Summary
Dette papir beskriver metoder, der demonstrerer tre almindelige biofilmhøstnings- og opdelingsteknikker på to overfladetyper, robusthedstest af en høstmetode og minimumsinformation, der skal overvejes, når man vælger og optimerer høst- og opdelingsteknikker for at øge reproducerbarheden.
Abstract
Biofilmmetoder består af fire forskellige trin: dyrkning af biofilmen i en relevant model, behandling af den modne biofilm, høst af biofilmen fra overfladen og opdeling af klumperne og analyse af prøven. Af de fire trin er høst og opdeling de mindst undersøgte, men ikke desto mindre kritiske, når man overvejer potentialet for testbias. Denne artikel viser almindeligt anvendte høst- og opdelingsteknikker til biofilm dyrket på tre forskellige overflader. De tre biofilm høst og opdeling teknikker, hentet fra en omfattende litteratur gennemgang, omfatter hvirvel og sonikering, skrabning og homogenisering, og skrabning, hvirvel og sonikering. To overfladetyper overvejes: hårdt ikke-porøst (polycarbonat og borosilikatglas) og porøst (silikone). Derudover giver vi anbefalinger til de minimumsoplysninger, der skal medtages, når den anvendte høstteknik rapporteres, og en ledsagende metode til at kontrollere for bias.
Introduction
Definitionen af biofilm har udviklet sig i løbet af de sidste par årtier og omfatter mikrobiel tilknytning til en række biologiske og/eller ikke-biologiske overflader, herunder ikke-cellulære komponenter1, der viser forskellig vækst og genetisk ekspression2 inden for en matrix. Biofilm giver beskyttelse mod miljøbelastninger såsom tørring og kan gøre virkningen af kemiske desinfektionsmidler mindre effektiv, hvilket resulterer i mikrobernes overlevelse. De overlevende i en biofilm kan potentielt udgøre en kilde til patogene mikroorganismer, der er et folkesundhedsproblem3.
Biofilmmetoder består af fire trin, vækst, behandling, prøveudtagning (høst og opdeling) og analyse. Vækst, det første trin, hvor brugeren bestemmer organismens vækstbetingelser, temperatur, medier osv., Er det mest overvejede og rapporterede i biofilmlitteraturen4,5,6,7. Behandlingstrinnet evaluerer antimikrobielle stoffer (f.eks. desinfektionsmidler) for at bestemme deres virkning enten mod en moden biofilm3,8,9, eller det antimikrobielle stof kan inkorporeres i overfladen for at bestemme produktets evne til at forebygge eller reducere biofilmvækst10. Det tredje trin, prøveudtagning, omfatter trin til at høste biofilmen fra den overflade, hvorpå den voksede, og til at opdele de fjernede klumper3,8,11. Det fjerde trin, analysen, kan omfatte levedygtige celletal, mikroskopi, fluorescensmålinger, molekylære resultater og/eller en matrixkomponentvurdering8,9. Vurdering af data giver information om resultatet af et eksperiment. Af de fire er prøveudtagning ofte det mest oversete trin, fordi det forudsætter, at den valgte biofilmhøstnings- og/eller opdelingsteknik er 100 % effektiv, ofte uden verifikation11.
Planktoniske suspensioner af bakterier, der ofte anses for at være homogene, kræver simpel hvirvel før analyse. Biofilm er imidlertid komplekse samfund sammensat af mikroorganismer (prokaryote og / eller eukaryote), exopolysaccharider, proteiner, lipider, ekstracellulært DNA og værtsceller12. Der er behov for skridt ud over traditionelle planktoniske mikrobiologiske dyrkningsmetoder for i tilstrækkelig grad at høste biofilm fra en overflade og derefter opdele den i en homogen enkeltcellesuspension. En omfattende litteraturgennemgang (oplysninger, der ikke er medtaget i denne publikation) viste, at valget af fjernelses- og opdelingsteknik afhænger af en række faktorer, herunder arter, der er til stede i biofilmen, overflade, som biofilmen er fastgjort til (ikke-porøs eller porøs), tilgængelighed til vækstoverflader (let aftagelig kupon eller fysisk ødelæggelse af apparater, hvor biofilmen vokser), overfladegeometri (areal og form), tæthed af biofilm på vækstoverflader og tilgængeligt laboratorieudstyr.
Når biofilm høstes fra en overflade, er den resulterende cellesuspension heterogen. Hvis denne uensartede suspension skal opregnes nøjagtigt, skal den opdeles i individuelle celler. Levedygtige pladetællinger antager, at en kolonidannende enhed stammer fra en bakterie. Hvis der placeres aggregater af biofilm på vækstmediet, er det umuligt at skelne mellem individuelle celler, hvilket kan føre til unøjagtige skøn. For eksempel, under desinfektionsmiddeleffektivitetstest, hvis en behandling fjerner biofilm meget effektivt fra en overflade sammenlignet med kontrollen, kan logreduktionen forekomme kunstigt stor sammenlignet med kontrollen. På den anden side vil et kemisk desinfektionsmiddel, der fastgør biofilm på en overflade sammenlignet med kontrollen, synes at have en lavere logreduktion11. Denne type scenarie kan føre til forudindtaget fortolkning af eksperimentelle data.
Som forberedelse til offentliggørelsen fastslog en gennemgang af litteraturen, at fælles tilgange til høst og opdeling af biofilm omfatter skrabning, podning, sonikering, hvirvel eller en kombination af disse. Skrabning defineres som fysisk fjernelse af biofilm fra overflader med en steril pind, spatel eller andet værktøj. Swabbing refererer til fjernelse af biofilm fra overflader med en bomuldstippe eller andet fast absorberende materiale. Sonikering refererer til forstyrrelse af biofilm fra overflader via ultralydbølger fordelt gennem vand. Vortexing refererer til brugen af en mixer for at opnå en flydende hvirvel af prøven inde i et rør. Homogenisering bruger roterende knive til at forskyde høstede biofilmklumper i en enkeltcellesuspension. I denne artikel præsenterer vi tre høst- og opdelingsmetoder for to forskellige overfladetyper, hårde/ikke-porøse og porøse.
Der findes en liste over anbefalede minimumsoplysninger, som forskere bør medtage i publikationens metodeafsnit. Vi håber, at inddragelse af disse oplysninger gør det muligt for andre forskere at reproducere deres arbejde. Der er ingen perfekt høst- og opdelingsmetode, derfor gives der også anbefalinger til, hvordan man kontrollerer teknikken.
Tre almindelige metoder til høst og opdeling af biofilm fra almindelige vækstoverflader er demonstreret i denne artikel. Disse oplysninger vil gøre det muligt for forskere bedre at forstå den overordnede præcision og bias af en biofilm testmetode. Beskrevne metoder er som følger: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på polycarbonatkuponer (hård ikke-porøs overflade) under høj væskeforskydning i CDC Biofilm Reactor høstes og opdeles efter en femtrins kombination af hvirvel og sonikering for at opnå biofilmhøst og opdeling (2) A P. aeruginosa biofilm dyrket på borosilikatglaskuponer (hård ikke-porøs overflade) i drypstrømsreaktoren under lav væskeforskydning høstes og opdeles ved hjælp af skrabning og homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm dyrket i silikonerør (porøs overflade) høstes og opdeles ved hjælp af skrabning efterfulgt af sonikering og hvirvel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hvirvel og sonikering
- Dyrk en moden P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm dyrket i henhold til ASTM Standard E25622.
- Ved udgangen af vækstperioden på 48 timer skal du forberede dig på at behandle biofilmen og prøvekuponerne i henhold til ASTM-standard E28718
- Aseptisk indsæt autoklavede stænkskærme i sterile 50 ml koniske rør ved hjælp af flammesteriliserede tang. Gentag for alle rør, der vil modtage behandling. Rør til kontrolkuponer behøver ikke en stænkskærm.
- Aseptisk fjern en tilfældigt udvalgt stang fra CDC Biofilm Reactor. Skyl kuponer for at fjerne løst fastgjorte celler ved forsigtigt at dyppe stangen i 30 ml sterilt bufferet vand.
- Hold stangen parallelt med bordpladen, over et tomt, sterilt 50 ml konisk rør, og brug en flammesteriliseret unbrakonøgle til at løsne sætskruen for at tabe en biofilmbelagt kupon i røret. Gentag for det ønskede antal kuponer. Fjern stænkskærme og læg dem i en separat beholder til sterilisering.
- Ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette pipette langsomt 4 ml af behandlingen eller kontrollen ind i rørene, så væsken strømmer ned ad indersiden af rørets væg.
- Tryk forsigtigt på bunden af røret, så eventuelle luftbobler under kuponen forskydes. Tillad 30 - 60 s mellem hver tilføjelse.
- Ved afslutningen af den angivne kontakttid pipetter 36 ml neutralisator ind i rørene i samme rækkefølge, som behandlingen (eller kontrollen) blev påført.
BEMÆRK: Det endelige volumen af kombineret behandling og neutralisator er vigtigt for nøjagtigt at bestemme biofilmlogdensiteten. - Vortex hvert rør på den højeste indstilling i 30 ± 5 s. Sørg for, at der opnås en komplet hvirvel.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed ved hvirvel af tunge kuponer såsom rustfrit stål i glashætteglas, hvor brud kan forekomme. - Bestem det optimale antal rør pr. bad og placering i reagensglasstativet, inden der behandles faktiske prøver. Hvis du behandler flere prøver, skal du bekræfte, at vandtemperaturen i sonikeringsbadet er 21 ± 2 oC.
- Placer rør i rørstativ suspenderet i afgasset sonikator, således at vandstanden i badet er lig med væskeniveauet i rør. Sonikat ved 45 kHz, 100% effekt og normal funktion i 30 ± 5 s. Gentag hvirvel- og sonikeringscyklusser, og afslut derefter med en endelig hvirvel (5 cyklusser i alt).
BEMÆRK: Disse rør med den høstede og disaggregerede biofilm er100 eller 0 fortynding. - Serielt fortyndet prøve i bufret vand. Plade på R2A-agar ved hjælp af passende pletteringsmetode. Inkuber ved 36 ± 2 oC i 24 timer. Tæl kolonier, alt efter hvad der er relevant for den anvendte belægningsmetode, og registrer data.
2. Skrabning og homogenisering
- Dyrk en moden P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm i henhold til ASTM Standard E264713.
- Opsæt prøveudtagningsstationen til at omfatte prøveudtagningstavle, 95% ethanol i et bægerglas, alkoholbrænder, hæmostater, værktøj til fjernelse af kuponer, bægerglas med sterilt fortyndingsvand og fortyndingsrør til skylning af kuponerne.
- Sluk for pumpen. Fjern et kanaldæksel, og brug et sterilt værktøj til fjernelse af kuponer og hæmostater til at fjerne kuponen, og pas på ikke at forstyrre biofilmen.
- Skyl kuponen ved forsigtigt at nedsænke med en væskebevægelse i 45 ml sterilt fortyndingsvand (indeholdt i et 50 ml centrifugerør). Vend straks bevægelsen om for at fjerne kuponen.
- Anbring kuponen i et bægerglas indeholdende 45 ml sterilt fortyndingsvand. Den biofilmdækkede kuponoverflade skrabes i nedadgående retning i ca. 15 s ved hjælp af en steril spatel eller skraber. Skyl spatlen eller skraberen ved at røre den i bægerglasset. Gentag skrabnings- og skylleprocessen 3-4 gange, og sikre fuld dækning af kuponoverfladen.
- Skyl kuponen ved at holde den i en 60° vinkel over det sterile bægerglas og pipettere 1 ml sterilt fortyndingsvand over kuponens overflade. Gentag for i alt 5 skylninger. Det endelige volumen i bægerglasset er 50 ml.
BEMÆRK: Det endelige volumen af kombineret behandling og neutralisator er vigtigt for nøjagtigt at bestemme biofilmlogdensiteten. - Udskift hvert kanaldæksel, når kuponerne fjernes.
- Arbejder i biosikkerhedsskabet, homogenisere den skrabede biofilmprøve. Fastgør en steril homogenisatorsonde til homogenisatoren, anbring sondespidsen i væsken, tænd homogenisatoren og rampe op til 20.500 o / min.
- Homogeniser prøven i 30 s. Skru ned for omdrejningstallet, og sluk for homogenisatoren.
- Rens sonden mellem biofilmprøver ved at homogenisere et 9 ml sterilt fortyndingsemne ved 20.500 o / min i 30 s som beskrevet ovenfor. Homogeniser et 9 ml rør med 70% ethanol i 30 s, løsn sonden og lad stå i ethanolrøret i 1 min. Homogeniser to yderligere fortyndingsemner.
BEMÆRK: Der kan anvendes en engangshomogenisatorsonde til hver prøve. - Fortynd prøverne serielt i bufferet vand. Plade på R2A-agar ved hjælp af den relevante pletteringsmetode. Inkubere plader ved 36 ± 2oC i 24 timer, tælle kolonier efter behov til den anvendte belægningsmetode og registrere data.
3. Skrabning, hvirvel og sonikering
- Dyrk en moden Escherichia coli ATCC 53498 biofilm i silikonekateterrør10.
- Forbered prøveudtagningsmaterialer: skyllerør, sterilt centrifugerør, tom steril petriskål, flammesteriliseret hæmostat i rustfrit stål og saks, timer og lineal.
- Når pumpen er sat på pause, skal du bruge 70% ethanol til at rengøre ydersiden af slangen. Mål 2 cm fra enden, undgå det område, der er fastgjort til stikket, og markér slangen for at bestemme skæreplaceringer.
- Skær slangen på 2 cm-mærket med flammesteriliseret saks og læg segmentet i tom steril petriskål. Tør slangen af med 70% ethanol, og tilslut den distale ende til affaldsslangen igen.
- Skyl slangesegmentet for at fjerne planktoniske celler. Med flammesteriliserede tang nedsænkes forsigtigt slangesegmentet i 20 ml sterilt fortyndingsvand og fjernes derefter straks. Anbring segmentet i 10 ml neutralisator.
- Med flammesteriliserede tang skal du holde slangesegmentet og skrabe med steril træapplikatorpind, indtil alle indvendige områder af slangen er skrabet. Skyl lejlighedsvis pinden i 10 ml neutralisator og læg segmentet tilbage i prøverøret. Det skrabede slangesegment er fortyndingen på 100 eller 0.
BEMÆRK: Det endelige volumen af kombineret behandling og neutralisator er vigtigt for nøjagtigt at bestemme biofilmlogdensiteten. - Vortex hvert rør på den højeste indstilling i 30 ± 5 s. Placer røret i rørstativ suspenderet i sonicator, således at vandstanden i badet er lig med væskeniveauet i rør. Sonikat ved 45 kHz, 100% effekt og normal funktion i 30 ± 5 sekunder. Gentag hvirvel- og sonikeringscyklusser og afslut derefter med en endelig hvirvel.
BEMÆRK: Dette rør med den høstede og disaggregerede biofilm er 100 fortynding. - Fortynd prøverne serielt i bufferet vand. Plade på Tryptic Soy Agar ved hjælp af den passende pletteringsmetode.
- Inkuber plader ved 36 ± 2 oC i 24 timer. Tæl kolonier, alt efter hvad der er relevant for den anvendte belægningsmetode, registrer data og beregn det aritmetiske gennemsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering/bekræftelse af en høstmetode
Flere undersøgelser, der blev udført i vores laboratorium, undersøgte evnen til hvirvel og sonikering til effektivt at høste biofilm dyrket i biofilmreaktoren (ASTM E2562)2 ved hjælp af Single Tube Method (ASTM E2871)8.
En P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm blev dyrket i henhold til ASTM E25622 på borosilikatglaskuponer. Efter 48 timer blev fire kuponer anbragt i hætteglas, "behandlet" med 4 ml sterilt bufferet vand og neutraliseret med 36 ml 2x D / E neutraliserende bouillon. Den oprindelige sonikeringsindstilling på 45 kHz, 10% effekt, Fejeindstilling, 30 ± 5 s blev brugt til at høste og opdele biofilmen fra tre af de fire kuponer. Efter afslutningen af hvirvel- og sonikeringscyklussen blev hver kupon farvet med krystalviolet og fotograferet. Figur 1 viser mængden af biofilm, der er tilbage på de tre kuponer efter hvirvel og sonikering sammenlignet med kontrollen.
For at teste dette yderligere blev en P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm dyrket som beskrevet tidligere, og to sonikeringsindstillinger blev sammenlignet: 1) 45 kHz, 10% effekt, Fejeindstilling, 30 ± 5 sekunder og 2) 45 kHz, 100% effekt, Normal indstilling, 30 ± 5 sekunder. En kupon fra hvert sæt af de tre blev farvet med BacLight Live / Dead plet og afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi (CM). De resterende to kuponer fra hvert sæt blev fortyndet, belagt og opregnet til levedygtige celler. De levedygtige pladetællingsresultater var 9.230 Log10 CFU / kupon ± 0.007 (SD_R) til indstilling 1 og 9.272 Log10 CFU / kupon ± 0.066 (SD_R) til sonikeringsindstilling 2. Disse data bekræftede en EPA Single Tube Method Collaborative Study fra 2015, hvor 9,03 Log10 CFU/kupon ± 0,272 (SD_R) blev opnået9. Ifølge de levedygtige pladetal ser det ud til, at alle tre midler er ens nok til ikke at berettige yderligere undersøgelse af forskellene mellem de to høstmetoder. De mikroskopiske billeder, der er vist i figur 2, kan dog tyde på, at der var mere biofilm tilbage efter brug af indstilling 1 end indstilling 2. Mens vi observerer, at biofilm, der er tilbage på kuponerne, ser ud til at være død (rød i farven), er det vanskeligt at fortolke levedygtigheden ved brug af BacLight Live / Dead-pletten14,15. I stedet for at fokusere på levedygtighedsimplikationer af den farvede biofilm, brugte vi denne plet til at visualisere biofilm, der var tilbage på overfladerne. Derudover, mens vi anerkender, at sonikering kunne være skadelig for bakteriel levedygtighed, viste en publikation fra 2007 af Kobayashi et al.16, at øget sonikeringstid ud over 5 minues resulterede i nedsat levedygtige pladeantal. Da vores undersøgelse brugte i alt 1 minuts sonikering, er vi overbeviste om, at få celler blev dræbt via sonikering som vist af >9.2 LOG10 CFU / kuponer til de to sonikeringsparametre. Det er interessant, at en fuldstændig høst af biofilmen fra overfladen ikke blev opnået ved nogen af metoderne. Dette fund viser, at levedygtige pladetal alene ikke er tilstrækkelige til at bestemme høst- og opdelingsbias og derfor skal parres med en yderligere metode, f.eks. mikroskopi.
Ud over sonikatorindstillingerne undersøgte vi andre vigtige faktorer, der påvirker sonikering. Disse omfattede væskemængden i hætteglassene (10 eller 40 ml), typen af væske i hætteglasset (bufret vand eller 2X D /E neutraliserende bouillon) og antallet af hætteglas anbragt i badet på samme tid (3 eller 12 hætteglas)9.
P. aeruginosa biofilm på CDC Biofilm Reactor kuponer blev sonikeret ved hjælp af sonikatorindstilling 2 (45 kHz, 100% effekt, Normal indstilling, 30 ± 5 sekunder). Alle prøver blev hvirvlet enten 3 ad gangen eller 6 ad gangen ved hjælp af en hvirvel udstyret med en 6-steds rørfastgørelse og derefter sonikeret som beskrevet i figur 3. En kupon fra hver af følgende kategorier blev afbildet ved hjælp af CM (figur 3).
I den anden undersøgelse, hvor sonikeringsparametre blev undersøgt, antyder de mikroskopiske billeder (figur 3), at minimering af volumenet i rørene, reduktion af antallet af rør, der behandles på én gang og brug af D / E Neutraliserende bouillon (som indeholder overfladeaktivt stof) alle bidrager til forbedret biofilmhøst fra kuponerne.
Biocider kan positivt eller negativt forbedre høst og opdeling. I lighed med at bekræfte, at en neutralisator effektivt stopper den aktive, mens den ikke øger drabet, inden der udføres en effektivitetstest, er det vigtigt at bekræfte, at et biocid ikke påvirker høst og opdeling forskelligt. For effektivitetstest, bias resultater, hvis og kun hvis der er differentiel fjernelse for kontrol vs behandlede biofilmprøver11.
Figur 1: Billeder af kuponer farvet med krystalviolet, der viser resterende biofilm. A) Kupon fjernet fra reaktoren og farvet med krystalviolet. B, C, D) Tre replikatkuponer blev særskilt "behandlet" med sterilt bufferet vand og derefter neutraliseret. For at høste og opdele blev kuponerne hvirvlet (30 ± 5 sekunder) og sonikeret (45 kHz, 10% effekt, fejeindstilling, 30 ± 5 sekunder) to gange og modtog derefter en endelig hvirvel. Billeder venligst udlånt af Danielle Orr og Blaine Fritz. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konfokal mikroskopi billeder af kuponer, der sammenligner to forskellige sonikeringsindstillinger. Kuponer (12,5X forstørrelse) behandlet via sonikering indstilling 1 (45 kHz, 10% effekt, Sweep indstilling) til venstre eller sonikering indstilling 2 (45 kHz, 100% effekt, Normal indstilling) til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Konfokal mikroskopi billeder af kuponer, der sammenligner mængder, sonikering væske og antal rør. Kuponer (12,5X forstørrelse) behandlet i 10 eller 40 ml volumener, i fortyndingsvand (DW) eller D / E neutraliserende bouillon (D / E), 3 eller 12 rør ad gangen med optimeret sonikeringsindstilling (45 kHz, 100% effekt, Normal indstilling). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Nøgleparametre af betydning for høst og disaggagregation Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimumsoplysninger for høst- og opdelingsmetoder
For at skabe reproducerbare biofilmdata på tværs af det videnskabelige samfund er det bydende nødvendigt, at forfattere inkluderer så mange detaljer som muligt om hvert af vækst-, behandlings-, prøveudtagnings- og analysetrinnene i en biofilmmetode. Standardiseringen af biofilmmetoder har hjulpet i denne bestræbelse, da det giver forskeren mulighed for at henvise til en bestemt metode og eventuelle relevante ændringer. Imidlertid indeholder mange papirer kun en sætning eller to til at beskrive biofilmhøst og opdeling. For bedre reproducerbarhed anbefaler vi, at publikationerne indeholder minimumsoplysninger for biofilmhøst. Dette bygger på initiativet Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE), der blev præsenteret af Lourenco et al.17. I tilfælde af anvendelse af sonikering til biofilmhøstning og opdelingsparametre skal oplysningerne omfatte: placering af rør i badet (producentens anbefalinger for at undgå at beskadige transducerne), antal rør sonikeret på samme tid, rørmateriale, volumen og type væske i røret, tilstedeværelse af overfladeaktivt stof, væskeposition i rør i forhold til væskeniveau af ultralydsbad, enhed, der bruges til at holde rørene i badet (glasbægerglas vs. reagensglasstativ), afgasning af vandbad inden sonikering af prøver (hvis afgasning ikke er en producentmulighed, vil enkel betjening af badet, før prøverne indsættes, hjælpe med at fjerne nogle opløste gasser fra badevæsken), vandbadets temperatur (temperaturer kan stige efter lange perioder med sonikering), frekvens (f.eks. 25 kHz eller 45 kHz), badefunktion (f.eks. feje eller normal) og effektområde leveret til transducere (f.eks. 10-100%. Disse indstillinger bør optimeres til den biofilm, der undersøges, det system, der bruges til at dyrke biofilmen og det specifikke mærke / model af ultralydsbad18.
Sonicator indstillinger kan ændres for at optimere ønskede høst effekter. Afgasning fjerner opløst luft i badevæsken og forbedrer derved rengøringskraften. Frekvensen kan justeres til en lav eller høj indstilling. En lav indstilling som f.eks. 25 kHz ville hjælpe med at høste ihærdige prøver, mens en højere indstilling på 45 kHz ville være mere hensigtsmæssig for følsomme prøver. En badfunktion af fejning eller normal giver mulighed for fordeling af kavitation. Fejefunktionen skaber en kontinuerlig forskydning af lydtryksmaksen. Den normale funktion gør det muligt for transducerne at fungere i dobbelt halvbølgetilstand, hvilket kan resultere i døde zoner, hvilket gør sonikeringen mindre effektiv. Effektområderne kan ændres fra 10-100 % af den effekt, der leveres til transducerne19. Det er kendt, at sonikering kan skadeligt påvirke bakteriel levedygtighed. En undersøgelse fra 2008 af Stamper et al.20 udsatte bakteriekulturer for at øge ultralydsenergi over tid for at skabe bakterielle drabskurver. Vi anbefaler, at brugerne bekræfter, at en bestemt kombination af sonikeringsindstillinger ikke forårsager et fald i levedygtige bakterier20.
Der findes ingen perfekt metode til at høste og opdele biofilm, men bestemte metoder virker bedre for nogle overflader/mikrobekombinationer end andre. Vi går ind for, at læseren bestemmer, hvilke parametre der er vigtige for deres særlige biofilmscenarie. Nøgleparametre af betydning for høst og opdeling er inkluderet i supplerende fil 1.
For sonikering undersøgelser udført for at vurdere høst og disaggregation bias, fandt vi, at sonikering er praktisk, effektiv og i stand til at blive standardiseret til høst og opdeling af biofilm fra overflader. Placering af kuponer i hætteglas minimerer variation mellem tekniker og tekniker, der ville opstå i metoder, hvor kuponer f.eks. Fysisk skrabes af laboratoriepersonale. Selvom det virker simpelt nok at placere hætteglas i et sonikerende vandbad, er der mange parametre, der skal overvejes for at opnå optimal høst af biofilm.
To typer sonikering udstyr er tilgængelige, ultralydsbade og ultralydssonder. Dette papir fokuserer primært på ultralydsbade, hvor ultralydsenergi genereres i området fra høj (20 - 45 kHz) til normal (40 - 60 Hz) frekvens.
Tre hovedprocesser er i spil, når du bruger en ultralydsenhed til at rengøre en overflade. Elektrisk energi omdannes til akustisk energi, når en højfrekvent strøm sendes til en piezoelektrisk eller magnetostriktiv transducer, der svinger som reaktion på strømmen. Svingningen genererer kompressionsbølger (rarefaction) i væsken. Kavitationsbobler dannes på grund af undertryk under sjældenhed. Boblerne vokser, indtil de når en ustabil størrelse og kollapser, hvilket skaber en vandstråle, der renser overflader21.
Tre høst- og opdelingsmetoder demonstreres i denne artikel: sonikerings- og hvirvelmetoder til høst og opdeling af biofilm, når de dyrkes på polycarbonatkuponer i CDC Biofilm Reactor i henhold til Single Tube Method. Skrabnings- og homogeniseringsmetoder til høst og opdeling af biofilm vises, når de dyrkes på glaskuponer ved hjælp af Drip Flow Biofilm Reactor. Skrabning, sonikering og hvirvelmetoder til høst og opdeling af biofilm vises, når de dyrkes i silikonerør.
Der er ingen perfekt metode til at høste og opdele biofilmen, men nogle tilgange er bedre til forskellige overflader og / eller applikationer. Det vigtige er at tage sig tid til at validere den anvendte metode. I dette papir diskuterede vi brugen af krystalviolet og mikroskopi, men der findes andre valg afhængigt af den krævede følsomhed. Hvis forskningen omfatter effektivitetstest, er det afgørende at bekræfte gyldigheden af tilgangen i nærvær af det antimikrobielle stof6. Alt udstyr er lidt anderledes, så selvom høst- og opdelingsmetoden er blevet standardiseret, er det stadig klogt at bekræfte processen for det anvendte udstyr. Høst- og opdelingsmetoder er specifikke for overfladerelaterede bakterier og biofilmbakterier. Forskning har vist, at forkerte valg kan føre til forudindtagede testresultater. Ikke desto mindre er høst og opdeling det mindst undersøgte af de fire trin i biofilmmetoder. Det er generelt også det urevaliderede trin (taget for givet som arbejde) med de mindste oplysninger til stede i offentliggjort papir, hvilket gør det udfordrende at reproducere processen i et andet laboratorium. Dette papir og ledsagende video viser tre fælles tilgange til to overfladetyper og foreslår, hvordan man validerer en metode til et individuelt laboratorium. Disse oplysninger vil hjælpe forskere med at træffe mere informerede beslutninger om, hvilken metode der skal anvendes, og giver vejledning i, hvad de skal rapportere for at forbedre reproducerbarheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløringer.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers og Fei San Lee for deres bidrag til denne artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
