Summary
Detta dokument beskriver metoder som visar tre vanliga biofilm skörd och uppdelning tekniker på två yttyper, robusthet testning av en skördemetod och minsta information att tänka på när du väljer och optimerar skörde- och uppdelningstekniker för att öka reproducerbarheten.
Abstract
Biofilmsmetoder består av fyra distinkta steg: att odla biofilmen i en relevant modell, behandla den mogna biofilmen, skörda biofilmen från ytan och dela upp klumpar och analysera provet. Av de fyra stegen är skörden och uppdelningen de minst studerade men ändå kritiska när man överväger potentialen för testbias. Denna artikel visar vanliga skörde- och disagregeringstekniker för biofilm som odlas på tre olika ytor. De tre biofilm skörd och disaggregering tekniker, hämtat från en omfattande litteratur översyn, inkluderar virvel och ultraljudsbehandling, skrapning och homogenisering och skrapning, virvel och ultraljudsbehandling. Två yttyper beaktas: hårt icke-poröst (polykarbonat och borosilikatglas) och poröst (silikon). Dessutom ger vi rekommendationer för den minsta information som bör inkluderas vid rapportering av den skördande teknik som följts och en medföljande metod för att kontrollera om det finns partiskhet.
Introduction
Definitionen av biofilm har utvecklats under de senaste decennierna och omfattar mikrobiell associering med en mängd olika biologiska och/eller icke-biologiska ytor, införande av icke-cellulära komponenter1 som uppvisar olika tillväxt och genetiskt uttryck2 i en matris. Biofilm ger skydd mot miljöbelastningar som torkning och kan göra verkan av kemiska desinfektionsmedel mindre effektiv vilket resulterar i mikrobers överlevnad. De överlevande i en biofilm kan potentiellt utgöra en källa till patogena mikroorganismer som är ett folkhälsoproblem3.
Biofilmsmetoder består av fyra steg, tillväxt, behandling, provtagning (skörd och uppdelning) och analys. Tillväxt, det första steget, där användaren bestämmer organismens tillväxtförhållanden, temperatur, media etc., är det mest ansedda och rapporterade i biofilmslitteraturen4,5,6,7. Behandlingssteget utvärderar antimikrobiella medel (t.ex. desinfektionsmedel) för att bestämma deras effekt antingen mot en mogen biofilm3,8,9 eller det antimikrobiella läkemedlet kan införlivas i ytan för att bestämma produktens förmåga att förhindra eller minska biofilmstillväxt10. Det tredje steget, provtagning, inkluderar steg för att skörda biofilmen från den yta där den växte och för att disaggregera de borttagna klumparna3,8,11. Det fjärde steget, analys, kan omfatta livskraftiga cellantal, mikroskopi, fluorescensmätningar, molekylära resultat och/eller en matriskomponentbedömning8,9. Bedömning av data ger information om resultatet av ett experiment. Av de fyra är provtagning ofta det mest förbisedda steget eftersom det förutsätter att den valda biofilmskördnings- och/eller uppdelningstekniken är 100% effektiv, ofta utan verifiering11.
Planktoniska suspensioner av bakterier, som ofta anses vara homogena, kräver enkel virvel före analys. Biofilmer är dock komplexa samhällen som består av mikroorganismer (prokaryota och/eller eukaryota), exopolysackarider, proteiner, lipider, extracellulärt DNA och värdceller12. Steg bortom traditionella planktoniska mikrobiologiska odlingsmetoder behövs för att på ett adekvat sätt skörda biofilm från en yta och sedan dela upp den i en homogen encellig suspension. En omfattande litteraturöversikt (information som inte ingår i denna publikation) visade att valet av borttagnings- och uppdelningsteknik är beroende av ett antal faktorer, inklusive arter som finns i biofilmen, yta som biofilmen är fäst vid (icke-porös eller porös), tillgänglighet till tillväxtytor (lätt avtagbar kupong eller fysisk destruktion av apparater där biofilmen växer). ytgeometri (yta och form), biofilms densitet på tillväxtytor och tillgänglig laboratorieutrustning.
När biofilm skördas från en yta är den resulterande cellupphängningen heterogen. Om denna nonuniform suspension ska räknas upp korrekt måste den delas upp i enskilda celler. Livskraftiga platträkningar förutsätter att en kolonibildande enhet härstammar från en bakterie. Om aggregat av biofilm placeras på tillväxtmediet är det omöjligt att skilja enskilda celler som kan leda till felaktiga uppskattningar. Till exempel, under desinfektionseffekttestning, om en behandling tar bort biofilm mycket effektivt från en yta jämfört med kontrollen, kan stockreduktionen verka artificiellt stor jämfört med kontrollen. Å andra sidan verkar ett kemiskt desinfektionsmedel som fixerar biofilm på en yta jämfört med kontrollen ha en lägre stockreduktion11. Denna typ av scenario kan leda till partisk tolkning av experimentella data.
Som förberedelse för publiceringen bestämde en genomgång av litteraturen att gemensamma metoder för skörd och disaggregering biofilm inkluderar skrapning, svabba, ultraljudsbehandling, virvel eller en kombination av dessa. Skrapning definieras som fysisk borttagning av biofilm från ytor med en steril pinne, spatel eller annat verktyg. Med svabbning avses avlägsnande av biofilm från ytor med en bomullsspetsad pinne eller annat fast absorberande material. Ultraljudsbehandling avser störningar av biofilm från ytor via ultraljud vågor distribueras genom vatten. Med virvel avser användning av en mixer för att uppnå en flytande virvel av provet inuti ett rör. Homogenisering använder roterande blad för att skjuva skördade biofilmklumpar i en enda cellfjädring. I detta dokument presenterar vi tre skörde- och disagregeringsmetoder för två olika yttyper, hårda/icke-porösa och porösa.
En förteckning över rekommenderad minimiinformation som forskare bör inkludera i metoderna finns avsnitt i publikationer. Vi hoppas att införandet av denna information gör det möjligt för andra forskare att reproducera sitt arbete. Det finns ingen perfekt skörde- och uppdelningsmetod, därför ges också rekommendationer för hur man kontrollerar tekniken.
Tre vanliga metoder för att skörda och disaggregera biofilm från vanliga tillväxtytor demonstreras i den här artikeln. Denna information kommer att göra det möjligt för forskare att bättre förstå den övergripande precisionen och förspänningen hos en biofilmtestmetod. De metoder som beskrivs är följande: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm odlad på polykarbonatkuponger (hård icke-porös yta) under hög vätskeskjuvning i CDC Biofilm Reactor skördas och disaggregeras efter en femstegskombination av virvel och ultraljudsbehandling för att uppnå biofilm skörd och disaggregering (2) A P. aeruginosa Biofilm som odlas på borosilikatglaskuponger (hård icke-porös yta) i droppflödesreaktorn under låg vätskeskjuvning skördas och disaggreras med skrapning och homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm odlad i silikonrör (porös yta) skördas och disaggreras med skrapning, följt av ultraljudsbehandling och virvel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virvel och ultraljudsbehandling
- Odla en mogen P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm odlad enligt ASTM Standard E25622.
- I slutet av tillväxtperioden på 48 timmar, förbered dig på att behandla biofilmen och provkupongerna enligt ASTM Standard E28718
- För aseptiskt in autoklaverade stänkskydd i sterila 50 ml koniska rör med flamsteriliserade tångar. Upprepa för alla rör som kommer att få behandling. Rör för kontrollkuponger behöver inte ett stänkskydd.
- Ta aseptiskt bort en slumpmässigt vald stav från CDC Biofilm Reactor. Skölj kuponger för att ta bort löst fästa celler genom att försiktigt doppa stången i 30 ml sterilt buffrat vatten.
- Håll stången parallellt med bänkskivan, över ett tomt, sterilt koniskt rör på 50 ml och använd en flamsteriliserad insexnyckel, lossa setskruven för att släppa en biofilmsbelagd kupong i röret. Upprepa för önskat antal kuponger. Ta bort stänkskydd och placera i en separat behållare för sterilisering.
- Använd en serologisk pipett på 5 ml och rör långsamt 4 ml av behandlingen eller kontroll i rören så att vätskan strömmar ner på insidan av rörets vägg.
- Knacka försiktigt på botten av röret så att eventuella luftbubblor under kupongen förskjuts. Tillåt 30-60 s mellan varje tillägg.
- I slutet av den angivna kontakttiden, pipetten 36 ml neutralisator i rören i samma ordning som behandlingen (eller kontrollen) applicerades.
OBS: Den slutliga volymen kombinerad behandling och neutralisator är viktig för att noggrant bestämma biofilmsloggtätheten. - Virvel varje rör på den högsta inställningen för 30 ± 5 s. Se till att en komplett virvel uppnås.
OBS: Försiktighet bör iakttas vid virvelning av tunga kuponger som rostfritt stål i glasflaskor där brott kan uppstå. - Bestäm det optimala antalet rör per bad och placering i provrörsstället innan de faktiska proverna bearbetas. Vid bearbetning av flera prover, bekräfta att vattentemperaturen i det sonderande badet är 21 ± 2 oC.
- Placera rören i rörstället upphängda i avgasad ljudledare så att vattennivån i badet är lika med vätskenivån i rören. Sonicate vid 45 kHz, 100% effekt och Normal funktion i 30 ± 5 s. Upprepa virvel och ultraljudsbehandling cykler och sedan avsluta med en sista virvel (5 cykler totalt).
OBS: Dessa rör med den skördade och uppdelade biofilmen är utspädningen 100 eller 0. - Späd ut provet i buffrat vatten. Platta på R2A-agar med lämplig pläteringsmetod. Inkubera vid 36 ± 2 oC i 24 timmar. Räkna kolonier efter lämplig pläteringsmetod som används och registrera data.
2. Skrapning och homogenisering
- Odla en mogen P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm enligt ASTM Standard E264713.
- Ställ in provtagningsstationen så att den omfattar provtagningstavla, 95 % etanol i en bägare, alkoholbrännare, hemostat, verktyg för borttagning av kuponger, bägare med sterilt utspädningsvatten och utspädningsrör för sköljning av kupongerna.
- Stäng av pumpen. Ta bort ett kanalskydd och använd ett sterilt verktyg för borttagning av kuponger och hemostats för att ta bort kupongen, var försiktig så att du inte stör biofilmen.
- Skölj kupongen genom att försiktigt nedsänka, med en flytande rörelse, i 45 ml sterilt utspädningsvatten (som finns i ett 50 ml centrifugrör). Vänd omedelbart rörelsen för att ta bort kupongen.
- Placera kupongen i en bägare som innehåller 45 ml sterilt utspädningsvatten. Skrapa den biofilmtäckta kupongytan i nedåtgående riktning i cirka 15 s med hjälp av en steril spatel eller skrapa. Skölj spateln eller skrapan genom att röra om den i bägaren. Upprepa skrapnings- och sköljprocessen 3-4 gånger, vilket säkerställer full täckning av kupongytan.
- Skölj kupongen genom att hålla den i 60° vinkel över den sterila bägaren och pipettera 1 ml sterilt utspädningsvatten över kupongens yta. Upprepa för totalt 5 sköljningar. Den slutliga volymen i bägaren är 50 ml.
OBS: Den slutliga volymen kombinerad behandling och neutralisator är viktig för att noggrant bestämma biofilmsloggtätheten. - Byt ut varje kanalskydd när kupongerna tas bort.
- Arbeta i biosäkerhetsskåpet, homogenisera det skrapade biofilmprovet. Fäst en steril homogenisatorsond på homogenisatorn, placera sondens spets i vätskan, slå på homogenisatorn och ramp upp till 20 500 varv/min.
- Homogenisera provet i 30 s. S nej till RPM:erna och stäng av homogenisatorn.
- Sanera sonden mellan biofilmsprover genom att homogenisera ett 9 ml sterilt utspädningsämne vid 20 500 varv/min i 30 s enligt beskrivningen ovan. Homogenisera ett 9 ml-rör med 70% etanol i 30 s, lossa sonden och låt stå i etanolröret i 1 min. Homogenisera ytterligare två utspädningsämnen.
OBS: En engångs homogenisatorsond kan användas för varje prov. - Späd ut proverna i buffrat vatten. Platta på R2A-agar med lämplig pläteringsmetod. Inkubera plattor vid 36 ± 2oC i 24 timmar, räkna kolonier efter behov för pläteringsmetod som används och registrera data.
3. Skrapning, virvel och ultraljudsbehandling
- Odla en mogen Escherichia coli ATCC 53498 biofilm i silikonkateterrör10.
- Förbered provtagningsmaterial: sköljrör, sterilt centrifugrör, tom steril Petri-skål, flamsteriliserad rostfri hemostat och sax, timer och linjal.
- Med pumpen pausad, använd 70% etanol för att rengöra utsidan av slangen. Mät 2 cm från änden, undvik det område som är fäst vid kontakten och markera slangen för att bestämma skärplatser.
- Skär slangen på 2 cm-märket med flamsteriliserad sax och placera segmentet i tom steril Petri-skål. Torka av slangen med 70% etanol och återanslut den distala änden till avfallsslangar.
- Skölj slangsegmentet för att avlägsna planktonceller. Med flamsteriliserade tångar, sänk försiktigt ner slangsegmentet i 20 ml sterilt utspädningsvatten och ta sedan omedelbart bort. Placera segmentet i 10 ml neutralisator.
- Med flamsteriliserade tångar håller du rörsegmentet och skrapar med steril träapplikatorpinne tills alla inre delar av slangen har skrapats. Skölj ibland pinnen i 10 ml neutralisator och placera segmentet tillbaka i provröret. Det skrapade slangsegmentet är 100 eller 0 utspädning.
OBS: Den slutliga volymen kombinerad behandling och neutralisator är viktig för att noggrant bestämma biofilmsloggtätheten. - Virvel varje rör på den högsta inställningen för 30 ± 5 s. Placera röret i rörstället upphängt i sonicator så att vattennivån i badet är lika med vätskenivån i rören. Sonicate vid 45 kHz, 100% effekt och normal funktion i 30 ± 5 sekunder. Upprepa virvel och ultraljudsbehandling cykler sedan avslutas med en sista virvel.
OBS: Detta rör med den skördade och uppdelade biofilmen är 100 utspädning. - Späd ut proverna i buffrat vatten. Platta på tryptisk soja agar med lämplig pläteringsmetod.
- Inkubera plattor vid 36 ± 2 oC i 24 timmar. Räkna kolonier efter lämplig pläteringsmetod, registrera data och beräkna det aritmetiska medelvärdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering/bekräftelse av en skördemetod
Flera studier som genomfördes i vårt laboratorium undersökte förmågan att virvelring och ultraljudsbehandling effektivt skörda biofilm odlad i biofilmreaktorn (ASTM E2562)2 med hjälp av Single Tube Method (ASTM E2871)8.
En P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm odlades enligt ASTM E25622 på borosilikatglaskuponger. Efter 48 timmar placerades fyra kuponger i injektionsflaska, "behandlas" med 4 ml sterilt buffrat vatten och neutraliserades med 36 ml 2x D/E neutraliserande buljong. Den första ultraljudsbehandling inställningen av 45 kHz, 10% effekt, Svep inställning, 30 ± 5 s användes för att skörda och dela upp biofilmen från tre av de fyra kupongerna. Efter slutförande av virvel och ultraljudsbehandling cykel, var varje kupong färgades med kristall violett och fotograferas. Figur 1 visar mängden biofilm som finns kvar på de tre kupongerna efter virvel och ultraljudsbehandling jämfört med kontrollen.
För att testa detta vidare odlades en P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm som beskrivits tidigare och två ultraljudsbehandling inställningar jämfördes: 1) 45 kHz, 10% effekt, Svep inställning, 30 ± 5 sekunder och 2) 45 kHz, 100% effekt, Normal inställning, 30 ± 5 sekunder. En kupong från varje uppsättning av de tre färgades med BacLight Live / Dead fläck och avbildas med confocal mikroskopi (CM). De återstående två kupongerna från varje uppsättning späddes ut, pläterades och räknades upp för livskraftiga celler. De livskraftiga platträkning resultaten var 9.230 Log10 CFU /kupong ± 0.007 (SD_R) för inställning 1 och 9.272 Log10 CFU/kupong ± 0.066 (SD_R) för ultraljudsbehandling inställning 2. Dessa data bekräftade en 2015 EPA Single Tube Method Collaborative Study där 9.03 Log10 CFU / kupong ± 0.272 (SD_R) uppnåddes9. Enligt de livskraftiga plåträkningarna verkar det som om alla tre medlen är tillräckligt lika för att inte motivera ytterligare undersökningar av skillnaderna mellan de två skördemetoderna. De mikroskopiska bilder som visas i figur 2 kan dock tyda på att mer biofilm återstod efter användning av inställning 1 än inställning 2. Medan vi observerar att biofilm som finns kvar på kupongerna verkar död (röd i färg), är tolkningen av livskraften när du använder BacLight Live / Dead fläck svår14,15. Istället för att fokusera på livskraft konsekvenser av den färgade biofilmen, använde vi denna fläck för att visualisera biofilm kvar på ytorna. Dessutom, medan vi erkänner att ultraljudsbehandling kan vara skadliga för bakteriell livskraft, visade en 2007 publikation av Kobayashi et al.16 att ökad ultraljudsbehandling tid utöver 5 minues resulterade i minskade livskraftiga platta räkningar. Eftersom vår studie använde totalt 1 minut ultraljudsbehandling, är vi övertygade om att få celler dödades via ultraljudsbehandling som visas av >9.2 LOG10 CFU/kuponger för de två ultraljudsbehandling parametrarna. Det är intressant att en fullständig skörd av biofilmen från ytan inte uppnåddes med någon av metoderna. Denna slutsats visar att enbart livskraftiga antal plattor inte är tillräckliga för att bestämma avverknings- och uppdelningsförskjutning och därför måste paras ihop med en ytterligare metod, till exempel mikroskopi.
Förutom sonicator inställningar, undersökte vi andra viktiga faktorer som påverkar ultraljudsbehandling. Dessa inkluderade volymen vätska i injektionsflaskan (10 eller 40 ml), typen av vätska i injektionsflaskan (buffrat vatten eller 2X D/E Neutraliserande buljong) och antalet injektionsflaska som placerats i badet samtidigt (3 eller 12 injektionsflaska)9.
P. aeruginosa biofilmer på CDC Biofilm Reactor kuponger var sonicated med sonicator inställning 2 (45 kHz, 100% effekt, Normal inställning, 30 ± 5 sekunder). Alla prover virvlade antingen 3 i taget eller 6 åt gången med hjälp av en virvelspelare utrustad med en 6-plats rörfäste sedan sonicated enligt beskrivningen i figur 3. En kupong från var och en av följande kategorier avbildades med CM (bild 3).
I den andra studien där ultraljudsbehandling parametrar undersöktes, de mikroskopiska bilderna (figur 3) tyder på att minimera volymen i rören, minska antalet rör bearbetas på en gång och användning av D/E neutralisera buljong (som innehåller tensid) alla bidra till förbättrad biofilm skörd från kupongerna.
Biocider kan positivt eller negativt förbättra skörden och uppdelningen. I likhet med att bekräfta att en neutralisator effektivt stoppar den aktiva utan att öka dödandet innan ett effekttest utförs, är det viktigt att bekräfta att en biocid inte påverkar skörden och disagregeringen på ett differentiellt sätt. För effekttestning resulterar bias om och endast om det finns differentiell borttagning för kontroll vs behandlade biofilmprover11.
Bild 1: Bilder av kuponger färgade med kristallviolett som visar rest biofilm. A) Kupong borttagen från reaktorn och fläckad med kristallviolett. B, C, D) Tre replikatkuponger "behandlades" separat med sterilt buffrat vatten och neutraliserades sedan. För att skörda och dela upp var kupongerna virvlade (30 ± 5 sekunder) och sonicated (45 kHz, 10% effekt, Svepinställning, 30 ± 5 sekunder) två gånger sedan fick en slutlig virvel. Bilder med tillstånd av Danielle Orr och Blaine Fritz. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Konfokal mikroskopi bilder av kuponger som jämför två olika ultraljudsbehandling inställningar. Kuponger (12,5X förstoring) bearbetas via ultraljudsbehandling inställning 1 (45 kHz, 10% effekt, Svep inställning) till vänster eller ultraljudsbehandling inställning 2 (45 kHz, 100% effekt, Normal inställning) till höger. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3. Confocal mikroskopi bilder av kuponger som jämför volymer, ultraljudsbehandling vätska och antal rör. Kuponger (12,5X förstoring) bearbetade i 10 eller 40 ml volymer, i utspädningsvatten (DW) eller D / E neutraliserande buljong (D / E), 3 eller 12 rör åt gången med optimerad ultraljudsinställning (45 kHz, 100% effekt, Normal inställning). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil 1: Viktiga parametrar av betydelse för skörd och disaggagregation Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minsta information för avverknings- och disagregeringsmetoder
För att skapa reproducerbara biofilmsdata i hela forskarsamhället är det absolut nödvändigt att författarna innehåller så mycket detaljer som möjligt om vart och ett av tillväxt-, behandlings-, provtagnings- och analysstegen i en biofilmmetod. Standardiseringen av biofilmsmetoder har hjälpt till i denna strävan eftersom det gör det möjligt för forskaren att hänvisa till en specifik metod och eventuella relevanta ändringar. Många papper innehåller dock bara en mening eller två för att beskriva biofilmsskörd och uppdelning. För bättre reproducerbarhet rekommenderar vi att minimiinformation för biofilmsskörd inkluderas i publikationer. Detta bygger på initiativet Minimum Information About a Biofilm Experiment (MIABiE) som lagts fram av Lourenco et al.17. Vid användning av ultraljudsbehandling för parametrar för biofilmsavverkning och uppdelning bör informationen omfatta: rörens position i badet (tillverkarnas rekommendationer för att undvika att skada givare), antal rör som sonicerats samtidigt, rörmaterial, volym och typ av vätska i röret, närvaro av tensid, vätskeposition i rör i förhållande till vätskenivån i ultraljudsbad, Anordning som används för att hålla rören i badet (glasbägare kontra provrörsställ), avgasning av vattenbad före ultraljudsbehandling av prover (om avgasning inte är ett tillverkaralternativ, kommer enkel användning av badet innan proverna sätts in att hjälpa till att avlägsna vissa upplösta gaser från badvätskan), vattenbadets temperatur (temperaturen kan stiga efter långa perioder av ultraljudsbehandling). frekvens (t.ex. 25 kHz eller 45 kHz), badfunktion (svep eller normalt till exempel) och effektområde som levereras till givare (t.ex. 10–100).25 kHz, till exempel). Dessa inställningar bör optimeras för biofilmen som studeras, systemet som används för att odla biofilmen och den specifika make / modellen av ultraljud bad18.
Sonicator-inställningarna kan ändras för att optimera önskade skördeeffekter. Avgasning avlägsnar upplöst luft i badvätskan och förbättrar därmed rengöringseffekten. Frekvensen kan justeras till en låg eller hög inställning. En låg inställning som 25 kHz skulle till exempel bidra till att skörda fasta prover, medan en högre inställning på 45 kHz skulle vara lämpligare för känsliga prover. En badfunktion av sopa eller normal möjliggör fördelning av kavitation. Svepfunktionen skapar en kontinuerlig växling av ljudtrycksmaximen. Den normala funktionen gör det möjligt för givaren att arbeta i dubbel halvvågsläge som kan resultera i döda zoner, vilket gör ultraljudsbehandlingen mindre effektiv. Effektintervall kan ändras från 10 till 100% av den effekt som levereras till givare19. det är känt att ultraljudsbehandling kan negativt påverka bakteriell livskraft. En studie från 2008 av Stamper et al.20 utsatte bakteriekulturer för att öka ultraljudsenergi över tid för att skapa bakteriella dödskurvor. Vi rekommenderar att användare bekräftar att en viss kombination av ultraljudsbehandling inställningar inte orsakar en minskning av livskraftiga bakterier20.
Det finns ingen perfekt metod för att skörda och disaggregera biofilm, men vissa metoder fungerar bättre för vissa ytor/mikrobkombinationer än andra. Vi förespråkar att läsaren bestämmer vilka parametrar som är viktiga för deras specifika biofilmsscenario. Viktiga parametrar av betydelse för avverkning och uppdelning ingår i kompletterande fil 1.
För ultraljudsbehandling studier görs för att bedöma skörd och disagregering bias, fann vi att ultraljudsbehandling är bekvämt, effektivt och kunna standardiseras för skörd och disaggregering biofilm från ytor. Placering av kuponger i injektionsflaska minimerar tekniker till teknikervariation som skulle uppstå i metoder där kuponger fysiskt skrapas av laboratoriepersonal, till exempel. Även om det verkar enkelt nog att placera injektionsflaska i ett soniskt vattenbad, finns det många parametrar som måste övervägas för att uppnå optimal skörd av biofilm.
Två typer av ultraljudsbehandling utrustning finns, ultraljud bad och ultraljud sonder. Detta papper fokuserar främst på ultraljud bad där ultraljud energi genereras i intervallet av hög (20 - 45 kHz) till normal (40 - 60 Hz) frekvens.
Tre huvudprocesser spelar in när du använder en ultraljudsenhet för att rengöra en yta. Elektrisk energi omvandlas till akustisk energi när en högfrekvent ström skickas till en piezoelektrisk eller magnetostrictiv givare som svänger som svar på strömmen. Svängningen genererar komprimeringsvågor (rarefaction) i vätskan. Kavitation bubblor bildas på grund av undertryck under rarefaction. Bubblorna växer tills de når en instabil storlek och kollapsar, vilket skapar en vattenstråle som rengör ytor21.
Tre skörde- och deseggregeringsmetoder demonstreras i denna artikel: ultraljudsbehandling och virvelmetoder för skörd och uppdelning av biofilm när de odlas på polykarbonatkuponger i CDC Biofilm Reactor enligt Single Tube Method. Skrapnings- och homogeniseringsmetoder för skörd och uppdelning av biofilm visas när de odlas på glaskuponger med drip flow biofilm-reaktorn. Skrapning, ultraljudsbehandling och virvelmetoder för skörd och disaggregering av biofilm visas när de odlas i silikonrör.
Det finns ingen perfekt metod för att skörda och dela upp biofilmen, men vissa metoder är bättre för olika ytor och/eller tillämpningar. Det viktiga är att ta sig tid att validera den metod som används. I detta dokument diskuterade vi användningen av kristallviolett och mikroskopi, men andra val finns beroende på den känslighet som krävs. Om forskningen omfattar effekttestning är det viktigt att bekräfta metodens giltighet i närvaro av antimikrobiella6. All utrustning är något annorlunda, så även om skörde- och uppdelningsmetoden har standardiserats är det fortfarande klokt att bekräfta processen för den utrustning som används. Skörde- och disagregeringsmetoder är specifika för ytassocierade och biofilmsbakterier. Forskning har visat att felaktiga val kan leda till partiska testresultat. Ändå är skörd och uppdelning de minst studerade av de fyra stegen i biofilmsmetoder. Det är i allmänhet också det icke-berättigade steget (taget för givet som arbete) med minst information som finns i publicerat papper vilket gör det utmanande att reproducera processen i ett annat labb. Detta dokument och medföljande video visar tre vanliga metoder för två yttyper och föreslår hur man validerar en metod för ett enskilt labb. Denna information kommer att hjälpa forskare att fatta mer välgrundade beslut om vilken metod som ska användas och ger vägledning om vad de ska rapportera för att förbättra reproducerbarheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers och Fei San Lee för deras bidrag till denna tidning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
