهتماما كبيرا في تطوير أنظمة المواد المستوحاة من الخلايا التي تبني على استخدام الأغشية المتجاوبة مع المحفزات18و24و25و26و27و28و2829، تقسيم متوازن ونقل14،30،31، ومواد تشبه الأنسجة17،23،32،33،34،35،36.

أجريت غالبية التجارب المنشورة على أغشية نموذجية، بما في ذلك تلك التي تحتوي على ثنائي الفينيل متعدد المستويات، في درجة حرارة الغرفة (RT، ~20-25 درجة مئوية) ومع عدد قليل من الدهون الاصطناعية (على سبيل المثال، DOPC، DPhPC، الخ). تحد هذه الممارسة من نطاق الأسئلة الفيزيائية الحيوية التي يمكن دراستها في الأغشية النموذجية ، وبناء على الملاحظة ، يمكن أن تحد أيضا من أنواع الدهون التي يمكن استخدامها لتجميع ثنائيات الفينيل متعددة الدهون. على سبيل المثال، الدهون الاصطناعية مثل DPPC، التي لديها درجة حرارة ذوبان 42 درجة مئوية، لا تجمع monolayers معبأة بإحكام أو شكل DIBs في RT37. وقد ثبت أيضا تشكيل DIB في درجة حرارة الغرفة من الصعب على المستخلصات الطبيعية، مثل تلك من الثدييات (على سبيل المثال، استخراج الدهون مجموع الدماغ، BTLE)38 أو البكتيريا (على سبيل المثال، اسشيريتشيا القولونية مجموع استخراج الدهون، ETLE)37،والتي تحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الدهون وتنشأ من الخلايا التي تتواجد في درجات حرارة مرتفعة (37 درجة مئوية). وبالتالي فإن دراسة التركيبات المتنوعة تتيح فرصا لفهم العمليات التي يتم التوسط فيها بالأغشية في الظروف ذات الصلة بيولوجيا.

رفع درجة حرارة الزيت يمكن أن يخدم غرضين: أنه يزيد من حركية التجمع أحادي الطبقة ويمكن أن يسبب الدهون للخضوع لعملية انتقال ذوبان للوصول إلى مرحلة اضطراب السائل. كلا العواقب المساعدة في تجميع أحادية الطبقة39، وهو شرط مسبق لDIB. بالإضافة إلى التدفئة لتشكيل ثنائي الطبقة ، يمكن استخدام تبريد الغشاء بعد التشكيل لتحديد التحولات الحرارية في ثنائيات الدهون المفردة38، بما في ذلك تلك الموجودة في مخاليط الدهون الطبيعية (على سبيل المثال ، BTLE) التي يمكن أن يكون من الصعب اكتشافها باستخدام قياس السعرات الحرارية. وبصرف النظر عن تقييم التحولات الحرارية من الدهون، يمكن استخدام تغيير درجة حرارة DIB بدقة لدراسة التغيرات الناجمة عن درجة الحرارة في هيكل الغشاء38 ودراسة كيفية تأثير تكوين الدهون وسيولة على حركية الأنواع النشطة في الأغشية (على سبيل المثال، الببتيدات تشكيل المسام والبروتينات عبر الدهون37)،بما في ذلك الأغشية نموذج الثدييات والبكتيريا في درجة حرارة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (37 درجة مئوية).

وفي هذه العبارة، سيتم شرح وصف لكيفية تجميع خزان نفط معدل من نوع DIB وتشغيل وحدة تحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة لتمكين تجميع الطبقة الأحادية وتكوين طبقة ثنائية في درجات حرارة أعلى من RT. تتميز عن البروتوكول السابق40، يتم تضمين تفاصيل واضحة بشأن دمج الأجهزة اللازمة لقياس درجة الحرارة والتحكم فيها بالتوازي مع تجميع وتوصيف DIB في خزان النفط. وبالتالي فإن الإجراء سيمكن المستخدم من تطبيق هذه الطريقة لتشكيل ودراسة ثنائيات الفينيل متعددة التخصصات عبر مجموعة من درجات الحرارة في سياقات علمية متنوعة. وعلاوة على ذلك، تقدم النتائج التمثيلية أمثلة محددة لأنواع التغيرات القابلة للقياس في كل من هيكل الغشاء والنقل الأيوني التي يمكن أن تحدث مع تنوع درجة الحرارة. هذه التقنيات هي إضافات هامة للعديد من الدراسات الفيزيائية الحيوية التي يمكن تصميمها وتنفيذها بفعالية في DIBs ، بما في ذلك دراسة حركية الأنواع النشطة في الأغشية في تكوينات أغشية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لاعبا اساسيا ساخنة

  1. جمع 2 قطعة من المطاط العازل 1 ملم سميكة قلصت إلى 25 ملم × 40 ملم في العرض والطول، على التوالي، 2 قطعة من المطاط 6 مم سميكة التي هي أيضا 25 ملم × 40 ملم، والتجمع قاعدة الألومنيوم جاهزة لاعبا اساسيا، وخزان النفط الاكريليك الذي يناسب في نافذة عرض لاعبا اساسيا قاعدة الألومنيوم (انظر الأرقام S1، S2، و S3 للحصول على تفاصيل حول تلفيق وعرض انفجرت من التجمع). إعداد لاعبا اساسيا الألومنيوم أولا عن طريق إرفاق إلى الجزء السفلي من لاعبا اساسيا نافذة عرض غطاء الزجاج مع لاصق UV قابل للشفاء والتمسك 1 عنصر التدفئة المقاومة إلى الجزء العلوي من كل 25 ملم × 25 ملم شفة الجانب من لاعبا اساسيا.
  2. ضع القطع المطاطية الرقيقة على خشبة مسرح المجهر بحيث تكون الحافة الطويلة لكل قطعة عرضية لفتح المرحلة كما هو موضح في(الشكل 1).
  3. ضع القاعدة الألومنيوم لاعبا اساسيا على رأس منصات عازلة مع نافذة عرض لاعبا اساسيا تركزت فوق العدسة الهدف. مطلوب محاذاة مناسبة لتصوير قطرات متصلة.
  4. ضع قطعة مطاطية أكثر سمكا فوق كل عنصر تدفئة مقاوم واستخدم مقطع مرحلة المجهر لعقدها في مكانها. هذه القطع حماية عناصر التدفئة من التلف الناجم عن مقاطع المرحلة وعزل ضد التقصير الكهربائية العرضية بين عناصر التدفئة وكلا لاعبا اساسيا الألومنيوم ومرحلة المجهر.
  5. ثني بعناية قياس نهاية الحرارية لتحقيق زاوية 90 درجة في ~ 4 ملم من النهاية.
  6. إدراج طرف عازمة من الحرارية في الزاوية اليسرى السفلى من لاعبا اساسيا الألومنيوم وتأمين بلطف مع المسمار قفل.
  7. وضع خزان الاكريليك في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم. ويتم ذلك قبل إضافة زيت الهيكساديكان إلى البئر (الخطوة 1.8) من لاعبا اساسيا الألومنيوم لتقليل خطر محاصرة فقاعات الهواء بين نافذة العرض وأسفل خزان الاكريليك، والتي يمكن أن تعوق وجهة نظر قطرات.
    ملاحظة: يستخدم الزيت المضاف إلى حجرة العرض في زاوية الألومنيوم لمطابقة المؤشرات الانكسارية للأكريليك والزجاج للحصول على تصوير أوضح للقطرات الموجودة داخل خزان الأكريليك. وبالتالي، تجدر الإشارة إلى أن النفط في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم لا يتصل محتويات خزان الاكريليك وتنظيف دقيق من لاعبا اساسيا الألومنيوم ليست مطلوبة.
  8. الاستغناء ~ 1000 ميكرولتر من زيت الهيكساديكان في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم (أي بين جدران خزان الاكريليك ولاعبا اساسيا الألومنيوم) ، مع الحرص على عدم الملء الزائد. يجب أن يكون مستوى الزيت في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم عالية كما هو ممكن لتحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية لنقل الحرارة، مع عدم السماح للنفط لتسرب على حواف لاعبا اساسيا على مرحلة المجهر أو عدسة الهدف.
  9. الاستغناء ~ 1000 ميكرولتر من زيت الهيكساديكان في خزان الاكريليك ، مع الحفاظ على الذهن لعدم الملء الزائد.
    ملاحظة: يجب تنظيف خزان الأكريليك دائما بشكل شامل بين التجارب. يجب على المستخدم توظيف فوج يتكون من شطف متتالية مع الكحول الإيثيلي والمياه deionized تليها التجفيف في وعاء مجفف لأكثر من 12 ساعة.

Figure 1
الشكل 1: مرحلة ساخنة التجمع. تظهر الصور تجميع التركيبة الموصلة حراريا وخزان النفط لتشكيل DIB؛ تحدد الأرقام الموجودة أسفل كل صورة الخطوة المقابلة للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الأجهزة للتحكم في درجة الحرارة ردود الفعل في وقت واحد والتوصيف الكهربائي من DIB

ملاحظة: يدمج هذا البروتوكول الأدوات التالية لتمكين التحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة والتوصيف الكهربائي المتزامن ل DIB: كمبيوتر شخصي (PC) مع اتصالين عالميين متاحين للحافلات التسلسلية (USB) ، ومكبر للصوت المشبك التصحيحي مقترن بنظام مخصص للحصول على البيانات (DAQ-1) ، ومولد شكل موجي ، وDAQ قابل للبرمجة الثاني (DAQ-2) مع إخراج الجهد ووحدات إدخال درجة الحرارة ، وإمدادات الطاقة / مكبر الصوت. تصف الخطوات التالية الوصلات الضرورية لهذه الأدوات (كما هو موضح في الشكل 2 أ)اللازمة لعزل قياس درجة الحرارة والتحكم فيها من الفيزيولوجيا الكهربية المتزامنة في DIB. ويمكن إجراء تبديلات للصكوك المكافئة حسب الاقتضاء.

  1. إنشاء اتصالات الإخراج والإدخال إلى الوحدات النمطية DAQ-2.
    1. حدد اثنين من أزواج من المحطات المسمار على وحدة إخراج الجهد لاتصالات الجهد التفاضلي وإرفاق الأسلاك يؤدي إلى هذه المواقع. عدد المحطات الفردية هي وصلات أرضية مشتركة، والمحطات حتى عدد هي النواتج لا أساس لها، كما هو مبين في(الشكل 2C). قم بتوصيل كل من هذين الزوجين من أسلاك الرصاص لفصل محولات المسمار الطرفية BNC ثم قم بتوصيل كل محول بكابل BNC منفصل يستخدم لتوجيه إشارات الجهد إلى أجهزة أخرى.
      ملاحظة: في هذا الإعداد، يتم تعيين الاتصالات التفاضلية في المحطتين 0 و1 لإخراج التحكم في درجة الحرارة إلى مكبر الصوت، في حين يتم تعيين زوج آخر من الاتصالات في المحطتين 6 و 7 لإخراج الجهد ليتم إرسالها إلى قطرات عبر مكبر للصوت المشبك التصحيح.
    2. في إشارة إلى (الشكل 2c)، حدد مجموعة واحدة من محطات الترمو المزدوج (على سبيل المثال، يتم تعيين المحطتين 2 و 3 كزوج TC1) على وحدة الإدخال الحرارية والاتصال به الأسلاك الحرارية.

Figure 2
الشكل 2: اتصالات أسلاك النظام. يظهر تخطيطي للأجهزة والأسلاك المطلوبة للنظام في (أ) ، بينما يتم توفير نظرة مفصلة على اتصالات DAQ-2 في (ب). يبين الرسم التوضيحي في (ج) قطرات مائية على أقطاب كهربائية مغلفة بالهيدرجيل مغمورة في الزيت لتشكيل DIB. يتم توصيل القطبين إلى اتصالات على الأرض وغير أساسها (V +) ، على التوالي ، على وحدة headstage من مكبر للصوت المشبك التصحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. بعد إجراء اتصالات كهربائية بوحدات DAQ-2، قم بتوصيل هيكل DAQ-2 بجهاز كمبيوتر عبر اتصال USB والاتصال بمصدر طاقة كهربائية. ثم تأكد من نجاح برنامج التشغيل وتثبيت البرامج قبل استخدامها مع برنامج تجاري.
  2. تكوين وتوصيل مكبر للصوت الطاقة بين DAQ-2 وعناصر التدفئة المقاومة.
    1. تكوين مكبر للصوت للعمل في وضع تضخيم ثابتة الكسب مع مكسب 10X.
    2. باستخدام محول مقبس الموز BNC، قم بتوصيل كابل BNC الناشئ من المحطتين 0 و1 على وحدة إخراج الجهد(الشكل 2b)باتصالات الإدخال على مكبر الصوت.
    3. باستخدام محولات BNC إضافية وكابلات، قم بتوصيل محطات إخراج مكبر الصوت بالطاقة بكلتا المجموعتين من عناصر التدفئة، والتي يتم توصيلها بالتوازي مع بعضها البعض ومكبر للصوت لضمان أن كلا العنصرين يحافظان على نفس انخفاض الجهد أثناء الاستخدام.
  3. إنشاء الاتصالات اللازمة لمعدات الفيزيولوجيا الكهربية.
    1. توصيل كابل BNC الناشئة من المحطتين 6 و 7 على وحدة إخراج الجهد(الشكل 2B)إلى موصلات BNC القيادة الخارجية تبديل الخلفي على الجزء الخلفي من مكبر للصوت المشبك التصحيح.
    2. قم بتوصيل كابل BNC ثان بين مخرجات مولد شكل الموجة واتصال الأوامر الخارجية لمفتاح الأمام في الجزء الخلفي من مكبر الصوت المشبك التصحيحي.
      ملاحظة: توفر هاتان التوصيلتان طرقا بديلة لتوليد أشكال موجية للجهد يتم تطبيقها على أقطاب القطرة عبر مكبر الصوت المشبك التصحيحي. مولد الموجي مفيدة بشكل خاص لتوليد الفولتية الموجي الثلاثي المستخدمة لقياس سعة الغشاء. قد يقرر المستخدم أيهما، إذا كان ضروريا لتطبيقه الخاص.
    3. مع كابل BNC الثالث، قم بتوصيل إخراج التيار المقاس الموجود على اللوحة الأمامية لمكبر المشبك التصحيحي بموصل BNC إدخال تمثيلي متاح على الجزء الأمامي من DAQ-1.
    4. مع كابل BNC الرابع، قم بتوصيل مخرج جهد الغشاء المقاس (في الجزء الخلفي من مكبر الصوت المشبك التصحيحي) بموصل إدخال تمثيلي منفصل على DAQ-1. وهذا يتيح رقمنة الجهد المطبق عبر الأقطاب الكهربائية.
    5. مع اثنين من أقطاب قطرة أعدت ودعمها على micromanipulators كما هو موضح في الخطوات 7-9 فيالمرجع. 40، توصيل القطب يؤدي إلى التصحيح المشبك headstage ، وهو المرفقة عبر كابل إلى مكبر للصوت المشبك التصحيح.
      ملاحظة: دور المسرح الرئيسي هو التحكم في الجهد بين الأقطاب الكهربائية وقياس التيار الناتج ، والذي يتم تحويله إلى جهد نسبي يحصل على الإخراج بواسطة مكبر الصوت المشبك التصحيح إلى DAQ-1.
    6. قم بتوصيل DAQ-1 بجهاز كمبيوتر عبر اتصال USB وتوصيل كبلات إمدادات الطاقة المقابلة بكل من مكبر الصوت المشبك التصحيحي وDAQ-1.
  4. الطاقة على جميع معدات القياس.
    ملاحظة: ربما تكون أهم التفاصيل في هذا الإعداد هي ضمان عزل توصيلات مخرجات مضخم الطاقة (mA-A) كهربائيا من وحدة المسرح الرئيسي لمكبر المشبك التصحيحي، والذي يستخدم دائرة حساسة لقياس تيارات مستوى pA-nA في DIB.

3. التحكم في درجة الحرارة ردود الفعل من ثنائيات واجهة قطرة

ملاحظة: تستند الخطوات التالية لتشغيل نظام التحكم في درجة الحرارة الملاحظات على واجهة مستخدم رسومية مخصصة (GUI) تم إنشاؤها لتنفيذ التحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة النسبية المتكاملة (PI)40،41 (انظر ملفات الترميز التكميلية). يمكن استخدام برامج وخوارزميات تحكم أخرى بدلا من ذلك. يتم توفير نسخة من هذا البرنامج للقارئ مع المعلومات التكميلية للورقة، ولكن المستخدم هو المسؤول عن تكوينه لمعداتهم واحتياجاتهم الخاصة.

  1. بدء تشغيل برنامج DAQ-2 على الكمبيوتر وفتح ملف برنامج التحكم في درجة الحرارة. بمجرد فتح واجهة المستخدم الرسومية، افتح البرنامج مرة أخرى عن طريق النقر على رمز المجلد في الزاوية اليسرى السفلى من واجهة المستخدم الرسومية واختيار برنامج التحكم في درجة الحرارة(الشكل 3).
  2. أدخل القيم العددية المناسبة لتحقيق مكاسب التحكم النسبي(KP)وكسب التحكم المتكامل(KI).
    ملاحظة: تم العثور على قيم KP و KI من 0.598 و 0.00445 على التوالي للعمل بشكل جيد في الإعداد. وقد حددت هذه القيم تكراريا من خلال المحاكاة باستخدام نموذج نظام يتضمن بارامترات تم الحصول عليها من استجابات التدفئة المفتوحة الحلقة المقاسة (انظر الشكل 4). أثناء تدفئة الحلقة المفتوحة، تكون قوة التدفئة الموصوفة مستقلة عن درجة الحرارة المقاسة. وعلى النقيض من ذلك، تتكون التدفئة ذات الحلقة المغلقة من ضبط الطاقة المطبقة باستمرار على السخانات بطريقة تساعد على تقريب درجة الحرارة المقاسة من درجة الحرارة المطلوبة. ويتحقق ذلك هنا باستخدام نظام التحكم PI.
  3. لاختبار نظام التحكم في درجة الحرارة، أدخل درجة حرارة نقطة محددة مرغوبة (فوق درجة حرارة الغرفة) ثم قم بتشغيل التحكم في درجة حرارة الملاحظات داخل واجهة المستخدم الرسومية. مراقبة إشارة درجة الحرارة المقاسة تحت التغذية المرتدة (الحلقة المغلقة) التحكم، والتي يتم عرضها في واجهة المستخدم الرسومية للدقائق القليلة القادمة. إذا كانت درجة الحرارة المقاسة للنفط تتجاوز درجة الحرارة المطلوبة بشكل كبير ، أو تتفاعل ببطء شديد مع التغييرات ، أو تفشل في التقارب مع نقطة المجموعة المطلوبة ، فسيحتاج المستخدم إلى ضبط مكاسب التحكم لتحقيق أداء الحلقة المغلقة المطلوب.
    ملاحظة: يحدد البرنامج حد التشبع للطاقة (وبالتالي الجهد) المقدمة إلى عناصر التدفئة المقاومة. على سبيل المثال، عنصرين ذكرت هنا تستهلك ما يصل إلى 5 واط الطاقة لكل منهما. الأسلاك لهم في موازاة يعني أن إجمالي استهلاك الطاقة لا ينبغي أن يتجاوز 10 واط. ينصح المستخدم بالنظر في الحد الأقصى لكمية الطاقة التي يجب توفيرها للأجهزة ومعرفة أن هذا الحد يمكن أن يؤثر على السرعة التي سيستجيب بها نظام الحلقة المغلقة للتغيرات في درجة الحرارة المطلوبة. عناصر تسخين الطاقة أعلى تمكين التدفئة أسرع وارتفاع درجات الحرارة نقطة مجموعة ولكن تتطلب أعلى التيارات الموردة للتدفئة.
  4. مع ضبطها مع النظام إلى أداء حلقة مغلقة مقبولة، أدخل درجة حرارة الزيت المطلوب لتشكيل بنك الاستثمار الأوروبي كنقطة مجموعة في واجهة المستخدم الرسومية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، درجة حرارة نقطة محددة من 60 درجة مئوية أسفرت عن نتائج جيدة في التجارب مع الليبوسومات BTLE في قطرات مائي37. يشار إلى المستخدم في مكان آخر2،40 لبروتوكولات شرح التجمع DIB بين قطرات معلقة على أقطاب كهربائية من نوع الأسلاك وتكوين معدات الكهربية باستخدام مكبر للصوت المشبك التصحيح ، DAQ - 1 ، وبرنامج قياس الكهربية. وعلى وجه التحديد، يمكن متابعة البروتوكول الذي قدمه نجم وآخرون40 عن كثب حتى الخطوة 13. أبعد من تلك الخطوة، يتم استخدام نهج مختلف قليلا لتشكيل أحادي الطبقة وثنائية الطبقة ناجحة عند استخدام الدهون التي تتطلب التدفئة لتعزيز تشكيل أحادي الطبقة أو ثنائية الطبقات.
  5. خفض نصائح من كلوريد الفضة / الفضة (Ag / AgCl) الأقطاب الكهربائية في النفط حتى أنها ما يقرب من لمس الجزء السفلي من خزان الاكريليك. هذا تحديد المواقع من نصائح القطب أمر بالغ الأهمية للحفاظ على قطرة على القطب في الزيت الساخن، حيث لوحظ التيارات الحمل الحراري في النفط لفصل قطرات من الأقطاب الكهربائية المغلفة هيدروجيل(الشكل 2C).
  6. ماصة قطرة 250 nL من محلول الدهون المائية التي تحتوي على 2 ملغم / مل من BTLE، 100 مللي متر كلوريد البوتاسيوم (KCl)، و 10 M 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS) على كل طرف القطب والسماح لهم احتضان في الزيت الساخن لمدة لا تقل عن 10 دقائق لتعزيز تشكيل أحادية الطبقة.
  7. تغطية headstage ولاعبا اساسيا مرحلة ساخنة مع قفص فاراداي على الارض.
  8. جلب قطرات في اتصال لطيف ببطء
    التلاعب في المواقف الأفقية للأقطاب الكهربائية حتى يرى المستخدم قطرات تشوه من الاتصال أو البدء في تشريد بعضها البعض والانتظار بضع دقائق حتى يبدأ تشكيل طبقة ثنائية. إذا لم تتشكل طبقة ثنائية بعد عدة دقائق ، يمكن إجبار القطرات معا أكثر لتسهيل تكوين طبقة ثنائية. يمكن تأكيد تشكيل طبقة ثنائية رقيقة بين البينية من خلال الفحص البصري(الشكل 5a)أو عن طريق قياس الزيادة في سعة تيار سعة الموجي المربع الناجم عن مولد الموجي الناتجة عن 10 mV، 10 هرتز الجهد الثلاثي22. السماح للمكون ثنائي الطبقات بالتوازن لمدة لا تقل عن 10 دقائق للوصول إلى منطقة ثابتة بين الأعراق ، عند التكوين الأولي وقبل التوصيف اللاحق عند نقطة المجموعة الأولية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون لنوع الزيت تأثير كبير على ترقق الطبقة الثنائية وسماكة الغشاء وزاوية الاتصال بين القطرات. بشكل عام، أصغر جزيء النفط بسهولة أكبر يمكن أن تبقى في قلب الكاره للماء من طبقة ثنائية المحتلة من قبل سلاسل أسيل الدهون. الاحتفاظ بالنفط يزيد من كل من التوترات أحادية الطبقة وسمك ثنائي الطبقات ويقلل من مساحة وزاوية الاتصال بين قطرات. هذه المقاييس تدل على حالة أضعف من الالتصاق. الجزيئات الأكبر حجما والأكبر حجما تمارس التأثير المعاكس. على سبيل المثال، السكوالين هو جزيء أكبر من الألكانات مثل الهيكساديكان، والذي يمكن من استبعاده بسهولة من بين الطبقات الأحادية أثناء ترقق الطبقة الثنائية. على هذا النحو ، DIBs التي تشكلت في السكوالين هي أرق ، فإنها تعرض مناطق اتصال أعلى وزوايا ، وتظهر طاقات حرة أعلى من التكوين22،42 (مقياس للالتصاق قطرة قطرة).

4. توصيف السلوكيات المعتمدة على درجة الحرارة في DIBs

ملاحظة: يمكن دراسة العديد من العمليات الفيزيائية في أغشية النموذج المستندة إلى DIB ، بما في ذلك كيفية تأثير التغيرات في درجة الحرارة على بنية الغشاء وخصائص النقل. يجب تنفيذ الخطوات التالية بعد تشكيل ثنائي الطبقة بنجاح عند درجة الحرارة المطلوبة.

  1. قياس السعة الاسمية للغشاء مع خفض درجة حرارة حمام الزيت من نقطة محددة تسمح بتكوين طبقة ثنائية لتحديد انتقالات المرحلة الحرارية من الدهون في الغشاء38.
    1. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني لدرجة الحرارة على واجهة المستخدم الرسومية ومسح البيانات المعروضة. وهذا يضمن مساحة كافية في المخزن المؤقت متوفرة للتسجيلات اللاحقة.
    2. باستخدام مولد الموجي متصلة مكبر للصوت المشبك التصحيح، وتطبيق الموجي الجهد الثلاثي (على سبيل المثال، 10 mV، 10 هرتز) عبر الأقطاب DIB وتسجيل الاستجابة الحالية المستحثة من خلال طبقة ثنائية.
    3. تبريد طبقة ثنائية عن طريق خفض درجة الحرارة نقطة محددة في 5 درجة مئوية زيادات والانتظار بحد أدنى 5 دقائق في درجة حرارة الدولة ثابتة جديدة بين التغيرات في درجة الحرارة حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المطلوبة. بدلا من ذلك، حاول تبريد ثنائي الطبقة بشكل سلبي عن طريق إيقاف تشغيل نظام التحكم في الملاحظات. كن على علم، مع ذلك، أن التجارب التي تنفذ التبريد السلبي من 50-60 درجة مئوية أسفرت عن ارتفاع معدلات التلاحم.
    4. بعد حمام الزيت وبرد ثنائي الطبقات إلى الحد الأدنى المطلوب لدرجة الحرارة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني لدرجة الحرارة في واجهة المستخدم الرسومية مرة أخرى وتصدير بيانات درجة الحرارة مقابل الوقت إلى برنامج جدول البيانات. إيقاف التسجيل الحالي.
    5. من التيار المقاس، احسب السعة الاسمية للاستجابة الحالية للموجة المربعة مقابل الوقت خلال فترة التبريد.
    6. مؤامرة السعة الاسمية (C) مقابل درجة الحرارة (T) لمراقبة كيفية تغير سعة الغشاء. حدد موقع التغيرات غير الصوتية في C مقابل T لتحديد TM.
      ملاحظة: يمكن حساب السعة الاسمية من سعة الموجة المربعة الحالية43 (| أنا|) استخدام | العلاقة أنا | = C dv/dt، حيث يساوي dv/dt أربعة أضعاف ناتج سعة الجهد (| V|) وتردد (و) من الجهد الثلاثي تطبيقها. من هذه المعادلات، C = | |/(4| V|f).
  2. وبالمثل، تقييم السعة المحددة شبه ثابتة(Cm)من طبقة ثنائية في درجات حرارة ثابتة عن طريق زيادة درجة حرارة حمام الزيت ومنطقة ثنائية الطبقات على التوالي.
    1. تغيير درجة حرارة نقطة تعيين في زيادات 10 درجة مئوية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية والسماح للنظام إلى التوازن إلى درجة الحرارة الجديدة.
      1. تنفيذ الخطوة 4.1.2 لبدء قياس التيار بالسعة والتسجيل.
      2. تغيير منطقة ثنائي الطبقة عن طريق ضبط بعناية مواقف الأقطاب الكهربائية باستخدام المتلاعبين الصغيرة (أي فصل الأقطاب يقلل من منطقة ثنائية الطبقة). السماح للتيار الموجة المربعة للوصول إلى سعة حالة ثابتة وجمع الصور من DIB لتمكين حساب منطقة الغشاء مقابل الوقت باستخدام كاميرا محمولة على المجهر لتصوير طبقة ثنائية كما رأينا من فتحة مرحلة المجهر. في نفس الوقت، إضافة علامة رقمية في برنامج التسجيل الحالي لوضع علامة على نقطة الوقت المقابلة لجمع الصور.
        ملاحظة: تسمح المتلاعبات الدقيقة بالتحكم الدقيق في الأقطاب الكهربائية وبالتالي الاتصال اللطيف بين القطرات. التلاعب الخشن من قطرات يمكن أن يؤدي إلى تجربة فاشلة عن طريق الالتحام من قطرات أو عن طريق التسبب في قطرة لتسقط من القطب. كما تمت مناقشته في مكان آخر22، يتم حساب منطقة ثنائية الطبقة من طول الاتصال بين القطرات ، والتي تظهر كدوائر متداخلة في صورة عرض أسفل. يمكن حساب مواقع وأبعاد القطرات وطول خط الاتصال باستخدام برنامج معالجة الصور أو مع أدوات البرمجة العلمية الأخرى.
      3. كرر الخطوة 4.2.1.2 على الأقل 4 مرات للحصول على ما مجموعه 5 صور DIB ومناطق ثابتة الحالة من تيار ثنائي الطبقة.
    2. كرر الخطوة 4.2.1 في كل درجة حرارة مرغوبة.
    3. عند النقاط الزمنية الموسومة المقابلة لمناطق ثنائية الطبقة الثابتة للصور المكتسبة، قم بتحليل التسجيلات الحالية وصور DIB لاستخراج بيانات C و A لكل درجة حرارة.
    4. رسم C مقابل بيانات لكل درجة حرارة وحساب المنحدر من الانحدار من الدرجة الأولى، والذي يمثل م C من طبقة ثنائية في كل درجة حرارة22.
    5. قيم الرسم ل Cm التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.2.4 مقابل T.
    6. فحص البيانات C m مقابل T للاختلافات غير الرتابة لتحديد درجات حرارة ذوبان، TM.
  3. تقييم ديناميات تشكيل قناة الأيونات التي تعتمد على الجهد عن طريق توليد مدخلات خطوة الجهد dc عبر طبقة ثنائية.
    1. تعيين الجهد الأولي إلى قيمة الخطوة المطلوبة في mV (على سبيل المثال، 100 mV).
    2. تعيين الجهد النهائي وحجم الخطوة إلى قيمة أعلى من الخطوة المطلوبة (على سبيل المثال، 110 mV الجهد النهائي وحجم الخطوة 110 mV).
    3. تعيين مدة زمنية مطلوبة لإدخال الخطوة بالثواني (على سبيل المثال، 90 ثانية).
    4. اختر القطبية المطلوبة لإدخال الخطوة (على سبيل المثال، إيجابي).
    5. تبديل مكبر للصوت المشبك التصحيح لإرسال إلى المسرح الجهد الأمر الناشئة من وحدة الانتاج واجهة المستخدم الرسومية / الجهد.
    6. بدء التسجيلات الحالية.
    7. بدوره على الجهد وتسجيل الاستجابة الحالية المستحثة، والتي ينبغي أن تظهر استجابة على شكل S إلى الجهد الحرج (على سبيل المثال، ~ 70 mV ل1 ميكروغرام / مل Mz في 2 ملغ / مل BTLE).
  4. بشكل منفصل ، يمكن الحصول على علاقات الجهد الحالي الديناميكية للغشاء في درجات الحرارة المطلوبة للكشف عن العلاقات المعتمدة على الجهد ، مثل سلوكيات القناة الأيونية.
    1. تبديل مكبر للصوت المشبك التصحيح لإرسال إلى headstage الجهد الأمر الناشئة من مولد الموجي وبدء التسجيلات الحالية.
    2. على مولد الموجي، إخراج الموجي الجيبي المستمر مع السعة المطلوبة، والإزاحة، والتردد.
    3. تسجيل الاستجابة الحالية المستحثة عبر دورة واحدة أو عدة دورات.
    4. كرر كما هو مطلوب لمختلف السعة موجة جيبي والترددات ودرجات الحرارة.

Figure 3
الشكل 3: واجهة المستخدم الرسومية التحكم في درجة الحرارة. هذا الرقم يسلط الضوء على وتسميات الخطوات الحاسمة المطلوبة لاستخدام واجهة المستخدم الرسومية للبرنامج للسيطرة على درجة حرارة حمام الزيت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 كيف يتم إعداد تجهيزات الألومنيوم وخزان زيت الأكريليك على مرحلة المجهر لتشكيل DIB. تعمل خطوات التجميع 1.2-1.4 على عزل المباراة حراريا عن المسرح للحصول على تدفئة أكثر كفاءة. تظهر الخطوات 1.5-1.7 كيفية إرفاق القسطرة الحرارية بشكل صحيح بالتركيبة ووضع خزان النفط، وتظهر الخطوات 1.8 -1.9 المواقع الموصى بها لتوزيع النفط في هذه القطع.

يوضح الشكل 2 المكونات المستخدمة لإنشاء التحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة وإجراء القياسات الكهربائية على DIB: جهاز كمبيوتر شخصي ، ومكبر صوت ثابت للقوة ، ومكبر للصوت المشبك التصحيحي ونظام DAQ (أو أداة مكافئة لتطبيق التيارات على مستوى pA-nA وقياسها) ، وDAQ ثانية مع مدخلات ونواتج تمثيلية مناسبة ، ومولد موجي ، وعنصر أساسي من الألومنيوم المجمع مع سخانات مقاومة مرفقة. DAQ-2 يجعل استخدام وحدتين(الشكل 2ب). يتم استخدام وحدة إخراج الجهد التناظرية 4 قنوات ±10 V و 16 بت لبدء الجهد المستقل المقدم إلى مدخلات مضخم الطاقة (اتصال أزرق في الشكل 2a)وإدخال الأمر الخارجي على مكبر للصوت المشبك التصحيح (اتصال أخضر). وحدة الانتاج الجهد محدودة من قبل تيار الانتاج الحد الأقصى من 46 م أ والحد الأقصى من الجهد الناتج من 10 V، في حين أن كل عنصر التدفئة المستخدمة هنا يستهلك بقدر 5 واط من الطاقة (~ 180 ماكس م أ) في أقصى جهد من 28 V. لهذا السبب، تم تضمين إمدادات الطاقة / مكبر للصوت لتضخيم ما قبل الجهد الناتج واستكمال التيار الموردة اللازمة لتشغيل عناصر التدفئة (السلكية بالتوازي) تعلق على لاعبا اساسيا الألومنيوم. يستخدم جهاز إدخال حراري 4 قنوات و24 بت لرقمنة قياسات درجة الحرارة من خزان النفط بالقرب من DIB (اتصال أصفر). نظرا لأن وحدة جهاز الإدخال الحرارية تسمح بما يصل إلى 4 درجات حرارية ، فقد يفكر المستخدم في مراقبة درجات الحرارة في مواقع أخرى في المباراة. إذا تم ذلك، فإنها سوف تحتاج أيضا إلى النظر في إشارة أو مزيج من الإشارات التي تستخدم للمقارنة مع درجة الحرارة المطلوبة نقطة مجموعة داخل حلقة التغذية المرتدة.

يتم التحكم في هذه المخرجات والإشارات المقاسة عن طريق برنامجين: 1) واجهة المستخدم الرسومية المخصصة للتحكم في درجة الحرارة؛ 2) واجهة المستخدم الرسومية المخصصة للتحكم في درجة الحرارة؛ 1) واجهة المستخدم الرسومية المخصصة للتحكم في درجة الحرارة؛ 1) واجهة المستخدم الرسومية المخصصة لل و 2) برامج قياس الفيزيولوجيا الكهربية. يظهر الشكل 3 لقطة شاشة ل GUI ويتضمن تعليقات توضيحية للخطوات المقابلة في البروتوكول. يتم استخدام واجهة المستخدم الرسومية لتحديد المعلمات الرئيسية (تعيين درجة حرارة النقطة، مكاسب التحكم PI، حدود الجهد)، مقارنة درجة الحرارة المقاسة لدرجة حرارة نقطة مجموعة وحساب إشارة التحكم الموردة إلى مكبر للصوت ومن ثم عناصر التدفئة، وتسجيل البيانات من درجة الحرارة والجهد التطبيقي مقابل الوقت. ويشمل هذا البرنامج أيضا القدرة على قيادة الجهد المطبق على أقطاب DIB (الشكل 2C) عن طريق مكبر للصوت المشبك التصحيح. وبشكل منفصل، يتم استخدام برنامج القياس لتكوين قياسات لكل من الجهد المطبق على أقطاب DIB والتيارات المستحثة من خلال طبقة ثنائية الدهون. الجهد المتناسب مع تيار DIB هو الناتج عن طريق مكبر للصوت المشبك التصحيح وإرسالها عبر كابل BNC إلى DAQ-1 (اتصال غير مبين).

الشكل 4 يرسم التغير في درجة الحرارة والطاقة الكهربائية المطلقة المرسلة إلى سخانات مقابل الوقت في إطار كل من حلقة مفتوحة ومغلقة حلقة سيناريوهات التدفئة. بالنسبة للسابق ، تم تطبيق جهد إدخال تعسفي مقابل ~ 5.2 W من الطاقة على السخانات ، مما أدى إلى ارتفاع هائل في درجة الحرارة مع ثابت زمني قدره ~ 125 ثانية وحالة ثابتة ΔT ≈ 4.5 درجة مئوية / غربا بعد تأخير أولي قدره ~ 20 ثانية. وقد استخدمت هذه الخصائص لنظام الحلقة المفتوحة لبناء نموذج لنظام الحلقة المغلقة في برنامج محاكاة (انظر الشكل S4 للحصول على تفاصيل) يمكن استخدامه لتحديد القيم لتحقيق مكاسب التحكم النسبية والتكاملية. وبالتالي تمثل استجابات النموذج المغلقة والمحاكاة في الشكل 4 الاستجابات المقاسة والمحاكاة لوحدة التحكم PI المضبوطة، مع KP و KI قيم 0.598 و 0.00445، على التوالي، إلى درجة حرارة نقطة محددة 20 درجة مئوية أعلى من RT. بالمقارنة مع حالة الحلقة المفتوحة، كل من المحاكاة والقياسات تؤكد زيادة سرعة الاستجابة في نظام الحلقة المغلقة (ثابت الوقت ~ 63 ثانية). ويأتي تخفيض وقت التدفئة على حساب ارتفاع الطاقة الأولية المطبقة. ومع ذلك، ظلت درجة الحرارة المحددة المطلوبة ودرجة حرارة الزيت المقاسة في حدود 0.6 درجة مئوية في حالة ثابتة، والتي اعتبرت مناسبة للاستخدام. يقتصر إجمالي الطاقة الموردة داخل البرنامج أثناء التحكم في الحلقة المغلقة حتى لا يحجب الحد الأقصى للطاقة الإجمالية 10 W لسخانين.

تم استخدام نظام التحكم في درجة الحرارة لعرض درجة حرارة الاعتماد على المذيبات في DIB التي تشكلت من الدهون BTLE وتأثيرها على سعة الغشاء (الشكل 5). تم اختيار الدهون BTLE لهذا القياس لأن التدفئة مطلوبة لتشكيل DIB بسبب مرحلة انتقال الدهون التي تحدث بين 35-42 درجة مئوية38. تم تنفيذ البروتوكول الموصوف هنا لبدء تشكيل ثنائي الطبقة عند 60 درجة مئوية. بعد تشكيل الغشاء والتوازن ، يمكن خفض درجة الحرارة أو رفعها على التوالي حسب الحاجة لتوصيف استجابة الغشاء. على سبيل المثال، يظهر الشكل 5a قياسات تمثيلية للتيار السعي الخام (شكل موجي على شكل مربع) ودرجة الحرارة مقابل الوقت خلال دورة التدفئة من RT إلى ~60 درجة مئوية. لاحظ أن سعة الشكل الموجي الحالي السعائي تنخفض بأكثر من النصف مع ارتفاع درجة الحرارة ، وهو ما يسببه امتصاص النفط في قلب الغشاء الكاره للماء. هذا التغيير يثخن واجهة ويغير التوتر الجانبي من طبقة ثنائية22،37،38.

تتغير البيانات في الشكل 5b المستند في C (تطبيعها من قبل السعة في 27 درجة مئوية) مقابل T عبر دورة تبريد التدفئة كاملة واحدة بعد تشكيل ثنائي الطبقة الأولي في 60 درجة مئوية. تماما كما هو الحال في الشكل 5a، مع ارتفاع درجة الحرارة ، تنخفض السعة. ومع ذلك، ما يظهر هذا العرض أكثر وضوحا هي التغيرات غير الصوتية التي تحدث في درجات حرارة بين ~ 30-42 درجة مئوية، والذي يمثل درجة حرارة ذوبان الجماعية، TM، خلالها خليط الدهون التحولات بين السائل أمر ومرحلة الحرارية السائلة المضطربة. درجة الحرارة حيث يحدث التغيير غير البوني في السعة يتوافق مع تغيير في سمك ثنائي الطبقة من استبعاد النفط من الغشاء38. أيضا، لاحظ أن الغشاء النجمي هو مبين بين دورة التدفئة ودورة التبريد ويرجع ذلك إلى تغييرات لا رجعة فيها في منطقة ثنائية الطبقة التي تحدث بين الدورات اللاحقة، والتي كانت تؤدي عادة 10 دقيقة عن بعضها البعض.

وبالمثل، الشكل 6a،ب تبين كيف يمكن استخدام القياسات شبه ثابتة من CM في درجات حرارة مختلفة لتحديد TM. هنا ، تختلف مساحة الغشاء على التوالي عن طريق زيادة المسافة يدويا بين أقطاب القطرة. خلال هذه التجربة ، يتم دفع القطرات أولا معا لتعزيز أقصى مساحة غشاء قبل التخفيضات اللاحقة في منطقة الاتصال مع فصل تدريجي بين الأقطاب الكهربائية. وفي كل مستوى من مستويات الاتصال، تقيم السعة الاسمية للطابقين من التيار المستحث وتحدد مساحته من خلال تحليل الصور. يسمح رسم C مقابل A بتراجع خطي، حيث يمثل الميل قيمة Cm كما هو موضح في الشكل 6a. تكرار هذا الإجراء عبر درجات حرارة متعددة(الشكل 6b)يظهر أن Cm ينخفض بنسبة 50٪ تقريبا في درجات الحرارة فوق TM، مما يؤكد زيادة في سمك الغشاء الكاره للماء بسبب امتصاص الهيكساديكان الناجم عن التدفئة (انظر الشكل S5 للحصول على بيانات C مقابل A كاملة). في درجات حرارة أعلى ، يقلل المذيب الإضافي في الغشاء أيضا من منطقة الاتصال القصوى بين القطرات ، وبالتالي الحد الأقصى من السعة الاسمية. خفض درجة الحرارة عكس هذه الآثار. تظهر صورة DIB في الشكل 6c أنه عندما تكون درجة الحرارة (25 درجة مئوية) أقل بكثير من TM، يمكن للغشاء اعتماد حالة لاصقة للغاية حتى تحت توتر القطرات الممتدة الناجمة عن الأقطاب الكهربائية المنفصلة جيدا. هذا هو نتيجة الاستبعاد الكامل للهيكساديكان من الطبقة الثنائية ، مما يزيد من طاقة التصاق القطرات. في هذه الحالة، لا يمكن تغيير منطقة الطبقة الثنائية بشكل موثوق من خلال التلاعب بالأقطاب الكهربائية ويعيق القدرة على قياس السعة المحددة بدقة (انظر الشكل S5 لمزيد من التفاصيل).

وأخيرا، تبين البيانات التمثيلية في الشكل 7 كيف يمكن أن تؤثر التغيرات في درجات الحرارة على سلوكيات الأنواع التي تشكل المسام التي تخلق قنوات أيونية من خلال DIB. تم اختيار مونازوميسين (Mz) ، وهو مضاد حيوي مشحون إيجابيا يشكل قنوات انتقائية من خلال طبقة ثنائية في إمكانات تحويل الميمبران الكافية37،44، لإظهار هذه العلاقة. أجريت هذه القياسات على تركيز نهائي قائم على BTLE (2 ملغم / مل في كلا القطيرتين) DIB مخدر مع Mz (تركيز نهائي 1 ميكروغرام / مل في كلا القطيرتين). تم الحصول على آثار التيار مقابل الجهد الموضحة في الشكل 7a عن طريق تطبيق الفولتية الغشاء الجيوب الأنفية وقياس التيار المستحث في درجات حرارة مختلفة اثنين; الأسهم والأرقام اللاحقة في الشكل 7a المعونة في تصور أرباع متتالية من الجهد الجيبي فيما يتعلق بالوقت. وغالبا ما يتم إجراء هذا النوع من القياس لدراسة الاعتماد على الجهد من التيار من خلال القنوات الأيونية. وتظهر البيانات هنا أن زيادة درجة حرارة بنك الاستثمار الأوروبي من 27 درجة مئوية إلى 45 درجة مئوية تتسبب في ارتفاع عتبة تكوين القناة من ~|100 mV| إلى ~|110 mV|. هذا التغيير، الذي من المرجح أن يكون مدفوعا بارتفاع سمك الغشاء بسبب امتصاص النفط، يظهر أن حاجز الطاقة للإدخال قد ارتفع. والنجمة في هذه المنحنيات- مما يدل على مقاومة الذاكرة-يمكن أن يكون سببها التغيرات الناجمة عن الجهد في منطقة ثنائية الطبقة أو الحركية لتشكيل قناة Mz وعطل44.

للمساعدة في فصل هذه العوامل في DIBs ، يمكن قياس التغيرات العابرة في تيار الأيونات استجابة لجهد خطوة DC. ويبين الشكل 7ب الكثافة الحالية المقاسة لنفس غشاء BTLE المخدر ب MMZ على نفس مستوى الجهد (+90 mV) واثنين من درجات الحرارة المختلفة (27 درجة مئوية و 45 درجة مئوية). وتظهر البيانات بوضوح أن حركية استجابات القناة مختلفة تماما. وتجدر الإشارة إلى أن الغشاء عند درجة حرارة 27 درجة مئوية يظهر زيادة أسرع وأكبر في التيار يتبعها بعد ذلك تسوس عابر (وهذا الأخير هو نتيجة لقنوات Mz التي تنقل عبر الطبقة الثنائية إلى حالة غير نشطة44). الاستجابة أكثر كتم عند 45 درجة مئوية، حيث لا يتم المضي قدما في الارتفاع على شكل حرف Sفي التيار عن طريق انخفاض لاحق. مثل هذه الاختلافات مفيدة لتقييم حركية استجابات القناة وفهم كيف يمكن أن تسهم هذه في المقاومة الديناميكية الكاملة للغشاء.

Figure 4
الشكل 4: حلقة مفتوحة مقابل التدفئة حلقة مغلقة. لوحة (أ) يقارن الاستجابات الزمنية لقياس ومحاكاة (انظر SI) نظام حلقة مغلقة لخطوة درجة حرارة +20 درجة مئوية لاستجابة التدفئة حلقة مفتوحة تحت قوة ثابتة التطبيقية. لوحة (ب) يعرض الطاقة تبدد من قبل كل نظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:قياس السعة ودرجة الحرارة المختلفة. تظهر الاستجابة الحالية النموذجية الموجية المربعة لمدخلات شكل موجي مثلث 10 mV و 10 هرتز على غشاء دهون BTLE يخضع لانتقال مرحلي في (a). ويمكن أيضا أن ينظر إلى مرحلة انتقال الدهون في بيانات قياس المنطقة المعروضة أعلاه لوحة(أ). يظهر السعة الطبيعية بواسطة السعة الأولية عند 27 درجة مئوية في لوحة(ب)مرسومة كدالة لدرجة الحرارة لدورة التدفئة والتبريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: قياسات السعة المحددة الفريق (أ) يبين السعة الاسمية مقابل منطقة ثنائية الطبقات التي تم الحصول عليها في مناطق الاتصال المتعاقبة لدرجات حرارة مختلفة اثنين. يتم استخدام الانحدارات الخطية لكل مجموعة لتحديد قيمها الخاصة ب CM. لوحة (ب) المؤامرات CM مقابل T، في حين لوحة (ج) يظهر مستقرة الموجي الحالي بالسعة (يسار) ومنطقة الاتصال (يمين) تحت محاولة فصل قطرة في 25 درجة مئوية.

Figure 7
الشكل 7:مقاومة الأغشية المعتمدة على الجهد وحركية قناة Mz الأيونية مقابل درجة الحرارة. لوحة (أ)   يبين كيف تتغير العلاقة التيار الجهد مع درجة الحرارة لBTLE DIBs تشكلت بين قطرات تحتوي على 1 ميكروغرام / مل Mz. تمثل الأسهم والأرقام الأجزاء المتتالية من موجة جيبية مطبقة. توضح الاختلافات في هذه الآثار كيف تحول درجة الحرارة عتبة الجهد لإدراج Mz ، والتي يتم تحديدها على أنها حجم الجهد حيث يزيد التيار المستحث بشكل حاد. وبالمثل، لوحة(ب)يظهر تأثير درجة الحرارة على الاستجابة الحالية العابرة الناجمة عن الجهد خطوة العاصمة من 90 mV. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: لاعبا اساسيا الألومنيوم. يظهر هذا الرسم الأبعاد والميزات اللازمة لتصنيع لاعبا اساسيا الألومنيوم الذي هو قاعدة المرحلة ساخنة. تم تصميم البقع المسطحة مقاس 25.2 مم × 26 مم المجاورة الآبار النفطية للسماح بكمية قصوى من ملامسة مساحة السطح بين التجهيزات وعناصر التدفئة التوصيل الحراري. وبالمثل، تم اختيار الألومنيوم لمواد التجهيزات الأساسية بسبب الموصلية الحرارية العالية. يتم استخدام ثقب المسمار M3 X 0.5 مم الذي تم استدعاؤه في الطباعة لتأمين ووضع الزئن الحراري في بئر الزيت. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S2: ركيزة الاكريليك. الركيزة الاكريليك هو قطعة بسيطة نسبيا لتصنيع، مع عدم وجود ميزات المعلقة الحرجة، باستثناء الملف الشخصي. تم تصميم الملف الخارجي مع بوكا-نير في الاعتبار بحيث يمكن توجيه الركيزة الاكريليك فقط في لاعبا اساسيا في مثل هذه الطريقة للسماح مجالا واسعا لترمو المزدوج لتناسب في بئر النفط. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S3: مرحلة ساخنة التجمع. تم توفير عرض منفجر للمرحلة ساخنة تجميعها لمساعدة المجرب أثناء الإعداد الأولي. أيضا، يحيط علما المنطقة التي أبرزتها دائرة متقطعة، وهذا هو الموقف المثالي لملء لاعبا اساسيا الألومنيوم مع النفط خلال الخطوة البروتوكول 1.8. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S4: فتح حلقة البيانات ولوحة النمذجة Simulink. (أ) يبين استجابات درجة الحرارة المفتوحة الحلقة لمستويات الطاقة dc متفاوتة التي استخدمت لتقييم وقت التأخير، رد،ثابت الوقت، τ،وكسب التدفئة حلقة مفتوحة، α،من النظام. يمثل وقت التأخير الفارق الزمني قبل أن تبدأ درجة الحرارة في الارتفاع (~ 20 s). وتعرف كل قيمة من هذه القيمة (التي تحمل علامة *، ~125 s) بأنها الوقت المطلوب لحدوث 63.2٪ من إجمالي الارتفاع في درجة الحرارة. لوحة (ب) يظهر التغير المطرد في حالة درجة الحرارة (∆T)مقابل السلطة المطبقة. تم استخدام ميل البيانات المرسومة في (ب) لحساب α، والذي يمثل نسبة تغير درجة الحرارة لكل طاقة تم توفيرها. وقد استخدمت هذه المعلمات في النموذج المبين في اللوحة (ج) وقدمت كملف تكميلي لضبط وحدة تحكم PI لتحقيق استجابة التحكم في درجة الحرارة المغلقة المطلوبة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S5: بيانات إضافية محددة عن السعة. تم تجميع المؤامرات الموضحة في الشكل 6a، b من مجموعة بيانات C M هذه. كما تعرض هذه المؤامرة عدم القدرة على قياس السعة بدقة عند درجات حرارة 25 درجة مئوية وما دونها، وبالتالي تم استبعاد هذا القياس من مجموعة البيانات. تتطلب تغييرات المنطقة اللازمة لقياس Cm الدقيق تطبيق القوة المفرطة على القطرات من المحفزات الدقيقة ، مما يسبب تشويها قطعيا لشكل القطرات ومنطقة الاتصال. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملفات الترميز التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا تعليمات لتجميع وتشغيل نظام تجريبي للتحكم في درجة حرارة الزيت والقطرات المستخدمة لتشكيل DIBs. ومن المفيد بشكل خاص لتمكين تشكيل بنك الاستثمار الأوروبي باستخدام الدهون التي لديها ذوبان درجات الحرارة فوق RT. وعلاوة على ذلك، من خلال تغيير درجة حرارة خزان النفط بدقة، يمكن التلاعب بدرجة حرارة الطبقة المزدوجة لدراسة آثار درجات الحرارة المرتفعة على خصائص الأغشية المختلفة والخصائص، بما في ذلك السعة، والمنطقة، وسمك، والتغيرات المستحثة في المرحلة الحرارية، وحركية الأنواع النشطة في الأغشية، وحيوية التصاق واجهة طبقة ثنائية37،38.

يتكون البروتوكول من ثلاثة أجزاء قبل استخدامها في دراسة DIB: 1) إعداد وتجميع لاعبا اساسيا مرحلة ساخنة؛ 2) 1) إعداد وتركيبة المرحلة ساخنة؛ 1) 1) 1) إعداد وتركيبة من المباراة المرحلة ساخنة؛ 1) 2) ربط مختلف الصكوك؛ و 3) تأكيد الأداء المناسب للتحكم في درجة الحرارة مع مكاسب التحكم النسبية المتكاملة المختارة. الأهم من ذلك في الجزء 2، يجب على المستخدم التأكد من تجنب مسارات التوصيل المشتركة بين إخراج مكبر للصوت الطاقة (>تياراتmA) والتصحيح المشبك headstage (pA-nA التيارات). يمكن أن يسبب القصير غير المقصود ضررا دائما على خشبة المسرح. بالإضافة إلى ذلك، فإن ضمان توصيل الكمبيوتر وجميع الأدوات بمساح طاقة AC مشترك، واستخدام قفص فاراداي على الأرض بالقرب من أقطاب الرأس والقطيرات يساعد على تقليل الضوضاء في القياسات الحالية ثنائية الطبقات. بعد اكتمال الإعداد في الجزء 2 ، يجب على المستخدم أولا تقييم استجابة التدفئة المفتوحة لخزان النفط عن طريق تطبيق جهد ثابت على عناصر التدفئة وتسجيل الارتفاع اللاحق في درجة الحرارة (كما هو موضح في الشكل 4a). يمكن استخدام هذا النوع من الاستجابة الأسية لتعريف محاكاة نموذج بسيط لنظام الحلقة المغلقة لقيم متفاوتة من مكاسب التحكم (انظر الشكل S4 للحصول على التفاصيل). مكاسب التحكم المبلغ عنها هنا تسمح للنظام للحرارة إلى مستوى درجة الحرارة المطلوب بسرعة (~ 2 دقيقة) ومع تجاوز قليلا والحفاظ على قيمة نقطة محددة بدقة. ولكن المكاسب المحددة المطلوبة سوف تعتمد على مستوى الطاقة من عناصر التدفئة، فضلا عن هندسة لاعبا اساسيا التي تدعم خزان النفط. وبمجرد تحديد القيم المناسبة لمكاسب التحكم وتشغيل نظام التحكم في التغذية المرتدة على النحو المطلوب، قد يبدأ المستخدم بعد ذلك في تجميع وتوصيف بنك الاستثمار الإسلامي.

البروتوكول لا يغير عملية تشكيل أو توصيف بنك الاستثمار الأوروبي، ولكن هناك قيود واعتبارات. يمكن أن يؤثر رفع درجة حرارة الزيت على كيفية تعليق القطرات على الأقطاب الكهربائية ، بسبب انخفاض التوتر أحادي الطبقة وكثافة الزيت التي تزيد من ترهل القطرات والتيارات الحملية في الزيت الذي يمكن أن يحرك القطرات. وبالتالي ، يقترح البروتوكول خفض نصائح الأقطاب الكهربائية إلى بالقرب من السطح السفلي للركيزة بحيث يتم دعم القطرات والاحتفاظ بها من قبل خزان الأكريليك. يجب على المستخدم تقييم مدى الركيزة قد تكون تشويه قطرات (إذا خفضت بعيدا جدا)، والنظر في هذا التشويه عند حساب مساحة طبقة ثنائية من صور DIBs كما نوقش في مكان آخر22.

في حين يقتصر النظام الموصوف على تسخين حمام الزيت ، يمكن استخدام جهاز تبريد Peltier بدلا من عناصر التدفئة المقاومة إذا كانت هناك حاجة إلى اختبار في درجات حرارة أقل من RT. في هذه الحالة، ومع ذلك، فإن المستخدم بحاجة إلى النظر في نقطة تجميد مرحلة النفط. العديد من الألكانات تتجمد عند درجات حرارة أعلى من 0 درجة مئوية. hexadecane وصفها هنا يتجمد عند 18 درجة مئوية. إذا تجمد الزيت، لن تكون القطرات قابلة للتحرك بعد الآن وقد يصبح الطبقة الثنائية بين القطرات غير مستقرة أو ممزقة.

لتكوين الدهون لم تختبر من قبل، والمجهولات الرئيسية هي وقت الحضانة ودرجة الحرارة اللازمة لتمكين التجميع أحادي الطبقة كافية على أسطح قطرات. القاعدة العامة هي تسخين الزيت إلى درجة حرارة أعلى من TM، حيث يتم تعزيز حركة الدهون مما يسمح بنشر الجانبي بشكل أسرع والتعبئة الأكثر إحكاما في واجهة النفط والمياه45، والانتظار لفترة طويلة بما فيه الكفاية بحيث التعبئة أحادية الطبقة في واجهة النفط والمياه عالية. يمكن للمستخدم مراجعة الأدبيات المنشورة أو النظر في القياسات التكميلية الخاصة بهم لتحديد الوقت المناسب وقيم درجة الحرارة: يمكن استخدام قياسات التوتر بين البينية على مقياس ال غونيمتر قطرة قلادة لتقييم الوقت اللازم لتجميع أحادي الطبقة46 وغالبا ما يستخدم قياس السعرات الحرارية للمسح التفاضلي لتحديد التحولات الحرارية للدهون38. أو يمكن اتباع نهج تكراري لتحديد الوقت المناسب ودرجة الحرارة حيث يكون تشكيل الطبقة المزدوجة متسقا ، والغشاء مستقر لأكثر من بضع دقائق ، ومقاومة الطبقة الثنائية هي >1 GΩ. في الدراسات الحديثة مع E. القولونية مجموع مستخلص الدهون (ETLE)37 و BTLE38،47 درجة حرارة تبدأ >50 درجة مئوية يؤدي باستمرار إلى تشكيل ثنائي الطبقة مستقرة. وبالمثل، فإن الحد الأدنى من درجة الحرارة المستقرة بعد DIB لنوع معين من الدهون قد تختلف أيضا بين اختيارات الدهون. على سبيل المثال يمكن تبريد ETLE DIBs إلى 25 درجة مئوية37، في حين أن مكون واحد DPPC DIBs تتجمع دائما تحت TM~ 40 ° C38. وقد أظهرت الملاحظة أن BTLE DIBS تبين أن 27 درجة مئوية هي درجة حرارة دنيا آمنة للحفاظ على طبقة ثنائية مستقرة.

تظهر النتائج التمثيلية لدينا أن التغيرات في درجة الحرارة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على خصائص DIB الناتجة. تظهر البيانات في الشكل 5 أن السعة الاسمية للغشاء تنخفض مع ارتفاع درجة الحرارة. لأن السعة، C،تتناسب بشكل مباشر مع منطقة ثنائية الطبقات، A،وتناسب عكسيا مع سمك، د،كما هو معطى من قبل

Equation 1, (1)

يمكن أن يكون الانخفاض في C واضحا بانخفاض في A، أو زيادة في d، أو كليهما (على افتراض السماحية العازلة الثابتة ، ε). هذه العلاقات تحفز استخدام قياسات السعة وصور DIB لتقييم التغيرات في Cو Aو Cm مقابل درجة الحرارة لتحديد الآثار الهامة. وتبين البيانات الواردة في الشكل 5 والشكل 6 ل BTLE DIBs أن كلا من C و Cm (الذي يمثل النسبة ε/d)ينخفضان بنسبة 50٪ تقريبا مع ارتفاع درجة الحرارة من 30 C إلى 60 C. معا، وتشير هذه البيانات إلى أن ارتفاع درجة الحرارة يزيد من سماكة الطبقة الثنائية، بسبب زيادة قابلية الذوبان لسلاسل أسيل الدهون في hexadecane48. يمكن أن يؤثر الزيت الإضافي في الغشاء أيضا على التوتر بين البينيين في الطبقة الثنائية وزاوية الاتصال بينقطرات 22،38. ويمكن قياس هذه الآثار من خلال تحليل صور DIB في فترات زمنية محددة من قبل المستخدم لمراقبة منطقة ثنائية الطبقة وزاوية الاتصال أثناء التدفئة والتبريد.

يمكن أيضا استخدام تفضيل درجة حرارة الزيت في الغشاء لتقييم درجات حرارة ذوبان الدهون الحرارية والتأثير على الحركية قناة أيونية. يمكن تعريف درجة حرارة ذوبان خليط الدهون عن طريق تحديد التغيرات غير الصوتية في العلاقات C مقابل T كما هو الحال في الشكل 6. وتكشف القياسات الحالية في الشكل 7 كذلك أن التغيرات الناجمة عن درجة الحرارة في المرحلة (أي السيولة) والسماكة يمكن أن تؤثر على الجهد العتبي لإدراج الأيونوفوريس مثل Mz. هذه الجمعيات المادية مهمة لفهم سلوكيات قناة أيون في أغشية النموذج، وخاصة في السيناريوهات التي تهدف إلى تكرار بيئات درجة حرارة الجسم. ومع ذلك ، فإنها قد تكون مفيدة أيضا لضبط الموصلية من طبقة ثنائية في تطبيقات مثل أجهزة الحوسبة العصبية47 على سبيل المثال ، زيادة الحركية قناة هي ميزة مرغوب فيه عند تصنيع الأجهزة التي تظهر مقاومة الذاكرة التي تحتاج إلى تقليد سرعة ، وظائف ، واللدونة على المدى القصير من الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تقديم الدعم المالي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم منحة CBET-1752197 ومكتب القوات الجوية للبحوث العلمية منحة FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 170، الهندسة، الهندسة الحيوية، طبقة ثنائية الدهون، ثنائية واجهة القطيرات، التحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة، قياسات السعة، قناة أيون، علوم الحياة
تجميع درجة الحرارة التي تسيطر عليها وتوصيف ثنائي واجهة قطرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter