Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השימוש במערכת חימום מבוקרת טמפרטורת משוב כדי לקדם הרכבה מונולאייר השומנים ואת היווצרות bilayer ממשק טיפה עבור שומנים עם טמפרטורות התכה גבוהות, ומדידות קיבוליות לאפיון שינויים מונחי טמפרטורה בקרום.

Abstract

שיטת bilayer ממשק טיפה (DIB) להרכבת bilayers השומנים (כלומר, DIBs) בין טיפות מימיות מצופות שומנים בשמן מציע יתרונות מרכזיים לעומת שיטות אחרות: DIBs הם יציבים ולעתים קרובות לאורך זמן, אזור bilayer ניתן לכוונן באופן הפיך, אסימטריה עלון נשלטת בקלות באמצעות קומפוזיציות טיפה, רשתות כמו רקמות של bilayers ניתן להשיג על ידי הסמוך טיפות רבות. יצירת DIBs דורש הרכבה ספונטנית של שומנים לתוך monolayers השומנים בצפיפות גבוהה על פני השטח של טיפות. בעוד זה קורה בקלות בטמפרטורת החדר עבור שומנים סינתטיים נפוצים, monolayer מספיק או bilayer יציב אינו מצליח להיווצר בתנאים דומים עבור שומנים עם נקודות התכה מעל טמפרטורת החדר, כולל כמה תמציות שומנים הסלולר. התנהגות זו הגבילה ככל הנראה את ההרכבים – ואולי גם את הרלוונטיות הביולוגית – של DIBs במחקרי קרום מודל. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול ניסיוני מוצג כדי לחמם בזהירות את מאגר הנפט המארח טיפות DIB ולאפיין את ההשפעות של הטמפרטורה על קרום השומנים. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש גוף אלומיניום מוליך תרמית ואלמנטים חימום התנגדותי נשלט על ידי לולאת משוב לרשום טמפרטורות גבוהות, אשר משפר הרכבה monolayer היווצרות bilayer עבור קבוצה רחבה יותר של סוגי שומנים. מאפיינים מבניים של הממברנה, כמו גם את המעברים שלב תרמוטרופי של השומנים המרכיבים את bilayer, הם מכמתים על ידי מדידת השינויים קיבוליות חשמלית של DIB. יחד, הליך זה יכול לסייע בהערכת תופעות ביופיזיות בקרומי מודל על פני טמפרטורות שונות, כולל קביעת טמפרטורת התכה יעילה (TM) עבור תערובות שומנים רב רכיבים. יכולת זו תאפשר כך שכפול קרוב יותר של מעברי פאזה טבעיים בקרומי מודל ותעודד היווצרות ושימוש בקרומי מודל ממגוון רחב יותר של מרכיבי קרום, כולל אלה הלוכדים טוב יותר את ההטרוגניות של עמיתיהם התאיים.

Introduction

ממברנות הסלולר הן מחסומים חדירים באופן סלקטיבי המורכבים מאלפי סוגי שומנים1, חלבונים, פחמימות וטרולים העוטפים ומחלקים את כל התאים החיים. הבנת האופן שבו הרכביהם משפיעים על תפקודיהם וחושפים כיצד מולקולות טבעיות וסינתטיות מתקשרות, דבקות, משבשות ומשתנות קרום תאי, ולכן תחומי מחקר חשובים בעלי השלכות רחבות היקף בביולוגיה, רפואה, כימיה, פיזיקה והנדסת חומרים.

מטרות אלה לגילוי נהנות ישירות מטכניקות מוכחות להרכבה, מניפולציה ולימוד של ממברנות מודל – כולל ביליאריות שומנים המורכבות משומנים סינתטיים או טבעיים – המחקות את ההרכב, המבנה ותכונות ההובלה של מקביליהם התאיים. בשנים האחרונות, ממשק טיפה bilayer (DIB) שיטה2,3,4 לבניית bilayer השומנים מישורי בין טיפות מים מצופות שומנים בשמן קיבל תשומת לב משמעותית 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, והפגין יתרונות מעשיים על פני גישות אחרות עבור היווצרות קרום מודל: שיטת DIB היא פשוטה לביצוע, לא דורש ייצור או הכנה מתוחכמים (למשל, "ציור") של מצע לתמיכה בקרום, מניב באופן עקבי ממברנות עם מעולה אריכות ימים, מאפשר מדידות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, ומפשט את היווצרותם של קרום מודל עם קומפוזיציות עלון אסימטרי3. מכיוון שהדו-שכבה נוצרת באופן ספונטני בין טיפות וכל טיפה יכולה להיות מותאמת במיקום ובאיפור, טכניקת DIB משכה גם עניין רב בפיתוח מערכות חומר בהשראת תאים המתבססות על שימוש בקרומים מגיביםלגירויים 18,24,25,26,27,28,29,מידור מאוזן והובלה14,30,31, וחומרים דמויירקמות 17,23,32,33,34,35,36.

רוב הניסויים שפורסמו על קרום המודל, כולל אלה עם DIBs, בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, ~ 20-25 מעלות צלזיוס) ועם קומץ שומנים סינתטיים (למשל, DOPC, DPhPC, וכו '). תרגול זה מגביל את היקף השאלות הביופיזיות שניתן ללמוד בקרומי מודל, ובהתבסס על התבוננות, הוא יכול גם להגביל את סוגי השומנים שניתן להשתמש בהם להרכבת DIBs. לדוגמה, שומנים סינתטיים כגון DPPC, אשר יש טמפרטורת התכה של 42 °C (69 °F), אינו להרכיב monolayers ארוז היטב או טופס DIBs ב RT37. היווצרות DIB בטמפרטורת החדר הוכיחה גם קשה עבור תמציות טבעיות, כגון אלה מיונקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת במוח, BTLE)38 או חיידקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת Escherichia coli, ETLE)37, אשר מכילים סוגים רבים ושונים של שומנים ומקורם תאים המתגוררים בטמפרטורות גבוהות (37 °C (37 °F). מתן אפשרות ללמוד קומפוזיציות מגוונות ובכך מספק הזדמנויות להבנת תהליכים בתיווך ממברנה בתנאים רלוונטיים ביולוגית.

העלאת הטמפרטורה של השמן יכולה לשרת שתי מטרות: זה מגביר את הקינטיקה של הרכבה monolayer וזה יכול לגרום שומנים לעבור מעבר נמס להגיע לשלב מופרע נוזלי. שתי ההשלכות מסייעות בהרכבה חד שכבתית39, דרישה מוקדמת עבור DIB. בנוסף לחימום להיווצרות bilayer, קירור הממברנה לאחר היווצרות יכול לשמש כדי לזהות מעברים תרמוטרופיים bilayers השומנים יחיד38, כולל אלה תערובות השומנים הטבעיות (למשל, BTLE) זה יכול להיות קשה לזהות באמצעות קלורימטריה. מלבד הערכת מעברים תרמוטרופיים של שומנים, דווקא שינוי הטמפרטורה של DIB יכול לשמש כדי לחקור שינויים הנגרמים על ידי טמפרטורה במבנה קרום38 ולבחון כיצד הרכב השומנים ונזילות להשפיע על קינטיקה של מינים פעילים קרום (למשל, פפטידים יוצרי נקבוביות וחלבונים transmembrane37), כולל קרום מודל יונקים וחיידקים בטמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס).

להלן, תיאור של כיצד להרכיב מאגר שמן DIB שונה ולהפעיל בקר משוב טמפרטורה כדי לאפשר הרכבה monolayer היווצרות bilayer בטמפרטורות גבוהות יותר RT יוסבר. בהבדיל מפרוטוקול40הקודם , נכלל פרט מפורש לגבי שילוב המכשור הדרוש למדידה ובקרה של הטמפרטורה במקביל להרכבה ואפיון של ה- DIB במאגר הנפט. ההליך יאפשר למשתמש ליישם שיטה זו לגיבוש ולימוד DIBs על פני מגוון טמפרטורות במגוון הקשרים מדעיים. יתר על כן, התוצאות הייצוגיות מספקות דוגמאות ספציפיות לסוגי השינויים הניתנים מדידה הן במבנה הממברנה והן בהובלת היונים שיכולים להתרחש מכיוון שהטמפרטורה מגוונת. טכניקות אלה הן תוספות חשובות למחקרים הביופיזיים הרבים שניתן לתכנן ולבצע ביעילות ב- DIBs, כולל לימוד הקינטיקה של מינים פעילים בקרום בהרכבי קרום שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מתקן מחומם

  1. לאסוף 2 חתיכות של גומי מבודד בעובי 1 מ"מ קצוץ ל 25 מ"מ x 40 מ"מ רוחב ואורך, בהתאמה, 2 חתיכות של גומי 6 מ"מ עבה כי הם גם 25 מ"מ x 40 מ"מ, מכלול בסיס אלומיניום מוכן, מאגר שמן אקרילי שמתאים בחלון הצפייה של גוף בסיס אלומיניום (ראה איורים S1, S2, ו S3 לפרטים על ייצור תצוגה מתפוצצת של הרכבה). הכינו תחילה את גוף האלומיניום על ידי הצמדה לתחתית המתקן חלון צפייה מכוסה זכוכית עם דבק UV לריפוי ודבק 1 גוף חימום התנגדותי לחלק העליון של כל אוגן צד 25 מ"מ x 25 מ"מ של המתקן.
  2. מניחים את חתיכות הגומי הדקות יותר על במת המיקרוסקופ כך שהקצה הארוך של כל חתיכה משיק לפתיחת הבמה כפי שמוצג ב -איור 1.
  3. מקם את גוף בסיס האלומיניום על גבי רפידות הבידוד עם חלון הצפייה של המתקן ממורכז מעל העדשה האובייקטיבית. נדרש יישור נכון להדמיית הטיפות המחוברות.
  4. מניחים חתיכת גומי עבה יותר על גבי כל גינל חימום התנגדותי ומשתמשים בקליפ שלב מיקרוסקופ כדי להחזיק אותו במקומו. חלקים אלה מגנים על גופי החימום מפני נזק שנגרם על ידי מהדקי הבמה ומבודדים מפני קצר חשמלי מקרי בין גופי החימום והן גוף האלומיניום לשלב המיקרוסקופ.
  5. בזהירות לכופף את קצה המדידה של thermocouple כדי להשיג זווית של 90 ° ב ~ 4 מ"מ מהקצה.
  6. הכנס את הקצה הכפוף של התרמופול לפינה השמאלית התחתונה של גוף האלומיניום ואבטח אותו בעדינות באמצעות בורג הנעילה.
  7. מניחים את המאגר האקרילי בבאר של גוף האלומיניום. זה נעשה לפני הוספת שמן הקסדקאן לבאר (שלב 1.8) של מתקן האלומיניום כדי למזער את הסיכון של לכידת בועות אוויר בין חלון הצפייה לתחתית המאגר האקרילי, אשר יכול לחסום את התצוגה של טיפות.
    הערה: שמן שנוסף לתא הצפייה של גוף האלומיניום משמש להתאמת מדדי השבירה של האקריליק והזכוכית להדמיה ברורה יותר של הטיפות הכלולות במאגר האקרילי. לכן, ראוי לציין כי שמן בבאר של מתקן אלומיניום אינו יוצר קשר עם התוכן של המאגר האקרילי וניקוי קפדני של מתקן אלומיניום אינו נדרש.
  8. לוותר ~ 1,000 μL של שמן הקסדקאן לתוך הבאר של מתקן אלומיניום (כלומר, בין הקירות של המאגר האקרילי גוף אלומיניום), מקפיד לא למלא יתר על המידה. רמת השמן בבאר של מתקן האלומיניום צריכה להיות גבוהה ככל האפשר כדי למקסם את שטח הפנים להעברת חום, תוך לא מאפשר שמן לשפוך על הקצוות של המתקן על שלב מיקרוסקופ או עדשה אובייקטיבית.
  9. לוותר ~ 1,000 μL של שמן הקסדקאן לתוך המאגר האקרילי, תוך שמירה על מודעות לא למלא יתר על הזמן.
    הערה: יש תמיד לנקות ביסודיות את מאגר האקריליק בין הניסויים. המשתמש חייב להעסיק גדוד המורכב שטיפות רצופות עם אתיל אלכוהול ומים deionized ואחריו ייבוש בקערת יבוש במשך 12 שעות.

Figure 1
איור 1: הרכבת במה מחוממת. תמונות מראות את ההרכבה של גוף מוליך תרמית ומאגר שמן עבור היווצרות DIB; מספרים מתחת לכל תמונה מזהים את השלב המתאים של הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. מכשור לבקרת טמפרטורת משוב בו זמנית ואפיון חשמלי של DIB

הערה: פרוטוקול זה משלב את המכשירים הבאים להפעלת בקרת טמפרטורת משוב ואפיון חשמלי בו זמנית של DIB: מחשב אישי (PC) עם שני חיבורי אפיק טורי אוניברסלי (USB) זמינים, מגבר מהדק תיקון המשויך למערכת רכישת נתונים ייעודית (DAQ-1), מחולל צורת גל, DAQ לתכנות שני (DAQ-2) עם מודולי יציאת מתח וכניסת טמפרטורה, ואספקת חשמל/ מגבר. השלבים הבאים מתארים את החיבורים הדרושים של מכשירים אלה (כפי שמודגם באיור 2a)הדרושים לבידוד המדידה והבקרה של הטמפרטורה מאלקטרופיזיולוגיה סימולטנית של DIB. החלפות עבור מכשירים מקבילים עשויות להתבצע כנדרש.

  1. צור חיבורי פלט וקלט למודולים DAQ-2.
    1. בחר שני זוגות של מסופי בורג במודול יציאת המתח עבור חיבורי מתח דיפרנציאליים והצמד מוביל חוט למיקומים אלה. מסופי מספרים אי-זוגיים הם חיבורי קרקע נפוצים, ומסופי המספרים הזוגיים הם יציאות לא מוארקות, כפי שמוצג ב- (איור 2c). חבר כל אחד משני זוגות חוטי העופרת הללו למתאמי BNC נפרדים של מסוף-בורג ולאחר מכן חבר כל מתאם לכבל BNC נפרד המשמש לניתוב אותות מתח למכשירים אחרים.
      הערה: בהתקנה זו, חיבורים דיפרנציאליים במסופים 0 ו- 1 מוקצים עבור פלט בקרת הטמפרטורה למגבר החשמל, בעוד שזוג חיבורים נוסף במסופים 6 ו- 7 מיועדים לתפוקת מתח להישלח לטיפות באמצעות מגבר המהדק של התיקון.
    2. בהתייחס (איור 2c), בחר ערכה אחת של מסופי תרמוקופול (למשל, מסופים 2 ו- 3 מוגדרים כזוג TC1) במודול הקלט התרמוקופול וחבר אליו את חוטי התרמופול.

Figure 2
איור 2: חיבורי חיווט מערכת. סכמטי של ההתקנים והחיווט הדרושים למערכת מוצג ב- (א), בעוד שמבט מפורט על חיבורי DAQ-2 מסופק ב - (b). האיור ב- (c) מציג טיפות מימיות על אלקטרודות מצופות הידרוג'ל שקועות בשמן להיווצרות DIB. שתי האלקטרודות מחוברות לחיבורים המוארקים והלא מוארקים (V+), בהתאמה, על יחידת הראש של מגבר המהדק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. לאחר שבוצעו חיבורים חשמליים למודולים DAQ-2, חבר את מארז DAQ-2 למחשב באמצעות חיבור USB והתחבר למקור חשמל. לאחר מכן אשר התקנה מוצלחת של מנהלי התקנים ותוכנות לפני השימוש עם תוכנה מסחרית.
  2. קבע תצורה וחבר מגבר הספק בין DAQ-2 לבין רכיבי חימום התנגדותיים.
    1. קבע את תצורת המגבר כך שיפעל במצב הגברה ברווח קבוע עם רווח של פי 10.
    2. באמצעות מתאם שקע בננה-BNC, חבר את כבל BNC שמקורו במסופים 0 ו- 1 במודול יציאת המתח (איור 2b) לחיבורי הקלט במגבר החשמל.
    3. באמצעות מתאמי BNC וכבלים נוספים, חבר את מסופי היציאה של מגבר החשמל לשתי קבוצות של רכיבי חימום, המחוברים במקביל זה לזה והמגבר כדי להבטיח ששני האלמנטים ישמרו על אותו ירידת מתח במהלך השימוש.
  3. ליצור קשרים הדרושים עבור ציוד אלקטרופיזיולוגיה.
    1. חבר כבל BNC שמקורו במסופים 6 ו- 7 במודול יציאת המתח (איור 2b)למחברי BNC של הפקודה החיצונית המתויגת האחורית בחלק האחורי של מגבר המהדק של התיקון.
    2. חבר כבל BNC שני בין הפלט של מחולל צורת הגל לבין חיבור הפיקוד החיצוני של המתג הקדמי בחלק האחורי של מגבר המהדק של התיקון.
      הערה: שני חיבורים אלה מספקים שיטות חלופיות ליצירת צורות גל מתח המוחלות על אלקטרודות טיפה באמצעות מגבר מהדק התיקון. מחולל צורת הגל שימושי במיוחד ליצירת מתחי צורת גל משולשים המשמשים למדידת קיבוליות קרום. המשתמש עשוי להחליט אילו, אם בכלל, נחוצים ליישום שלו.
    3. באמצעות כבל BNC שלישי, חבר את הפלט של הזרם הנמדד הממוקם בלוח הקדמי של מגבר המהדק של התיקון למחבר BNC עם קלט אנלוגי זמין בחזית DAQ-1.
    4. באמצעות כבל BNC רביעי, חבר את היציאה של מתח ממברנה נמדד (בחלק האחורי של מגבר המהדק של התיקון) למחבר כניסה אנלוגי נפרד ב- DAQ-1. זה מאפשר דיגיטציה של המתח המוחל על פני האלקטרודות.
    5. עם שתי אלקטרודות טיפה מוכן ונתמך על micromanipulators כמתואר בשלבים 7-9 ב ref.40, לחבר את האלקטרודה מוביל ראש מהדק תיקון, שהוא מחובר באמצעות כבל למגבר מהדק תיקון.
      הערה: תפקידו של כיסוי הראש הוא לשלוט במתח בין האלקטרודות ולמדוד את הזרם שנוצר, אשר מומר למתח פרופורציונלי שמקבל יציאה על ידי מגבר מהדק התיקון ל- DAQ-1.
    6. חבר DAQ-1 למחשב באמצעות חיבור USB וחבר את כבלי אספקת החשמל המתאימים הן למגבר המהדק של התיקון והן ל- DAQ-1.
  4. כוח על כל ציוד המדידה.
    הערה: אולי הפרט החשוב ביותר בהתקנה זו הוא להבטיח שחיבורי פלט מגבר החשמל (mA-A) מבודדים חשמלית מיחידת הראש של מגבר המהדק של התיקון, המשתמש במעגל רגיש למדידת זרמי רמת pA-nA ב- DIB.

3. בקרת טמפרטורת משוב של bilayers ממשק טיפה

הערה: השלבים הבאים להפעלת מערכת בקרת טמפרטורת המשוב מבוססים על ממשק משתמש גרפי (GUI) מותאם אישית שנוצר ליישום בקרת טמפרטורת משוב פרופורציונלית-אינטגרלית (PI)40,41 (ראה קבצי קידוד משלימים). במקום זאת, ניתן להשתמש באלגוריתמים אחרים של תוכנה ובקרה. עותק של תוכנית זו מסופק לקורא עם מידע משלים עבור הנייר, אולם המשתמש אחראי להגדיר את זה עבור הציוד שלהם ואת הצרכים.

  1. הפעל את תוכנת DAQ-2 במחשב ופתח את קובץ התוכנית לבקרת טמפרטורה. לאחר פתיחת ממשק משתמש גרפי, פתח את התוכנית שוב על-ידי לחיצה על סמל התיקיה בפינה השמאלית התחתונה של ממשק ה- GUI ובחירת תוכנית בקרת הטמפרטורה (איור 3).
  2. הזן ערכים מספריים מתאימים עבור הגבר הפקד היחסי (KP) ורווח שליטה אינטגרלי (KI).
    הערה: נמצאו ערכי KP ו- KI של 0.598 ו- 0.00445, בהתאמה, פועלים היטב בהגדרה. ערכים אלה נקבעו באופן איטרטיבי באמצעות סימולציה באמצעות מודל מערכת המשלב פרמטרים המתקבלים מתגובות חימום מדודות בלולאה פתוחה (ראו איור 4). במהלך חימום לולאה פתוחה, כוח החימום שנקבע אינו תלוי בטמפרטורה הנמדדת. לעומת זאת, חימום בלולאה סגורה מורכב מהתאמת הכוח המוחל ללא הרף לתנורים באופן המסייע לקרב את הטמפרטורה הנמדדת לטמפרטורה הרצויה. הדבר מושג בזאת באמצעות ערכת בקרת PI.
  3. כדי לבדוק את ערכת בקרת הטמפרטורה, הזן את טמפרטורת נקודת ההגדרה הרצויה (מעל טמפרטורת החדר) ולאחר מכן הפעל את בקרת טמפרטורת המשוב בתוך ממשק ה- GUI. שים לב לאות הטמפרטורה הנמדד תחת פקד משוב (לולאה סגורה), המוצג ב- GUI במשך הדקות הקרובות. אם הטמפרטורה הנמדדת של השמן עולה במידה ניכרת על הטמפרטורה הרצויה, מגיבה לאט מדי לשינויים, או אינה מתכנסת לנקודת ההגדרה הרצויה, המשתמש יצטרך להתאים את רווחי הבקרה כדי להשיג את ביצועי הלולאה הסגורה הרצויים.
    הערה: התוכנית מגדירה מגבלת רוויה עבור הכוח (ובכך מתח) המסופקים אלמנטים חימום התנגדותי. לדוגמה, שני אלמנטים המדווחים בזאת צורכים עד 5 ואט כל אחד. חיווט אותם במקביל פירושו שצריכת החשמל הכוללת לא תעלה על 10 ואט. מומלץ למשתמש לשקול את כמות החשמל המרבית שיש לספק למכשירים ולדעת כי מגבלה זו יכולה להשפיע על המהירות שבה מערכת הלולאה הסגורה תגיב לשינויי הטמפרטורה הרצויים. רכיבי חימום הספק גבוהים יותר מאפשרים חימום מהיר יותר ומפרטורות גבוהות יותר של נקודות הגדרה, אך דורשים זרמים מסופקים גבוהים יותר לחימום.
  4. כאשר המערכת מכוונת לביצועי לולאה סגורה מקובלים, הזן את טמפרטורת השמן הרצויה להיווצרות DIB כנקודת ההגדרה ב- GUI.
    הערה: לדוגמה, טמפרטורת נקודה מוגדרת של 60 °C (60 °F) הניבה תוצאות טובות בניסויים עם ליפוזומים BTLE ב טיפות מימית37. המשתמש מופנה למקום אחר2,40 עבור פרוטוקולים המסבירים הרכבה DIB בין טיפות תלויות על אלקטרודות מסוג חוט ותצורה של ציוד אלקטרופיזיולוגיה באמצעות מגבר מהדק תיקון, DAQ-1, ותוכנת מדידה אלקטרופיזיולוגית. באופן ספציפי, הפרוטוקול על ידי Najem, ואח'40 ניתן לעקוב מקרוב עד שלב 13. מעבר לצעד זה, גישה שונה במקצת משמשת להיווצרות מוצלחת של מונולאייר וביליאר בעת שימוש בליפידים הדורשים חימום כדי לקדם היווצרות מונולאייר או bilayer.
  5. מנמיכים את קצות האלקטרודות כסף / כסף כלוריד (Ag / AgCl) לתוך השמן עד שהם כמעט לגעת בתחתית המאגר האקרילי. מיקום זה של קצות האלקטרודה חיוני לשמירת הטיפה על האלקטרודה בשמן מחומם, שבו נצפו זרמים קונבקטיביים בשמן כדי לנתק טיפות מהאלקטרודות מצופות ההידרוגל(איור 2c).
  6. פיפטה טיפת 250 nL של תמיסת השומנים מימית המכילה 2 מ"ג / מ"ל של BTLE, 100 מ"מ אשלגן כלורי (KCl), ו 10 מ"מ 3-(N-מורפולינו) חומצה פרופאנסולפונית (MOPS) על כל קצה אלקטרודה ולתת להם דגירה בשמן מחומם במשך מינימום של 10 דקות כדי לקדם היווצרות monolayer.
  7. מכסים את כיסוי הראש ואת גוף הבמה המחומם בכלוב פאראדיי מקורקע.
  8. הביאו את הטיפות למגע עדין באיטיות
    מניפולציה המיקומים האופקיים של האלקטרודות עד שהמשתמש רואה את הטיפות לעוות ממגע או להתחיל לעקור אחד את השני ולחכות כמה דקות עד היווצרות bilayer מתחיל. אם לאחר מספר דקות bilayer לא נוצר, טיפות ניתן לכפות יחד יותר כדי להקל על היווצרות bilayer. ניתן לאשר היווצרות דו-שכבתית בין-גזעית דקה באמצעות בדיקה ויזואלית(איור 5a)או על ידי מדידת הגידול במשרעת של זרם קיבולי בצורת גל מרובע המושרה על ידי מחולל צורת גל המפיק מתח משולש 10 mV, 10 הרץ22. אפשר את bilayer כדי להשוות במשך מינימום של 10 דקות כדי להגיע לאזור בין-גזעי יציב, על היווצרות ראשונית ולפני האפיון הבא בנקודת הסט הראשונית.
    הערה: לסוג השמן יכולה להיות השפעה משמעותית על דילול הדו-שכבתי, עובי הממברנה וזווית המגע בין טיפות. באופן כללי, ככל שמולקולת השמן קטנה יותר, כך היא יכולה להישאר בקלות רבה יותר בליבה ההידרופובית של הביליאר שנכבש על ידי שרשראות אסיל השומנים. החזקת שמן מגבירה הן את המתחים והן את העובי הדו-שכבתי ומפחיתה את האזור ואת זווית המגע בין טיפות. מדדים אלה מסמלים מצב חלש יותר של הידבקות. מולקולות גדולות ומגושמים יותר מפעילות את האפקט ההפוך. לדוגמה, סקוואלן היא מולקולה מגושמת יותר מאלקנים כגון הקסדקאן, המאפשרת להוציא אותה בקלות בין מונוליירים במהלך דילול bilayer. ככאלה, DIBs שנוצרו סקוואלן הם דקים יותר, הם מציגים אזורי מגע וזוויות מגע גבוהים יותר, והם מפגינים אנרגיות חופשיות גבוהות יותר של היווצרות22,42 (מידה של הידבקות טיפת טיפה).

4. אפיון התנהגויות תלויות טמפרטורה ב- DIBs

הערה: תהליכים פיזיקליים רבים ניתן ללמוד בקרומי מודל מבוססי DIB, כולל כיצד שינויים בטמפרטורה משפיעים על תכונות המבנה והתחבורה של הממברנה. השלבים הבאים צריכים להתבצע לאחר היווצרות דו שכבתית מוצלחת בטמפרטורה הרצויה.

  1. למדוד את הקיבוליות הנומינלית של הממברנה תוך הורדת הטמפרטורה של אמבט השמן מנקודת מוגדרת המאפשרת היווצרות bilayer לזהות מעברי שלב תרמוטרופיים של השומנים בקרום38.
    1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI ונקה את הנתונים המוצגים. פעולה זו מבטיחה שטח מספיק במאגר זמין עבור הקלטות עוקבות.
    2. באמצעות מחולל צורת הגל המחובר למגבר מהדק התיקון, החל צורת גל מתח משולש (למשל, 10 mV, 10 הרץ) על פני אלקטרודות DIB ולתעד את התגובה הנוכחית המושרה דרך bilayer.
    3. מצננים את הדו-שכבתית על ידי הפחתת טמפרטורת הנקודה שנקבעה במרווחים של 5 מעלות צלזיוס והמתנה של 5 דקות לפחות בטמפרטורת המצב היציבה החדשה בין שינויי הטמפרטורה עד להשגת הטמפרטורה הרצויה. לחלופין, נסה לקירור פסיבי של הדו-שכבתי על-ידי כיבוי מערכת בקרת המשוב. שים לב, עם זאת, כי ניסויים המיישמים קירור פסיבי מ 50-60 מעלות צלזיוס הביא לשיעורים גבוהים יותר של התמזגות.
    4. לאחר אמבט השמן ואת bilayer מגניב לטמפרטורה המינימלית הרצויה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI שוב ולייצא את נתוני הטמפרטורה לעומת זמן לתוכנת גיליון אלקטרוני. הפסק את ההקלטה הנוכחית.
    5. מהזרם הנמדד, חשב את התפקוד הנומינלי של התגובה הנוכחית של הגל המרובע לעומת הזמן במהלך תקופת הקירור.
    6. קיבוליות נומינלית עלילה (C) לעומת טמפרטורה (T) כדי לבחון כיצד קיבוליות הממברנה השתנתה. אתר שינויים לא-מונוטוניים ב- C לעומת T כדי לזהות את TM.
      הערה: קיבוליות נומינלית ניתן לחשב משרעת של גל מרובע הנוכחי43 (| אני |) שימוש | קשר הגומלין אני | = C dv / dt, שבו dv / dt שווה פי ארבעה מהתוצר של משרעת המתח (| V|) ותדר(f)של המתח המשולש המיושם. מתוך משוואות אלה, C = | אני |/(4| V|f).
  2. באופן דומה, להעריך את קיבוליות ספציפית מעין סטטית (Cm) של bilayer בטמפרטורות קבועות על ידי הגדלה רצופה של הטמפרטורה של אמבט השמן ואת אזור bilayer.
    1. שנה את טמפרטורת הנקודה שנקבעה במרווחים של 10 °C (70 °F) באמצעות ממשק המשתמש הגרפי (GUI) ואפשר למערכת להשתוות לטמפרטורה החדשה.
      1. בצע את שלב 4.1.2 כדי ליזום את המדידה של זרם והקלטה קיבוליים.
      2. שנה את אזור הדו-שכבתי על-ידי כוונון קפדני של מיקומי האלקטרודות באמצעות המיקרו-מניפולטורים (כלומר, הפרדת האלקטרודות מפחיתה את אזור הדו-שכבתי). אפשר לזרם הגל המרובע להגיע משרעת מצב יציב ולאסוף תמונות של DIB כדי לאפשר חישוב של אזור קרום לעומת זמן באמצעות מצלמה המותקנת על המיקרוסקופ כדי לדמיין את bilayer כפי שניתן לראות מן הצמצם של שלב המיקרוסקופ. בו-זמנית, הוסף תגית דיגיטלית בתוכנת ההקלטה הנוכחית כדי לסמן את נקודת הזמן המתאימה לאיסוף תמונות.
        הערה: מיקרו מניפולטורים מאפשרים שליטה מדויקת של האלקטרודות ובכך מגע עדין בין טיפות. מניפולציה גסה של הטיפות יכולה להוביל לניסוי כושל על ידי התמזגות של הטיפות או על ידי גרימת טיפה ליפול מהאלקטרודה. כפי שנדון במקומותאחרים 22, אזור bilayer מחושב מאורך המגע בין טיפות, המופיעות כעיגולים חופפים בתמונה בתצוגה התחתונה. ניתן לחשב את המיקומים והממדים של הטיפות, ואת אורך קו המגע, באמצעות תוכנת עיבוד תמונה או באמצעות כלי תכנות מדעיים אחרים.
      3. חזור על שלב 4.2.1.2 מינימום של 4 פעמים כדי להשיג סך של 5 תמונות DIB ואזורים במצב יציב של זרם bilayer.
    2. חזור על שלב 4.2.1 בכל טמפרטורה רצויה.
    3. בנקודות הזמן המתויגות המתאימות לאזורים דו-שכבתיים במצב יציב עבור תמונות שנרכשו, נתח את ההקלטות הנוכחיות ואת תמונות ה- DIB כדי לחלץ נתוני C ו- A עבור כל טמפרטורה.
    4. התוויית נתונים C לעומת A עבור כל טמפרטורה וחישוב השיפוע של רגרסיה מסדר ראשון, המייצגת את Cm של bilayer בכל טמפרטורה22.
    5. ערכי התוויה של Cm שהתקבלו משלב 4.2.4 לעומת T.
    6. בדוק את נתוני Cm לעומת T עבור וריאציות לא מונוטוניות לזיהוי טמפרטורות נמסות, TM.
  3. להעריך את הדינמיקה של היווצרות ערוץ יון תלוי מתח על ידי יצירת קלט שלב מתח dc על פני bilayer.
    1. הגדר מתח התחלתי לערך השלב הרצוי ב- mV (למשל,100 mV).
    2. הגדר מתח סופי וגודל צעד לערך גבוה יותר מהשלב הרצוי (למשל, מתח סופי של 110 mV וגודל צעד של 110 מ"ו).
    3. הגדר משך זמן רצוי עבור קלט השלב בשניות (לדוגמה, 90 שניות).
    4. בחר את הקוטביות הרצויה עבור קלט השלב (למשל, חיובי).
    5. החלף את מגבר מלחצי התיקון כדי לשלוח לראשי הבמה את מתח הפקודה שמקורו במודול יציאת ה- GUI/מתח.
    6. אתחל הקלטות נוכחיות.
    7. הפעל את המתח ותקליט את תגובת הזרם המושרה, שאמורה להציג תגובה בצורת S למתח קריטי (למשל, ~ 70 mV עבור Mz 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 2 מ"ג / מ"ל BTLE).
  4. בנפרד, ניתן להשיג קשרי מתח זרם דינמיים עבור קרום בטמפרטורות הרצויות כדי לחשוף קשרים תלויי מתח, כגון התנהגויות ערוץ היונים.
    1. החלף את מגבר המהדק של התיקון כדי לשלוח לראש את מתח הפקודה שמקורו במחולל צורת הגל וליזום הקלטות זרם.
    2. במחולל צורת הגל, פלט צורת גל סינוסואידית רציפה עם משרעת, היסט ותדירות רצויים.
    3. רשום את התגובה הנוכחית המושרה על-פני מחזור אחד או יותר.
    4. חזור על הפעולה הרצויה עבור משרעת גלי סינוס שונים ותדרים וטמפרטורות.

Figure 3
איור 3: ממשק משתמש גרפי של בקרת טמפרטורה. נתון זה מדגיש ומתייג את השלבים הקריטיים הנדרשים כדי להשתמש ב- GUI של התוכנית כדי לשלוט בטמפרטורה של אמבט השמן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מראה כיצד גוף האלומיניום ומאגר הנפט האקרילי מוכנים על במת המיקרוסקופ להיווצרות DIB. שלבי ההרכבה 1.2-1.4 משמשים לבידוד תרמי של המתקן מהבמה לחימום יעיל יותר. שלבים 1.5-1.7 מראים כיצד לחבר כראוי את התרמופול למתקן ולמקם את מאגר הנפט, וצעדים 1.8-1.9 מראים מיקומים מומלצים לחלוקת שמן לחתיכות אלה.

איור 2 מתאר את הרכיבים המשמשים ליצירת בקרת טמפרטורת משוב ולביצוע מדידות חשמליות ב- DIB: מחשב, מגבר כוח להגברה קבועה, מגבר מהדק תיקון ומערכת DAQ (או מכשיר שווה ערך להחלת מתח ומדידת זרמי רמת pA-nA), DAQ שני עם כניסות ותפוקות אנלוגיות מתאימות, מחולל צורת גל, וגוף האלומיניום המורכב עם תנורי התנגדות מחוברים. DAQ-2 עושה שימוש בשני מודולים (איור 2b). מודול יציאת מתח אנלוגי של 4 ערוצים, ±10 V, 16 סיביות משמש לאתחול המתחים הבלתי תלויים המסופקים לקלט של מגבר החשמל (חיבור כחול באיור 2a)וקלט פקודה חיצונית במגבר המהדק (חיבור ירוק). מודול יציאת המתח מוגבל על ידי זרם יציאה מרבי של 46 mA ומתח יציאה מרבי של 10 V, ואילו כל גימנט חימום המשמש בזאת צורכת עד 5 W של כוח (~ 180 mA מקסימום) במתח מרבי של 28 V. מסיבה זו, ספק הכוח/ המגבר נכלל כדי להגביר מראש את מתח היציאה ולהשלים את הזרם המסופק הדרוש להפעלת גופי החימום (קוויים במקביל) המחוברים לגוף האלומיניום. התקן קלט תרמוקופול 4 ערוצים של 24 סיביות משמש לדיגיטציה של מדידות טמפרטורה ממאגר השמן ליד ה- DIB (חיבור צהוב). מאז מודול התקן קלט thermocouple מאפשר עד 4 thermocouples, המשתמש עשוי לשקול ניטור טמפרטורות במקומות אחרים במתקן. אם נעשה, הם גם יצטרכו לשקול איזה אות או שילוב של אותות משמש להשוואה לטמפרטורת הנקודה שנקבעה הרצויה בתוך לולאת המשוב.

יציאות ואותות נמדדים אלה נשלטים באמצעות שתי תוכנות: 1) ממשק המשתמש הגרפי המותאם אישית לבקרת טמפרטורה; ו-2) תוכנת מדידת אלקטרופיזיולוגיה. איור 3 מציג צילום מסך של ממשק משתמש גרפי וכולל ביאורים לשלבים המתאימים בפרוטוקול. ממשק המשתמש הגרפי משמש להגדרת פרמטרי מפתח (טמפרטורת נקודת סט, רווחי בקרת PI, מגבלות מתח), להשוות את הטמפרטורה הנמדדת לטמפרטורת נקודת ההגדרה ולחשוב את אות הבקרה המסופק למגבר ולאחר מכן את רכיבי החימום, ולתעד נתונים של הטמפרטורה והמתח המוחל לעומת הזמן. תוכנית זו כוללת גם את היכולת לשלוט במתח המוחל על אלקטרודות DIB (איור 2c) באמצעות מגבר המהדק של התיקון. בנפרד, תוכנת מדידה משמשת לקביעת תצורה של מדידות הן של המתח המוחל על אלקטרודות DIB והן של הזרם המושרה באמצעות bilayer השומנים. מתח פרופורציונלי לזרם DIB הוא יציאה על ידי מגבר מהדק התיקון ונשלח באמצעות כבל BNC ל- DAQ-1 (החיבור אינו מוצג).

איור 4 מתווה את שינוי הטמפרטורה ואת החשמל המוחלט שנשלח לתנורים לעומת הזמן הן בתרחישי חימום בלולאה פתוחה והן בתרחישי חימום בלולאה סגורה. עבור הראשון, מתח כניסה שרירותי המתאים ~ 5.2 W של כוח הוחל על תנורי חימום, אשר הביא לעלייה אקספוננציאלית בטמפרטורה עם קבוע זמן של ~ 125 s ומצב יציב ΔT ≈ 4.5 ° C / W לאחר עיכוב ראשוני של ~ 20 s. מאפיינים אלה של מערכת הלולאה הפתוחה שימשו לבניית מודל של מערכת הלולאה הסגורה בתוכנת הדמיה (ראה איור S4 לקבלת פרטים) שניתן להשתמש בו כדי לקבוע ערכים עבור רווחי הבקרה היחסיים והאינטגרליים. התגובות הסגורות והדגם המדומה באיור 4 מייצגות אפוא את התגובות הנמדדות והמדומיות של בקר ה- PI המכוון, עם ערכי KP ו- KI של 0.598 ו- 0.00445, בהתאמה, לטמפרטורת נקודה מוגדרת הגבוהה מ- RT. בהשוואה למארז הלולאה הפתוחה, הן הסימולציה והן המדידות מאשרות את מהירות התגובה המוגברת במערכת הלולאה הסגורה (זמן קבוע ~ 63 הירידה בזמן החימום באה על חשבון כוח יישומי ראשוני גבוה יותר. ובכל זאת, טמפרטורת נקודת הקבע הרצויה וטמפרטורת השמן הנמדדת נשארו בטווח של 0.6 מעלות צלזיוס במצב יציב, שנחשב מתאים לשימוש. צריכת החשמל הכוללת המסופקת מוגבלת בתוך התוכנית במהלך בקרת לולאה סגורה כדי לא להאפיל על מגבלת החשמל הכוללת של 10 W עבור שני תנורי החימום.

מערכת בקרת הטמפרטורה שימשה להצגת התלות בטמפרטורה של ממס ב- DIB שנוצר משומנים BTLE והשפעתו על קיבוליות הממברנה (איור 5). שומנים BTLE נבחרו עבור מדידה זו כי חימום נדרש עבור היווצרות DIB עקב מעבר שלב השומנים המתרחשת בין 35-42 °C38. הפרוטוקול המתואר בזאת בוצע כדי ליזום היווצרות bilayer ב 60 °C (60 °F). בעקבות היווצרות ממברנה ושיווי משקל, ניתן להוריד או להעלות את הטמפרטורה ברצף לפי הצורך כדי לאפיין את התגובה של הממברנה. לדוגמה, איור 5a מציג מדידות מייצגות של זרם קיבולי גולמי (צורת גל בצורת ריבוע) וטמפרטורה לעומת זמן במהלך מחזור חימום מ- RT עד ~ 60 °C (60 °F). שים לב כי משרעת של צורת הגל הנוכחית קיבולי מפחיתה ביותר ממחצית ככל שהטמפרטורה עולה, אשר נגרמת על ידי ספיגת השמן לתוך הליבה ההידרופובית של הממברנה. שינוי זה מעבה את הממשק ומשנה את המתח לרוחב של bilayer22,37,38.

הנתונים במסמך איור 5b משתנים ב- C (מנורמלים בקיבוליות של 27 °C (67 °F) לעומת T על פני מחזור חימום קירור מלא אחד לאחר היווצרות bilayer הראשונית ב 60 °C (60 °F). בדיוק כמו באיור 5א, כשהטמפרטורה עולה, הקיבוליות יורדת. עם זאת, מה מצגת זו מראה בצורה ברורה יותר הם שינויים nonmonotonic המתרחשים בטמפרטורות בין ~ 30-42 מעלות צלזיוס, המייצג את טמפרטורת ההיתוך הקולקטיבית, TM, שבמהלכו תערובת השומנים עוברת בין נוזל מסודר לשלב תרמוטרופי עם הפרעה נוזלית. הטמפרטורה שבה מתרחש השינוי הלא-מונוטוני ב קיבוליות תואמת לשינוי בעובי bilayer מהדרת שמן מהממברנה38. כמו כן, שים לב כי ההיסטרזיס המוצג בין מחזור החימום לבין מחזור הקירור נובע משינויים בלתי הפיכים באזור bilayer המתרחשים בין המחזורים הבאים, אשר בוצעו בדרך כלל 10 דקות זה מזה.

באופן דומה, איור 6a,b מראה כיצד ניתן להשתמש במדידות מעין סטטיות של Cm בטמפרטורות שונות כדי לזהות את TM. כאן, שטח הממברנה משתנה ברציפות על ידי הגדלה ידנית של המרחק בין האלקטרודות טיפה. במהלך ניסוי זה, הטיפות נדחפות תחילה יחד כדי לקדם את אזור הממברנה המרבי לפני הפחתות הבאות באזור המגע עם הפרדות חורגות בין האלקטרודות. בכל רמה של מגע, היבול הנומינלי של הדו-שכבתי מוערך מהזרם המושרה ושטחו נקבע באמצעות ניתוח תמונה. התוויית C לעומת A מאפשרת רגרסיה ליניארית, כאשר השיפוע מייצג את הערך Cm כפי שמוצג באיור 6a. חזרה על הליך זה על פני טמפרטורות מרובות (איור 6b) מראה כי Cm יורדת בכמעט 50% בטמפרטורות מעל TM, המאשר עלייה בעובי ההידרופובי של הממברנה עקב ספיגת הקסדקן הנגרמת על ידי חימום (ראה איור S5 לנתוני C מלאים לעומת A). בטמפרטורות גבוהות יותר, הממס הנוסף בקרום גם מקטין את אזור המגע המרבי בין הטיפות, ובכך קיבוליות נומינלית מקסימלית. הפחתת הטמפרטורה הופכת השפעות אלה. תמונת DIB באיור 6c מראה כי כאשר הטמפרטורה (25 °C (25 °C) הוא הרבה מתחת TM, הממברנה יכולה לאמץ ביציבות מצב דבק מאוד- אפילו תחת המתח של טיפות מתוחות הנגרמות על ידי אלקטרודות מופרדות היטב. זוהי תוצאה של הדרה מוחלטת של הקסדקאן מן bilayer, אשר מגביר את אנרגיית הידבקות של טיפות. במצב זה, לא ניתן לשנות את אזור הדו-שכבתי באופן אמין באמצעות מניפולציה של האלקטרודות ומעכב את היכולת למדוד במדויק קיבוליות ספציפית (ראה איור S5 לקבלת פרטים נוספים).

לבסוף, הנתונים הייצוגיים באיור 7 מראים כיצד שינויי טמפרטורה יכולים להשפיע על התנהגויות של מינים יוצרי נקבוביות היוצרים ערוצי מוליך יון באמצעות DIB. Monazomycin (Mz), אנטיביוטיקה טעונה חיובית היוצרת ערוצים סלקטיביים קטיון דרך bilayer ב מספיק פוטנציאל transmembrane37,44, נבחר כדי להדגים את הקשר הזה. מדידות אלה נערכו על בסיס BTLE (2 מ"ג / מ"ל ריכוז סופי בשתי טיפות) DIB מסומם עם Mz (1 מיקרוגרם / מ"ל הריכוז הסופי בשתי טיפות). עקבות הזרם לעומת המתח המוצגות באיור 7a התקבלו על ידי החלת מתחי קרום סינוסואידיים ומדידת הזרם המושרה בשתי טמפרטורות שונות; החצים והמספרים הבאים באיור 7a מסייעים לדמיין את רבעי המתח הסינוסואידי העוקבים ביחס לזמן. סוג זה של מדידה מבוצע לעתים קרובות כדי לבחון את תלות המתח של הזרם דרך ערוצי יון. הנתונים כאן מראים כי הגדלת הטמפרטורה של DIB מ 27 °C (69 °F) ל 45 °C (60 °F) גורם הסף להיווצרות ערוץ לעלות ~ |100 mV| ~ |110 mV|. שינוי זה, ככל הנראה מונע על ידי עובי הממברנה הגבוהה יותר עקב שמן נספג, מראה כי מחסום האנרגיה להחדרת עלה. ההיסטרזיס בעקומות אלה - אשר מסמל התנגדות זיכרון - יכול להיגרם על ידי שינויים הנגרמים על ידי מתח באזור bilayer או קינטיקה של היווצרות ערוץ Mz ואיון44.

כדי לסייע בהפרדת גורמים אלה ב- DIBs, ניתן למדוד שינויים ארעיים בזרם היון בתגובה למתח צעד DC. איור 7b מציג את צפיפות הזרם הנמדדת עבור אותה קרום BTLE מסומם ב-Mz באותה רמת מתח (+90 mV) ושתי טמפרטורות שונות (27 °C (27 °C (70 °F) ו 45 °C (69 °F) ו- 45 °C (70 °F). הנתונים מראים בבירור כי הקינטיקה של תגובות הערוץ שונה לגמרי. יש לציין, ב 27 מעלות צלזיוס, הממברנה מציגה עלייה מהירה יותר, גדולה יותר בזרם שלאחר מכן על ידי ריקבון חולף (האחרון הוא תוצאה של תעלות Mz טרנסלוקציה על פני bilayer למצב לא פעיל44). התגובה היא הרבה יותר מושתק ב 45 °C (69 °F), שם עלייה בצורת Sבזרם אינו ממשיך על ידי ירידה עוקבת. הבדלים כגון אלה מועילים להערכת הקינטיקה של תגובות ערוץ והבנה כיצד אלה יכולים לתרום ההתנגדות הדינמית הכוללת של הממברנה.

Figure 4
איור 4: לולאה פתוחה לעומת חימום בלולאה סגורה. פאנל ( א )משווהאת תגובות הזמן עבור מערכת הלולאה הסגורה הנמדדת והמדומה (ראה SI) לשלב טמפרטורה של +20 °C (70 °F) לתגובת החימום בלולאה פתוחה בעוצמה קבועה. לוח (b) מציג את העוצמה המתפוגגת על-ידי כל מערכת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מדידת קיבוליות וטמפרטורה משתנה. התגובה הנוכחית של צורת גל מרובעת טיפוסית לקלט צורת גל משולשת של 10 mV, 10 הרץ על קרום השומנים BTLE העובר מעבר פאזה מוצג ב - (a). מעבר הפאזה של השומנים ניתן לראות גם בנתוני מדידת האזור המוצגים לעיל (a). קיבוליות מנורמלת על ידי קיבוליות ראשונית ב 27 °C (70 °F) מוצג בלוח (ב) התווה כפונקציה של טמפרטורה עבור מחזור חימום וקירור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: לוח מדידות קיבוליות ספציפי (a) מציג קיבוליות נומינלית לעומת אזור דו-שכבתי המתקבל באזורי מגע עוקבים עבור שתי טמפרטורות שונות. רגרסיות ליניאריות לכל ערכה משמשות לקביעת הערכים המתאימים שלהן של CM. פאנל (ב) התוויות CM לעומת T, בעוד פאנל (ג) מציג את צורת הגל הנוכחית קיבולי יציב (שמאל) ואזור מגע (ימין) תחת הפרדה טיפה ניסיון ב 25 °C (69 °F).

Figure 7
איור 7: עמידות בקרום תלוי מתח וקינטיקה של ערוץ יון Mz לעומת טמפרטורה. פאנל (א)   מראה כיצד מערכת היחסים במתח הנוכחי משתנה עם הטמפרטורה עבור DIBs BTLE נוצר בין טיפות המכילות 1 מיקרוגרם / מיליליטר Mz. החצים והמספרים מייצגים את החלקים העוקבים של גל הסיין המוחל. ההבדלים בעקבות אלה ממחישים כיצד הטמפרטורה מסיטה את סף המתח להחדרת Mz, המזוהה כגודל המתח שבו הזרם המושרה עולה בחדות. כמו כן, פאנל (b) מראה את טמפרטורת ההשפעה יש על התגובה זרם ארעי המושרה על ידי מתח צעד DC של 90 mV. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור S1: גוף אלומיניום. ציור זה מציג את הממדים והתכונות הדרושים לייצור גוף האלומיניום שהוא הבסיס של השלב המחומם. 25.2 מ"מ X 26 מ"מ כתמים שטוחים הסמוכים לבאר השמן נועדו לאפשר כמות מקסימלית של מגע שטח הפנים בין המתקן לבין גופי החימום להולכת חום. כמו כן, אלומיניום נבחר עבור חומר אביזר הבסיס בשל מוליכות תרמית גבוהה שלה. חור בורג M3 X 0.5 מ"מ שנקרא בהדפסה משמש לאבטחת ולמיקום התרמופול בבאר השמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S2: מצע אקרילי. המצע האקרילי הוא חתיכה פשוטה יחסית לפברק, ללא תכונות מצטיינים קריטיים, למעט הפרופיל. הפרופיל החיצוני תוכנן תוך התחשבות בפוקה - עול כך שהמצע האקרילי יכול להיות מכוון רק בגוף באופן שיאפשר מספיק מקום לתרמוקופלה להשתלב היטב בשמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S3: הרכבת במה מחוממת. תצוגה מפוצצת של השלב המחומם שהורכב סופקה כדי לסייע לנסיין במהלך ההתקנה הראשונית. כמו כן, שימו לב לאזור המודגש על ידי העיגול המקווקו, שכן זוהי העמדה האידיאלית למלא את גוף האלומיניום בשמן במהלך שלב פרוטוקול 1.8. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S4: פתח נתוני לולאה ואת לוח הדוגמנות Simulink. (א) מציג את תגובות הטמפרטורה בלולאה פתוחה לרמות הספק DC משתנות ששימשו להערכת זמן ההשהיה, td, קבוע הזמן, τ , ורווח חימום לולאהפתוחה, α, של המערכת. זמן ההשהיה מייצג את השהיית הזמן לפני שהטמפרטורה מתחילה לעלות (~ 20 שניות). כל ערך של τ (מסומן על ידי *, ~ 125 s) מוגדר כזמן הנדרש עבור 63.2% מכלל עליית הטמפרטורה להתרחש. לוח (b) מציג את שינוי המצב היציב בטמפרטורה (∆T) לעומת הכוח המוחל. שיפוע הנתונים שהותוו ב- (b) שימש לחישוב α, המייצג את היחס בין שינוי הטמפרטורה לכל עוצמה שסופקה. פרמטרים אלה שימשו במודל המוצג בחלונית (c) וניתן כקובץ משלים כדי לכוונן את בקר ה- PI כדי להשיג את תגובת בקרת הטמפרטורה הרצויה בלולאה סגורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S5: נתוני קיבוליות ספציפיים נוספים. העלילות המוצגות באיור 6א,b נאספו מערכת נתונים זו של CM. עלילה זו גם מציגה את חוסר היכולת למדוד במדויק קיבוליות בטמפרטורות של 25 °C (69 °F) ומטה, ולכן מדידה זו לא נכללה ערכת הנתונים. שינויי האזור הדרושים למדידת Cm מדויקת דורשים הפעלת כוח מופרז על הטיפות מהמיקרומניפולטורים, מה שגורם לעיוות ניתוק צורת הטיפות ואזור המגע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קבצי קידוד משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר בזאת מספק הוראות להרכבה ותפעול של מערכת ניסיונית לשליטה בטמפרטורת השמן והטיפות המשמשות ליצירת DIBs. זה מועיל במיוחד עבור הפעלת היווצרות DIB באמצעות שומנים כי יש טמפרטורות נמס מעל RT. יתר על כן, על ידי שינוי מדויק של הטמפרטורה של מאגר הנפט, טמפרטורת bilayer ניתן לתפעל כדי ללמוד את ההשפעות של טמפרטורות גבוהות על תכונות ממברנה שונות ומאפיינים, כולל קיבוליות, אזור, עובי, שינויים תרמוטרופיים המושרה שלב, קינטיקה של מינים פעילים קרום, ואת האנרגטיקה של הידבקות של ממשק bilayer37,38.

הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים לפני השימוש במחקר DIB: 1) הכנה והרכבה של גוף השלב המחומם; 2) חיבור המכשירים השונים; ו-3) אישור ביצועי בקרת טמפרטורה מתאימים עם הישגי הבקרה היחסיים והאינטגרליים שנבחרו. החשוב ביותר בחלק 2, המשתמש חייב לוודא להימנע מנתיבי הולכה משותפים בין הפלט של מגבר חשמל (>זרמיmA) לבין ראש מהדק התיקון (זרמי pA-nA). קצר בשוגג עלול לגרום לנזק בלתי הפיך לראש. בנוסף, הקפדה על חיבור המחשב וכל המכשירים לקרקע חשמל AC משותפת, והשימוש בכלוב פאראדיי מקורקע ליד אלקטרודות הראש והטיפה מסייע למזער את הרעש במדידות זרם bilayer. לאחר השלמת ההתקנה בחלק 2, על המשתמש להעריך תחילה את תגובת החימום בלולאה פתוחה של מאגר הנפט על-ידי החלת מתח קבוע על רכיבי החימום ורישום עליית הטמפרטורה הבאה (כפי שמוצג באיור 4a). ניתן להשתמש בסוג זה של תגובה מעריכית כדי להגדיר ולדמות מודל פשוט של מערכת הלולאה הסגורה לקבלת ערכים משתנים של רווחי בקרה (ראה איור S4 לקבלת פרטים). רווחי הבקרה המדווחים בזאת מאפשרים למערכת להתחמם לרמת טמפרטורה רצויה במהירות (~ 2 דקות) ועם מעט overshoot ולשמור על ערך נקודה מוגדר במדויק. אבל הרווחים הספציפיים הנדרשים יהיו תלויים ברמת ההספק של גופי החימום, כמו גם בגיאומטריה של המתקן התומך במאגר הנפט. לאחר שייקבעו ערכים מתאימים של רווחי בקרה ומערכת בקרת המשוב תפעל כרצונו, המשתמש יוכל להתחיל להרכיב ולאפיין DIB.

הפרוטוקול אינו משנה את תהליך היווצרות או אפיון DIB, אולם יש מגבלות ושיקולים. העלאת הטמפרטורה של השמן יכולה להשפיע על האופן שבו טיפות תלויות על האלקטרודות, בשל ירידה במתח המונולאייר וצפיפות השמן המגבירים את הזרמים הנפולים וההכנעתיים בשמן שיכולים להזיז את הטיפות. לפיכך, הפרוטוקול מציע להוריד את קצות האלקטרודות קרוב לפני השטח התחתונים של המצע כך טיפות נתמכות ומוחזקות עדיין על ידי המאגר האקרילי. המשתמש צריך להעריך כמה המצע עשוי להיות עיוות טיפות (אם הוריד רחוק מדי), ולשקול עיוות זה בעת חישוב של האזור של bilayer מתמונות של DIBs כפי שנדון במקומות אחרים22.

בעוד המערכת המתוארת מוגבלת לחימום של אמבט השמן, מכשיר קירור Peltier יכול לשמש במקום אלמנטים חימום התנגדות אם בדיקות בטמפרטורות מתחת RT יש צורך. במקרה זה, עם זאת, המשתמש יצטרך לשקול את נקודת ההקפאה של שלב השמן. אלקנים רבים להקפיא בטמפרטורות גבוהות יותר כי 0 °C (69 °F); הקסדקאן המתואר בזאת קופא ב 18 °C (69 °F). אם השמן קופא, טיפות כבר לא יהיו ניתנות להזזה וביליאר בין טיפות עלול להפוך לבלתי יציב או לקרע.

עבור הרכב השומנים שלא נבדק בעבר, ידועים מפתח הם זמן הדגירה והטמפרטורה הנדרשים כדי לאפשר הרכבה מונולאית מספיק על פני השטח של הטיפות. הכלל הוא לחמם את השמן לטמפרטורה מעל TM, שם ניידות השומנים משופרת ומאפשרת דיפוזיה לרוחב מהירה יותר ואריזה הדוקה יותר בממשק מי השמן45, ולחכות מספיק זמן כך שאריזת המונולאייר בממשק מי השמן גבוהה. המשתמש רשאי לסקור ספרות שפורסמה או לשקול מדידות משלימות משלהם כדי לקבוע את ערכי הזמן והטמפרטורה המתאימים: מדידות מתח בין-גזעיות על גוניומטר טיפת תליון יכולות לשמש להערכת הזמן הנדרש להרכבה של monolayer46 וקלורימטריית סריקה דיפרנציאלית משמשת לעתים קרובות לזיהוי מעברים תרמוטרופיים של שומנים38. או גישה איטרטיבית ניתן לרדוף כדי לזהות זמן וטמפרטורה מתאימים שבו היווצרות bilayer הוא עקבי, הממברנה יציבה במשך יותר מכמה דקות, ואת ההתנגדות של bilayer הוא >1 GΩ. במחקרים אחרונים עם תמצית השומנים הכוללת E. coli (ETLE)37 ו BTLE38,47 טמפרטורה התחלתית >50 מעלות צלזיוס מוביל באופן עקבי להיווצרות bilayer יציב. באופן דומה, הטמפרטורה היציבה המינימלית לאחר DIB עבור סוג השומנים נתון עשויה להשתנות גם בין בחירות השומנים. לדוגמה DIBs ETLE ניתן לקרר ל 25 °C37, ואילו רכיב יחיד DPPC DIBs תמיד התמזג מתחת TM~ 40 °C38. תצפית הראתה כי BTLE DIBS להראות כי 27 °C (69 °F) היא טמפרטורה מינימלית בטוחה לשמירה על bilayer יציב.

התוצאות הייצוגיות שלנו מראות כי שינויים בטמפרטורה יכולים להשפיע מאוד על המאפיינים של DIB וכתוצאה מכך. הנתונים באיור 5 מראים כי היבול הנומינלי של הממברנה יורד ככל שהטמפרטורה עולה. בגלל קיבוליות, C, הוא פרופורציונלי ישירות לאזור bilayer, A, ו ביחס הפוך לעובי, ד, כפי שניתן על ידי

Equation 1, (1)

ירידה ב- C יכולה להתבטא בירידה ב- A, עלייה ב- d, או בשניהם (בהנחה של היתר דיאלקטרי קבוע, ε). קשרים אלה מניעים את השימוש במדידות קיבוליות ובתמונות DIB כדי להעריך שינויים ב- C, Aו- Cm לעומת טמפרטורה כדי לקבוע אילו השפעות משמעותיות. הנתונים הכלולים באיור 5 ובאיור 6 עבור BTLE DIBs מראים כי הן C והן Cm (המייצג את היחס ε/d)יורדים בכמעט 50% כאשר הטמפרטורה עולה מ-30 C ל-60 C. יחד, אלה מצביעים על כך שטמפרטורה גבוהה יותר מעבה את הדו-שכבתי, בשל מסיסות מוגברת של שרשראות האציל של השומנים בהקסדקאן48. השמן הנוסף בקרום יכול להשפיע גם על המתח הבין-גזעי של הדו-שכבתי ועל זווית המגע בין טיפות22,38. ניתן לכמת אפקטים אלה על-ידי ניתוח תמונות של DIB במרווחי זמן שצוינו על-ידי המשתמש כדי לפקח על אזור bilayer וזווית מגע במהלך חימום וקירור.

העדפת הטמפרטורה של שמן בקרום יכול לשמש גם כדי להעריך את טמפרטורות ההיתוך התרמוטרופי של השומנים ולהשפיע על קינטיקה ערוץ היונים. ניתן להגדיר את טמפרטורת ההיתוך של תערובת שומנים על ידי איתור שינויים לא-מונוטוניים ביחסי C לעומת T כמו באיור 6. המדידות הנוכחיות באיור 7 חושפות עוד כי שינויים הנגרמים על-ידי טמפרטורה בשלב (כלומר נזילות) ועובים יכולים להשפיע על מתח הסף להחדרת יונופורים כמו Mz. אסוציאציות פיזיות אלה חשובות להבנת התנהגויות ערוץ היונים בקרומי מודל, במיוחד בתרחישים שמטרתם לשכפל סביבות טמפרטורת הגוף. עם זאת, הם עשויים גם להיות שימושיים עבור כוונון המוליכות של bilayer ביישומים כגון התקני מחשוב נוירומורפיים47 לדוגמה, קינטיקה ערוץ מוגברת הם תכונה רצויה בעת ייצור התקנים המציגים עמידות לזיכרון כי צריך לחקות את המהירות, פונקציונליות, פלסטיות לטווח קצר של המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

תמיכה כספית ניתנה על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט CBET-1752197 ומשרד חיל האוויר של מענק מחקר מדעי FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Bioengineering גיליון 170 הנדסה ביולוגית bilayer שומנים bilayer ממשק טיפה בקרת טמפרטורת משוב מדידות קיבוליות ערוץ היונים מדעי החיים
הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter